Summary
A análise em todo o sistema de múltiplas biomoléculas é crucial para obter insights funcionais e mecanísticos em processos biológicos. Por este meio, um extenso protocolo é descrito para extração de alto débito de lipídios, metabólitos, proteínas e amido de uma única amostra colhida da cultura de Chlamydomonas sincronizada.
Abstract
Microalgas têm sido o foco da pesquisa para suas aplicações na produção de compostos de alto valor, alimentos e combustíveis. Além disso, são modelos fotosintéticos valiosos facilitando a compreensão dos processos celulares básicos. Os estudos de sistema amplos permitem uma compreensão abrangente e aprofundada das funções moleculares dos organismos. No entanto, várias amostras e protocolos independentes são necessários para os estudos de proteômica, Shotgun e Metabolômica, apresentando maior erro e variabilidade. Um método robusto de extração de alta taxa de transferência para a extração simultânea de clorofila, lipídios, metabólitos, proteínas e amido de uma única amostra da alga verde Chlamydomonas reinhardtii é apresentado aqui. A configuração experimental ilustrada é para as culturas de Chlamydomonas sincronizadas usando 12 h/12 h de luz/condições escuras. As amostras foram coletadas em um ciclo de 24 células h para demonstrar que os metabólitos, lipídios e amido obtidos utilizando várias plataformas analíticas estão bem conformados. Além disso, amostras de proteínas coletadas utilizando o mesmo protocolo de extração foram utilizadas para realizar análises de proteômica detalhadas para avaliar sua qualidade e reprodutibilidade. Com base nos dados, pode-se inferir que o método ilustrado fornece uma abordagem robusta e reprodutível para o avanço da compreensão de várias vias bioquímicas e suas funções com maior confiança para a pesquisa básica e aplicada.
Introduction
As microalgas são uma fonte rica de produtos naturais (por exemplo, combustíveis, nutrição humana e animal, cosméticos e substâncias farmacológicas). Numerosos esforços de pesquisa são realizados para aumentar a eficiência da produção de produtos de alto valor a partir de microalgas1,2,3,4. A compreensão em nível de sistemas do metabolismo é um pré-requisito para melhorar a qualidade e o rendimento dos produtos naturais5,6,7. Com o advento de técnicas genómicas funcionais e melhores métodos de espectrometria de massas, milhares de genes, transcrições, proteínas e metabólitos podem ser monitorados simultaneamente. No entanto, várias amostras são necessárias para os estudos de proteômica, Shotgun e Metabolômica em profundidade, que muitas vezes é difícil de alcançar em organismos unicelulares, especialmente se os estudos de curso de tempo devem ser realizados. Além disso, a coleta e o processamento de diferentes alíquotas de amostra em combinação com diferentes protocolos para coletar os dados Ômicas altamente complexos (i.e., proteômicos, lipidomicos e metabólicos) introduz variabilidade, tornando assim a integração dos dados um tarefa desafiadora.
Chlamydomonas fornece não só um excelente sistema microbiano para a investigação de processos celulares, mas também um modelo conveniente para estudar a coordenação do ciclo celular e metabolismo. Assim, uma forte coordenação da expressão de transcrições com o ciclo celular tem sido mostrada usando o perfil de transcriptoma de alta resolução da cultura sincronizada de Chlamydomonas8. Cerca de 80% das transcrições analisadas exibiram periodicidade robusta em um ciclo de 24 células h8. Da mesma forma, o peso seco, proteínas, clorofila, aminoácidos e ácidos graxos de duas cepas diferentes de Chlamydomonas mostraram-se correlacionar com a divisão celular em um estudo onde a amostragem foi realizada a cada 4 h9. Recentemente, relatou-se que o metabolito e a dinâmica lipídica do deslocamento celular com base em fases específicas do ciclo celular10. As mudanças sutis em diferentes biomoléculas foram possíveis para monitorar o uso de um robusto éter terc-butilo (MTBE): metanol: método de extração à base de água, que oferece um ponto de partida ideal para uma análise abrangente de vários Omics10 , o 11.
Os guias de protocolo apresentados através de uma estratégia reprodutível e eficiente10, para a extração simultânea de lipídios, metabólitos, proteínas e amido de uma única amostra alíquota, para o tempo resolvido Metabolômica e estudo lipidomicas de culturas de Chlamydomonas crescentes síncronas. Além de ilustrar os dados metabólicos e lipidomicas robustos e reprodutíveis10, aqui, a qualidade das amostras proteômica obtidas da mesma pelota é demonstrada igualmente.
Protocol
1. pré-culturas de Chlamydomonas reinhardtii
- Prepare as pré-culturas de Chlamydomonas reinhardtii (estirpe selvagem tipo CC-1690 MT +) Transferindo células de placas sólidas do meio TAP para frascos de Erlenmeyer com 200 ml de meio HSM12.
- Cresça as pre-culturas em um abanador giratório em 24 ° c em 100 μmoles · m-2· s-1 luz contínua até que a densidade da pilha alcangue ~ 2 x 106 Cells/ml.
2. sincronização das culturas líquidas de Chlamydomonas em fermentadores
Nota: os parâmetros apresentados neste protocolo, tais como temperatura, luz e CO2, são específicos para a sincronização da estirpe CC-1690 Mt +. A fim de desenvolver uma cultura sincronizada usando outra cepa, é necessário testar as condições ideais.
- Transfira a pré-cultura para um sistema de fermentadores (vide Figura 1 suplementar para o projeto de fermentador feito medida), conectado a um resfriador de recirculação para manter a temperatura, com borbulhagem de co2 filtrado (2%, v/v) e agitado com um Barra magnética do stir na parte inferior do fermentador com agitação constante.
- Para iniciar a sincronização, defina o fermentador no regime claro-escuro de 12:12 h, 34 ° c e 200 μmoles · m-2· s-1 luz e assegure-se de que contem 500 ml da cultura no meio de HSM com uma densidade da pilha de 1 x 106 Cells/ml.
- No fim do ciclo de 24 h, re-diluir a cultura a 1 x 106 Cells/ml com o meio fresco do HSM com perturbação mínima usando um sistema do tubo em combinação com as bombas peristáltica, que reserva para bombear primeiramente uma quantidade distinta de cultura para fora e mais tarde bombeie dentro autoclave-esterilizado médio.
Nota: como uma alternativa às bombas peristáltica, as seringas de inocular podem ser usadas para retirar a cultura, quando o volume exigido de meio fresco puder ser adicionado diretamente no fermentador circunstâncias estéreis. - Repita o passo 2,3 três vezes para obter as culturas sincronizadas no 4º dia de inoculação.
- A fim validar a sincronia das pilhas, amostras da colheita em um intervalo de cada 2 h e medir a densidade e o volume de pilha da pilha usando um contador da pilha e um analisador do tamanho (veja tabela dos materiais). Dependendo da densidade celular, diluir as amostras entre 1:10 a 1:100 e medir em uma faixa de tamanho de 30 – 1900 μm3.
3. colhendo células de Chlamydomonas
- Rotule 15 mL tubos de centrifugação cônicos e prepare um Dewar enchido com o nitrogênio líquido.
- Colher amostras usando uma seringa (50 cm3) através do tubo de vidro interno do fermentador. Distribua a amostra em tubos de centrífuga cônicos que devem conter 10-15 x 106 células. Anote o volume transferido a cada tubo e meça a densidade da pilha e o tamanho da pilha de cada ponto de tempo usando o contador da pilha e o analisador do tamanho (veja a tabela de materiais)
- Pellet as células por centrifugação por 5 min em 4000 x g. Em seguida, descartar o sobrenadante, congelar as pelotas em nitrogênio líquido e depois armazenar em-80 ° c.
4. preparação de buffers de extração e extração de clorofila, lipídios e metabólitos
PRECAUÇÃO: o metanol (MeOH) e o MTBE são inflamáveis e podem provocar irritação do trato respiratório, do olho ou da pele na exposição prolongada e/ou contacto. Manuseie-os cuidadosamente apenas numa capa de fumos e utilize os procedimentos de segurança adequados durante a extracção (jaleco, óculos de segurança, luvas, etc.).
-
Tampão de extração 1
- Em um balão volumétrico de 100 mL, adicione 75 mL de MTBE, 25 mL de MeOH (classe de UHPLC) e Homogeneize (3:1, Vol/Vol).
- Adicione a seguinte solução de padrões internos: 50 μL de corticosterona (1 mg/mL em MeOH), 50 μL 1,2-diheptadecanoil-SN-glicero-3-fosfocolina (17:0 PC) (1 mg/mL em clorofórmio HPLC grau), 25 μL de ampicilina (1 mg/mL em água UHPLC grau) e 50 μL de D-sorbitol-1-13C (1 mg/mL em água UHPLC grau).
- Transfira o tampão de extração para uma garrafa de vidro limpa e pré-resfrie a solução a-20 ° c, 1 h antes do uso. Use a solução preparada na hora para as extrações. Esta solução pode ser armazenada a 4 ° c por até 2 semanas.
-
Tampão de extração 2
- Em um balão volumétrico de 100 mL, adicione 75 mL da classe de UHPLC da água e 25 mL da classe de MeOH UHPLC e Homogeneize.
- Transfira o tampão de extração para uma garrafa de vidro limpa. Use uma nova solução para as extrações. Esta solução pode ser armazenada à temperatura ambiente durante várias semanas.
5. extração de clorofila, lipídios e metabólitos
- Disponha os tubos, com o pellet celular (contendo 10-15 x 106 células), em nitrogênio líquido.
- Ressuspender o pellet de células em cada tubo com 1 mL de tampão de extração pré-arrefecido (-20 ° c) 1.
Nota: Realize esta etapa rapidamente para evitar a evaporação do buffer de extração de baixa viscosidade. Depois de adicionar o tampão de extração 1, mantenha os tubos à temperatura ambiente. - Vortex até que as células sejam bem homogeneizadas dentro da mistura de extração e alíquota a mistura em 2 ml de tubo de microcentrífuga.
- SONICATE as culturas usando banho sonication (ver tabela de materiais) em água de refrigeração de gelo por 10 min.
- Incubar todas as amostras em um agitador orbital a 1000 rpm por 60 min a 4 ° c.
- Para induzir a separação de fase, adicione 650 μL de tampão de extração 2.
- Vortex brevemente seguido por centrifugação a 20000 x g por 5 min a 4 ° c.
Nota: após esta etapa, há uma separação das fases líquidas e uma pelota contínua na parte inferior do tubo. Manuseie os tubos com cuidado para evitar a mistura das duas fases líquidas. O MTBE-Phase superior contem lipídios e clorofila, quando a fase mais baixa contiver os metabolitos polares e semi-polares. A pelota precipitada na parte inferior contem proteínas, amido e outras moléculas insolúveis.
6. alicitando as frações
- Transferir 500 μL de MTBE-Phase superior (lipídios) para um tubo de 1,5 mL rotulado. Seque as amostras utilizando um concentrador de vácuo (ver tabela de materiais) e armazene a-80 ° c até à medição.
- Retire a MTBE-Phase remanescente utilizando uma pipeta de 200 μL.
- Transferir 650 μL da fase inferior (metabolitos polares e semi-polares) para um novo tubo rotulado. Seque as amostras utilizando um concentrador de vácuo (ver tabela de materiais) e armazene a-80 ° c até à medição.
- Retire a fase inferior restante introduzindo o volume em excesso.
- Congele a pelota contínua no nitrogênio líquido e armazene-o em-80 ° c até uma extração mais adicional.
7. determinação dos metabolitos polares (metabolitos primários)
- Resuspend a pelota secada da fase polar (etapa 6,3) na solução do methoxyamine-hydrochloride/pyridine para o methoxymization de grupos carbonila.
- Aqueça as amostras a 37 ° c por 90 min.
- Derivatize as amostras com N-methyl-N-trimethylsilyltrifloracetamide (MSTFA) por 30 minutos em 37 ° c como descrito previamente13.
- Use cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas de tempo de voo (GC-TOF-MS) para analisar os metabolitos primários. Os parâmetros de gradiente utilizados foram de acordo com o protocolo previamente descrito14.
8. determinação de metabolitos não polares (lipídios)
- Re-suspender a pelota seca da fase não polar (etapa 6,1) em uma mistura de acetonitrila: isopropanol (7:3, v:v).
- Centrifugar a 20000 x g e separar numa coluna C8 de fase inversa (100 mm × 2,1 mm × 1,7 μm de partículas), utilizando um sistema uplc (ver tabela de materiais). As duas fases móveis foram a água com 1% 1 M de acetato de amônio, 0,1% de ácido acético (tampão A), e acetonitrila: isopropanol (7:3) contendo 1% 1 M de acetato de amônio, 0,1% de ácido acético (tampão B).
- Use os parâmetros de gradiente de acordo com o protocolo descrito anteriormente14.
9. determinação do teor de clorofila
- Misturar 100 μL da fase MTBE (passo 6,1) com 900 μL de metanol de 90% para um método em branco, bem como as amostras experimentais.
- Meça a absorvência usando o espectrofotômetro em um comprimento de onda de 665 nanômetro e de 652 nanômetro para distinguir entre a clorofila a e a clorofila b.
Nota: a absorção deve variar entre 0,1 e 1 para o cálculo de concentração válido. Diluir as amostras, se necessário. - Calcule o teor de clorofila a e b, e também o teor de clorofila total de acordo com as seguintes fórmulas.
CHLa = 16.82 a665 – 9.28 a652
CHLb = 36.92 a652 – 16.54 a665
CHLa = b = 0.28 a665 + 27.64 a652
Nota: as fórmulas foram descritas por bar-nun e Ohad15.
10. extração e determinação do teor de proteínas, digestão e análise
Nota: para ressuscitação da proteína, utilizou-se tampão de ureia/tioureia (6 M de ureia, 2 M de thioureaand protease e inibidores da fosfatase) com modificações no protocolo previamente descrito16. No entanto, qualquer tampão de escolha pode ser usado para ressuscirepensão de proteínas.
- Prepare o tampão proteico utilizando as seguintes concentrações: 6 M de ureia e 2 M de tioureia.
- Dissolver o pellet (passo 6,5) em 200 μL de tampão proteico (10,1).
- Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 30 min, seguida de centrifugação a 20000 x g por 5 min.
- Transfira o sobrenadante, que contém as proteínas, para um novo tubo.
- Determine a concentração da proteína pelo ensaio17de Bradford.
- Digerir 50 μg de proteína em solução com um protocolo de escolha. Aqui, use o seguinte protocolo.
- Reduza 50 μg de amostras de proteínas utilizando 5 mM de DTT durante 30 min seguido de alquilação utilizando iodoacetamida de 10 mM durante 30 min à temperatura ambiente no escuro.
- Adicionar Trypsin/Lys-C Mix em uma 25:1 proteína: protease Ratio (w/w), misture e incubar para 3 h em 37 ° c.
- Diluir as amostras seis dobras usando 50 mM TrisHCl (pH 8) e incubar durante a noite a 37 ° c.
- Termine a digestão adicionando o ácido trifluoroacético (TFA) a uma concentração final de 0.5 – 1%.
- Após a digestão, realize a dessalinização dos peptídeos antes da espectrometria de massas usando pontas do estágio C18 e eluir os peptídeos digeridos18.
- Concentre as amostras em secura próxima, deixando 2-5 μL de solução em um concentrador de vácuo (ver tabela de materiais) sem aquecimento.
- Ressuscite as amostras no tampão de carga (5% acetonitrila, 0,5% ácido fórmico) e analise as misturas peptídicas por LC-MS/MS usando um espectrómetro de massa de alta resolução (ver tabela de materiais) conectado a um sistema nano-uplc.
- Separe os peptídeos utilizando o sistema UPLC (ver tabela de materiais) numa coluna de 20 cm de superfície com carga híbrida (csh) (ver tabela de materiais) com um diâmetro interno de 75 μm e um tamanho de partícula de 1,7 μm.
- Carregue 4 μL da amostra e corra através do gradiente de 90 min a uma vazão de 300 nL/min.
- Defina o gradiente. Use configurações de loop-off-line parciais com gradiente isocrático definido em 3% do buffer B (99,9% acetonitrila + 0,1% de ácido fórmico) mantido por 14 min antes do loop é deslocado para a posição on-line com a coluna, depois disso o gradiente é aumentado linearmente para 50 min, até 20% buffer B é atingido.
- Dentro dos próximos 15 min, aumente a concentração de tampão B a 30%. Em seguida, nos 15 minutos seguintes, aumente o tampão B para 40%, antes de atingir 90% do tampão B após outro 4 min. Realize a etapa de lavagem, que é exigida para limpar a coluna, em 400 nL/min e segure por 10 min adicionais (ver tabela 1 para gradiente detalhado condições de utilização).
- Finalmente, ajuste para trás o sistema a uma taxa de fluxo de 300 nL/min e uma concentração do amortecedor B de 3% dentro de 1 minuto. equilibram a coluna por 15 minutos antes que a amostra seguinte seja injetada.
Nota: uma lista completa de proteínas identificadas após A análise de LCMS/MS é apresentada na tabela 2.
11. extração e determinação do teor de amido
Nota: para determinação do teor total de proteínas e amido, o pellet sólido foi extraído em procedimento em duas etapas, conforme descrito anteriormente10.
- Adicionar 500 μL de 80% (v/v) de etanol ao pellet celular (passo 6,5) e incubar por 10 min a 80 ° c.
- Centrifugar a 4000 x g durante 10 min à temperatura ambiente. Em seguida, dissolver o pellet em 250 μL de água estéril seguida pela adição de 250 μL de 100 mM de acetato de sódio.
- Hydrolyze o amido pelo aquecimento por 3 h em 99 ° c. Digerir o amido dissolvido em monômeros de glicose durante a noite, adicionando uma mistura enzimática de α-amilase (4,2 unidades por amostra) e α-amiloglucosidase (10 unidades por amostra). Incubar os tubos a 37 ° c durante a noite.
Nota: após a incubação, as amostras podem ser congeladas a-20 ° c por alguns dias, ou a-80 ° c durante vários meses, antes das medições de glicose. - Centrifugue o extrato digerido em 20000 x g por 5 min e recolher o sobrenadante. Dissolver o sobrenadante (com os monómeros de glicose derivados de amido) em 100 mM de tampão HEPES (pH 7) que contém 5 mM MgCl2, 60 mg/ml ATP, 36 mg/ml NADP e glicose-6-fosfato-desidrogenase (1 unidade por amostra).
- A fim de analisar o teor de amido, primeiro medir a absorvância basal em 340 nm. Em seguida, adicione hexoquinase (1 unidade por amostra) para iniciar a reação. Finalmente medir o aumento de NADPH + H+ (indicando o nível de amido digerido à glicose) em 340 nm com um leitor de placa 96-well.
Nota: a diferença do valor máximo em 340 nm (não deve exceder o intervalo linear de 1) e a linha de base é equivalente à concentração de glicose do amido digerido. Deve-se fazer uma curva de glicose para determinar a concentração de glicose em nmol de glicose por mL.
Representative Results
Chlamydomonas reinhardtii CC-1690 sincronização de cultura
Para demonstrar os resultados representativos para o protocolo dado, apresentamos o exemplo de dados multiomônicos obtidos após a colheita e extração de amostras de Chlamydomonas sincronizadas reinhardtii culturas10. As culturas sincronizadas de Chlamydomonas compreendem das pilhas que pertencem à fase uniforme do crescimento em um ponto de tempo específico. As culturas de Chlamydomonas foram sincronizadas em 12 h/12 h de luz/ciclo escuro, 34 ° c com a intensidade luminosa de 200 μmol · m-2· s-1 e a concentração de co2 of2%, v/v, descrita como a concentração óptima para a tensão CC-1690 MT +10 . Essas condições haviam sido previamente otimizadas e validadas usando vários parâmetros do ciclo celular10. A Figura 1 exibe a distribuição do tamanho da célula medida com o contador Coulter em pontos de tempo distintos de culturas sincronizadas. Uma mudança no volume da célula pode ser observada à medida que as células crescem em tamanho durante toda a fase de luz, seguido pela liberação de células filhas começando no final da fase de luz de 10 h. Uma vez que todas as células filhas são liberados, Shift no volume da célula pode ser observado como as células filhas recém-lançadas são dispostas a começar o próximo ciclo 10 (Figura 1).
Colheita de amostras, manuseio e extração
A colheita rápida das amostras é realizada usando a centrifugação e depois de descartar o sobrenadante, as pelotas podem ser armazenadas em-80 ° c até a extração. Como descrito acima (etapa 5), a extração de MTBE resulta em três fases distintas: a) a fase orgânica foi usada para medir lipídios, bem como os níveis de clorofila (fator de normalização), b) fase polar foi coletada para medir metabólitos no GCMS enquanto, c) o pellet foi usado para medir o teor de amido e proteínas. Uma visão geral da distribuição de diferentes fases e seu emprego é ilustrada na Figura 2.
Metabolitos polares e não polares
Com base na análise do GCMS da fração polar, 65 metabólitos foram anotados, abrangendo aminoácidos, ácidos nucleicos, intermediários de glicólise, gluconeogênese, ciclo de ácido tricarboxílico, via de fosfato de pentose e poliaminas (Figura 3a). A análise de LCMS de fase neutra contendo lipídios levou à identificação de 204 espécies lipídicas distintas que abrangem várias classes lipídicas, nomeadamente fosfatidilgliceróis, fosfatidilethanolamina, sulfoquinovosyl diacilgliceróis, monogalactosyldiacylglycerols, digalactosyldiacylglicerols, diacylglyceryltrimethylhomoserine, ácidos gordos, diacylglycerides e triacylglycerides. Para visualizar as mudanças globais nos metabólitos e lipídios em todo o ciclo celular, utilizou-se a análise de componentes principais (PCA). O PCA apresenta uma separação de fases claras e escuras para os Metabolômica e dados lipidomicas. Além disso, um semi-cíclico (círculo parcialmente aberto) pode ser observado para ambos os dados (Figura 3C, D). A lacuna parcial no padrão circular é atribuída ao fato de que as amostras a 24 h do ciclo celular foram coletadas o escuro em contraste com as amostras coletadas no início do ciclo celular após 0,25 h de exposição à luz (Figura 3C , D).
Análise de proteínas e amido
Para examinar a qualidade do pellet protéico Obtido em decorrência da extração do MTBE, foram utilizadas 6 amostras para análise proteômica. A qualidade dos dados proteônicos obtidos por meio da digestão de 50 μg de proteína/amostra, foi examinada por meio de uma ferramenta computacional de controle de qualidade-controle de qualidade proteômica (PTXQC)19, indicando reprodutível e de alta qualidade de dados proteônicos obtidos a partir de todas as repetições (Figura complementar 1). A cobertura funcional molecular das proteínas foi examinada usando REVIGO20. Uma visão geral do enriquecimento funcional das 2463 proteínas identificadas (ver tabela 2) é apresentada na figura 4a. O pellet remanescente após extração protéica foi utilizado para quantificação reprodutível do amido, conforme indicado pelo baixo desvio padrão entre as várias repetições (Figura 4B).
Figura 1: exemplo ilustrativo das alterações no volume celular em diferentes fases do ciclo celular em Chlamydomonas reinhardtii. O eixo x que representa o volume da célula enquanto o eixo y representa o número da célula. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: fluxo de trabalho ilustrado para o emprego de diferentes fases durante as pelotas de células de extração de múltiplos Omics. A figura foi reutilizada a partir de Juppner, J.et al. 10. please estalam aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: exemplo representativo de metabólitos e lipídios identificados por meio do protocolo descrito. (A) classes de metabolito identificadas pela análise do GCMS. (B) espécies lipídicas pertencentes a diferentes classes identificadas pela análise do LCMS. C) análise dos componentes principais dos níveis do metabolito em 24 ciclos de células h. (D) análise de componentes principais dos lipídios através do ciclo de células de 24 h. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: exemplo representativo dos dados de proteínas e amido. A) enriquecimento funcional molecular das proteínas identificadas usando a análise de LCMS, TreeMap as desenhado usando REVIGO 20 B) dados representativos do amido que indicam a reprodutibilidade do protocolo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1: projeto personalizado do sistema do fermentador para o crescimento Synchronous controlado da temperatura e da aeração de culturas de Chlamydomonas. A figura foi reutilizada a partir de Juppner, J.et al. 10. please estalam aqui para transferir este arquivo.
Figura complementar 2: desfecho representativo para a qualidade dos dados proteônicos. Heatmap plotado usando a ferramenta computacional PTXQC19. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
| Tempo (min) | % Buffer B para buffer A | |
| 0 a 15 min | Gradiente linear de 0 to3% | Tampão A: 0,1% ácido fórmico na água da classe de UPLC |
| 15 a 75 min | Gradiente linear de 3% para 30% | Tampão B: 0,1% de ácido fórmico em 60% UPLC grau acetonitrila |
| 75 a 90 min | Gradiente linear de 30% para 40% | Vazão 300 nL/min |
| 90 a 94 min | Gradiente linear de 40% para 90% | Volume de injecção 4 μL |
| 94 to104 min | coluna de lavagem com 90% | |
| 105 a 120 min | Equilibrar a coluna por 15 min a 3% |
Tabela 1: cromatografia líquida de amostras de peptídeos, parâmetros de gradiente.
Tabela 2: lista de proteínas identificadas após análise de LCMS/MS. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Discussion
Neste artigo, nós ilustramos um protocolo robusto e altamente aplicável da extração para o lipidomics detalhado, o Metabolomics, o amido e a análise do proteômica de uma única pelota de 10-15 x 106 pilhas. O método foi implementado com sucesso em vários estudos para uma ampla gama de células e tecidos10,14,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,35,36. Aqui, nós apresentamos um encanamento Stepwise para a análise do multi-Omics de biomoléculas diferentes de uma única amostra colhida da cultura de Chlamydomonas reinhardtii (CC-1690 MT +).
O protocolo fornece uma abordagem robusta e reprodutível para processar várias amostras de uma só vez, para a análise de várias biomoléculas. Entretanto, um número de etapas críticas deve ser tomado cuidado fora a fim minimizar a variação técnica. Em primeiro lugar, a colheita das células deve ser feita o mais rapidamente possível, mantendo as condições uniformes para todas as amostras colhidas para preservar o estado biológico das células. Embora tenhamos usado a centrifugação para colher as células, estratégias de colheita alternativas podem ser utilizadas para a colheita das amostras. No entanto, é importante notar que diferentes estratégias de colheita são conhecidas por influenciar o estado metabólico das células37 portanto, a abordagem de colheita consistente deve ser usada para todas as amostras experimentais. Em segundo lugar, é importante evitar a secagem da fase não polar superior contendo clorofila, uma vez que isso pode influenciar os níveis de clorofila dissolvida no solvente que afetam o fator de normalização para as amostras. Finalmente, o cuidado deve ser tomado ao remover a fase polar restante para obter a pelota da proteína e do amido, para evitar perturbar a pelota que pode influenciar o índice do amido e da proteína.
Assim apresentado protocolo de extração oferece vários benefícios para a análise de dados de múltiplos Omics. Além de minimizar o número de alíquotas de amostra exigidas, também reduz a variação entre os resultados analíticos obtidos para diferentes biomoléculas. Isso permite a comparação direta dos resultados obtidos a partir dos metabólitos primários, lipídios e dados proteônicos. Da mesma forma, a extração simultânea de várias classes compostas permite a estratégia de normalização consistente e uniforme dos diferentes conjuntos de dados. Isto é especialmente aplicável se a normalização é difícil de alcançar usando o peso seco ou fresco38 ou número de célula.
O protocolo pode ser implementado para a triagem rotineira de uma amostra biológica complexa. Estes conjuntos de dados metablomic, lipidomicas e proteômica holísticos podem oferecer a informação detalhada sobre mudanças sistemáticas no metabolismo. Adicionalmente, os dados obtidos a partir da análise proteômica, fornecem insights sobre as alterações quantitativas (abundância) e qualitativas (modificações) nas proteínas em relação aos metabólitos. Assim, a integração de dados Ômicas poderia revelar informações aprofundadas sobre as alterações induzidas por perturbações genéticas ou bióticas e/ou abióticas de um sistema biológico. Assim, elucidar mudanças moleculares de vias metabólicas específicas ou processos celulares. Da mesma forma, esses dados de alta taxa de transferência podem permitir a identificação de alvos para a engenharia metabólica e refinar ou testar previsões de modelos metabólicos de escala de genoma37,39.
Disclosures
Os autores não têm divulgações.
Acknowledgments
Estamos muito gratos a Gudrun Wolter e Änne Michaelis por uma excelente assistência técnica. Gostaríamos de agradecer a todos os membros do laboratório Giavalisco por sua ajuda. Somos gratos à sociedade Max Planck por financiar a pesquisa e a FAPESP para a comunhão de L A Giraldi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and standards | |||
| 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850360P | Internal standard for lipids |
| 13C Sorbitol | Sigma Aldrich | 605514 | Internal standard for metabolites, ISOTEC® Stable Isotopes |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393-5G | Internal standard for metabolites |
| Corticosterone | Sigma Aldrich | 27840-500MG | Internal standard for metabolites, HPLC grade |
| Methanol (MeOH) | Biosolve Chemicals | 13684102 | ULC-MS grade |
| Methyl tert-butyl ether (MTBE) | Biosolve Chemicals | 13890602 | HPLC grade |
| Trypsin/Lys-C mix | Promega | V5072 | Enzymatic digestion of proteins |
| Water | Biosolve Chemicals | 23214102 | ULC-MS grade |
| Equipment | |||
| 1.5 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | Used for fractions |
| 2 ml Safe-lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | Used for sample extarction |
| Balance | Sartorius Corporation | 14 557 572 | |
| Fermenter system | Glasbläserei Müller, Berlin, Germany | custom made fermenter of 800ml capacity | |
| Q-exactive HF Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf, model 5427R | 22620701 | |
| Reversed Phase (RP) Bridged Ethyl Hybrid (BEH) C8 column (100 mm×2.1 mm containing 1.7 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186002878 | Analysis of lipids |
| RP Charged Surface Hybrid (CSH) column (Waters) with an inner diameter of 75 μm and a particle size of 1.7 μm | Waters, Machester, UK | 186007477 | Analysis of proteins |
| RP High Strength Silica (HSS) T3 column (100 mm×2.1 mm containing 1.8 μm diameter particles) | Waters, Machester, UK | 186003539 | Analysis of metabolites |
| Shaker | Eppendorf Thermomixer 5436 | 2050-100-05 | |
| Sonicator | USC 300 TH | 142-0084 | standard preset sonication power at 45kHz |
| UPLC system | Waters Acquity UPLC system (Waters, Machester, UK) | ||
| Vacuum concentrator | Scan Speed Maxi Vac Alpha Evaporators | 7.008.500.002 | |
| Vortex mixer | Vortex-Genie 2, Model G560 | SI-0236 | |
| Z2 Coulter Particle Count and Size Analyzer | Beckman Coulter | 6605700 | particle (cells) volume and number analyser |
References
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