Summary
Представлены методы подготовки и характеристики физико-химических свойств и биоактивности нейтрали-заряженных, рН-отзывчивых наночастиц СиРНА. Обсуждаются критерии успешного, например, размер, морфология, поверхностная зарядка, нагрузка на иРНК и глушителей генов.
Abstract
Успех СиРНА как целевой молекулярной медицины зависит от его эффективной цитозололиной доставки в клетки в тканях патологии. Клинический успех для лечения ранее не «безнаркоспособных» целевых показателей печеночной болезни с помощью Сирны был достигнут. Однако эффективная поставка опухоли СиРНА обусловливает необходимость в дополнительных фармакокинетических соображениях проектирования, включая длительное время циркуляции, уклонение от очистки органов (например, печень и почки), а так же проникновение и удержание опухоли. Здесь мы описываем подготовку и экстракорпоральное физикохимическое/биологическое описание полимерных наночастиц, предназначенных для эффективной доставки СиРНА, в частности, к не печеночной ткани, такой как опухоли. Наночастицы СиРНА подготавлиются электростатической комплексообразованием СиРНА и полиолмера поли (этилен гликоль-б-[2-(диметиламин) этилметакриловой-Co-Butyl метакрилат]) (ПЭГ-дБ) для формирования polyion комплексов ( полиплексы), где СиРНА изолированный внутри полиплекса ядра и ПЭГ образует гидрофильные, нейтрально заряженных короны. Кроме того, блок DB становится мембранно-литической, как пузырьки эндолизомального пути окислить (< рН 6,8), вызывая эндосомальный побег и цитозололическую доставку СиРНА. Описаны методы для характеристики физикохимических характеристик наночастиц СиРНА, таких как размер, поверхностная зарядка, морфология частиц и нагрузка на СиРНА. Биоактивность наночастиц СиРНА измеряется с помощью люциферазы в качестве типового гена в быстром и высокой пропускной способности глушителей анализа гена. Проекты, которые проходят эти первоначальные тесты (например, полиплексы на основе ПЭГ-БД), считаются подходящими для перевода на доклинические исследования животных, оценивающих доставку СиРНА в опухоли или другие места патологии.
Introduction
Потому что сирнас ингибирует перевод белков из мРНК последовательностей, они теоретически могут быть использованы для наркотиков всех известных патологий1,2,3,4,5. Тем не менее, использование СиРНА в медицине ограничено всесторонне бедным Фармакокинетический профиль молекул СиРНА6,7. При введении внутривенно, сирнас быстро очищается через почки и/или деградирует нуклеазы8,9. Из-за большого размера и отрицательного заряда, СиРНА не может войти в клетки или избежать эндолизомального пути для доступа к РНК-индуцированной комплекс глушителей (RISC), который находится в цитозоль10,11,12, 13-ое. Таким образом, были предприняты активные усилия по разработке и внедрению стратегий доставки СиРНА14. Эти усилия в значительной степени сосредоточены на развитии липидных и полимеров на основе наночастиц, которые пакет СиРНА, защитить его от очистки и деградации в естественных условиях, и инициировать поглощение клеток и эндосомальных бежать через ионируемых, катионических аминов групп. Многие доклинические успехи были зарегистрированы и в последнее время, первый клинический успех был сообщены для нано, основанных на печени, на основе Рсрнк доставки для лечения наследственных транстимотина-опосредованного (Хаттр) амилоидоз15.
Есть много вызывающих рак генов, которые в настоящее время "undruggable" по традиционной фармакологии (например, малые молекулы наркотиков), мотивируя дизайн полимерных наночастиц СиРНА (Si-НПВ) для лечения рака16. Тем не менее, есть отдельный набор параметров дизайна, которые должны быть рассмотрены для не-печеночной СиРНА доставки. Система доставки должна оградить катионический заряд полиплекса, который вызывает агглютинации в рамках системного обращения17,18,19. Для доставки опухоли, в частности, Si-НП стабильности имеет важное значение для наделять длительный тираж и, следовательно, увеличение накопления в рамках опухоли с помощью расширенной проницаемости и удержания (ОРЭД) эффект20,21. Кроме того, контроль над размером Si-НП имеет важное значение, так как только наночастицы примерно 20-200 Нм диаметром в размер плечо ЭПР22, и меньше Si-ЯИЭ (~ 20-50 Нм диаметром) экспонат Улучшение проникновения опухоли более крупных размеров наночастиц и микрочастицы23.
Для решения этих дополнительных проектных ограничений на системную поставку опухоли в СиРНА после внутривенного введения, нейтрально заряженных, рН-отзывчивый Si-НПВ были разработаны (рис. 1)24. Эти Si-НПВ являются PEGylated, или совсем недавно, Zвиттерионионированной25, для нейтральной поверхности заряда и устойчивость к протеиновой адсорбции и опсонизации в обращении. Поскольку они не могут полагаться исключительно на катионический характер диска внутриклеточного доставки, чрезвычайно эффективным эндосомальных побег является обязательным условием для достижения мощного глушителей генов. Соответственно, ядро этих Si-НПВ состоит из высокоэндолитического ядра, которое инертно при внеклеточной рН (7,4), но которое срабатывает в коммутатор-подобный способ в подкисленные условия эндолизомального пути [pH 6,8 (ранние эндосомы)-5,0 ( лизосомы)]. Наконец, смесь катионного и гидрофобного содержания в ядре Si-ЯИЭ обеспечивают как электростатические, так и стабилизационные силы Ван-дер-Ваальса, улучшая устойчивость Si-НПВ в крови по сравнению с просто катионическим системами.
Интеграция многих функций в относительно простую конструкцию возможна с помощью обратимой цепочки переноса фрагментации (плот), контролируемой полимеризации, для производства полимеров со сложной архитектурой и точным составом. Для производства Si-ЯИЭ с нейтральным поверхностным зарядом, рН-отзывчивостью и стабильностью НП, плот используется для синтеза поли (этиленгликоль-б-[2-(диметиламин) Этилметакрилат-ко-бутил метакрилат)) (ПЭГ-дБ; Рис. 1A). ПЭГ-дБ является электростатически комплексированных с СиРНА, формирование Si-ЯИЭ с ПЭГ Корона и DB/СиРНА ядра (рис. 1b). ПЭГ образует инертный, нейтрально заряженный гидрофильный слой в Си-НП Корона. Блок DB состоит из 50:50 молярного соотношения 2-(диметиламин) этилметакрилта (DMAEMA) и бутиля метакрилат (БМА). Катионические DMAEMA электростатически комплексы отрицательно заряженные СиРНА. БМА самоассоциированные в рамках НП ядро взаимодействия ван дер Ваальса, повышение стабильности НП. Вместе, DMAEMA и БМА передавать рН-зависимых липидного билайер-lytic поведение БД полимерных блоков. При внеклеточной рН, блок DB поглощенных к Си-НП ядро и инертен для липидных билайеры. В кислотных условиях, таких, как в пределах эндосомального пути, иоментизируемая DMAEMA в блоке DB облегчает эффект протонной губки, где эндосомная буферизация приводит к осмотическим отеку и разрыву26. Дополнительно, гидрофобные МДА, в пределах блока DB активно интегрируются в и Lyse липидные билайеры, в результате мощного эндосомолиза. Таким образом, СиРНА комплексируется с ПЭГ-БД для формирования Si-НПВ, которые нейтрально заряженных и очень стабильной при внеклеточной рН, но которые нарушают липидные билайеры на кислотных рН, обеспечивая цитозололические доставки полезной нагрузки СиРНА.
Здесь описаны экспериментальные процедуры по производству Si-НПВ от ПЭГ-БД. Представлены и обсуждаются методы, характеризующие Физикохимические параметры и биоактивность Si-НПВ. Чтобы быстро оценить биоактивность Si-НП, Люцифераза используется в качестве типового гена для исследований нокдауна. Светлячок люциферазы является белок, ответственный за "свечение" светлячков27. Соответственно, клетки млекопитающих, трансфецированных в гене люцифязы Светлячок производят светящихся "свечение", которые могут быть захвачены с помощью лютометр для количественной оценки уровней люциферазы выражения. Здесь мы используем люциферазу для оценки биологической активности Si-НПВ, предоставляя СиРНА против люциферазы и количественного соответствующего сокращения биолюминесценции в Люцифферасе-экспрессируя клетки по сравнению с клетками, которые получают зашифрованный СиРНА.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка и характеристика Si-НПВ
- подготовка Си-НП
- Растворите полимер в 10-мм лимонной кислоты буфер (pH 4,0) на 3,33 мг/мл. Полимер может сначала растворяться в 10x концентрация в этанол для обеспечения растворения.
Примечание: полимер может быть растворен при более низких концентрациях, но использование в концентрациях выше 3,33 mg/mL может предотвратить однородное формирование НП. - Добавьте СиРНА (50 мкм в diH2O), чтобы привести к N+:P- соотношение 10. Смешайте полимер и растворы СиРНА тщательно пипетит и пусть инкубации в течение 30 мин. N+:P- соотношение представляет количество положительно заряженных групп аминов на полимер к числу отрицательно заряженных фосфатных групп на сирне и рассчитывается по формуле ниже:
где, мол Поль является молярным количеством полимера, RU Амин число повторяющихся единиц положительно заряженных аминов на полимер, мол СиРНА является молярное количество СиРНА, и BP СиРНА является количество базовых пар в молекуле СиРНА. - Добавьте 5-кратную избыточную 10-мм фосфатный буфер (pH 8,0) и аккуратно перемешайте либо путем пипетки, либо инвертинга трубки. Чтобы подтвердить, что конечный рН нейтрален (~ 7,2-7.5), Пипетка 10 мкл решения Si-НП на полоски тест рН.
Примечание: в соответствии с диаграммами буферного центра «Миллипор Сигма», мы подготовили буферы лимонной кислоты и фосфата.
- Растворите полимер в 10-мм лимонной кислоты буфер (pH 4,0) на 3,33 мг/мл. Полимер может сначала растворяться в 10x концентрация в этанол для обеспечения растворения.
- Физикохимическая характеристика Si-НПВ
- Запишите размер и поверхность заряда результирующего Si-НПВ с использованием динамического рассеяния света (DLS). Подготовьте образец DLS, отфильтровывая 1 мл Si-ЯИЭ (0,1 – 1,0 мг/мл), через 0,45 мкм, в квадратный кварц или полистирол кювет. Измерение размера и поверхности заряда с помощью прибора DLS в соответствии с техническими характеристиками производителя.
- Подтвердите размер и морфологию Si-НПВ путем анализа изображений с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА).
- Добавьте 5 мкл раствора Си-НП на 1 мг/мл в сетки ТЕА и Инкубируйте для 60 s. пятно сухое для 3 с.
- Добавить 5 мкл 3% уранилом ацетата раствор и инкубировать для 20 с. пятно сухой для 3 с. сухие сетки на ночь под высыхать.
- Сетки изображений в соответствии с протоколом, установленным для использования конкретного микроскопа.
- Характеризуют загрузку СиРНА в Si-НПВ на различных N+:P- коэффициенты с использованием замедления агарозы геля.
- Для производства 2% агарозы гель, добавить 2 г электрофорез класса агарозы порошок 100 мл 1x ТЭ (трис-ацетат-ЭДТА) буфер рН 8,0. Перемешать, чтобы приостановить агарозы. Тепло обнаружили в микроволновой печи, пока все агарозы растворяется (1-3 мин).
- После охлаждения, добавить 5 мкл этидий бромида (10 мг/мл в H2O), и хорошо перемешать. Налейте агарозы в гель лоток и место гребень для производства скважин, давая высохнуть в течение 30 мин. Осторожно удалите гребень, чтобы оставить позади погрузочные скважины, и заполните гель лоток до максимальной заливки линии с 1x ТЭ буфера.
- Генерировать Si-НПВ (в соответствии с вышеуказанной процедурой) при 0, 1, 2, 5, 7, 10, 20 и 40 N+:P- коэффициенты. Поместите 2 мкл аликвотов погрузки красителя (без СДД и сокращения агентов) на парафин пленки для каждой формулировки Si-НП. Смешайте 10 мкл раствора Си-НП с загрузкой красителя на парафиновые пленки с помощью пипетки.
- Добавить Si-НП/Загрузка красителя решения агарозы гель скважин. Запустите источник напряжения на 100 V для 35 min (или пока образцы пройдены 80% длины геля).
- Визуализация СиРНА полос на УФ-переходных в соответствии с требованиями производителя.
- Подтвердите размер и морфологию Si-НПВ путем анализа изображений с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА).
2. Определение экстракорпорального биоактивности Si-НПВ
- Нокдаун модели гена люциферазы
- Генерировать люциферазы Si-НПВ (в соответствии с вышеуказанной процедурой) с помощью люциферазы СиРНА и зашифрованный Si-НПВ с помощью зашифровано СиРНА последовательности в качестве элемента управления. Formualte оба Si-НПВ в то же окончательное N+:P- соотношение и оптимальное соотношение, выявленные исследования отсталости гелевых геля. Пример последовательности СиРНА включены в таблицу материалов.
- Семенные люцифферазы-экспрессия клеток [МДА-МБ-231/люциферазы (СMA) стабильные клетки] в 96-хорошо черные-стенные пластины при плотности 2 000 клеток на колодец. Разрешить придерживаться ночь в полном объеме средств массовой информации (ДМ, 10% ФПС) в инкубаторе (37 ° c, 5% CO2, 95% влажность).
- Разбавленный Si-НПВ в полной сыворотки СМИ для окончательного объема 100 мкл в колодец и концентрация СиРНА 100 Нм. Лечить клетки в течение 24 ч с Si-НПВ.
- После 24 ч, удалить лечения и заменить СМИ с полной сыворотки СМИ, содержащие 150 мкг/мл D-люциферин. Инкубировать клетки в течение 5 минут до измерения люминесценции на тарелку читателя или в естественных условиях оптической системы визуализации в соответствии с требованиями производителя.
- Замените люциферин-содержащие средства массовой информации свежими, полными сывороточных носителей, и Инкубируйте 24 ч больше. Повторите шаг выше, удаление средств массовой информации и замена с полной сыворотки СМИ, содержащие 150 мкг/мл D-люциферин, а затем 5 мин инкубации до измерения свечения на 48 h точка времени.
- Для продольных исследований, поддерживать клетки в стерильные условия при измерении люминесценции. Продолжать культуру в свежих, полных средств массовой информации между измерениями после замены люциферин-содержащих.
Примечание: соответствующая концентрация СиРНА будет варьироваться в зависимости от различных молекул Si-ЯИЭ и СиРНА. При использовании нейтрали-заряженных полиплексов с эндосомолитическим ядром (напр., ПЭГ-дБ), 100 Нм обычно хорошо переносится клетками и вырабатывает > 75% нокдаун люциферазы. Массовое соотношение ПЭГ-дБ к сирне при 10 N+:P- соотношение и 100 Нм лечение СиРНА (при предположении 26 БП сирна) составляет 23,3, т. е. прибавлять 23,3 нг ПЭГ-БД на каждые 1,0 нг СиРНА. Например, добавьте 1,16 мкл 3,33 мг/мл полимера для 166,5 нг СиРНА для лечения одного колодца на 100 Нм в 96-хорошо пластины (100 mL объем средств на хорошо).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Некоторые существенные характеристики эффективного Si-НПВ для в естественных условиях доставки СиРНА являются надлежащий размер (~ 20-200 Нм диаметр), СиРНА упаковки и гена глушителей биологической активности. Хотя это не исчерпывающий перечень (как это было в ходе обсуждения), эти основные характеристики должны быть подтверждены до рассмотрения дальнейших испытаний формулировки.
На рисунке 2 показано описание размера Си-НП и поверхности заряда при разработке. DLS и ТЕА используются в качестве дополняющих методов наблюдения размера Си-НП (оба), полидиспергичности (DLS) и морфологии (ТЕА). Измерения DLS показывают, что Си-НП 1 имеет средний диаметр 35 Нм, юнимодал распределения, указанный наличием одного пика, и низкой полдисдисперсией, указанной относительно узкой пиковой шириной (рисунок 2A). Измерения ТЕА подтверждают измерение размера от DLS, предполагают наличие единообразного населения Si-НПВ и раскрывают сферическую морфологию Si-НПВ (Рисунок 2C). Измерения DLS и ТЕА Си-НП 2 показывают, что она имеет нежелательный размер (> диаметр 200 Нм) среднего диаметра 1 500 Нм, мультимодального и полидисперсных популяций, и агрегаты в растворе, образуя не отдельную морфологию частиц (Рисунок 2B, D ). Оба Si-НПВ 1 и 2 дисплей нейтральной поверхности заряда, указывается почти нулевой среднее Дзета потенциальные значения (рис 2E).
Эффективность загрузки СРНК в Si-НПВ характеризуется использованием заторможенности геля агарозы. Un-комплексированный СиРНА мигрирует через гель агарозы и визуализируется (из-за связывания бромида этидия) на дне геля. Когда СиРНА комплексируется с полимером сформировать Si-ЯИЭ, миграция через агарозы гель затруднен и СиРНА визуализируется на гелевой верх (или там, где он был загружен в скважины). Для ПЭГ-DB основе Si-НПВ, комплеквих увеличивается с увеличением N+:P- коэффициенты до полного комплеквих достигается на ~ 10-20 N +:P соотношение (рис. 3).
Люциффераз используется в качестве типового гена для быстрой оценки гена Си-НП, глушителей биологической активности. Биолюминесценции измерений через пластины читателя или в естественных условиях оптической системы визуализации позволяют быстро, высокой пропускной способностью количественное выражение люциферазы белка в хорошо пластины формате. Этот метод значительно быстрее, дешевле и менее обременителен, чем анализ глушителей генов посредством традиционного молекулярного анализа, такого как ЦР (экспрессия генов) и Вестерн-блот (выражение белка). С помощью этого метода, люциферазы-экспрессия клетки обрабатывают люцифферазы Si-ЯИЭ и зашифрованный Si-НПВ (в качестве элемента управления), и% активность Люцифераза рассчитывается путем сравнения люминесценции сигнала на необработанные клетки. Биоактивные люциферазы Si-НПВ будет демонстрировать значительно уменьшилась% деятельности люциферазы по сравнению непосредственно с зашифрованный Си-НП контроля, как можно увидеть на Си-НП 1 на рисунке 4. В противоположность этому, Люцифераза Si-НПВ, которые не снижают активность люциферазы по сравнению с зашифрованный контроль Си-НП (например, Си-НП 2), не считаются биологически активными (рис. 4). Часто 48 h это время максимального глушителей генов (рис. 4), но мы наблюдали значительное глушителей генов в точках времени, начиная от 24 ч до 240 h после лечения.
На рисунке 1. Химия полимеров и схема Си-НП. (A) химический состав ПЭГ-БД диблок Кополимер, который сочиняет Si-ЯИЭ и наделяет нейтральный поверхностный заряд (блок ПЭГ) и pH-отзывчивое поведение (блок DB). B) Самосборка Si-НПВ. При pH 4,0, блок DB водорастворимый, потому что третичные амины DMAEMA высоко протоонированной. Положительно заряженный DB блок электростатически комплексов отрицательно заряженных молекул СиРНА. РН затем корректируется до ~ 7,4 путем добавления 5x pH 8,0 фосфатного буфера, в результате чего "гидрофодизации" блока DB и поглощения СиРНА и БД в ядре Si-НПВ. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунке 2. Характеристики DLS и ТЕА по размеру Си-НП, поверхностной зарядки и морфологии. (A, C) Си-НП 1 представляет собой единый образец с соответствующим размером (~ 50-100 Нм), тогда как (B, D) Си-НП 2 сформировал нежелательные, крупные и полидисперсные агрегаты. (Е) оба Si-НПВ дисплей почти нейтральной поверхности заряда (Дзета потенциал). Бары ошибок представляют стандартную ошибку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунке 3. Заторможенность геля агарозы для оценки эффективности Си-НП СиРНА загрузки. Исчезновение полос СиРНА на дне геля указывает на комплексние СиРНА в полимер. Полимер-комплексированный СиРНА не может мигрировать через гель и таким образом визуализируется в верхней части геля рядом с погрузочной скважины. По мере увеличения соотношения N +:P увеличивается, увеличение Комплеквих в СиРНА, о чем свидетельствует снижение интенсивности группы СиРНА на дне геля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
На рисунке 4. Си-НП-опосредованное нокдаун гена модели Люцифесаза в клетках Люцифазы МДА-МБ-231. Активность люциферазы на (A) 24 h и (B) 48 h после лечения либо омлет Си-ЯИЭ или люцифферазы Si-НПВ на 10 N+:P- соотношение и 100 Нм СиРНА доза. % Активность люциферазы рассчитывается путем деления люминесценции сигнала образцов лечения (платные и люциферазы) по люминесценции сигнала необработанных клеток. Примечание: Si-НП 1 представляет собой эффективную формулировку с глушителей гена биологической активности, в то время как Си-НП 2 представляет собой формулировку без гена глушителей биологической активности. (*) указывает на статистически значимое различие (p < 0,05) по сравнению с группой яичницы для формулировки в данном часовом пункте. Бары ошибок представляют стандартную ошибку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанные здесь Si-НПВ формируются электростатической ассоциацией анионических СиРНА и катионических полимеров в полионные комплексы (полиплексы). Электростатическое комплексирование СиРНА и катионический DB полимеров ПЭГ-DB способствует смешиванию при низком РН (4,0). При pH 4,0, DMAEMA очень протоонированной, и, следовательно, блок DB очень заряжен. Это гарантирует, что полимеры растворяются как унимерс в растворе, в отличие от формирования мицеллы и что комплексы DB эффективно с СиРНА. Впоследствии рН раствора корректируется на нейтральный (pH 7,4), вызывая «гидрофодизацию» блока DB, формирование Микеля и захвата комплексированного СиРНА в ядре результирующего полиплекса. Эти полиплексы сконструированы таким образом, что ПЭГ образует гидрофильную, инертную оболочку вокруг БД/СиРНА ядра, что приводит к нейтральной поверхности заряда, который необходим для системного управления. На рисунке 1изложена полимерная химия и процесс формирования полиплекса.
Строгая физикохимическая характеристика Si-ЯИЭ имеет важное значение для определения того, являются ли формулировки подходящими для перехода в биологическое тестирование. Размер, поверхностная зарядка, и форма частиц/морфология являются важными параметрами, которые могут повлиять на биологические показатели. Для системной доставки в опухоли, Si-НП размер должен упасть между 20-200 Нм диаметром22, и последние исследования показывают, 20-50 Нм диаметром частиц являются идеальными23. Поверхностная зарядка должна быть нейтральной или слегка отрицательной для минимизации адсорбции белка и опсонизации28. Исследования исследовали связь между формой частиц и фармакокинетикой/расчисткой частиц, предполагая, что частицы с высоким соотношением пропорции желательны над сферическими частицами29,30,31. Тем не менее, на сегодняшний день сферические частицы по-прежнему наиболее часто используемых, и, насколько нам известно, являются единственной формой частиц были переведены на человека исследований в области онкологии.
Важно отметить, что равномерное и последовательное формирование полиплексов, таких как Si-НПВ, представленные здесь, зависит от диапазона параметров физикохимических. Эмпирически мы обнаружили, что концентрация полиплекса, pH раствора и соотношение полимера к Сирне (N+:P- соотношение) оказывают существенное влияние на формирование полиплекса. В наших руках концентрация СиРНА не оказывает большого влияния на формирование полиплекса, но использование концентраций полимеров превышает 3,33 мг/мл в результате формирования больших агрегатов и непоследовательного размера полиплекса. Поскольку эти Si-НПВ являются рН-отзывчивым, различные проблемы могут возникнуть, когда конечный рН решений Si-НП слишком кислой (< pH 7,2). Два способа предотвратить эти осложнения заключаются в лиофиллизации полимеров в чистом diH2O, так что нет соли, чтобы изменить буферную композицию после растворения и повторно сделать буферы часто, чтобы предотвратить "дрейф" буферного pH с течением времени. Чтобы быть осторожным, рН буферов должен быть подтвержден каждый раз, прежде чем сделать Si-ЯИЭ, и окончательный рН решений Si-НП всегда должны быть проверены. И наконец, N+:P- соотношение Si-ЯИЭ влияет на эффективность загрузки и полиплекса физикохимических параметров. Там, как правило, существует идеальный N+:P- соотношение, при котором все СиРНА загружается, но нет избытка не-комплексированных полимера, который образует отдельные популяции мицеллы и увеличивает цитотоксичность. Для Si-НПВ, представленных здесь, N+:P-10-20- это диапазон, в котором наблюдались оптимальная последовательность и производительность.
Линии сотовой связи «люцифёзы» используются здесь для быстрого и высокопропускной анализа биологической активности Si-НП. Линии ячейки люцифёзы должны быть сгенерированные или приобретенные до начала анализа биоактивности, что потребует первоначальных инвестиций во времени и расходах. Тем не менее, использование клеток-репортёр-люциферазы для оценки глушителей генов быстрее, более поддается анализу высокой пропускной способности, и дешевле с течением времени, чем выполнение RT-ЦР (для измерения экспрессии мРНК) или западные пятна (для измерения экспрессии белка). Например, измерение люминесценции в этом анализа обычно занимает всего несколько минут, в отличие от всех дневных или многодневных процессов, необходимых для выполнения RT-ЦР или западных blots. Кроме того, люминесцентные измерения могут быть проведены на хорошо пластин, что позволяет одновременное количественное определение многих образцов (до 96-хорошо пластин были использованы авторами). Наконец, D-люцифферин является единственным реагентом необходимо выше, и за ее пределами типичных реагентов клеточной культуры, что делает метод гораздо более доступным, чем RT-ЦР или Вестерн-блот. Следует, однако, отметить, что анализ ячейки люциферазы репортер ограничивается только оценки глушителей гена модели гена люциферазы и не может быть использован для измерения глушителей генов других "терапевтических генов" интерес. Таким образом, авторы отсылат читателей к нескольким исследованиям, где RT-СР и/или Вестерн-блот используется для оценки глушителей генов терапевтических генов, представляющих интерес24,32,33,34.
В дополнение к биологической активности, исследователи должны в идеале рассмотреть всеобъемлющий спектр в пробирке биологических тестов для характеристики Si-НП производительности. Анализ люциферазы описано выше, также могут быть использованы для оценки жизнеспособности клеток путем сравнения люминесценции сигнала платные Si-НП обработанных клеток необработанных клеток. Так как СиРНА является последовательность без таргетинга, любые изменения в люминесценции могут быть отнесены к неспецифическое воздействие Si-НПВ на жизнеспособность клеток, и этот эффект, как правило, зависит от химии полимеров и молярной суммы. Методы в потоке цитометрии и флуоресцентной микроскопии могут быть использованы для оценки поглощения клеток Si-НПВ с использованием флуоресцированы-помечены Сирнас, полимеров, или обоих. Кроме того, молекулярные методы, такие как коцр стволовых петли и Argonaut 2 иммунорецепция могут быть использованы для точного измерения внутриклеточных уровней СиРНА. Так как СиРНА только биологически, если доставлен в цитозоль, где он загружается в RISC, Si-НПВ должны вызвать эндосомального побега СиРНА раз интернализированных клеток. Исследования, используемые для экспериментально измерить эндосомального побега включают красных кровяных клеток гемолиза анализа (описано в деталях Эванс et al.35), флуоресцентной визуализации колокализации флюоресцированные, Si-НП грузов и LysoTracker36, и совсем недавно, флуоресцентные изображения набора galectin 8 Проколотые эндосомальных везикулы37,38. Сбор данных и обобщение результатов в пробирке экспериментов для жизнеспособности клеток, поглощение клеток, эндосомальных побег, и биоактивность обеспечивают исследователь дополняющих частей информации, из которой рисовать интерпретации и заручиться механистической представление о Си-НП (в) эффективности.
В целом, наночастицы, способные эффективно доставлять СиРНА, имеют огромный потенциал для лечения болезней. Например, в онкологии многие гены, вызывающие прогрессирование рака, устойчивость к терапии и метастазирование, являются «незатруднеспособными» по общепринятой фармакологии, но могут рассматриваться с использованием СиРНА. Однако, предпосылка к их применению в моделях животных заболевания, нанометины СиРНА (refer to здесь как Si-НПВ) требует обширной физикохимической и биологической характеризации для того чтобы обеспечить и их безопасность и эффективность. С этой целью, методы были описаны здесь, чтобы производить и характеризовать Si-ЯИЭ в пробирке, с помощью которого Si-НПВ может быть оценена на пригодность для переноса в исследованиях на животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не раскрывают никакие потенциальные конфликты интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят доктора Крейга Дюваля и Ребекку Кук за доступ к данным и лабораторным ресурсам для проведения этих исследований. Авторы благодарят институт по наноразмерным наукам и разработкам (VINSE) Вандербильта для доступа к инструментам DLS и ТЕА (EPS 1004083). Авторы благодарят Национальный научный фонд за поддержку программы стипендий для выпускников исследовательских программ (ННФ # 1445197). Авторы благодарят национальные институты здравоохранения за финансовую поддержку (низ R01 EB019409). Авторы благодарят программу медицинского исследования Министерства обороны США, направленную на финансовую поддержку (ДМО OR130302).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm pore-size syringe filters | Thermo Fisher Scientific | F25133 | 17 mm diameter, PTFE membrane |
| 0-14 pH test strips | Millipore Sigma | P4786 | |
| 10x TAE buffer | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | AM9869 | |
| 6-7.7 pH test strips | Millipore Sigma | P3536 | |
| 96-well black walled plates | Corning | 3603 | Tissue-culture treated |
| Agarose Powder | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 16500 | |
| Citric acid monohydrate | Millipore Sigma | C1909 | |
| dibasic sodium phosphate dihydrate | Millipore Sigma | 71643 | |
| D-luciferin | Thermo Fisher Scientific | 88294 | Monopotassium Salt |
| DMEM | Gibco | 11995065 | High glucose and pyruvate |
| Ethanol | Millipore Sigma | 459836 | |
| ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 15585011 | |
| FBS | Gibco | 26140079 | |
| loading dye | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | R0611 | |
| Luciferase siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC AAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACU GAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases |
| MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells | GenTarget Inc | SC059-Bsd | Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity |
| monobasic sodium phosphate monohydrate | Millipore Sigma | S9638 | |
| Scarmbled siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUU AUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUAC GCGUA*T* *DNA bases |
| square polystyrene cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | 4.5 mL capacity |
| TEM grids | Ted Pella, Inc. | 1GC50 | PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper |
| Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804 | |
| uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 |
References
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).
- Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).
- Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244 (2002).
- Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
- Wittrup, A., Lieberman, J. Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543 (2015).
- Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies. Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).
- Bartlett, D. W., Davis, M. E. Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing. Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).
- Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. E. Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (8), 3137-3142 (2012).
- Dominska, M., Dykxhoorn, D. M. Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape. Journal of Cell Science. 123 (Pt 8), 1183-1189 (2010).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle–mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638 (2013).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nature Biotechnology. 33 (8), 870-876 (2015).
- Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
- Adams, D., et al. Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis. New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).
- Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502 (2017).
- Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).
- Verbaan, F. J., et al. The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration. International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).
- Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).
- Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. C. Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities. Nature Reviews Cancer. 17 (1), 20 (2016).
- Torchilin, V. Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (3), 131-135 (2011).
- Duncan, R. The dawning era of polymer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (5), 347 (2003).
- Tang, L., et al. Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (43), 15344-15349 (2014).
- Nelson, C. E., et al. Balancing Cationic and Hydrophobic Content of PEGylated siRNA Polyplexes Enhances Endosome Escape, Stability, Blood Circulation Time, and Bioactivity in vivo. ACS Nano. 7 (10), 8870-8880 (2013).
- Jackson, M. A., et al. Zwitterionic Nanocarrier Surface Chemistry Improves siRNA Tumor Delivery and Silencing Activity Relative to Polyethylene Glycol. ACS Nano. , (2017).
- Akinc, A., Thomas, M., Klibanov, A. M., Langer, R. Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis. The Journal of Gene Medicine. 7 (5), 657-663 (2005).
- de Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).
- Aggarwal, P., Hall, J. B., McLeland, C. B., Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 428-437 (2009).
- Geng, Y., et al. Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery. Nature Nanotechnology. 2 (4), 249 (2007).
- Chauhan, V. P., et al. Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration. Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).
- Chu, K. S., et al. Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft. Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).
- Werfel, T. A., et al. Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival. Cancer Research. 78 (7), 1845-1858 (2018).
- Sarett, S. M., et al. Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).
- Williams, M. M., et al. Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers. Cell Death and Disease. 9 (2), 21 (2018).
- Evans, B. C., et al. Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs. Journal of Visualized Experiments. (73), e50166 (2013).
- Werfel, T., et al. Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo. Journal of Controlled Release. , (2017).
- Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes. Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).
- Kilchrist, K. V., et al. Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability. ACS Nano. , (2019).
