Summary
On présente des méthodes pour préparer et caractériser les propriétés physico-chimiques et la bioactivité des nanoparticules de siRNA à charge neutrale et à pH réactif. On discute des critères pour les nanomédites siRNA réussis tels que la taille, la morphologie, la charge superficielle, le chargement de siRNA et le silençage génique.
Abstract
Le succès de la siRNA en tant que médecine moléculaire ciblée dépend de sa délivrance efficace de cytosoliques aux cellules dans le tissu de la pathologie. Le succès clinique pour le traitement des cibles de maladies hépatiques précédemment «non-droguables» avec siRNA a été atteint. Cependant, la livraison efficace de siRNA tumoral nécessite des considérations de conception pharmacocinétique supplémentaires, y compris le temps de longue circulation, l’évasion des organes de clairance (par exemple, le foie et les reins), et la pénétration et la rétention des tumeurs. Ici, nous décrivons la préparation et la caractérisation physicochimique/biologique in vitro des nanoparticules polymériques conçues pour une administration efficace de siRNA, en particulier pour les tissus non hépatiques tels que les tumeurs. Les nanoparticules de siRNA sont préparées par complexation électrostatique de siRNA et le poly copolymère dibloc (éthylène glycol-b-[2-(diméthylamino) éthyl méthacrylate-co-butyl méthacrylate]) (PEG-dB) pour former des complexes polyioniques ( polyplexes) où le siRNA est séquestré dans le noyau Polyplex et le PEG forme une couronne hydrophile à charge neutralement. De plus, le bloc DB devient membranaire comme vésicules de la voie endolysosomale acidifiante (< pH 6,8), déclenchant l’évasion endosomique et la délivrance cytosolique de siRNA. On décrit les méthodes permettant de caractériser les caractéristiques physico-chimiques des nanoparticules de siRNA telles que la taille, la charge superficielle, la morphologie des particules et le chargement de siRNA. La bioactivité des nanoparticules de siRNA est mesurée à l’aide de la luciférase comme gène modèle dans un test de silençage génique rapide et à haut débit. Les conceptions qui passent ces tests initiaux (tels que les polyplexes à base de PEG-DB) sont jugées appropriées pour la traduction à des études précliniques d’animaux évaluant la livraison du siRNA aux tumeurs ou à d’autres sites de pathologie.
Introduction
Parce que les siRNAs inhibent la traduction des protéines des séquences d’ARNm, ils peuvent théoriquement être utilisés pour le médicament toutes les pathologies connues1,2,3,4,5. Cependant, l’utilisation de siRNA en médecine est limitée par le profil pharmacocinétique globalement médiocre des molécules de siRNA6,7. Lorsqu’elles sont injectées par voie intraveineuse, les siRNAs sont rapidement déblayés par les reins et/ou dégradés par les nucléases8,9. En raison de sa grande taille et de sa charge négative, siRNA ne peut pas pénétrer dans les cellules ou échapper à la voie endolysosomale pour accéder au complexe de silençage induit par l’ARN (RISC) qui réside dans le cytosol10,11,12, le 13. Ainsi, des efforts considérables ont porté sur la conception et la mise en œuvre des stratégies de livraison du siRNA14. Cet effort s’est largement concentré sur le développement de nanoparticules à base de lipides et de polymères qui emballez le siRNA, le protègent contre le dégagement et la dégradation in vivo, et initient l’absorption cellulaire et l’évasion endosomique par des groupes ionisables et cationiques d’amine. De nombreux succès précliniques ont été rapportés et, plus récemment, le premier succès clinique a été rapporté pour l’administration de siRNA hépatiques à base de nanoparticles pour traiter l’amylose à médiation transthyrétine héréditaire (hATTR)15.
Il y a beaucoup de gènes causant le cancer qui sont actuellement «undruggable» par la pharmacologie conventionnelle (c.-à-d. les médicaments de petite molécule), motivant la conception des nanoparticules de siRNA polymériques (si-NPs) pour traiter le cancer16. Cependant, il existe un ensemble distinct de paramètres de conception qui doivent être pris en compte pour la livraison de siRNA non hépatique. Le système de livraison doit protéger la charge cationique du Polyplex qui provoque une agglutination dans la circulation systémique17,18,19. Pour la délivrance de tumeurs, plus précisément, la stabilité du si-NP est essentielle pour doter la longue circulation et donc l’accumulation accrue dans les tumeurs par l’effet de perméabilité et de rétention améliorée (EPR)20,21. En outre, le contrôle de la taille de si-NP est essentiel puisque seulement des nanoparticules approximativement 20 – 200 nm de diamètre dans l’effet de levier de taille EPR22, et les plus petits Si-NPS (~ 20 – 50 nm de diamètre) montrent une pénétration tumorale améliorée sur des nanoparticules de plus grande taille et microparticules23.
Pour répondre à ces contraintes de conception supplémentaires pour la délivrance de tumeurs systémiques du siRNA après administration intraveineuse, des si-NPs sensibles au pH, à charge neutralement, ont été développés (figure 1)24. Ces si-NPs sont PEGylated, ou plus récemment, Zwitterionated25, pour la charge de surface neutre et la résistance à l’adsorption des protéines et l’opsonisation en circulation. Puisqu’ils ne peuvent pas compter uniquement sur le caractère cationique pour conduire l’accouchement intracellulaire, une évasion endosomique extrêmement efficace est indispensable pour obtenir un silencieux génique puissant. En conséquence, le noyau de ces si-NPs est composé d’un noyau hautement endosomolytique qui est inerte au pH extracellulaire (7,4), mais qui est déclenché de manière semblable aux commutateurs dans les conditions acidifiées de la voie endolysosomale [pH 6,8 (endosomes précoces) – 5,0 ( lysosomes)]. Enfin, un mélange de contenu cationique et hydrophobe dans le noyau du si-NPs fournit des forces de stabilisation électrostatique et van der Waals, améliorant la stabilité du si-NPs dans le sang par rapport aux systèmes simplement cationiques.
L’intégration de nombreuses fonctions dans une conception relativement simple est possible en utilisant réversible addition-fragmentation chaîne transfert (RAFT) contrôlée de polymérisation pour produire des polymères avec une architecture complexe et une composition précise. Pour produire du si-NPs avec une charge de surface neutre, une réactivité au pH et une stabilité NP, RAFT est utilisé pour synthétiser du poly (éthylène glycol-b-[2-(diméthylamino) éthyle méthacrylate de méthacrylate deco-butyle]) (PEG-DB; Figure 1a). Le PEG-DB est complexé par électrostatiquement avec le siRNA, formant le si-NPs avec une Corona de PEG et un noyau de DB/siRNA (figure 1b). Le PEG forme une couche hydrophile inerte et neutralement chargée sur la Couronne si-NP. Le bloc de DB se compose d’un ratio molaire de 50:50 de 2-(diméthylamino) éthyl méthacrylate (DMAEMA) et de méthacrylate de butyle (BMA). DMAEMA cationique complexe électrostatiquement des siRNA à charge négative. Les auto-associés BMA dans le noyau NP par les interactions de van der Waals, augmentant la stabilité de NP. Ensemble, le DMAEMA et le BMA transmettent un comportement lytique lipidique dépendant du pH au bloc polymère DB. Au pH extracellulaire, le bloc de DB est séquestré au noyau si-NP et est inerte aux bilayers lipidiques. Dans des conditions acides, telles que celles de la voie endolysosomale, le DMAEMA ionisable dans le bloc de DB facilite l’effet de l’éponge de proton, où le tampon endosomique conduit à un gonflement osmotique et à une rupture26. En outre, les fractions hydrophobes de BMA dans le bloc de DB s’intègrent activement et lyse les bicouches lipidiques, entraînant une endosomolyse puissante. Ainsi, siRNA est complexé avec PEG-DB pour former des Si-NPS qui sont neutralement chargés et très stables au pH extracellulaire, mais qui perturbent les bicouches lipidiques à pH acide, assurant la livraison cytosolique de la charge utile siRNA.
Dans les présentes sont décrits les procédures expérimentales pour produire si-NPs de PEG-DB. Les méthodes permettant de caractériser les paramètres physicochimiques et la bioactivité des si-NPs sont présentées et discutées. Afin d’évaluer rapidement la bioactivité du si-NP, la luciférase est utilisée comme gène modèle pour les études de renversement. Luciferase Firefly est la protéine responsable de la «lueur» des lucioles27. En conséquence, les cellules de mammifères transfectées avec le gène luciférase Firefly produisent une «lueur» bioluminescente qui peut être capturée à l’aide d’un luminomètre pour quantifier les niveaux d’expression de la luciférase. Ici, nous utilisons Luciferase pour évaluer la bioactivité de si-NPs en livrant siRNA contre luciferase et en quantifiant la réduction correspondante de la bioluminescence dans les cellules exprimant la luciférase par rapport aux cellules qui reçoivent un siRNA brouillé.
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Protocol
1. préparation et caractérisation des si-NPs
- préparation du si-NP
- Dissoudre le polymère dans un tampon d’acide citrique de 10 mM (pH 4,0) à 3,33 mg/mL. Le polymère peut d’abord être dissous à une concentration de 10x dans l’éthanol pour assurer la dissolution.
Remarque: le polymère peut être dissous à des concentrations plus faibles, mais l’utilisation à des concentrations supérieures à 3,33 mg/mL peut empêcher la formation de NP homogène. - Ajouter le siRNA (50 μM dans diH2O) pour aboutir à N+:P- ratio de 10. Mélanger soigneusement les solutions de polymère et siRNA par pipetage et laisser incuber pendant 30 min. Le rapport N+:P représente le nombre de groupes d’amines chargés positivement sur le polymère et le nombre de groupes de phosphates chargés négativement sur le siRNA et est calculé par la formule ci-dessous:
où, mol Pol est la quantité molaire de polymère, l’amine RU est le nombre d’unités répétées d’amines positivement chargées par polymère, mol siRNA est la quantité molaire de siRNA, et BP siRNA est le nombre de paires de base par molécule de siRNA. - Ajouter un excès de 5 fois de tampon phosphate de 10 mM (pH 8,0) et mélanger doucement soit en pipetant, soit en invertant le tube. Pour confirmer que le pH final est neutre (~ 7,2-7,5), Pipetter 10 μL de solution si-NP sur des bandelettes de test de pH.
Remarque: les tampons d’acide citrique et de phosphate sont préparés selon les graphiques du centre de référence des tampons Millipore Sigma.
- Dissoudre le polymère dans un tampon d’acide citrique de 10 mM (pH 4,0) à 3,33 mg/mL. Le polymère peut d’abord être dissous à une concentration de 10x dans l’éthanol pour assurer la dissolution.
- Caractérisation physicochimique des si-NPs
- Enregistrez la taille et la charge surfacique des si-NPs résultants en utilisant la diffusion dynamique de la lumière (DLS). Préparer un échantillon de DLS en filtrant 1 mL de si-NPs (0,1 – 1,0 mg/mL) à travers des filtres de seringue de taille de pores de 0,45 μm dans une cuvette carrée de quartz ou de polystyrène. Mesure de la taille des enregistrements et des frais de surface à l’aide d’un instrument DLS selon les spécifications du fabricant.
- Confirmer la taille et la morphologie du si-NPs par analyse d’imagerie à l’aide de la microscopie électronique à transmission (TEM).
- Ajouter 5 μL de solution si-NP à 1 mg/mL aux grilles TEM et incuber pour 60 s. sécher pendant 3 s.
- Ajouter 5 μL de solution d’acétate d’uranyle à 3% et incuber pendant 20 s. sécher pendant 3 s. sécher les grilles pendant la nuit sous dessiccation.
- Grilles d’image selon le protocole établi pour le microscope spécifique à utiliser.
- Caractériser le chargement de siRNA dans le si-NPs à divers ratios N +:P en utilisant le retardement de gel d’d’agarose.
- Pour produire 2% de gel d’d’agarose, ajouter 2 g de poudre d’d’agarose de grade d’électrophorèse à 100 mL de tampon de 1x TAE (tris-acétate-EDTA) à pH 8,0. Remuer pour suspendre l’agarose. La chaleur est découverte au micro-ondes jusqu’à dissolution de tous les d’agarose (1-3 min).
- Une fois refroidi, ajouter 5 μL de bromure d’éthidium (10 mg/mL en H2O) et bien mélanger. Versez l’d’agarose dans un plateau de gel et placez le peigne pour produire des puits, en laissant sécher pendant 30 min. Enlevez délicatement le peigne pour laisser derrière les puits de chargement, et remplissez le plateau de gel à la ligne de remplissage maximum avec 1x tampon TAE.
- Générez des si-NPs (selon la procédure ci-dessus) à 0, 1, 2, 5, 7, 10, 20, et 40 N+:P- ratios. Placer 2 μL d’aliquotes de colorant de chargement (sans SDS et agents réducteurs) sur pellicule de paraffine pour chaque formulation de si-NP. Mélanger 10 μL de solution si-NP avec le colorant de chargement sur le film de paraffine par pipette.
- Ajouter des solutions de teinture si-NP/Loading aux puits de gel d’d’agarose. Exécutez la source de tension à 100 V pour 35 min (ou jusqu’à ce que les échantillons aient parcouru 80% de la longueur du gel).
- Visualisez les bandes de siRNA sur un Transilluminateur UV selon les spécifications du fabricant.
- Confirmer la taille et la morphologie du si-NPs par analyse d’imagerie à l’aide de la microscopie électronique à transmission (TEM).
2. détermination de la bioactivité in vitro du si-NPs
- Renversement du gène modèle luciférase
- Générez la luciférase si-NPs (selon la procédure ci-dessus) en utilisant la luciférase siRNA et les si-NPs brouillés en utilisant une séquence de siRNA brouillée comme un contrôle. Formualte les deux si-NPs à la même finale N+:P- ratio et au rapport optimal identifiés par des études de retardement de gel d’d’agarose. Exemples de séquences de siRNA sont incluses dans la table des matières.
- Cellules exprimant la luciférase des semences [MDA-MB-231/luciférase (BSD) cellules stables] dans 96-puits à parois noires à une densité de 2 000 cellules par puits. Permettre d’adhérer pendant la nuit dans un support complet (DMEM, 10% FBS) dans un incubateur (37 ° c, 5% CO2, 95% d’humidité).
- Diluer le si-NPs dans des milieux sériques complets pour un volume final de 100 μL par puits et une concentration de siRNA de 100 nM. Traitez les cellules pendant 24 h avec le si-NPs.
- Après 24 h, enlever les traitements et remplacer les fluides par des milieux sériques complets contenant 150 μg/mL de D-luciférine. Incuber les cellules pendant 5 min avant de mesurer la luminescence sur un lecteur de plaque ou un système d’imagerie optique in vivo selon les spécifications du fabricant.
- Remplacez les milieux contenant de la luciférine par des milieux sériques frais et pleins et incubez 24 h de plus. Répétez l’étape ci-dessus, en enlevant le support et en le remplaçant par des milieux sériques complets contenant 150 μg/mL de D-luciférine, suivis d’une incubation de 5 min avant de mesurer la luminescence au point de temps de 48 h.
- Pour les études longitudinales, maintenir les cellules dans des conditions stériles tout en mesurant la luminescence. Continuez à la culture dans les médias frais et pleins entre les mesures après avoir remplacé le contenant de luciférine.
NOTE: la concentration de siRNA appropriée variera avec différentes molécules de si-NPs et de siRNA. Lors de l’utilisation de polyplexes à charge neutrale avec un noyau endosomolytique (p. ex. PEG-DB), 100 nM est généralement bien toléré par les cellules et produit > 75% de luciférase knockdown. Le ratio de masse de PEG-DB à siRNA à 10 N+:P- ratio et 100 nm siRNA traitements (en supposant 26 BP sirna) est 23,3, c.-à-d., ajouter 23,3 ng de PEG-DB pour chaque 1,0 ng de siRNA. Par exemple, ajouter 1,16 μL de 3,33 mg/mL de polymère pour 166,5 ng de siRNA pour traiter un puits à 100 nM dans une plaque de 96 puits (100 mL de volume de support par puits).
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Representative Results
Certaines caractéristiques essentielles d’un si-NPs efficace pour la livraison de siRNA in vivo sont la taille appropriée (~ 20 – 200 nm de diamètre), l’emballage de siRNA, et la bioactivité de silençage génique. Bien qu’il ne s’agit pas d’une liste exhaustive (telle que abordée dans la discussion), ces caractéristiques de base devraient être confirmées avant d’envisager d’autres essais d’une formulation.
La figure 2 illustre la caractérisation de la taille du si-NP et de la charge superficielle lors de la formulation. Les DLS et les TEM sont utilisés comme méthodes complémentaires pour observer la taille du si-NP (les deux), la polydispersité (DLS) et la morphologie (TEM). Les mesures DLS montrent que si-NP 1 a un diamètre moyen de 35 nm, une distribution unimodale indiquée par la présence d’un pic unique et une faible polydispersité indiquée par une largeur de crête relativement étroite (figure 2a). Les mesures TEM confirment la mesure de la taille de DLS, suggèrent la présence d’une population uniforme de si-NPs, et révèlent la morphologie sphérique du si-NPs (Figure 2c). Les mesures DLS et TEM du si-NP 2 révèlent qu’il a une taille indésirable (> 200 nm de diamètre) de diamètre moyen 1 500 nm, une population multimodale et polydispersante, et des agrégats en solution, ne formant aucune morphologie particulaire distincte (figure 2b, D ). Les deux si-NPs 1 et 2 affichent une charge de surface neutre, indiquée par des valeurs de potentiel zêta moyenne proche de zéro (Figure 2e).
L’efficacité de chargement de siRNA en si-NPs est caractérisée par un test de retardement de gel d’d’agarose. Le siRNA non complexé migse à travers le gel d’d’agarose et est visualisé (en raison de la liaison du bromure d’éthidium) au fond du gel. Quand le siRNA est complexé avec le polymère pour former le si-NPs, la migration par le gel d’d’agarose est obstruée et le siRNA est visualisé au dessus de gel (ou où il a été chargé dans des puits). Pour le si-NPs basé sur PEG-DB, la complexation augmente avec des ratios n+:P croissants jusqu’à ce que la complexation complète soit obtenue à ~ 10-20 n+:P- ratio (figure 3).
La luciférase est utilisée comme gène modèle pour l’évaluation rapide de la bioactivité du silençage génique du si-NP. Les mesures de bioluminescence par l’intermédiaire d’un lecteur de plaques ou d’un système d’imagerie optique in vivo permettent la quantification rapide et à haut débit de l’expression de la protéine luciférase dans un format bien plat. Cette technique est considérablement plus rapide, moins coûteuse et moins lourde que l’analyse du silençage génique par des analyses moléculaires traditionnelles telles que PCR (expression génique) et Western Blot (expression protéique). Par cette méthode, les cellules exprimant la luciférase sont traitées avec la luciférase Si-NPS et le Si-NPS brouillé (en tant que contrôle), et l’activité de% luciférase est calculée en comparant le signal de luminescence aux cellules non traitées. La luciférase bioactive si-NPs présentera une diminution significative de l’activité de luciférase par rapport directement au contrôle si-NP brouillé, comme on peut le voir pour le si-NP 1 dans la figure 4. En revanche, la luciférase Si-NPS qui ne réduisent pas l’activité de% luciférase par rapport au contrôle brouillé si-NP (tel que si-NP 2) ne sont pas considérées comme bioactives (figure 4). Souvent, 48 h est le temps du silençage génique maximal (figure 4), mais nous avons observé un silençage génique significatif à des points de temps variant de 24 h à 240 h après le traitement.
La figure 1. Chimie des polymères et schéma si-NP. (A) composition chimique du copolymère de dibloc PEG-DB qui compose le Si-NPS et dote la charge de surface neutre (bloc PEG) et le comportement réactif au pH (bloc dB). B) auto-assemblage de Si-NPS. À pH 4,0, le bloc DB est soluble dans l’eau car les amines tertiaires de DMAEMA sont fortement protonées. Le bloc de DB à charge positive complexe électrostatiquement des molécules de siRNA chargées négativement. Le pH est ensuite ajusté à ~ 7,4 par l’addition de 5x pH 8,0 phosphate tampon, ce qui entraîne la "hydrophobization" du bloc de DB et la séquestration de siRNA et DB dans le noyau de si-NPs. veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
La figure 2. Caractérisation DLS et TEM de la taille du si-NP, de la charge superficielle et de la morphologie. (A, C) si-NP 1 représente un échantillon uniforme avec une taille appropriée (~ 50-100 nm de diamètre), tandis que (B, D) si-NP 2 a formé des agrégats indésirables, grands et polydispersés. (E) les deux si-NPS affichent une charge de surface presque neutre (potentiel zêta). Les barres d’erreur représentent une erreur standard. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
La figure 3. Dosage de retardement de gel d’agarose pour évaluer l’efficacité de chargement de siRNA de si-NP. La disparition des bandes de siRNA au fond de gel indique la complexation de siRNA en polymère. Le siRNA complexé en polymère ne peut pas migrer à travers le gel et est donc visualisé au sommet du gel à proximité des puits de chargement. Comme le rapport N+:P est augmenté, la complexation de la siRNA augmente, comme indiqué par une diminution de l’intensité de la bande de siRNA au fond du gel. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
La figure 4. Si-NP-induite par le renversement du gène modèle Luciferase dans les cellules de luciferase MDA-MB-231. Activité de luciférase à (A) 24 h et (B) 48 h après le traitement parleSi-NPS ou la luciférase Si-NPS brouillés à 10 N+:P- ratio et dose de siRNA de 100 nm. % L’activité de luciférase est calculée en divisant le signal de luminescence des échantillons de traitement (brouillés et luciférases) par le signal de luminescence des cellules non traitées. Nota: si-NP 1 représente une formulation efficace avec une bioactivité de silençage génique, alors que si-NP 2 représente une formulation sans bioactivité de silençage génique. (*) indique une différence statistiquement significative (p < 0,05) par rapport au groupe brouillé pour une formulation à un point de temps donné. Les barres d’erreur représentent une erreur standard. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les si-NPs décrits ici sont formés par l’association électrostatique de siRNA anionique et de polymères cationiques en complexes POLYIONS (polyplexes). Le complexage électrostatique du siRNA et du bloc de DB cationique des polymères PEG-DB est facilité par un mélange à faible pH (4,0). À pH 4,0, le DMAEMA est fortement protoné, et par conséquent le bloc de DB est fortement chargé. Cela garantit que les polymères se dissolvent comme unimères en solution par opposition à former des micelles et que DB complexes efficacement avec siRNA. Par la suite, le pH de la solution est ajusté au neutre (pH 7,4), provoquant une «hydrophobization» du bloc de DB, la formation de micelle et le piégeage du siRNA complexé dans le noyau des polyplexes résultants. Ces polyplexes sont conçus de telle sorte que le PEG forme une coquille hydrophile inerte autour du noyau DB/siRNA, ce qui entraîne une charge de surface neutre qui est nécessaire pour l’administration systémique. La chimie des polymères et le processus de formation de Polyplex sont décrits dans la figure 1.
La caractérisation physicochimique rigoureuse du si-NPs est essentielle pour déterminer si les formulations sont appropriées pour passer à des essais biologiques. La taille, la charge superficielle et la forme/morphologie des particules sont autant de paramètres importants qui peuvent avoir un impact sur la performance biologique. Pour la livraison systémique aux tumeurs, la taille du si-NP devrait tomber entre 20 – 200 nm de diamètre22, et les études les plus récentes suggèrent que les particules de diamètre 20 – 50 nm sont idéales23. La charge superficielle doit être neutre ou légèrement négative pour minimiser l’adsorption et l’opsonisation des protéines28. Des études ont étudié le lien entre la forme des particules et la pharmacocinétique/clairance des particules, suggérant des particules avec un rapport d’aspect élevé sont souhaitables sur les particules sphériques29,30,31. Cependant, à ce jour, les particules sphériques sont encore plus couramment employées, et à notre connaissance, sont la seule forme de particule à avoir été traduite en études humaines en oncologie.
Il est important de noter que la formation uniforme et cohérente des polyplexes, comme le si-NPs présenté ici, dépend d’une gamme de paramètres physicochimiques. Nous avons constaté empiriquement que la concentration de Polyplex, le pH de la solution, et le rapport du polymère au siRNA (N+:P- ratio) ont tous un impact radical sur la formation de Polyplex. Dans nos mains, la concentration de siRNA n’a pas un grand impact sur la formation de Polyplex, mais l’utilisation de concentrations de polymères supérieures à 3,33 mg/mL entraîne la formation de grands agrégats et une taille de Polyplex incohérente. Comme ces si-NPs sont sensibles au pH, une variété de problèmes peuvent survenir lorsque le pH final des solutions si-NP est trop acide (< pH 7,2). Deux façons de prévenir ces complications sont de lyophiliser les polymères dans le diH2O pur de sorte qu’il n’y ait pas de sels pour changer la composition du tampon lors de la dissolution et de re-faire des tampons fréquemment pour empêcher la «dérive» du pH tampon au fil du temps. Pour être prudent, le pH des tampons doit être confirmé à chaque fois avant de faire si-NPs, et le pH final des solutions si-NP doit toujours être vérifiée. Enfin, le ratio N+:P du Si-NPS influe sur l’efficacité de chargement des siRNA et les paramètres physicochimiques Polyplex. Il existe généralement un ratio N+:P idéal à partir duquel tous les siRNA sont chargés, mais il n’y a pas de surabondance de polymère non complexé qui forme des populations distinctes de micelles et augmente la cytotoxicité. Pour le si-NPs présenté ici, N+:P- 10-20 est la gamme dans laquelle la consistance et les performances optimales ont été observées.
Les lignées de cellules reporter de luciferase sont utilisées ici pour l’analyse rapide et à haut débit de la bioactivité du si-NP. Les lignées de cellules reporter Luciferase doivent être générées ou achetées avant de commencer l’analyse de la bioactivité, nécessitant ainsi un investissement initial dans le temps et les dépenses. Cependant, l’utilisation des cellules de reporter de luciférase pour évaluer le silençage de gène est plus rapide, plus susceptible à l’analyse à haut débit, et moins cher au fil du temps que l’exécution de RT-PCR (pour mesurer l’expression d’ARNm) ou des taches occidentaux (pour mesurer l’expression de protéine). Par exemple, la mesure de la luminescence dans ce dosage ne prend généralement que quelques minutes, par opposition aux processus de toute la journée ou de plusieurs jours nécessaires à l’exécution de RT-PCR ou de blots occidentaux. En outre, les mesures de luminescence peuvent être effectuées sur des plaques de puits, permettant la quantification simultanée de nombreux échantillons (jusqu’à 96 plaques de puits ont été utilisés par les auteurs). Enfin, D-luciferin est le seul réactif nécessaire au-dessus et au-delà des réactifs de culture cellulaire typiques, rendant la méthode beaucoup plus abordable que RT-PCR ou Western Blot. Il convient toutefois de noter que le dosage de la luciférase de la cellule reporter est limité à l’évaluation du silençage génique du gène modèle luciférase et ne peut pas être utilisé pour mesurer le silençage génique d’autres «gènes thérapeutiques» d’intérêt. Ainsi, les auteurs renvoient les lecteurs à plusieurs études où RT-PCR et/ou Western Blot a été utilisé pour évaluer le silençage génique des gènes thérapeutiques d’intérêt24,32,33,34.
En plus de la bioactivité, les chercheurs devraient idéalement envisager une gamme complète de tests biologiques in vitro pour caractériser les performances du si-NP. Le dosage de la luciférase décrit ci-dessus peut également être utilisé pour évaluer la viabilité des cellules en comparant le signal de luminescence des cellules traitées si-NP brouillées aux cellules non traitées. Étant donné que le siRNA est une séquence de non-ciblage, tout changement de luminescence peut être attribué à l’impact non spécifique du si-NPs sur la viabilité cellulaire, et cet effet dépend généralement de la chimie du polymère et de la quantité molaire. Les techniques de cytométrie en flux et de microscopie fluorescente peuvent être utilisées pour évaluer l’absorption cellulaire de si-NPs à l’aide de siRNAs étiquetés fluorescents, de polymères ou des deux. En outre, les techniques moléculaires telles que la PCR par boucle de tige et l’immunopréprécipitation d’Argonaut 2 peuvent être utilisées pour mesurer précisément les niveaux de siRNA intracellulaires. Puisque siRNA est seulement bioactif si livré au cytosol, où il est chargé dans le RISC, si-NPs doit déclencher l’évasion endosomique du siRNA une fois internalisé par la cellule. Les dosages utilisés pour mesurer expérimentalement l’évasion endosomique comprennent l’analyse de l’hémolyse des globules rouges (décrite en détail par Evans et al.35), l’imagerie fluorescente de la colocalisation de la cargaison de si-NP marquée par fluorescence et le lysotracker36, et plus récemment, l’imagerie fluorescente du recrutement de GALECTINE 8 aux vésicules endosomiques perforées37,38. La collecte de données et la synthèse des résultats d’expériences in vitro pour la viabilité des cellules, l’absorption des cellules, l’évasion endosomique et la bioactivité fournissent au chercheur des informations complémentaires permettant de tirer des interprétations et de recueillir des éléments mécanistiques connaissances sur l’efficacité du si-NP (in).
En somme, les nanoparticules capables de délivrer efficacement des siRNA ont un potentiel énorme pour traiter la maladie. Par exemple, en oncologie, de nombreux gènes qui causent la progression du cancer, la résistance au traitement, et les métastases sont «undruggable» par la pharmacologie conventionnelle, mais pourraient être traités à l’aide de siRNA. Cependant, condition préalable à leur utilisation dans les modèles animaux de la maladie, les nanomédicines de siRNA (appelées ici comme si-NPs) exigent la caractérisation physicochimique et biologique extensive pour assurer à la fois leur sûreté et efficacité. À cette fin, des méthodes ont été décrites dans le présent document pour produire et caractériser le si-NPs in vitro, par lequel le si-NPs peut être évalué pour l’aptitude à reporter vers l’avant dans les études animales.
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Disclosures
Les auteurs ne divulguent aucun conflit d’intérêts potentiel.
Acknowledgments
Les auteurs sont reconnaissants aux Drs Craig Duvall et Rebecca Cook d’avoir accès aux données et aux ressources de laboratoire pour mener cette recherche. Les auteurs sont reconnaissants à l’Institut Vanderbilt pour la science et l’ingénierie nanométrique (VINSE) d’avoir accès aux instruments DLS et TEM (NSF EPS 1004083). Les auteurs sont reconnaissants à la National Science Foundation de soutenir le programme de bourses de recherche des diplômés (NSF # 1445197). Les auteurs sont reconnaissants aux instituts nationaux de la santé pour leur soutien financier (NIH R01 EB019409). Les auteurs sont reconnaissants au ministère de la défense du programme de recherche médicale dirigée par le Congrès pour le soutien financier (DOD CDMRP OR130302).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm pore-size syringe filters | Thermo Fisher Scientific | F25133 | 17 mm diameter, PTFE membrane |
| 0-14 pH test strips | Millipore Sigma | P4786 | |
| 10x TAE buffer | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | AM9869 | |
| 6-7.7 pH test strips | Millipore Sigma | P3536 | |
| 96-well black walled plates | Corning | 3603 | Tissue-culture treated |
| Agarose Powder | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 16500 | |
| Citric acid monohydrate | Millipore Sigma | C1909 | |
| dibasic sodium phosphate dihydrate | Millipore Sigma | 71643 | |
| D-luciferin | Thermo Fisher Scientific | 88294 | Monopotassium Salt |
| DMEM | Gibco | 11995065 | High glucose and pyruvate |
| Ethanol | Millipore Sigma | 459836 | |
| ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 15585011 | |
| FBS | Gibco | 26140079 | |
| loading dye | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | R0611 | |
| Luciferase siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC AAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACU GAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases |
| MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells | GenTarget Inc | SC059-Bsd | Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity |
| monobasic sodium phosphate monohydrate | Millipore Sigma | S9638 | |
| Scarmbled siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUU AUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUAC GCGUA*T* *DNA bases |
| square polystyrene cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | 4.5 mL capacity |
| TEM grids | Ted Pella, Inc. | 1GC50 | PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper |
| Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804 | |
| uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 |
References
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