Summary
Se presentan los métodos para preparar y caracterizar las propiedades fisicoquímicas y la bioactividad de las nanopartículas de siRNA con respuesta al pH, que son neutralmente cargadas. Se discuten los criterios para los nanomedicamentos siRNA exitosos, como el tamaño, la morfología, la carga superficial, la carga de siRNA y el silenciamiento del gen.
Abstract
El éxito de siRNA como medicina molecular dirigida depende de su eficiente entrega citosólica a las células dentro del tejido de la patología. Se ha logrado el éxito clínico para el tratamiento de los objetivos de enfermedad hepática previamente ' no druggable ' con siRNA. Sin embargo, la entrega eficiente de siRNA tumoral requiere consideraciones adicionales de diseño farmacocinético, incluyendo tiempo de circulación prolongado, evasión de órganos de aclaramiento (p. ej., hígado y riñones), y penetración y retención de tumores. Aquí describimos la preparación y la caracterización fisicoquímica/biológica in vitro de nanopartículas poliméricas diseñadas para el parto eficiente de siRNA, particularmente a los tejidos no hepáticos como los tumores. Las nanopartículas de siRNA se preparan mediante la compleción electrostática de siRNA y el copolímero de dibloque poli (etilenglicol-b-[2-(dimetilamino) etil metacrilato-Co-butilo metacrilato]) (PEG-dB) para formar complejos poliónicos ( poliplexos) donde siRNA es secuestrado dentro del núcleo de POLIPLEX y PEG forma una corona hidrófila, con carga neutra. Por otra parte, el bloque DB se convierte en membrana-lítica como vesículas de la vía endolisosomal acidificación (< pH 6,8), desencadenando la fuga endosómica y la entrega citosólica de siRNA. Se describen los métodos para caracterizar las características fisicoquímicas de las nanopartículas de siRNA, como el tamaño, la carga superficial, la morfología de las partículas y la carga de siRNA. La bioactividad de las nanopartículas de siRNA se mide utilizando luciferasa como un gen modelo en un ensayo de silenciamiento del gen rápido y de alto rendimiento. Los diseños que superan estas pruebas iniciales (como los poliplexos basados en PEG-DB) se consideran apropiados para la traducción a estudios en animales preclínicos que evalúan la entrega de siRNA a tumores u otros sitios de patología.
Introduction
Debido a que los siRNAs inhiben la traducción de las proteínas de las secuencias de mRNA, teóricamente pueden ser utilizados para drogas todas las patologías conocidas1,2,3,4,5. Sin embargo, el uso de siRNA en medicina está limitado por el perfil farmacocinético de las moléculas de siRNA6,7. Cuando se inyecta por vía intravenosa, los siRNAs se borran rápidamente a través de los riñones y/o se degradan mediante nucleasas8,9. Debido a su gran tamaño y carga negativa, siRNA no puede entrar en las células o escapar de la vía endolisosomal para acceder al complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que reside en el citosol10,11,12, 13. Así, un extenso esfuerzo se ha centrado en el diseño e implementación de las estrategias de entrega de siRNA14. Este esfuerzo se ha centrado en gran medida en el desarrollo de nanopartículas a base de lípidos y polímeros que empaquetan siRNA, la protegen del aclaramiento y la degradación in vivo, e inician la captación celular y el escape endosómico a través de grupos de Amina catiónica ionizable. Se han notificado muchos éxitos preclínicos y, más recientemente, se ha notificado el primer éxito clínico de la entrega de siRNA hepática basada en nanopartículas para tratar la amiloidosis15mediada por transthyretin hereditaria (hattr).
Hay muchos genes causantes del cáncer que actualmente son "no druggable" por Farmacología convencional (es decir, fármacos de moléculas pequeñas), motivando el diseño de nanopartículas de siRNA poliméricas (si-NPs) para tratar el cáncer16. Sin embargo, hay un conjunto separado de parámetros de diseño que deben tenerse en cuenta para la entrega no hepática de siRNA. El sistema de entrega debe proteger la carga catiónica del Polyplex que causa la aglutinación dentro de la circulación sistémica17,18,19. Para la entrega del tumor, específicamente, la estabilidad del si-NP es esencial para dotar de una larga circulación y así aumentar la acumulación dentro de los tumores a través del efecto de permeabilidad y retención mejorada (EPR)20,21. Además, el control sobre el tamaño del si-NP es esencial ya que sólo las nanopartículas de aproximadamente 20 – 200 nm de diámetro en tamaño aprovechan EPR22, y el si-NPS más pequeño (~ 20 – 50 nm de diámetro) exhiben una mejor penetración tumoral sobre nanopartículas de mayor tamaño y micropartículas23.
Para abordar estas limitaciones adicionales de diseño para la administración de tumores sistémicos de siRNA después de la administracion intravenosa, se han desarrollado los si-NPs con capacidad neutralmente, con pH-sensible (figura 1)24. Estos si-NPs son PEGylated, o más recientemente, Zwitterionated25, para la carga superficial neutral y la resistencia a la adsorción proteica y la opsonización en circulación. Dado que no pueden depender únicamente del carácter catiónico para impulsar el parto intracelular, es imprescindible un escape endosómico extremadamente eficiente para lograr un potente silenciamiento del gen. En consecuencia, el núcleo de estos si-NPs se compone de un núcleo altamente endosomolítico que es inerte al pH extracelular (7,4), pero que se desencadena de una manera de tipo interruptor en las condiciones acidificadas de la vía endolisosomal [pH 6,8 (endosomas tempranos) – 5,0 ( lisosomas)]. Por último, una mezcla de contenido catiónico e hidrófobo dentro del núcleo del si-NPs proporciona fuerzas de estabilización tanto electrostáticas como de van der Waals, mejorando la estabilidad del si-NPs en sangre en comparación con los sistemas meramente catiónicos.
La integración de muchas funciones en un diseño relativamente simple es posible utilizando la polimerización reversible de transferencia de la cadena de fragmentación (RAFT) para producir polímeros con una arquitectura compleja y una composición precisa. Para producir si-NPs con carga superficial neutral, respuesta de pH, y estabilidad NP, balsa se utiliza para sintetizar poli (etilenglicol-b-[2-(dimetilamino) etil metacrilato-Co-butilo de metacrilato]) (PEG-dB; Figura 1A). PEG-DB es completamenteado electrostaticamente con siRNA, formando si-NPs con una corona de PEG y núcleo de DB/siRNA (figura 1B). El PEG forma una capa hidrófila inerte de carga neutra en la corona si-NP. El bloque DB se compone de una relación 50:50 molar de 2-(dimetilamino) etil metacrilato (DMAEMA) y metacrilato de butilo (BMA). Cationic DMAEMA electrostaticamente complejos con carga negativa siRNA. Los autoasociados de BMA dentro del núcleo NP por las interacciones de van der Waals, aumentando la estabilidad NP. Juntos, DMAEMA y BMA imparten un comportamiento lipídico bicapa-lítico dependiente del pH al bloque de polímero DB. En el pH extracelular, el bloque DB está secuestrado en el núcleo si-NP y es inerte a las bicapas lipídicas. En condiciones ácidas, como las que están dentro de la vía endolisosomal, el DMAEMA ionizables dentro del bloque DB facilita el efecto de la esponja de protones, donde el tampón endosómico conduce a la hinchazón osmótica y la ruptura26. Adicionalmente, las mitades hidrófobas del BMA dentro del bloque DB se integran activamente en las bicapas lipídicas y Lyse, resultando en una potente endosomolisis. Por lo tanto, siRNA es complejado con PEG-dB para formar si-NPS que son neutralmente cargados y altamente estables a pH extracelular pero que interrumpen bicapas lipídicas a pH ácido, asegurando la entrega citosólica de la carga útil siRNA.
Aquí se describen los procedimientos experimentales para producir si-NPs de PEG-DB. Se presentan y discuten los métodos para caracterizar los parámetros fisicoquímicos y la bioactividad del si-NPs. Con el fin de evaluar rápidamente la bioactividad de si-NP, luciferasa se utiliza como un gen modelo para los estudios de Knock-down. Luciferasa luciérnaga es la proteína responsable del "resplandor" de las luciérnagas27. En consecuencia, las células de mamíferos transfectadas con el gen luciferasa Firefly producen un «resplandor» bioluminiscente que puede capturarse utilizando un luminómetro para cuantificar los niveles de expresión de luciferasa. Aquí, utilizamos luciferase para evaluar la bioactividad del si-NPs entregando siRNA contra luciferasa y cuantificando la correspondiente reducción en la bioluminiscencia en las células que expresan luciferasa en comparación con las células que reciben un siRNA revueltos.
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Protocol
1. preparación y caracterización del si-NPs
- la preparación del si-NP
- Disolver el polímero en tampón de ácido cítrico de 10 mM (pH 4,0) a 3,33 mg/mL. El polímero se puede disolver primero a una concentración de 10 veces en etanol para asegurar la disolución.
Nota: el polímero puede disolverse a concentraciones más bajas, pero el uso a concentraciones superiores a 3,33 mg/mL puede prevenir la formación de NP homogénea. - Añadir siRNA (50 μM en diH2O) para dar como resultado N+:P- ratio de 10. Mezcle las soluciones de polímero y siRNA a fondo mediante pipeteo y deje incubar durante 30 min. El N+:P- ratio representa el número de grupos de Amina positivamente cargados en el polímero al número de grupos fosfato con carga negativa en el siRNA y se calcula por la siguiente fórmula:
donde, mol Pol es la cantidad molar de polímero, la amina RU es el número de unidades repetidas de aminas cargadas positivamente por polímero, mol siRNA es la cantidad molar de siRNA, y BP siRNA es el número de pares de base por molécula de siRNA. - Agregue un exceso de 5 veces el tampón de fosfato de 10 mM (pH 8,0) y mezcle suavemente mediante el pipeteo o la inversión del tubo. Para confirmar que el pH final es neutro (~ 7.2-7.5), Pipetear 10 μL de solución si-NP en tiras de prueba de pH.
Nota: los tampones de ácido cítrico y fosfato se preparan de acuerdo con las cartas del centro de referencia de Millipore Sigma buffer.
- Disolver el polímero en tampón de ácido cítrico de 10 mM (pH 4,0) a 3,33 mg/mL. El polímero se puede disolver primero a una concentración de 10 veces en etanol para asegurar la disolución.
- Caracterización fisicoquímica de si-NPs
- Registre el tamaño y la carga superficial del si-NPs resultante mediante la dispersión de luz dinámica (DLS). Prepare una muestra de DLS filtrando 1 mL de si-NPs (0,1 – 1,0 mg/mL) a través de filtros de jeringa de tamaño de poro de 0,45 μm en una cubeta cuadrada de cuarzo o poliestireno. Registre las mediciones de tamaño y carga superficial utilizando un instrumento DLS de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
- Confirme el tamaño y la morfología del si-NPs mediante el análisis por imágenes mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM).
- Añadir 5 μL de solución si-NP a 1 mg/mL a las rejillas TEM e incubar durante 60 s. seque durante 3 s.
- Añadir 5 μL de solución de acetato de uranil al 3% e incubar durante 20 s. seque durante 3 s. rejillas secas durante la noche bajo desecación.
- Rejillas de imagen según el protocolo establecido para el microscopio específico que se utilizará.
- Caracterizar la carga de siRNA en si-NPS en varios N+:P- proporciones usando retardación de gel de agarosa.
- Para producir gel de agarosa al 2%, añada 2 g de polvo de agarosa de grado electroforesis a 100 mL de buffer 1x TAE (tris-acetato-EDTA) a pH 8,0. Remover para suspender la agarosa. Calor descubierto en el microondas hasta que toda la agarosa se disuelva (1-3 min).
- Una vez enfriado, añadir 5 μl de bromuro de etidio (10 mg/ml en H2O), y mezclar bien. Vierta la agarosa en una bandeja de gel y coloque el peine para producir pozos, dejando secar durante 30 min. Retire cuidadosamente el peine para dejar los pozos de carga, y llene la bandeja de gel a la línea de llenado máximo con 1x TAE buffer.
- Genere si-NPs (según el procedimiento anterior) en 0, 1, 2, 5, 7, 10, 20, y 40 N+:P- proporciones. Colocar 2 μL de alícuotos de tinte de carga (sin SDS y agentes reductores) en la película de parafina para cada formulación de si-NP. Mezclar 10 μL de solución si-NP con un tinte de carga en la película de parafina mediante pipetas.
- Añadir soluciones de colorante si-NP/carga a pozos de gel de agarosa. Ejecute la fuente de tensión a 100 V para 35 min (o hasta que las muestras hayan atravesado el 80% de la longitud del gel).
- Visualice las bandas siRNA en un transilluminador UV según las especificaciones del fabricante.
- Confirme el tamaño y la morfología del si-NPs mediante el análisis por imágenes mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM).
2. determinar la bioactividad in vitro de si-NPs
- Derribe del gen modelo luciferasa
- Generar luciferasa si-NPS (según el procedimiento anterior) usando luciferasa siRNA y codificado si-NPS usando una secuencia de siRNA codificada como un control. Formualte ambos si-NPS en el mismo final N+:P- ratio y en la proporción óptima identificada por los estudios de retardo de gel de agarosa. Ejemplo de secuencias siRNA se incluyen en la tabla de materiales.
- Semilla luciferasa-expresando células [MDA-MB-231/luciferasa (BSD) células estables] en placas de paredes negras de 96-Well a una densidad de 2.000 células por pozo. Permitir que se adhiera durante la noche en medios completos (DMEM, 10% FBS) en una incubadora (37 ° c, 5% CO2, 95% humedad).
- Diluir el si-NPs en un medio sérico completo para un volumen final de 100 μL por pozo y una concentración de siRNA de 100 nM. Trate las células durante 24 h con si-NPs.
- Después de 24 h, retire los tratamientos y reemplace los medios con un medio sérico completo que contenga 150 μg/mL de D-Luciferin. Incubar las células durante 5 minutos antes de medir la luminiscencia en un lector de placas o en un sistema de imagen óptica in vivo según las especificaciones del fabricante.
- Reemplace los medios que contengan Luciferin con medios séricos frescos y completos e incube 24 h más. Repita el paso anterior, eliminando los medios y sustituyéndolos por un medio sérico completo que contenga 150 μg/mL D-Luciferin, seguido de una incubación de 5 min antes de medir la luminiscencia en el punto de tiempo 48 h.
- Para estudios longitudinales, mantener las células en condiciones estériles mientras se mide la luminiscencia. Continúe con la cultura en medios frescos y completos entre las mediciones después de reemplazar el contenido de Luciferin.
Nota: la concentración apropiada de siRNA variará con diferentes moléculas de si-NPs y siRNA. Cuando se utilizan poliplexos con carga neutra con un núcleo endosomolítico (p. ej., PEG-DB), 100 nM es típicamente bien tolerado por las células y produce > 75% luciferasa Knock-down. La relación de masa de PEG-DB a siRNA a 10 N+:P- ratio y 100 nm tratamientos siRNA (suponiendo 26 BP sirna) es 23,3, es decir, añadir 23,3 ng de PEG-dB por cada 1,0 ng de siRNA. Por ejemplo, añadir 1,16 μL de polímero 3,33 mg/mL para 166,5 ng de siRNA para tratar un pozo a 100 nM en una placa de 96-Well (100 mL de volumen de medios por pozo).
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Representative Results
Algunas características esenciales de los si-NPs efectivos para la entrega en vivo de siRNA son el tamaño adecuado (~ 20 – 200 nm de diámetro), el envasado de siRNA y la bioactividad del silenciamiento del gen. Si bien esta no es una lista exhaustiva (como se aborda en el debate), estas características básicas deben confirmarse antes de considerar la posibilidad de seguir probando una formulación.
La figura 2 ilustra la caracterización del tamaño del si-NP y la carga superficial sobre la formulación. DLS y TEM se utilizan como métodos complementarios para observar el tamaño del si-NP (ambos), la polidispersidad (DLS) y la morfología (TEM). Las mediciones de DLS muestran que el si-NP 1 tiene un diámetro promedio de 35 nm, una distribución unimodal indicada por la presencia de un solo pico, y una baja polidispersidad indicada por un ancho de pico relativamente estrecho (figura 2A). Las mediciones TEM confirman la medición del tamaño de la DLS, sugieren la presencia de una población uniforme de si-NPs, y revelan la morfología esférica del si-NPs (figura 2C). Las mediciones DLS y TEM de si-NP 2 revelan que tiene un tamaño no deseable (> 200 nm de diámetro) de diámetro medio 1.500 nm, una población multimodal y polidispersa, y agregados en solución, formando ninguna morfología de partícula distinta (figura 2B, D ). Ambos si-NPs 1 y 2 muestran una carga superficial neutral, indicada por valores de potencial zeta medio casi nulo (Figura 2E).
La eficiencia de carga de siRNA en si-NPs se caracteriza por el uso de un ensayo de retardo de gel de agarosa. El siRNA no complejado migra a través del gel de agarosa y se visualiza (debido a la Unión del bromuro de etidio) en el fondo del gel. Cuando siRNA es complejado con el polímero para formar si-NPs, la migración a través del gel de agarosa se obstruye y siRNA se visualiza en la parte superior del gel (o donde se cargó en pozos). Para el si-NPS basado en PEG-dB, complejación aumenta con el aumentode n+:P-proporciones hasta que se alcanza la compleción completa en ~ 10-20 n+:P- ratio (figura 3).
Luciferase se utiliza como un gen modelo para la evaluación rápida de la bioactividad de silenciamiento del gen si-NP. Las mediciones de bioluminiscencia a través de un lector de placas o un sistema de imágenes ópticas in vivo permiten la cuantificación rápida y de alto rendimiento de la expresión de la proteína luciferasa en formato de placa de pozo. Esta técnica es considerablemente más rápida, más barata y menos gravosa que analizar el silenciamiento del gen a través de análisis moleculares tradicionales como la PCR (expresión génica) y Western Blot (expresión proteica). Por este método, las células que expresan luciferasa se tratan con luciferasa si-NPS y revueltos si-NPS (como un control), y% luciferasa actividad se calcula comparando la señal de luminiscencia a las células no tratadas. Bioactive luciferasa si-NPS exhibirá significativamente disminuido% luciferasa actividad cuando se compara directamente con el control si-NP codificado, como se puede ver para si-NP 1 en la figura 4. Por el contrario, luciferasa si-NPS que no reducen% actividad luciferasa en comparación con el control codificado si-NP (como si-NP 2) no se consideran bioactivos (figura 4). A menudo 48 h es el tiempo de silenciamiento del gen máximo (figura 4), pero hemos observado un silenciamiento del gen significativo en los puntos de tiempo que van desde 24 h a 240 h post-tratamiento.
Figura 1. Química de polímeros y esquema si-NP. (A) composición química del copolímero del dibloque PEG-dB que compone el si-NPS y dota a la carga neutra de la superficie (bloque PEG) y al comportamiento sensible al pH (bloque dB). (B) autoensamblado de si-NPS. A pH 4,0, el bloque DB es soluble en agua porque las aminas terciarias DMAEMA son altamente protonadas. El bloque de base de datos positivamente cargado complejos electroestáticamente las moléculas siRNA cargadas negativamente. El pH se ajusta a ~ 7,4 por la adición de 5x tampón de fosfato de pH 8,0, lo que resulta en la "hidrofobización" de bloque DB y secuestro de siRNA y DB dentro del núcleo de si-NPs. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Caracterización de DLS y TEM de tamaño de si-NP, carga superficial y morfología. (A, C) si-NP 1 representa una muestra uniforme con el tamaño apropiado (~ 50-100 nm de diámetro), mientras que (B, D) si-NP 2 ha formado agregados indeseables, grandes y polidispersos. (E) ambos si-NPS muestran carga superficial casi neutral (potencial zeta). Las barras de error representan un error estándar. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Ensayo de retardación de gel de Agarose para evaluar la eficiencia de carga de si-NP siRNA. La desaparición de las bandas de siRNA en el fondo del gel indica la compleción de siRNA al polímero. El siRNA complejado por polímeros no puede migrar a través del gel y se visualiza así en la parte superior del gel cerca de los pozos de carga. Como la N+:P- ratio se incrementa, la compleción de siRNA aumenta, como se indica por la disminución de la intensidad de la banda de siRNA en la parte inferior del gel. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Derribe mediada por si-NP del gen modelo luciferasa en células de luciferase MDA-MB-231. Actividad de luciferasa en (A) 24 h y (B) 48 h post-tratamiento con si-NPS revueltos o luciferasa si-NPS a 10 N+:P- ratio y 100 nm dosis de siRNA. % La actividad de luciferasa se calcula dividiendo la señal de luminiscencia de las muestras de tratamiento (revueltos y luciferasa) por la señal de luminiscencia de las células no tratadas. Nota: si-NP 1 representa una formulación eficaz con la bioactividad del silenciamiento del gen, mientras que el si-NP 2 representa una formulación sin el silenciamiento del gen bioactividad. (*) indica una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05) en comparación con el grupo codificado para una formulación en un punto de tiempo determinado. Las barras de error representan un error estándar. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los si-NPs descritos aquí están formados por la Asociación electrostática de siRNA aniónica y polímeros catiónicos en complejos poliónicos (poliplexos). El complejado electrostático de siRNA y el bloque catiónico DB de los polímeros PEG-DB se facilitan mezclando a bajo pH (4,0). A pH 4,0, DMAEMA está altamente protonated, y consecuentemente el bloque DB está altamente cargado. Esto asegura que los polímeros se disuelvan como unimers en solución en lugar de formar micelas y que los complejos DB eficientemente con siRNA. Posteriormente, el pH de la solución se ajusta a neutro (pH 7,4), causando ' hidrofobización ' del bloque DB, formación de micelas, y atrapamiento de la siRNA complejada dentro del núcleo de los poliplexos resultantes. Estos poliplexos están diseñados de tal manera que el PEG forma una cáscara hidrófila e inerte alrededor del núcleo DB/siRNA, resultando en una carga superficial neutra que es necesaria para la administración sistémica. La química de polímeros y el proceso de formación de POLIPLEX se describen en la figura 1.
La caracterización fisicoquímica rigurosa de si-NPs es esencial para determinar si las formulaciones son apropiadas para pasar a pruebas biológicas. El tamaño, la carga superficial y la forma/morfología de las partículas son parámetros importantes que pueden afectar el rendimiento biológico. Para la entrega sistémica a los tumores, el tamaño del si-NP debe caer entre 20 – 200 nm de diámetro22, y los estudios más recientes sugieren que las partículas de 20 – 50 nm de diámetro son ideales23. La carga superficial debe ser neutra o ligeramente negativa para minimizar la adsorción proteica y la opsonización28. Los estudios han investigado la conexión entre la forma de partícula y la farmacocinética/aclaramiento de partículas, sugiriendo que las partículas con alta relación de aspecto son deseables sobre partículas esféricas29,30,31. Sin embargo, hasta la fecha las partículas esféricas son todavía más comúnmente empleadas, y para nuestro conocimiento, son la única forma de partícula que se han traducido a los estudios en humanos en oncología.
Es importante tener en cuenta que la formación uniforme y consistente de los poliplexos, como el si-NPs presentado aquí, depende de una gama de parámetros fisicoquímicos. Hemos encontrado empíricamente que la concentración de POLIPLEX, el pH de la solución, y la relación de polímero a siRNA (N+:P- ratio) todo el impacto drásticamente la formación de Polyplex. En nuestras manos, la concentración de siRNA no tiene un gran impacto en la formación de POLIPLEX, pero el uso de concentraciones de polímeros en exceso de 3,33 mg/mL resulta en la formación de grandes agregados y tamaño de POLIPLEX inconsistente. Como estos si-NPs son sensibles al pH, una variedad de problemas pueden surgir cuando el pH final de las soluciones de si-NP es demasiado ácido (< pH 7,2). Dos formas de prevenir estas complicaciones son la liofilización de polímeros en puro diH2O de manera que no haya sales para cambiar la composición del tampón tras la disolución y volver a hacer tampones con frecuencia para evitar la "deriva" del pH del tampón con el tiempo. Para ser cauteloso, el pH de los buffers debe ser confirmado cada vez antes de hacer si-NPs, y el pH final de las soluciones si-NP debe ser siempre verificado. Finalmente, el N+:P- ratio de si-NPS impacta la eficiencia de carga de siRNA y los parámetros fisicoquímicos de Polyplex. Existe típicamente un N+:P- ratio ideal en el que se carga todo siRNA pero no hay una sobreabundancia de polímero no complejado que forma poblaciones separadas de micelas y aumenta la citotoxicidad. Para el si-NPs presentado aquí, N+:P- 10-20 es el rango en el que se han observado una consistencia y rendimiento óptimos.
Las líneas celulares de la reportera luciferase se utilizan aquí para el análisis rápido y de alto rendimiento de la bioactividad del si-NP. Las líneas celulares de luciferase deben generarse o comprarse antes de iniciar el análisis de bioactividad, lo que requiere una inversión inicial en tiempo y gastos. Sin embargo, el uso de las células de la reportera luciferasa para evaluar el silenciamiento del gen es más rápido, más susceptible al análisis de alto rendimiento y más barato con el tiempo que realizar RT-PCR (para medir la expresión de mRNA) o manchas occidentales (para medir la expresión proteica). Por ejemplo, la medición de la luminiscencia en este ensayo suele tardar unos minutos en lugar de los procesos de día o de varios días necesarios para realizar el RT-PCR o los blots occidentales. Además, las mediciones de luminiscencia pueden realizarse en placas de pozo, lo que permite la cuantificación simultánea de muchas muestras (hasta 96-las placas de pozo han sido utilizadas por los autores). Por último, D-Luciferin es el único reactivo necesario por encima y más allá de los reactivos de cultivo celular típicos, lo que hace que el método sea mucho más asequible que RT-PCR o Western blot. Sin embargo, cabe señalar que el ensayo de célula de luciferasa se limita a evaluar únicamente el silenciamiento del gen del modelo de luciferasa y no se puede utilizar para medir el silenciamiento del gen de otros "genes terapéuticos" de interés. Por lo tanto, los autores remiten a los lectores a varios estudios en los que se ha utilizado RT-PCR y/o Western blot para evaluar el silenciamiento del gen de los genes terapéuticos de interés24,32,33,34.
Además de la bioactividad, los investigadores deberían considerar idealmente una gama completa de pruebas biológicas in vitro para caracterizar el rendimiento de si-NP. El ensayo luciferasa descrito anteriormente también se puede utilizar para evaluar la viabilidad celular comparando la señal de luminiscencia de las células tratadas con el si-NP en las células no tratadas. Dado que el siRNA es una secuencia sin objetivo, cualquier cambio en la luminiscencia puede atribuirse a un impacto no específico del si-NPs en la viabilidad de la célula, y este efecto es típicamente dependiente de la química del polímero y la cantidad molar. Las técnicas de citometría de flujo y microscopía fluorescente se pueden utilizar para evaluar la captación de células de si-NPs utilizando siRNAs etiquetados con fluorescentemente, polímeros o ambos. Además, se pueden utilizar técnicas moleculares como la PCR de bucle de tallo y la inmunoprecipitación de Argonaut 2 para medir con precisión los niveles intracelulares de siRNA. Dado que siRNA es sólo bioactivo si se entrega al citosol, donde se carga en RISC, si-NPs debe desencadenar la fuga endosómica de siRNA una vez internalizada por la célula. Los ensayos utilizados para medir experimentalmente la fuga endosómica incluyen el ensayo de hemólisis de glóbulos rojos (descrito en detalle por Evans et al.35), imágenes fluorescentes de la colocalización de la carga de si-NP con fluorescencia y LysoTracker36, y más recientemente, imágenes fluorescentes del reclutamiento de galectin 8 a vesículas endosómicas perforadas37,38. La recopilación de datos y la síntesis de los resultados de los experimentos in vitro para la viabilidad celular, la captación de células, la fuga endosómica y la bioactividad proporcionan al investigador piezas complementarias de información desde las que dibujar interpretaciones y reunir información sobre la efectividad de si-NP (in).
En Resumen, las nanopartículas capaces de suministrar eficazmente siRNA tienen un enorme potencial para tratar la enfermedad. Por ejemplo, en oncología, muchos genes que causan progresión del cáncer, resistencia a la terapia y metástasis son ' indrutables ' por Farmacología convencional, pero podrían tratarse usando siRNA. Sin embargo, el requisito previo para su uso en modelos animales de enfermedad, los nanomedicamentos siRNA (denominados aquí como si-NPs) requieren una caracterización fisicoquímica y biológica extensa para garantizar su seguridad y efectividad. Con este fin, los métodos han sido descritos en el presente para producir y caracterizar el si-NPs in vitro, por el cual el si-NPs puede ser evaluado para la idoneidad para llevar adelante en estudios en animales.
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Disclosures
Los autores no revelan posibles conflictos de interés.
Acknowledgments
Los autores están agradecidos a los doctores Craig Duvall y Rebecca Cook por el acceso a los datos y recursos de laboratorio para llevar a cabo esta investigación. Los autores están agradecidos al Instituto Vanderbilt de Ciencia e ingeniería de Nanoscale (VINSE) para el acceso a los instrumentos DLS y TEM (NSF EPS 1004083). Los autores están agradecidos a la Fundación Nacional de Ciencias por apoyar el programa de becas de posgrado (NSF # 1445197). Los autores están agradecidos a los institutos nacionales de salud para el apoyo financiero (NIH r01 EB019409). Los autores están agradecidos al programa de investigación médica dirigida por el Congreso del Departamento de defensa para apoyo financiero (DOD CDMRP OR130302).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm pore-size syringe filters | Thermo Fisher Scientific | F25133 | 17 mm diameter, PTFE membrane |
| 0-14 pH test strips | Millipore Sigma | P4786 | |
| 10x TAE buffer | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | AM9869 | |
| 6-7.7 pH test strips | Millipore Sigma | P3536 | |
| 96-well black walled plates | Corning | 3603 | Tissue-culture treated |
| Agarose Powder | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 16500 | |
| Citric acid monohydrate | Millipore Sigma | C1909 | |
| dibasic sodium phosphate dihydrate | Millipore Sigma | 71643 | |
| D-luciferin | Thermo Fisher Scientific | 88294 | Monopotassium Salt |
| DMEM | Gibco | 11995065 | High glucose and pyruvate |
| Ethanol | Millipore Sigma | 459836 | |
| ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 15585011 | |
| FBS | Gibco | 26140079 | |
| loading dye | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | R0611 | |
| Luciferase siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC AAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACU GAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases |
| MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells | GenTarget Inc | SC059-Bsd | Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity |
| monobasic sodium phosphate monohydrate | Millipore Sigma | S9638 | |
| Scarmbled siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUU AUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUAC GCGUA*T* *DNA bases |
| square polystyrene cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | 4.5 mL capacity |
| TEM grids | Ted Pella, Inc. | 1GC50 | PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper |
| Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804 | |
| uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 |
References
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