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Bioengineering

साइटोसोलिक सिरना डिलिवरी के लिए तटस्थ-आवेशित, पीएच-उत्तरदायी पॉलीमेरिक नैनोकणों की तैयारी

Published: May 2, 2019 doi: 10.3791/59549
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Department of Chemical Engineering, University of Mississippi, 2Department of BioMolecular Sciences, University of Mississippi, 3Biomedical Engineering Program, University of Mississippi

Summary

शारीरिक रूप से आवेशित, पीएच-उत्तरदायी सिरना नैनोकणों के भौतिकोरासायनिक गुणों और बायोएक्टिविटी को तैयार करने और उनकी विशेषता बताने की विधियां प्रस्तुत की गई हैं । सफल सरना के लिए मापदंड जैसे आकार, आकारिकी, सतह आवेश, सिरना लोडिंग, और जीन साइलैंसिंग पर चर्चा की जाती है ।

Abstract

एक लक्षित आणविक चिकित्सा के रूप में siRNA की सफलता विकृति विज्ञान के ऊतकों के भीतर कोशिकाओं को अपने कुशल cytosolic प्रसव पर निर्भर है । सिरना के साथ पहले ' undruggable ' यकृत रोग लक्ष्य के इलाज के लिए नैदानिक सफलता हासिल की गई है । हालांकि, कुशल ट्यूमर सरना प्रसव के लिए अतिरिक्त फार्माकोकाटिक डिजाइन विचार करना आवश्यक है, जिसमें लंबे परिसंचरण समय, निकासी अंगों की चोरी (जैसे, यकृत और गुर्दे), और ट्यूमर प्रवेश और प्रतिधारण । यहाँ, हम, विशेष रूप से गैर-यकृत ऊतकों जैसे ट्यूमर के लिए, कुशल सरना प्रसव के लिए अभिकल्पित पॉलीमेरिक नैनोकणों की तैयारी और इन विट्रो फिजिकोकेमिकल/जैविकीय विशेषताओं का वर्णन करते हैं । सिरना नैनोकणों को सिलना और डिब्लॉक कोपॉलीमर पॉली (एथिलीन ग्लाइकोल-बी-(डाइमिथाइलइलिमिनो) एथिल मेथिक्रिलेट-सह-ब्यूटिल मेथैक्रिलेट]) (पीईजी-डीबी) के इलेक्ट्रोस्टेटिक संकुलन द्वारा पॉलीआयन कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए तैयार किया जाता है ( पॉलीप्लेज) जहां सिरना पॉलीप्लेक्स कोर के भीतर तनहा होता है और एक हाइड्रोफिलिक, न्यूट्रिन चार्ज कोरोना के रूप में पेग बनाता है । इसके अलावा, डीबी ब्लॉक endolysosomal मार्ग acidify (< पीएच ६.८) के पुटिकाओं के रूप में झिल्ली-lytic हो जाता है, अंत: सोमीय बच और सिलना के cytosolic वितरण ट्रिगर । इस तरह के आकार, सतह चार्ज, कण आकृति विज्ञान, और sirna लदान के रूप में sirna नैनोकणों की भौतिक विशेषताओं की विशेषता के लिए तरीके वर्णित हैं । सिरना नैनोकणों की जैव सक्रियता को एक तीव्र और उच्च थ्रूपुट जीन सिलैंसिंग परख में एक मॉडल जीन के रूप में luciferase का उपयोग करके मापा जाता है । डिजाइन जो इन प्रारंभिक परीक्षणों के पास (जैसे कि खूंटी-डीबी-आधारित पॉलीप्लेन्स) ट्यूमर या पैथोलॉजी के अन्य साइटों के लिए सिरना की डिलीवरी का आकलन करने के लिए पूर्व नैदानिक पशु अध्ययन करने के लिए अनुवाद के लिए उपयुक्त माना जाता है.

Introduction

क्योंकि सिनास mrna दृश्यों से प्रोटीन के अनुवाद को रोकते हैं, वे सैद्धांतिक रूप से दवा सभी ज्ञात विकृतियों1,2,3,4,5के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । तथापि, दवा में सिरना का उपयोग व्यापक रूप से गरीब sirna अणुओं के फार्माकोकानेटिक प्रोफ़ाइल द्वारा सीमित है6,7. जब नसों में इंजेक्शन, सिरनास तेजी से गुर्दे के माध्यम से मंजूरी दे दी है और/ अपने बड़े आकार और ऋणात्मक आवेश के कारण, सिरना कोशिकाओं में प्रवेश नहीं कर सकता या फिर आरएनए-प्रेरित साइलैंसिंग परिसर (RISC) का उपयोग करने के लिए एंडोलीसोसोमल मार्ग से बच नहीं पाता है जो सायकोसोल10,11,12, १३। इस प्रकार, व्यापक प्रयास ने सरना सुपुर्दगी रणनीतियों के डिजाइन और कार्यान्वयन पर ध्यान केन्द्रितकिया है । यह प्रयास काफी हद तक लिपिड के विकास पर ध्यान केंद्रित किया है-और बहुलक आधारित नैनोकणों जो पैकेज sirna, यह मंजूरी और vivo में गिरावट से बचाने के लिए, और सेलुलर तेज और अंतर्दैहिक एस्केप के माध्यम से शुरू ionizable, धनायनी amine समूह । कई पूर्व नैदानिक सफलताओं की सूचना दी है और सबसे हाल ही में, पहली नैदानिक सफलता नैनोकणों के लिए रिपोर्ट किया गया है आधारित यकृत siRNA प्रसव के लिए वंशानुगत transthyretin-मध्यस्थता (hATTR) amyloidosis के इलाज के लिए15।

कैंसर के कारण कई जीन हैं जो वर्तमान में पारंपरिक फार्माकोलॉजी (यानी, छोटे अणु की दवाओं) द्वारा "अनड्रग्ड" होते हैं, जो16कैंसर के इलाज के लिए पॉलीमेरिक सिरना नैनोकणों (Si-एनपीएस) के डिजाइन को प्रेरित करते हैं । हालांकि, वहां डिजाइन मापदंडों का एक अलग सेट है कि गैर के लिए विचार किया जाना चाहिए-यकृत siRNA वितरण कर रहे हैं । वितरण प्रणाली polyplex जो प्रणालीगत संचलन17,18,19के भीतर समूहन कारणों के धनायनी प्रभारी ढाल चाहिए । ट्यूमर के वितरण के लिए, विशेष रूप से, si-NP स्थिरता लंबे संचलन प्रदान करना और इस तरह बढ़ाया पारगम्यता और प्रतिधारण (epr) प्रभाव के माध्यम से ट्यूमर के भीतर वृद्धि संचय के लिए आवश्यक है20,21. इसके अलावा, सी पर नियंत्रण-NP आकार केवल नैनोकणों के बाद से आवश्यक है लगभग 20-२०० एनएम व्यास आकार का लाभ उठाने EPR22में, और छोटे सी-एनपीएस (~ 20-५० एनएम व्यास) प्रदर्शन में सुधार ट्यूमर प्रवेश पर बड़े आकार नैनोकणों और माइक्रोकणों23।

नसों में प्रशासन के बाद सिरना के प्रणालीगत ट्यूमर प्रसव के लिए इन अतिरिक्त डिजाइन बाधाओं को दूर करने के लिए, तटस्थ-आवेशित, पीएच-उत्तरदायी si-एनपीएस विकसित किया गया है (चित्रा 1)24. ये सी-एनपीएस पेग्यलित है, या सबसे हाल ही में, Zwitterionated25, तटस्थ सतह चार्ज और प्रोटीन अधिशोषण के लिए प्रतिरोध और संचलन में opsonization के लिए । वे केवल धनायनी चरित्र पर intracellular वितरण ड्राइव करने के लिए भरोसा नहीं कर सकते क्योंकि, अत्यंत कुशल endosomal भागने शक्तिशाली जीन को साइलैंसिंग प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । तदनुसार, इन पै-एनपीएस का मुख्य भाग एक अत्यधिक अंतर्सोपायिक क्रोड से बना होता है जो कोशिकाबाह्य पीएच (७.४) में निष्क्रिय होता है, लेकिन जो अंत: सोसोमीय मार्ग की एसिडिफाइड स्थितियों में स्विच-जैसे तरीके से ट्रिगर होता है [पीएच ६.८ (आरंभिक अंतःकाय)-५.० ( लइसोसोम्स)] । अंत में, पै-एनपीएस के क्रोड के भीतर धनायनिक और हाइड्रोफोबिक सामग्री का मिश्रण स्थिरवैद्युत और वान्डर-रवाल्स स्थिरीकरण बल प्रदान करता है, जो मात्र प्रमात्रा प्रणालियों की तुलना में रक्त में पै-एनपीएस की स्थिरता को बेहतर करता है ।

एक अपेक्षाकृत सरल डिजाइन में कई कार्यों के एकीकरण प्रतिवर्ती इसके अलावा का उपयोग कर संभव है-विखंडन श्रृंखला हस्तांतरण (बेड़ा) नियंत्रित बहुलकीकरण जटिल वास्तुकला और सटीक संरचना के साथ पॉलिमर का उत्पादन करने के लिए । तटस्थ सतह प्रभार, पीएच जवाबदेही, और एनपी स्थिरता के साथ एसआई-एनपीएस का उत्पादन करने के लिए, बेड़ा (एथिलीन glycol-b-(dimethylamino) एथिल methacrylate-सह-butyl METHACRYLATE) (पेग-DB) के संश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है । चित्र 1a) । खूंटी-डीबी, एक पेग कोरोना और डीबी/सिरना कोर (चित्र 1बी) के साथ सी-एनपीएस बनाने, सिरना के साथ इलेक्ट्रोटिकली complexed है । खूंटी के रूप में एक अक्रिय, उदासीनतापूर्वक-चार्ज हाइड्रोफिलिक परत पर si-NP कोरोना । डीबी ब्लॉक के एक 50:50 मोलर अनुपात के होते हैं 2-(dimethylamino) एथिल मेथिक्रिलेट (DMAEMA) और butyl methacrylate (BMA). धनायनिक दमामा इलेक्ट्रोस्टैटिकली परिसरों नकारात्मक-आरोप siRNA । BMA स्वयं-NP कोर के भीतर वान डेर Waals बातचीत से एसोसिएट्स, बढ़ती एनपी स्थिरता । DB बहुलक ब्लॉक करने के लिए एक साथ, DMAEMA और BMA पीएच पर निर्भर लिपिड बिलेयर-lytic व्यवहार प्रदान करते हैं । Extracellular पीएच पर, DB ब्लॉक si-NP कोर करने के लिए तनहा है और लिपिड bilayers के लिए निष्क्रिय है । अम्लीय परिस्थितियों में, जैसे कि एंडोसोसोमल पथ के भीतर, डीबी ब्लॉक के भीतर ionizable dmaema प्रोटन स्पंज प्रभाव, जहां endosomal बफरिंग परासरणी सूजन और टूटना करने के लिए सुराग की सुविधा26। इसके अतिरिक्त, डीबी ब्लॉक के भीतर जलविरागी bma moieties में सक्रिय रूप से और lyse लिपिड bilayers, शक्तिशाली endosomolysis में जिसके परिणामस्वरूप एकीकृत । इस प्रकार, सिरना में सी-एनपीएस बनाने के लिए खूंटी-डीबी का निर्माण किया जाता है जो कि न्यूली-आवेशित तथा निष्कर्षी पीएच पर अत्यधिक स्थिर होता है, लेकिन जो अम्लीय पीएच पर लिपिड बियर्स को बाधित करता है, जिससे सरना पेलोड का कोशिकाद्रव्य वितरण सुनिश्चित होता है ।

इसके साथ-साथ, खूंटी-डीबी से सी-एनपीएस का निर्माण करने के लिए प्रायोगिक प्रक्रियाएं वर्णित हैं । (क) में दिया गया है और इस पर विचार किया जाता है । आदेश में तेजी से si-एनपी bioactivity का आकलन करने के लिए, luciferase पछाडडाउन अध्ययन के लिए एक मॉडल जीन के रूप में प्रयोग किया जाता है. जुगनू Luciferase27जुगनू की ' चमक ' के लिए जिंमेदार प्रोटीन है । तदनुसार, स्तनधारी कोशिकाओं जुगनू luciferase जीन के साथ transfected एक बायोल्युमिनेसेंट ' चमक ' कि luciferase अभिव्यक्ति के स्तर की मात्रा करने के लिए एक luminometer का उपयोग कर कब्जा किया जा सकता का उत्पादन । यहाँ, हम सिल्यूफेरेज का उपयोग सी-एनपीएस के जैवसक्रियता का आकलन लूसीफेरेज के विरुद्ध सिरना को प्रदान करके और ल्यूसिफेरेज-व्यक्त कोशिकाओं में जैव-संदीप्ति में तदनुरूपी कमी की मात्रा का आंकलन करने के लिए करते हैं जो कि एक तले हुए सिरना प्राप्त करते हैं ।

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Protocol

1. si-एनपीएस की तैयारी और लक्षण वर्णन

  1. एसआई-एनपी तैयारी
    1. बहुलक 10 मिमी सिट्रिक एसिड बफर (पीएच ४.०) में ३.३३ मिलीग्राम/एमएल में भंग । बहुलक पहले विघटन सुनिश्चित करने के लिए इथेनॉल में 10x एकाग्रता में भंग किया जा सकता है ।
      नोट: बहुलक कम सांद्रता में भंग किया जा सकता है, लेकिन ३.३३ मिलीग्राम/एमएल से ऊपर सांद्रता पर उपयोग समरूप एनपी गठन को रोकने कर सकते हैं ।
    2. (५० μM डीह2ओ में) जोड़ें N+:P- अनुपात में परिणाम के लिए 10 । पॉलिमर और सिरना समाधान अच्छी तरह से pipetting और चलो 30 मिनट के लिए इंक्यूबेट द्वारा मिक्स । N+:P- अनुपात बहुलक पर सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए amine समूहों की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है जो सिरना पर नकारात्मक आवेशित फॉस्फेट समूहों की संख्या है और नीचे दिए गए सूत्र द्वारा परिकलित किया जाता है:
      Equation
      जहां, mol Pol बहुलक की मोलर राशि है, आरयू amine के प्रति बहुलक सकारात्मक-आवेशित अमीनों की दोहराने इकाइयों की संख्या है, mol siRNA सिरना की मोलर राशि है, और बीपी सरना आधार जोड़ों की संख्या प्रति सिरना अणु है ।
    3. 10 मिमी फॉस्फेट बफर की एक 5 गुना अतिरिक्त जोड़ें (पीएच ८.०) और धीरे से या तो मिश्रण pipetting या ट्यूब उलटा । पुष्टि करने के लिए कि अंतिम पीएच तटस्थ है (~ 7.2-7.5), पिपेट सी के 10 μl-पीएच परीक्षण स्ट्रिप्स पर NP समाधान ।
      नोट: साइट्रिक एसिड और फॉस्फेट बफ़र्स मिलीपोर सिग्मा बफर संदर्भ केंद्र चार्ट के अनुसार तैयार कर रहे हैं ।
  2. एसआई-एनपीएस के भौतिकोसायनिक लक्षण वर्णन
  3. गतिशील प्रकाश बिखरने (DLS) का उपयोग कर एसआई-एनपीएस परिणामस्वरूप के आकार और सतह चार्ज रिकॉर्ड । एक DLS नमूना तैयार si-एनपीएस के 1 मिलीलीटर (०.१-१.० मिलीग्राम/एमएल) के माध्यम से ०.४५ μm पोर-आकार सिरिंज फिल्टर एक वर्ग क्वार्ट्ज या पॉलीस्टाइरीन cuvette में । निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार एक DLS साधन का उपयोग कर रिकॉर्ड आकार और सतह चार्ज माप ।
    1. पारेषण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) का उपयोग करके इमेजिंग विश्लेषण द्वारा पै-एनपीएस के आकार और आकारिकी की पुष्टि करें ।
      1. 1 मिलीग्राम/एमएल पर 5 μL si-NP समाधान TEM ग्रिड के लिए और ६० एस के लिए सेते जोड़ें 3 एस के लिए सूखा ।
      2. 3 एस के लिए 5 μl जोड़ें यूरेनिल एसीटेट समाधान और 20 एस के लिए इंक्यूबेट शुष्क ग्रिड सुखाना के तहत रात भर के लिए सूखी ।
      3. विशिष्ट माइक्रोस्कोप के लिए स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार छवि ग्रिड के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
    2. एगारोस जेल मंदन का उपयोग करते हुए विभिन्न एन+:P- अनुपात में एसआई-एनपीएस में सरना के लदान की विशेषता ।
      1. 2% एगेरोस जेल का उत्पादन करने के लिए, पीएच ८.० में 1x TAE (Tris-एसीटेट-EDTA) बफर के १०० मिलीलीटर में 2 ग्राम इलेक्ट्रोफोरेसिस ग्रेड एगारोस पाउडर जोड़ें । को निलंबित agarose हलचल । माइक्रोवेव में खुला गर्मी जब तक सभी agarose (1-3 मिनट) भंग कर दिया है ।
      2. एक बार ठंडा होने के बाद इसमें 5 μL एथिडियम ब्रोमाइड (10 मिलीग्राम/एमएल एच2ओ) डालें और अच्छी तरह मिलाएं । एक जेल ट्रे और जगह कंघी में डालो करने के लिए कुओं का उत्पादन, 30 मिनट के लिए सूखी दे । ध्यान से कंघी हटाने के लिए कुओं लोडिंग के पीछे छोड़, और 1x TAE बफर के साथ अधिकतम भरने लाइन को जेल ट्रे भरें ।
      3. पै-एनपीएस (ऊपर की प्रक्रिया के अनुसार) 0, 1, 2, 5, 7, 10, 20, और ४० N+:P- अनुपात में जनरेट करें । प्रत्येक पै-NP सूत्रीकरण के लिए पैराफिन फिल्म पर 2 μL लोडिंग डाई (कोई एसडीएस और एजेंट को कम करने) के aliquots प्लेस । Pipette द्वारा पैराफिन फिल्म पर लोडिंग डाई के साथ एसआई-एनपी समाधान के 10 μL मिश्रण ।
      4. एगारोज़ जेल कुओं में पै-एनपी/लोडिंग डाई समाधान जोड़ें । ३५ मिनट के लिए १०० V पर वोल्टेज स्रोत भागो (या जब तक नमूनों जेल की लंबाई के ८०% तय है) ।
      5. निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार एक यूवी transilluminator पर सिरना बैंड कल्पना ।

2. पै-एनपीएस के विट्रो बायोएक्टिविटी का निर्धारण

  1. द मॉडल जीन लूलुफ़ेरेस का पछाडडाउन
    1. लूसिफेरेज सी-एनपीएस (ऊपर की प्रक्रिया के अनुसार) उत्पन्न करें लूसीफेरेज सिरना और तले हुए पै-NPs का उपयोग करके एक नियंत्रण के रूप में तले हुए सिरना अनुक्रम का उपयोग करते हुए. एक ही अंतिम एन+:P- अनुपात में और एगरोस जेल मंदन अध्ययनों द्वारा पहचाने गए इष्टतम अनुपात में दोनों एसआई-एनपीएस के formualte । उदाहरण siRNA दृश्यों सामग्री की तालिकामें शामिल हैं ।
    2. बीज luciferase-व्यक्त कोशिकाओं [एमडीए-एमबी-231/Luciferase (बीएसडी) स्थिर कोशिकाओं] ९६ में अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से २,००० कोशिकाओं के घनत्व पर काले दीवारों प्लेटों । एक इनक्यूबेटर (३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2, ९५% आर्द्रता) में पूर्ण मीडिया (dmem, 10% fbs) में रातोंरात पालन करने की अनुमति दें ।
    3. तनु सी-एनपीएस को १०० μL प्रति कूप और सिरना सांद्रण १०० एनएम की अंतिम मात्रा के लिए पूर्ण सीरम मीडिया में । 24 ज के लिए पै-एनपीएस के साथ कोशिकाओं का उपचार करें ।
    4. 24 घंटे के बाद, उपचार को हटाने और पूर्ण सीरम मीडिया के साथ १५० μg/एमएल डी-luciferin युक्त मीडिया की जगह । एक थाली रीडर पर या विवो ऑप्टिकल इमेजिंग प्रणाली में निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार संदीप्ति को मापने से पहले 5 मिनट के लिए सेक्यूबेट कोशिकाओं ।
    5. ताजा, पूर्ण सीरम मीडिया के साथ luciferin युक्त मीडिया की जगह, और 24 घंटे अधिक सेबेट. ऊपर दिए गए चरण को दोहराएं, मीडिया को हटाने और पूर्ण सीरम मीडिया के साथ की जगह १५० μg/एमएल डी-luciferin, एक 5 मिनट ऊष्मायन द्वारा पीछा किया ४८ एच timepoint पर संदीप्ति को मापने से पहले ।
    6. अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए, शर्तों के तहत कोशिकाओं को बनाए रखने के संदीप्ति को मापने । नए में संस्कृति के लिए जारी रखें, पूर्ण मीडिया माप के बीच luciferin-युक्त की जगह के बाद.
      नोट: विभिंन si-एनपीएस और सिरना अणुओं के साथ उपयुक्त सिरना एकाग्रता अलग-अलग होगी । जब एक endosomolytic कोर (जैसे, खूंटी-DB), १०० एनएम आम तौर पर अच्छी तरह से सहन की कोशिकाओं द्वारा बर्दाश्त की जाती है और > 75% luciferase knockdown का उत्पादन के साथ तटस्थ-चार्ज polyplexes का उपयोग । खूंटी-डीबी का जन अनुपात 10 छ+:P- अनुपात और १०० एनएम सरना उपचार (26 बीपी सरना मानते हुए) २३.३ है, अर्थात् सरना के प्रत्येक १.० एनजी के लिए पीईजी-डीबी के २३.३ एनजी को जोड़ दिया गया है । उदाहरण के लिए, एक ९६-कूप प्लेट (१०० एमएल मीडिया वॉल्यूम प्रति कूप) में १०० एनएम पर एक अच्छी तरह से इलाज करने के लिए ३.३३ मिलीग्राम/एमएल पॉली१६६.५ मर के १.१६ μl को जोड़ना ।

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Representative Results

वीवो सिरना डिलिवरी के लिए प्रभावी सी-एनपीएस की कुछ आवश्यक विशेषताएं उचित आकार (~ 20 – २०० एनएम व्यास), सिरना पैकेजिंग और जीन साइटिंग बायोएक्टिविटी हैं । हालांकि यह एक विस्तृत सूची (के रूप में चर्चा में संबोधित नहीं है), इन बुनियादी विशेषताओं की पुष्टि की जानी चाहिए एक सूत्रीकरण के आगे परीक्षण पर विचार करने से पहले ।

चित्रा 2 सी के लक्षण वर्णन-एनपी आकार और तैयार करने पर सतह प्रभारी दिखाता है । DLS और TEM के रूप में उपयोग किया जाता है पूरक तरीकों के निरीक्षण के लिए si-NP आकार (दोनों), polydispersity (DLS), और आकारिकी (TEM) । DLS माप पता चलता है कि si-NP 1 ३५ एनएम का एक औसत व्यास, unimodal वितरण एक चोटी की उपस्थिति द्वारा संकेत दिया है, और कम एक अपेक्षाकृत संकीर्ण पीक चौड़ाई द्वारा संकेत polydispersity (चित्रा 2a) । टीईएम मापन, DLS से आकार मापन की पुष्टि करते हैं, si-एनपीएस की एक समान जनसंख्या की उपस्थिति का सुझाव देते हैं, और si-एनपीएस के गोलाकार आकारिकी को प्रकट करते हैं (चित्र 2c) । Dls और एसआई की tem माप-NP 2 पता चलता है कि यह अवांछनीय आकार (> 200 एनएम व्यास) औसत व्यास १,५०० एनएम, एक मल्टीमॉडल और polydisperse आबादी है, और समाधान में समुच्चय, कोई विशिष्ट कण आकारिकी बनाने (चित्रा 2b, डी ). दोनों पै-NPs 1 और 2 प्रदर्शन तटस्थ सतह चार्ज, के द्वारा संकेत पास-शूंय माध्य जीटा संभावित मूल्यों (चित्र 2E) ।

एसआई-एनपीएस में सरना की लोडिंग क्षमता एक agarose जेल मंदन परख का उपयोग कर की विशेषता है । संयुक्त राष्ट्र-complexed सिरना एगरोज़ जेल के माध्यम से migrates और (एथिडियम ब्रोमाइड के बंधन के कारण) जेल के नीचे में कल्पना है । जब सिरना को पै-एनपीएस बनाने के लिए बहुलक के साथ संकुलीकृत किया जाता है, तो आगरोस जेल के माध्यम से प्रवासन बाधित होता है और सिरना जेल शीर्ष (या जहां इसे कुओं में लोड किया गया था) में कल्पना की जाती है । पेग-डीबी-आधारित पै-NPs के लिए, 10-20-2 के अनुपातमें:P वृद्धि के साथ संकुलन बढ़ जाती है जब तक की पूर्ण संकुलन प्राप्त की है ~ पर(चित्रा3)n+:P

Luciferase एसआई के तेजी से मूल्यांकन के लिए एक मॉडल जीन के रूप में प्रयोग किया जाता है-एनपी जीन मुंह बंद bioactivity. एक थाली रीडर या vivo ऑप्टिकल इमेजिंग प्रणाली में के माध्यम से bioluminescence माप तेजी से, अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में luciferase प्रोटीन अभिव्यक्ति के उच्च throughput प्रमात्रीकरण के लिए अनुमति देते हैं । यह तकनीक काफी तेजी से, सस्ती है, और पारंपरिक आणविक विश्लेषण जैसे पीसीआर (जीन एक्सप्रेशन) और वेस्टर्न ब्लॉट (प्रोटीन एक्सप्रेशन) के माध्यम से जीन साइलैंसिंग का विश्लेषण करने से कम बोझिल है । इस विधि के द्वारा, ल्यूसीफेरेज-व्यक्त कोशिकाओं को ल्यूसिफेरेज सी-एनपीएस के साथ उपचारित किया जाता है और (एक नियंत्रण के रूप में) सील्यूफेरेज गतिविधि का अनुपचारित किया जाता है । Bioactive luciferase सी-एनपीएस काफी कम% luciferase गतिविधि प्रदर्शन करेंगे जब सीधे तुलना में si-np नियंत्रण तले हुए करने के लिए, के रूप में si-1 चित्र 4में एनपी के लिए देखा जा सकता है । इसके विपरीत, luciferase सी-NPs कि% luciferase गतिविधि कम नहीं है की तुलना में तले हुए si-np नियंत्रण (जैसे पै-np 2) बायोएक्टिव नहीं माना जाता है (चित्रा 4). प्रायः ४८ ज अधिकतम जीन साइलैंसिंग का समय होता है (चित्र 4), लेकिन हमने 24 घंटे से लेकर २४० एच तक के बाद के समय बिंदुओं पर महत्वपूर्ण जीन साइलैंसिंग का अवलोकन किया है ।

Figure 1
चित्रा 1 । बहुलक रसायन विज्ञान और एसआई-एनपी योजनाबद्ध । (क) पीईजी-डीबी डिब्लॉक कोपोलीमर की रासायनिक संरचना जो सी-एनपीएस का गठन करता है और तटस्थ सतही आवेश (पीईजी ब्लॉक) और पीएच-उत्तरदायी व्यवहार (डीबी ब्लॉक) का रूप ले रहा है । (ख) एसआई-एनपीएस का स्व-विधान । पीएच ४.० पर, DB ब्लॉक पानी में घुलनशील है क्योंकि dmaema तृतीयक ऐमीन अत्यधिक protonated हैं । धनात्मक-आवेशित DB ब्लॉक इलेक्ट्रोस्टैटिकली कॉम्प्लेक्स ऋणात्मक रूप से-सिरना अणुओं का आरोप लगाया । पीएच तो 5x पीएच ८.० फॉस्फेट बफर के अलावा द्वारा ~ ७.४ करने के लिए समायोजित किया जाता है, डीबी ब्लॉक और एसआई के कोर के भीतर सिरना और DB के ज़ब्ती के "हाइड्रोफोबिलाइजेशन" में जिसके परिणामस्वरूप । कृपया इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 । डीएलएस और टीईएम सी-एनपी आकार, भूतल प्रभार, और morphology के लक्षण वर्णन । (क, ग) पै-एनपी 1 उपयुक्त आकार (~ 50-100 एनएम व्यास) के साथ एक समान प्रतिदर्श का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि (ख, घ) पै-एनपी 2 ने अवांछनीय, बड़े और पॉलीफैलाने वाले समुच्चय का गठन किया है । (ङ) दोनों सी-एनपीएस लगभग तटस्थ सतही आवेश (जीटा विभव) प्रदशत करते हैं । त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 । एगारोस जेल मंदन परख si-एनपी siRNA लोड हो रहा है दक्षता का आकलन करने के लिए । जेल के नीचे स्थित सिरना बैंड के गायब होने से सिन्ना का पॉलीमर में संकुलन होने का संकेत मिलता है । बहुलक-complexed सिरना जेल के माध्यम से स्थानांतरित करने में असमर्थ है और इस प्रकार लोडिंग कुओं के पास जेल के शीर्ष पर कल्पना है । के रूप में एन+:P- अनुपात बढ़ जाती है, सिरना संकुलन बढ़ जाती है, के रूप में जेल के नीचे में सिरना बैंड की कमी हुई तीव्रता से संकेत दिया. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 । Si-एनपी-mediated मॉडल जीन Luciferase के लूसीफेरेज एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं में गिरा दिया । (क) 24 ज और (ख) ४८---------------------------- ----------------------------10 १००:P छ % Luciferase गतिविधि उपचार नमूनों (तले हुए और luciferase) के संदीप्ति संकेत विभाजित द्वारा अनुपचारित कोशिकाओं के संदीप्ति संकेत द्वारा की गणना की है. ध्यान दें: si-NP 1 जीन सिलैसिंग बायोएक्टिविटी के साथ एक प्रभावी सूत्रण का प्रतिनिधित्व करता है (*) एक निश्चित समय बिंदु पर एक सूत्रीकरण के लिए तले हुए समूह की तुलना में (पी < ०.०५) एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर इंगित करता है । त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां वर्णित एसआई-एनपीएस का संबंध इलेक्ट्रोस्टेटिक एसोसिएशन ऑफ एनीमोनिक सिरना और धनायनी पॉलीमर्स में पॉलीआयन कॉम्प्लेक्स (पॉलीप्लेज) से होता है । स्थिरवैद्युत संकुलन सिरना और खूंटी-डीबी पॉलीमर्स के धनायनी DB ब्लॉक को कम पीएच (४.०) में मिलाने से सुविधा होती है । पीएच ४.०, DMAEMA अत्यधिक protonated है, और फलस्वरूप DB ब्लॉक उच्च चार्ज किया जाता है । इससे यह सुनिश्चित होता है कि बहुलक विलयन में अननुकारी के रूप में विलीन हो जाते हैं, जैसे-माइक्रोसेल बनाने के लिए और जो कि DB परिसरों को सिरना से कुशलतापूर्वक बनाते हैं । बाद में, समाधान के पीएच को तटस्थ (पीएच ७.४) को समायोजित किया जाता है, जिससे DB ब्लॉक, मिसेल गठन के ' हाइड्रोफोबाइजेशन ', और परिणामस्वरूप पॉलीप्लेनों के कोर के भीतर complexed sirna के फंसाने । इन पॉलीप्लेनों को ऐसे डिज़ाइन किया गया है कि खूंटी/सिरना कोर के चारों ओर एक हाइड्रोफिलिक, अक्रिय कवच, तटस्थ सतह आवेश में जिसके परिणामस्वरूप, प्रणालीगत प्रशासन के लिए आवश्यक है । बहुलक रसायन और पॉलीप्लेक्स गठन की प्रक्रिया चित्रा 1में उल्लिखित हैं ।

यह निर्धारित करने के लिए कि क्या फार्मूलेशन जैविक परीक्षण में जाने के लिए उपयुक्त हैं, एसआई-एनपीएस का कठोर भौतिकोसायनिक लक्षण-वर्णन आवश्यक है । आकार, भूतल प्रभार, और कण आकृति/आकारिकी सभी महत्वपूर्ण मापदंडों है कि जैविक प्रदर्शन को प्रभावित कर सकते हैं । ट्यूमर के लिए प्रणालीगत प्रसव के लिए, si-NP आकार 20 – २०० एनएम व्यास22के बीच गिर जाना चाहिए, और सबसे हाल के अध्ययनों से सुझाव 20 – ५० एनएम व्यास कणों23आदर्श होते हैं । प्रोटीन अधिशोषण और ओसोराइजेशन28को कम करने के लिए भूतल आवेश तटस्थ या थोड़ा नकारात्मक होना चाहिए । अध्ययन कण आकार और फार्माकोकाइनेटिक्स/कण निकासी के बीच संबंध की जांच की है, उच्च पहलू अनुपात के साथ कणों का सुझाव गोलाकार कणों29,30,31से अधिक वांछनीय हैं । हालांकि, तारीख करने के लिए गोलाकार कणों अभी भी सबसे अधिक कार्यरत हैं, और हमारे ज्ञान के लिए, कैंसर विज्ञान में मानव अध्ययन करने के लिए अनुवाद किया गया है करने के लिए ही कण आकार रहे हैं ।

यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि पॉलीप्लेनों का एकसमान और सुसंगत निर्माण, जैसे कि यहाँ प्रस्तुत si-एनपीएस, भौतिकोरासायनिक मापदंडों की एक श्रेणी पर निर्भर करता है । हम अनुभवकीय पाया है कि polyplex एकाग्रता, समाधान के पीएच, और बहुलक का अनुपात (N+:P- अनुपात) सभी काफी polyplex गठन प्रभाव । हमारे हाथ में, siRNA एकाग्रता polyplex गठन पर एक बड़ा प्रभाव नहीं है, लेकिन ३.३३ मिलीग्राम/बड़े समुच्चय और असंगत polyplex आकार के गठन में एमएल परिणाम से अधिक में बहुलक सांद्रता का उपयोग. चूंकि ये si-एनपीएस पीएच-उत्तरदायी हैं, इसलिए कई प्रकार की समस्याएं उत्पन्न हो सकती हैं जब पै-NP समाधानों के अंतिम पीएच भी अम्लीय (< pH ७.२) है । दो तरीके से इन जटिलताओं को रोकने के लिए कर रहे है lyophilize पॉलिमर शुद्ध डीह में2ओ इतना है कि वहां कोई लवण को भंग करने पर बफर संरचना बदलने के लिए और फिर से समय के साथ बफर पीएच के "बहती" को रोकने के लिए बार-बार बफ़र्स बनाने के लिए कर रहे हैं । सावधान रहने के लिए, बफ़र्स के पीएच सी-एनपीएस बनाने से पहले हर बार पुष्टि की जानी चाहिए, और एसआई के अंतिम पीएच-एनपी समाधान हमेशा सत्यापित किया जाना चाहिए । अंत में, पै-एनपीएस का एन+:P- अनुपात, सिरना लोडिंग एफिशिएंसी और पॉलीप्लेक्स फिजिकोकेमिकल पैरामीटर पर प्रभाव डालता है । वहां आम तौर पर एक आदर्श एन+:P- अनुपात है जिस पर सभी sirna भरी हुई है, लेकिन वहां संयुक्त राष्ट्र के एक अधिकता-complexed बहुलक जो मिसेल और बढ़ cytotoxicity की अलग आबादी रूपों नहीं है । यहां प्रस्तुत एसआई-एनपीएस के लिए, N+:P- 10-20 वह रेंज है जिसमें इष्टतम संगति और प्रदर्शन देखा गया है ।

Luciferase रिपोर्टर सेल लाइनों के लिए यहाँ उपयोग किया जाता है तीव्र और उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण si-एनपी bioactivity. Luciferase रिपोर्टर सेल लाइनों उत्पन्न या bioactivity विश्लेषण शुरू करने से पहले खरीदा जाना चाहिए, इस प्रकार समय और खर्च में एक प्रारंभिक निवेश की आवश्यकता. हालांकि, के लिए luciferase रिपोर्टर कोशिकाओं का उपयोग जीन चुप्पी का आकलन करने के लिए तेजी से है, अधिक उच्च थ्रूपुट विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी, और समय पर आरटी-पीसीआर प्रदर्शन (mrna अभिव्यक्ति को मापने के लिए) या पश्चिमी blots (प्रोटीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए) से अधिक सस्ता. उदाहरण के लिए, इस परख में संदीप्ति मापने आम तौर पर बस कुछ ही मिनट लगते है के रूप में सभी दिन या बहु के विरोध में दिन के लिए आरटी-पीसीआर या पश्चिमी blots प्रदर्शन आवश्यक प्रक्रियाओं । इसके अलावा, संदीप्ति माप अच्छी प्लेटों पर आयोजित किया जा सकता है, कई नमूनों की एक साथ प्रमात्रीकरण के लिए अनुमति (अप करने के लिए ९६-अच्छी तरह से प्लेटें लेखकों द्वारा इस्तेमाल किया गया है). अंत में, डी-luciferin केवल ऊपर और ठेठ सेल संस्कृति अभिकर्मकों से परे की जरूरत अभिकर्मक है, विधि बनाने आरटी से अधिक किफायती-पीसीआर या वेस्टर्न ब्लॉट । यह हालांकि ध्यान दिया जाना चाहिए, कि luciferase रिपोर्टर सेल परख केवल जीन मॉडल जीन luciferase के मुंह बंद का आकलन करने के लिए सीमित है और ब्याज की अंय "चिकित्सकीय जीन" के जीन मुंह बंद को मापने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है । इस प्रकार, लेखकों कई अध्ययनों के लिए पाठकों का उल्लेख है जहां आरटी-पीसीआर और/या पश्चिमी ब्लॉट ब्याज24,३२,३३,३४के चिकित्सकीय जीन के जीन मुंह बंद का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।

Bioactivity के अलावा, शोधकर्ताओं आदर्श में एक व्यापक सरगम पर विचार करना चाहिए के लिए si-NP प्रदर्शन की विशेषता में विट्रो जैविक परीक्षण । Luciferase परख भी अनुपचारित si-एनपी इलाज कोशिकाओं को उपचार कोशिकाओं के संदीप्ति संकेत की तुलना करके सेल व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ऊपर वर्णित है । चूंकि सिरना एक गैर-लक्ष्यीकरण अनुक्रम है, इसलिए संदीप्ति में किसी भी परिवर्तन को सेल व्यवहार्यता पर si-एनपीएस के गैर-विशिष्ट प्रभाव के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, और यह प्रभाव आमतौर पर बहुलक रसायन और मोलर राशि पर निर्भर करता है । फ्लो साइटोमेट्री और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी में तकनीक का उपयोग फ्लूरेस्बेलेबल सिरन, पॉलिमर, या दोनों का उपयोग करते हुए पै-एनपीएस के सेल अपले का आकलन करने के लिए किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, आण्विक तकनीकों जैसे स्टेम लूप पीसीआर और अर्गोनाउट 2 immunoprecipitation ठीक intracellular सिरना स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । चूंकि सिन्ना केवल बायोएक्टिव है अगर cytosol, जहां यह risc में भरी हुई है के लिए दिया, si-एनपीएस sirna के endosomal भागने ट्रिगर एक बार सेल द्वारा भली भांति चाहिए । Assays हैं३६, प्रायोगिक रूप से किया जाता है अंत: सोमल एस्केप लाल रक्त कोशिका hemolysis परख शामिल है (द्वारा विस्तार से वर्णित इवांस एट अल.३५ हाल ही में, galectin 8 की पंचर endosomal पुटिकाओं३७,३८भर्ती के फ्लोरोसेंट इमेजिंग । डेटा एकत्र करने और सेल व्यवहार्यता के लिए इन विट्रो प्रयोगों से परिणाम synthesizing, सेल तेज, अंत: सोमीय भागने, और bioactivity जानकारी के शोधकर्ता पूरक टुकड़े जो से व्याख्याओं आकर्षित करने के लिए और यांत्रिक जुटाने के लिए प्रदान सी के बारे में अंतर्दृष्टि-एनपी (में) प्रभावशीलता ।

संक्षेप में, नैनोकणों को कुशलता से देने में सक्षम है, जिसमें बीमारी का इलाज करने की जबरदस्त क्षमता है । उदाहरण के लिए, ऑन्कोलॉजी में, कई जीन है कि कैंसर में प्रगति का कारण, चिकित्सा के लिए प्रतिरोध, और मेटास्टेसिस पारंपरिक औषध विज्ञान द्वारा ' undruggable ' हैं, लेकिन सिरना का उपयोग कर इलाज किया जा सकता है. तथापि, रोग के पशु मॉडलों में उनके उपयोग के लिए शर्त, सिरना नैनोडाइबाइन (एसआई-एनपीएस के रूप में यहां संदर्भित) में उनकी सुरक्षा और प्रभावशीलता दोनों को सुनिश्चित करने के लिए व्यापक भौतिक रासायनिक और जैविक लक्षण-वर्णन की आवश्यकता होती है । इस उद्देश्य के लिए, इन विट्रो में सी-एनपीएस का उत्पादन करने और उसकी विशेषताएँ बताने के लिए पद्धतियों का उल्लेख किया गया है, जिसके द्वारा एसआई-एनपीएस को पशु अध्ययन में आगे ले जाने के लिए उपयुक्तता के लिए आंका जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों ब्याज की कोई संभावित संघर्ष का खुलासा ।

Acknowledgments

लेखक डीआरएस के आभारी हैं । क्रेग Duvall और रेबेका इस अनुसंधान के संचालन के लिए डेटा और प्रयोगशाला संसाधनों तक पहुंच के लिए कुक । लेखक Nanoscale विज्ञान और इंजीनियरिंग के लिए Vanderbilt संस्थान (VINSE) के लिए आभारी है DLS और TEM (NSF EPS १००४०८३) उपकरणों के लिए उपयोग । लेखकों स्नातक अनुसंधान फैलोशिप कार्यक्रम (NSF # 1445197) का समर्थन करने के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन के लिए आभारी हैं । लेखक वित्तीय सहायता (NIH R01 EB019409) के लिए स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के लिए आभारी हैं । लेखक रक्षा विभाग के लिए आभारी है कांग्रेसवादी वित्तीय सहायता (DOD CDMRP OR130302) के लिए चिकित्सा अनुसंधान कार्यक्रम का निर्देशन किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm pore-size syringe filters Thermo Fisher Scientific F25133 17 mm diameter, PTFE membrane
0-14 pH test strips Millipore Sigma P4786
10x TAE buffer Thermo Fisher Scientific/Invitrogen AM9869
6-7.7 pH test strips Millipore Sigma P3536
96-well black walled plates Corning 3603 Tissue-culture treated
Agarose Powder Thermo Fisher Scientific/Invitrogen 16500
Citric acid monohydrate Millipore Sigma C1909
dibasic sodium phosphate dihydrate Millipore Sigma 71643
D-luciferin Thermo Fisher Scientific 88294 Monopotassium Salt
DMEM Gibco 11995065 High glucose and pyruvate
Ethanol Millipore Sigma 459836
ethidium bromide Thermo Fisher Scientific/Invitrogen 15585011
FBS Gibco 26140079
loading dye Thermo Fisher Scientific/Invitrogen R0611
Luciferase siRNA IDT N/A Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC
AAUUGUU
Sense Strand Sequense: CAAUUGCACU
GAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases
MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells GenTarget Inc SC059-Bsd Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity
monobasic sodium phosphate monohydrate Millipore Sigma S9638
Scarmbled siRNA IDT N/A Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUU
AUACGCGAUUAACGAC
Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUAC
GCGUA*T* *DNA bases
square polystyrene cuvettes Fisher Scientific 14-955-129 4.5 mL capacity
TEM grids Ted Pella, Inc. 1GC50 PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper
Trisodium citrate dihydrate Millipore Sigma S1804
uranyl acetate Polysciences, Inc. 21447-25

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Bioengineering मुद्दा १४७ आरएनए हस्तक्षेप अंत: सोमीय एस्केप Endosomolysis पीएच उत्तरदायी नैनो बहुलक नैनोकणों जैव चिकित्सा इंजीनियरिंग दवा वितरण कैंसर
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