Summary
Metoder til at forberede og karakterisere de fysisk-kemiske egenskaber og Bioaktivitet af neutrally-ladede, pH-Responsive siRNA nanopartikler præsenteres. Kriterier for vellykkede siRNA nanomediciner såsom størrelse, morfologi, overflade ladning, siRNA lastning, og genhæmning diskuteres.
Abstract
Den succes siRNA som en målrettet Molekylær medicin er afhængig af sin effektive cytosoliske levering til celler i vævet af patologi. Der er opnået klinisk succes med behandling af tidligere ' ubeskadigede ' hepatiske sygdoms mål med siRNA. Men, effektiv tumor siRNA levering kræver yderligere farmakokinetiske design overvejelser, herunder lang cirkulation tid, unddragelse af clearance organer (f. eks, leveren og nyrerne), og tumor penetration og fastholdelse. Her beskriver vi forberedelsen og in vitro fysisk-kemiske/biologiske karakterisering af polymere nanopartikler designet til effektiv siRNA levering, især til ikke-hepatisk væv såsom tumorer. SiRNA nanopartiklerne fremstilles ved elektrostatisk komplexering af siRNA og diblok copolymer poly (ethylenglycol-b-[2-(dimethylamino) ethylmethacrylat-Co-butylmethacrylat]) (peg-dB) til dannelse af polyion-komplekser ( polyplexer), hvor siRNA er afsondret inden for Polyplex-kernen, og PEG danner en hydrofile, neutrally-ladet Corona. Desuden bliver DB blokken membran-lytisk som vesikler af endolysosomale pathway acidificering (< pH 6,8), udløser endosomal flugt og cytosoliske levering af siRNA. Metoder til at karakterisere de fysisk-kemiske egenskaber af siRNA nanopartikler såsom størrelse, overflade ladning, partikel morfologi, og siRNA lastning er beskrevet. Bioaktivitet af siRNA nanopartikler måles ved hjælp af luciferase som et model-gen i en hurtig og høj gennemløb genhæmnings analyse. Design, der passerer disse indledende tests (såsom PEG-DB-baserede polyplexer) anses for passende til oversættelse til prækliniske dyreforsøg, der vurderer leveringen af siRNA til tumorer eller andre steder af patologi.
Introduction
Fordi sirnas hæmmer oversættelsen af proteiner fra mRNA-sekvenser, kan de teoretisk bruges til at stof alle kendte patologier1,2,3,4,5. Brugen af siRNA i medicin er imidlertid begrænset af den omfattende dårlige farmakokinetiske profil af siRNA-molekyler6,7. Når der injiceres intravenøst, ryddes sirnas hurtigt gennem nyrerne og/eller nedbrydes af nukleaser8,9. På grund af sin store størrelse og negative ladning kan siRNA ikke trænge ind i cellerne eller undslippe endolysosomal pathway for at få adgang til det RNA-inducerede lyddæmpnings kompleks (RISC), der findes i cytosol10,11,12, 13. det er Derfor har en omfattende indsats fokuseret på design og implementering af siRNA leveringsstrategier14. Denne indsats har i høj grad fokuseret på udvikling af lipid-og polymer-baserede nanopartikler, som pakke siRNA, beskytte det mod clearance og nedbrydning in vivo, og initiere cellulære optagelse og endosomal undslippe gennem ionizable, kationiske Amin grupper. Der er rapporteret om mange prækliniske succeser, og senest er den første kliniske succes blevet rapporteret for nanopartikel-baseret hepatisk siRNA-levering til behandling af arvelig transthyretin-medieret (hATTR) amyloidose15.
Der er mange kræftfremkaldende gener, der i øjeblikket er "ubeskadigede" af konventionelle farmakologi (dvs., små molekyle narkotika), motiverende design af polymere siRNA nanopartikler (si-NPs) til behandling af kræft16. Der er dog et separat sæt af design parametre, der skal overvejes for ikke-hepatisk siRNA levering. Leveringssystemet skal beskytte den kationiske ladning af Polyplex, som forårsager agglutinations i det systemiske kredsløb17,18,19. For tumor levering, specifikt, si-NP stabilitet er afgørende for udstyre lang cirkulation og dermed øget akkumulering inden tumorer via den forstærkede permeabilitet og retention (EPR) effekt20,21. Desuden, kontrol over si-NP størrelse er afgørende, da kun nanopartikler ca 20 – 200 Nm diameter i størrelse gearing EPR22, og mindre si-NPS (~ 20 – 50 nm diameter) udviser forbedret tumor penetration over større størrelse nanopartikler og mikropartikler23.
For at løse disse yderligere konstruktions begrænsninger for systemisk tumor levering af siRNA efter intravenøs administration er der udviklet neutrally-ladede, pH-Responsive si-NP'er (figur 1)24. Disse si-NPs er pegyleret, eller senest, Zwitterionated25, for neutral overflade opladning og resistens over for protein adsorption og opsonisation i omløb. Da de ikke kan stole udelukkende på kationisk karakter til at drive intracellulære levering, ekstremt effektiv endosomal flugt er bydende nødvendigt for at opnå potent genhæmning. Derfor består kernen af disse si-NP'er af en meget endosomolytisk kerne, som er inaktiv ved ekstracellulær pH (7,4), men som udløses på en switch-lignende måde i de syrnede forhold på endolysosomal pathway [pH 6,8 (tidlige endosomer) – 5,0 ( lysosomer)]. Endelig giver en blanding af kationisk og Hydrofobisk indhold i kernen af si-NPs både elektrostatiske og van der Waals stabiliserings kræfter, hvilket forbedrer stabiliteten af si-NP'er i blodet sammenlignet med blot kationiske systemer.
Integrationen af mange funktioner i et relativt simpelt design er muligt ved hjælp af reversible addition-fragmentering kæde Transfer (RAFT) kontrolleret polymerisering til at producere polymerer med kompleks arkitektur og præcis sammensætning. For at producere si-NPs med neutral overflade opladning, pH-reaktionsevne, og NP stabilitet, er TØMMERFLÅDE bruges til at syntetisere poly (ethylenglycol-b-[2-(dimethylamino) ethylmethacrylat-Co-butylmethacrylat]) (peg-DB; Figur 1a). Peg-DB er elektrostatisk kompleks bundet med siRNA, der danner si-NPS med en peg Corona og DB/siRNA kerne (figur 1b). PEG danner et inert, neutralt ladet hydrofile lag på si-NP Corona. DB blokken består af en 50:50 molær ratio på 2-(dimethylamino) ethylmethacrylat (DMAEMA) og butylmethacrylat (BMA). Kationiske DMAEMA elektrostatiske komplekser negativt opladet siRNA. BMA Self-Associates inden for NP kerne af van der Waals interaktioner, øge NP stabilitet. Sammen, DMAEMA og BMA overgive pH-afhængige lipid bilayer-lytisk opførsel til DB polymer blokken. Ved ekstracellulær pH, er DB blokken sekvenestered til si-NP kerne og er inaktiv til lipid bilag. Under sure forhold, såsom dem inden for endolysosomal pathway, letter ionisérbare dmaema inden for DB blokken proton svamp effekt, hvor endosomal buffer fører til osmotisk hævelse og ruptur26. Derudover er hydrofobe BMA-fuser i DB-blokken aktivt integreret i og lysere lipid-bilag, hvilket resulterer i potent endosomolyse. Således er siRNA kompleks bundet med peg-dB til at danne si-NPS, der er neutralt-ladede og meget stabile ved ekstracellulær pH, men som forstyrrer lipid bilag ved sur pH, hvilket sikrer cytosoliske levering af siRNA nyttelast.
Heri beskrives de eksperimentelle procedurer til fremstilling af si-NP'er fra PEG-DB. Metoder til at karakterisere de fysisk-kemiske parametre og Bioaktivitet af si-NPs præsenteres og diskuteres. For hurtigt at kunne vurdere si-NP-Bioaktivitet anvendes luciferase som et model-gen til Knockdown undersøgelser. Firefly luciferase er det protein, der er ansvarlig for "glød" af ildfluer27. Derfor producerer pattedyrsceller, der er transficeret med Firefly luciferase-genet, en bioluminescerende ' glød ', der kan optages ved hjælp af et luminometer til kvantificering af niveauet af luciferase-ekspression. Her bruger vi luciferase til at vurdere Bioaktivitet af si-NPS ved at levere siRNA mod luciferase og kvantificere den tilsvarende reduktion i bioluminescens i luciferase-udtrykker celler sammenlignet med celler, der modtager en røræg siRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. udarbejdelse og karakterisering af si-NP'er
- forberedelse af si-NP
- Polymer opløses i 10 mM citronsyre buffer (pH 4,0) ved 3,33 mg/mL. Polymer kan først opløses ved 10x koncentration i ethanol for at sikre opløsning.
Bemærk: polymer kan opløses ved lavere koncentrationer, men anvendelse ved koncentrationer over 3,33 mg/mL kan forhindre homogen dannelse af NP. - Tilsæt siRNA (50 μM i diH2O) til at resultere i N+:P- forhold på 10. Bland polymer-og siRNA-opløsninger grundigt ved pipettering, og lad inkuere i 30 minutter. N+:P- ratio repræsenterer antallet af positivt ladede amingrupper på polymeren til antallet af negativt ladede fosfat grupper på siRNA og beregnes ved formlen nedenfor:
hvor, mol Pol er den molære mængde polymer, er RU Amin antallet af gentagne enheder af positivt ladede aminer pr. polymer, mol siRNA er den molære mængde siRNA, og BP siRNA er antallet af base-par pr. siRNA-molekyle. - Tilsæt et 5-fold overskud af 10 mM fosfatbuffer (pH 8,0) og bland forsigtigt enten ved at pipette eller invertere røret. For at bekræfte, at den endelige pH-værdi er neutral (~ 7,2-7,5), pipette 10 μL si-NP-opløsning på pH-teststrimler.
Bemærk: citronsyre og fosfat buffere fremstilles i henhold til Millipore Sigma buffer reference Center Charts.
- Polymer opløses i 10 mM citronsyre buffer (pH 4,0) ved 3,33 mg/mL. Polymer kan først opløses ved 10x koncentration i ethanol for at sikre opløsning.
- Fysisk-kemisk karakterisering af si-NP'er
- Optag størrelse og overflade ladning af resulterende si-NPs ved hjælp af dynamisk lysspredning (DLS). Der fremstilles en DLS-prøve ved at filtrere 1 mL si-NPs (0,1 – 1,0 mg/mL) gennem 0,45 μm-sprøjte filtre i porestørrelse til et kvadratisk kvarts eller polystyren kuvette. Optag størrelse og overflade opladnings målinger ved hjælp af et DLS-instrument i henhold til fabrikantens specifikationer.
- Bekræft størrelsen og morfologien af si-NPs ved billedanalyse ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM).
- Der tilsættes 5 μL si-NP-opløsning ved 1 mg/mL til TEM-gitre, og der inkubeeres til 60 s. blot tør i 3 s.
- Der tilsættes 5 μL 3% uranylacetat opløsning, og der inkueres i 20 s. blot tør i 3 s. tørre gitre natten over under tørring.
- Billednet i henhold til den protokol, der er fastsat for det specifikke mikroskop, der skal anvendes.
- Karakterisere lastning af siRNA i si-NPs ved forskellige N+:P- nøgletal ved hjælp af agrose gel retardering.
- For at fremstille 2% agopstået gel tilsættes 2 g elektroforese grade-agopstået pulver til 100 mL 1x TAE (Tris-acetat-EDTA) buffer ved pH 8,0. Rør til suspension agopstået. Varme afsløret i mikrobølgeovnen, indtil alle agopstod er opløst (1-3 min.).
- Når afkølet, tilsættes 5 μL ethidium bromid (10 mg/mL i H2O), og blandes godt. Hæld agopstået i en gel bakke og sted kam til at producere brønde, lade tørre i 30 min. forsigtigt fjerne kam til at efterlade lastning brønde, og fylde gelbakken til max fylde linje med 1x TAE buffer.
- Generer si-NPs (i henhold til proceduren ovenfor) på 0, 1, 2, 5, 7, 10, 20 og 40 N+:P- nøgletal. Der anbringes 2 μL aliquoter af indladnings farve (ingen SDS og reduktionsmidler) på paraffin folie for hver si-NP-formulering. Der blandes 10 μL si-NP-opløsning med læsse farve på paraffin folie med pipette.
- Tilsæt si-NP/loading Dye-opløsninger til agopstået gel brønde. Kør spændingskilde ved 100 V i 35 min (eller indtil prøverne har krydset 80% af gelens længde).
- Visualiser siRNA-båndene på en UV-transilluminator i henhold til producentens specifikationer.
- Bekræft størrelsen og morfologien af si-NPs ved billedanalyse ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM).
2. bestemmelse af si-NPs in vitro-Bioaktivitet
- Knockdown af modellen gen luciferase
- Generer luciferase si-NPS (i henhold til proceduren ovenfor) ved hjælp af luciferase siRNA og røræg si-NPS ved hjælp af en røræg siRNA sekvens som en kontrol. Formualte begge si-NP'er ved samme endelige N+:P-ratio og ved det optimale forhold, som blev identificeret ved agopstået gel retardering- studier. Eksempel siRNA-sekvenser er inkluderet i tabellen over materialer.
- Frø luciferase-udtrykker celler [MDA-MB-231/luciferase (BSD) stabile celler] i 96-godt sort-walled plader på en massefylde på 2.000 celler per brønd. Tillad at overholde natten i fuld medier (DMEM, 10% FBS) i en inkubator (37 °C, 5% CO2, 95% fugtighed).
- Der fortyndes si-NPs til fulde serum medier til et endeligt volumen på 100 μL pr. brønd og siRNA-koncentration på 100 nM. Behandl celler i 24 timer med si-NP'er.
- Efter 24 timer skal du fjerne behandlingerne og udskifte medier med komplette serum medier, der indeholder 150 μg/mL D-luciferin. Cellerne inkuieres i 5 minutter, inden de måler luminescens på en plade læser eller in vivo optisk billedbehandlingssystem i henhold til fabrikantens specifikationer.
- Udskift de luciferin-holdige medier med friske, fulde serum medier, og inkuleter 24 timer mere. Gentag ovenstående trin, fjernelse af medier og udskiftning med komplette serum medier indeholdende 150 μg/mL D-luciferin, efterfulgt af en 5 min inkubation før måling af luminescens ved 48 h-tidspunktet.
- I langsgående undersøgelser skal cellerne vedligeholdes under sterile forhold, mens luminescens måles. Fortsæt til kultur i friske, fulde medier mellem målinger efter udskiftning af luciferin-holdige.
Bemærk: den passende siRNA-koncentration vil variere med forskellige si-NP'er og siRNA-molekyler. Ved brug af neutralt ladede polyplexer med en endosomolytisk kerne (f. eks. PEG-DB), 100 nM er typisk veltolereret af cellerne og producerer > 75% luciferase Knockdown. Massen ratio af PEG-DB til siRNA ved 10 N+:P- ratio og 100 nm siRNA behandlinger (forudsat 26 BP sirna) er 23,3, dvs, tilsæt 23,3 ng af peg-DB for hver 1,0 ng af siRNA. For eksempel tilsættes 1,16 μL af 3,33 mg/mL polymer til 166,5 ng af siRNA for at behandle en brønd ved 100 nM i en 96-brønd plade (100 mL medie volumen pr. brønd).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nogle væsentlige karakteristika ved effektive si-NP'er for in vivo siRNA-levering er den korrekte størrelse (~ 20 – 200 Nm-diameter), siRNA-emballering og genhæmnings Bioaktivitet. Selv om dette ikke er en udtømmende liste (som omtalt i diskussionen), bør disse grundlæggende egenskaber bekræftes, før man overvejer yderligere testning af en formulering.
Figur 2 illustrerer karakteriseringen af si-NP størrelse og overflade ladning ved formulering. DLS og tem anvendes som komplementære metoder til at observere si-NP størrelse (begge), polydispersitet (DLS), og morfologi (tem). DLS-målinger viser, at si-NP 1 har en gennemsnitlig diameter på 35 nm, unimodal fordeling, der er angivet ved tilstedeværelsen af en enkelt top, og lav polydispersitet angivet med en relativt smal spids bredde (figur 2a). TEM-målinger bekræfter størrelses målingen fra DLS, antyder tilstedeværelsen af en ensartet population af si-NP'er og afslører den sfæriske morfologi for si-NP'er (figur 2c). DLS-og TEM-målinger af si-NP 2 afslører, at den har en uønsket størrelse (> 200 Nm-diameter) med en gennemsnitlig diameter på 1.500 nm, en multimodal og polydispergeringspopulation og aggregater i opløsning, der ikke danner nogen særskilt partikel morfologi (figur 2b, D ). Både si-NPs 1 og 2 display neutral overflade opladning, angivet ved nær nul gennemsnitlige Zeta potentielle værdier (figur 2E).
Loading effektivitet af siRNA i si-NPs er karakteriseret ved hjælp af en agopstået gel retardering assay. Un-complexed siRNA migrerer gennem agopstået gel og er visualiseret (på grund af binding af ethidium bromid) på gel bunden. Når siRNA er kompleks bundet med polymer til at danne si-NPS, er migration gennem agrose gel blokeret og siRNA er visualiseret på geltoppen (eller hvor det blev lastet i brønde). For peg-DB-baserede si-NPS øges kompleksdannelse med stigende N+:P- ratioer, indtil fuld komplexation opnås ved ~ 10-20 N+:P- ratio (figur 3).
Luciferase anvendes som et model-gen til hurtig vurdering af si-NP-genhæmning af Bioaktivitet. Bioluminescens målinger via en plade læser eller in vivo optisk billedbehandlingssystem muliggør hurtig kvantificering af luciferaseproteinekspression i brønd plade format. Denne teknik er betydeligt hurtigere, billigere og mindre besværlig end at analysere genhæmning gennem traditionelle molekylære analyser som PCR (genekspression) og Western blot (protein udtryk). Ved denne metode, er luciferase-udtrykker celler behandlet med luciferase si-NPS og røræg si-NPS (som en kontrol), og% luciferase aktivitet beregnes ved at sammenligne luminescens signal til ubehandlede celler. Bioaktive luciferase si-NPs vil udvise signifikant formindsket% Luciferaseaktivitet, når den sammenlignes direkte med forvrænget si-NP-kontrol, som det kan ses for si-NP 1 i figur 4. I modsætning hertil anses luciferase si-NPs, der ikke reducerer Luciferaseaktivitet i forhold til forvrænget si-NP-kontrol (såsom si-NP 2), ikke som bioaktive (figur 4). Ofte 48 h er tidspunktet for maksimal genhæmning (figur 4), men vi har observeret signifikant genhæmning på tidspunkter, der spænder fra 24 h til 240 h efter behandling.
Figur 1. Polymer kemi og si-NP skematisk. (A) den kemiske sammensætning af pind-DB diblok copolymer, der komponerer si-NPS og forlener neutral overflade ladning (peg blok) og ph-responsiv opførsel (db blok). B) selvsamling af si-NP'er. Ved pH 4,0 er DB-blokken vandopløselig, fordi DMAEMA tertiære aminer er stærkt protonerede. Den positivt ladede DB blok elektrostatisk komplekser negativt ladede siRNA molekyler. PH justeres derefter til ~ 7,4 ved tilsætning af 5x pH 8,0 fosfatbuffer, hvilket resulterer i "hydrofobization" af DB blok og binding af siRNA og DB inden for kernen af si-NPs. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. DLS og TEM karakterisering af si-NP størrelse, overflade ladning, og morfologi. (A, C) si-NP 1 repræsenterer en ensartet prøve med passende størrelse (~ 50-100 nm diameter), hvorimod (b, D) si-NP 2 har dannet uønskede, store og polydispers aggregater. (E) begge si-NP'er udviser nær-neutral overflade ladning (zeta-potentiale). Fejllinjer repræsenterer standardfejl. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Agrose gel retardering-assay til vurdering af si-NP siRNA-belastnings effektivitet. SiRNA-bandens forsvinden ved gel-bunden indikerer kompleksdannelse af siRNA til polymer. Polymer-complexed siRNA er ude af stand til at migrere gennem gelen og er således visualiseret i toppen af gelen i nærheden af læsse hullerne. Da N+:P-ratio øges, øges siRNA kompleksdannelse, hvilket indikeres af nedsat intensitet af siRNA- båndet ved gelbunden. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Si-NP-medieret Knockdown af model genet luciferase i luciferase MDA-MB-231 celler. Luciferaseaktivitet ved (a) 24 h og (B) 48 h efter behandling med enten røræg si-NPS eller luciferase si-NPS ved 10 N+:P- ratio og 100 nm siRNA dosis. % Luciferaseaktivitet beregnes ved at dividere luminescens signalet fra behandlings prøverne (scrambled og luciferase) med luminescens signalet fra ubehandlede celler. Bemærk: si-NP 1 repræsenterer en effektiv formulering med genhæmnings Bioaktivitet, hvorimod si-NP 2 repræsenterer en formulering uden genhæmning af Bioaktivitet. (*) indikerer en statistisk signifikant forskel (p < 0,05) sammenlignet med scrambled gruppen for en formulering på et givent tidspunkt. Fejllinjer repræsenterer standardfejl. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De her beskrevne si-NPs dannes ved elektrostatisk sammenslutning af anioniske siRNA og kationiske polymerer i polyionkomplekser (polyplexer). Elektrostatisk kompleksning af siRNA og den kationiske DB-blok af PEG-DB-polymerer lettes ved at blande ved lav pH-værdi (4,0). Ved pH 4,0 er DMAEMA meget protoneret, og derfor er DB blokken meget opladet. Dette sikrer, at polymerer opløses som unimere i opløsning i modsætning til at danne miceller, og at DB komplekser effektivt med siRNA. Efterfølgende justeres opløsningens pH-værdi til neutral (pH 7,4), hvilket forårsager "hydro fobisering" af DB-blokken, Micelle dannelse og indklemning af den kompleks bundet siRNA i kernen af de resulterende polyplexer. Disse polyplexer er konstrueret således, at PEG danner en hydrofile, inaktiv Shell omkring DB/siRNA kerne, hvilket resulterer i neutral overflade ladning, der er nødvendig for systemisk administration. Polymer kemi og proces af Polyplex formation er skitseret i figur 1.
Streng fysisk-kemisk karakterisering af si-NP'er er afgørende for at afgøre, om formuleringer er egnede til at bevæge sig ind i biologiske test. Størrelse, overflade ladning, og partikelform/morfologi er alle vigtige parametre, der kan påvirke den biologiske ydeevne. For systemisk levering til tumorer, si-NP størrelse bør falde mellem 20 – 200 Nm diameter22, og de seneste undersøgelser tyder på 20 – 50 nm diameter partikler er ideelle23. Overflade ladning skal være neutral eller svagt negativ for at minimere protein adsorption og opsonisation28. Undersøgelser har undersøgt forbindelsen mellem partikelform og farmakokinetik/partikel clearance, tyder partikler med høj størrelsesforhold er ønskeligt over sfæriske partikler29,30,31. Men, til dato sfæriske partikler er stadig mest almindeligt anvendte, og til vores viden, er den eneste partikelform, der er blevet oversat til humane undersøgelser i onkologi.
Det er vigtigt at bemærke, at den ensartede og konsekvente dannelse af polyplexer, såsom si-NPs præsenteret her, er afhængig af en række fysisk-kemiske parametre. Vi har fundet empirisk, at Polyplex koncentration, pH af opløsningen, og forholdet mellem polymer til siRNA (N+:P- ratio) alle drastisk indvirkning Polyplex formation. I vores hænder, siRNA koncentration ikke har en stor indvirkning på Polyplex formation, men ved hjælp af polymer koncentrationer i over 3,33 mg/mL resulterer i dannelsen af store aggregater og inkonsistent Polyplex størrelse. Da disse si-NP'er er pH-Responsive, kan der opstå en række problemer, når den endelige pH-værdi af si-NP-opløsninger er for sur (< pH 7,2). To måder at forebygge disse komplikationer er at lyofilisere polymerer i ren diH2O, så der er ingen salte til at ændre buffer sammensætning ved opløsning og til at re-gøre buffere ofte for at forhindre "Drifting" af buffer pH over tid. For at være forsigtig skal pH-værdien af buffere bekræftes hver gang, før der foretages si-NP'er, og den endelige pH-værdi af si-NP-opløsninger skal altid verificeres. Endelig, N+:P- forholdet mellem si-NPS påvirker siRNA loading effektivitet og Polyplex fysisk-kemiske parametre. Der findes typisk en ideel N+:P- ratio, hvor alle siRNA er indlæst, men der er ikke en overflod af un-complexed polymer, som danner separate populationer af miceller og øger cytotoksicitet. For si-NPs præsenteret her, N+:P- 10-20 er det område, hvor optimal konsistens og ydeevne er blevet observeret.
Luciferase reporter cellelinjer bruges her til hurtig og høj-gennemløb analyse af si-NP Bioaktivitet. Luciferase reporter cellelinjer skal genereres eller købes før påbegyndelse af Bioaktivitet analyse, hvilket kræver en initialinvestering i tid og omkostninger. Men, brug af luciferase reporter celler til at vurdere genhæmning er hurtigere, mere underholdende til høj-gennemløb analyse, og billigere over tid end at udføre RT-PCR (til at måle mRNA udtryk) eller Western klatter (til at måle protein udtryk). For eksempel, måling luminescens i denne analyse tager typisk kun et par minutter i modsætning til hele dagen eller flere dage processer er nødvendige for at udføre RT-PCR eller Western blots. Desuden kan der foretages luminescens målinger på brønd plader, hvilket giver mulighed for samtidig kvantificering af mange prøver (op til 96-brønd plader er blevet brugt af forfatterne). Endelig er D-luciferin det eneste reagens, der er nødvendigt ud over typiske celle dyrknings reagenser, hvilket gør metoden meget mere overkommelig end RT-PCR eller Western blot. Det skal dog bemærkes, at luciferase reporter celle assay er begrænset til kun at vurdere genhæmning af modellen gen luciferase og kan ikke bruges til at måle genhæmning af andre "terapeutiske gener" af interesse. Forfatterne henviser således læserne til flere undersøgelser, hvor RT-PCR og/eller Western blot er blevet anvendt til at vurdere genhæmning af terapeutiske gener af interesse24,32,33,34.
Ud over Bioaktivitet, bør forskerne ideelt overveje en omfattende farveskala af in vitro biologiske tests for at karakterisere si-NP ydeevne. Den ovenfor beskrevne luciferaseanalyse kan også anvendes til at vurdere cellernes levedygtighed ved at sammenligne luminescens signalet fra kodede si-NP-behandlede celler med ubehandlede celler. Da siRNA er en ikke-målretnings sekvens, kan enhver ændring i luminescens tilskrives ikke-specifikke virkninger af si-NPs på cellernes levedygtighed, og denne effekt er typisk afhængig af polymer kemi og molær mængde. Teknikker i flow cytometri og fluorescerende mikroskopi kan bruges til at vurdere cellernes optagelse af si-NPs ved hjælp af fluorescerende mærkede siRNAs, polymerer eller begge dele. Derudover kan molekylære teknikker såsom Stam løkke PCR og Argonaut 2 immunopræcipitation anvendes til præcist at måle intracellulære siRNA-niveauer. Da siRNA kun er Bioaktiv, hvis det leveres til cytosol, hvor det indlæses i RISC, skal si-NPs udløse endosomal flugt fra siRNA, når det er internaliseret af cellen. Assays, der anvendes til eksperimentelt at måle endosomal flugt, omfatter de røde blodlegemer hæmolyse-assay (beskrevet i detaljer af Evans et al.35), fluorescerende billeddannelse af samlokalisering af optælling mærket si-NP-last og lysotracker36, og senest, fluorescerende billeddiagnostik af rekrutteringen af galectin 8 til punkterede endosomale vesikler37,38. Indsamling af data og syntetisere resultaterne fra in vitro eksperimenter for cellernes levedygtighed, celle optagelse, endosomal flugt, og Bioaktivitet giver forskeren komplementære stykker af oplysninger, hvorfra man kan drage fortolkninger og samle mekanistiske indsigt om si-NP (i) effektivitet.
Kort sagt har nanopartikler, der effektivt kan levere siRNA, et enormt potentiale til at behandle sygdomme. For eksempel, i onkologi, mange gener, der forårsager kræft progression, resistens over for terapi, og metastaser er ' uruggable ' af konventionelle farmakologi, men kunne behandles ved hjælp siRNA. Men, forudsætning for deres anvendelse i dyremodeller af sygdom, siRNA nanomediciner (omtales her som si-NPs) kræver omfattende fysisk-kemiske og biologiske karakterisering for at sikre både deres sikkerhed og effektivitet. Med henblik herpå er der beskrevet metoder til at fremstille og karakterisere si-NP'er in vitro, hvorved det kan vurderes, om de er egnede til at videreføre til dyreforsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne afslører ingen potentielle interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelige for DRs. Craig Duvall og Rebecca Cook for adgang til data og lab ressourcer til at gennemføre denne forskning. Forfatterne er taknemmelige for Vanderbilt Institute for Nanoscale Science and Engineering (VINSE) for adgang til DLS og TEM (NSF EPS 1004083) instrumenter. Forfatterne er taknemmelige for National Science Foundation for at støtte Graduate Research Fellowship Program (NSF # 1445197). Forfatterne er taknemmelige for de nationale institutter for sundhed for økonomisk støtte (NIH R01 EB019409). Forfatterne er taknemmelige for Department of Defense Congressionally instrueret medicinsk forskning program for økonomisk støtte (DOD CDMRP OR130302).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm pore-size syringe filters | Thermo Fisher Scientific | F25133 | 17 mm diameter, PTFE membrane |
| 0-14 pH test strips | Millipore Sigma | P4786 | |
| 10x TAE buffer | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | AM9869 | |
| 6-7.7 pH test strips | Millipore Sigma | P3536 | |
| 96-well black walled plates | Corning | 3603 | Tissue-culture treated |
| Agarose Powder | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 16500 | |
| Citric acid monohydrate | Millipore Sigma | C1909 | |
| dibasic sodium phosphate dihydrate | Millipore Sigma | 71643 | |
| D-luciferin | Thermo Fisher Scientific | 88294 | Monopotassium Salt |
| DMEM | Gibco | 11995065 | High glucose and pyruvate |
| Ethanol | Millipore Sigma | 459836 | |
| ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 15585011 | |
| FBS | Gibco | 26140079 | |
| loading dye | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | R0611 | |
| Luciferase siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC AAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACU GAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases |
| MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells | GenTarget Inc | SC059-Bsd | Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity |
| monobasic sodium phosphate monohydrate | Millipore Sigma | S9638 | |
| Scarmbled siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUU AUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUAC GCGUA*T* *DNA bases |
| square polystyrene cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | 4.5 mL capacity |
| TEM grids | Ted Pella, Inc. | 1GC50 | PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper |
| Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804 | |
| uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 |
References
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).
- Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).
- Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244 (2002).
- Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
- Wittrup, A., Lieberman, J. Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543 (2015).
- Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies. Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).
- Bartlett, D. W., Davis, M. E. Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing. Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).
- Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. E. Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (8), 3137-3142 (2012).
- Dominska, M., Dykxhoorn, D. M. Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape. Journal of Cell Science. 123 (Pt 8), 1183-1189 (2010).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle–mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638 (2013).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nature Biotechnology. 33 (8), 870-876 (2015).
- Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
- Adams, D., et al. Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis. New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).
- Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502 (2017).
- Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).
- Verbaan, F. J., et al. The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration. International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).
- Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).
- Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. C. Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities. Nature Reviews Cancer. 17 (1), 20 (2016).
- Torchilin, V. Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (3), 131-135 (2011).
- Duncan, R. The dawning era of polymer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (5), 347 (2003).
- Tang, L., et al. Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (43), 15344-15349 (2014).
- Nelson, C. E., et al. Balancing Cationic and Hydrophobic Content of PEGylated siRNA Polyplexes Enhances Endosome Escape, Stability, Blood Circulation Time, and Bioactivity in vivo. ACS Nano. 7 (10), 8870-8880 (2013).
- Jackson, M. A., et al. Zwitterionic Nanocarrier Surface Chemistry Improves siRNA Tumor Delivery and Silencing Activity Relative to Polyethylene Glycol. ACS Nano. , (2017).
- Akinc, A., Thomas, M., Klibanov, A. M., Langer, R. Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis. The Journal of Gene Medicine. 7 (5), 657-663 (2005).
- de Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).
- Aggarwal, P., Hall, J. B., McLeland, C. B., Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 428-437 (2009).
- Geng, Y., et al. Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery. Nature Nanotechnology. 2 (4), 249 (2007).
- Chauhan, V. P., et al. Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration. Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).
- Chu, K. S., et al. Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft. Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).
- Werfel, T. A., et al. Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival. Cancer Research. 78 (7), 1845-1858 (2018).
- Sarett, S. M., et al. Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).
- Williams, M. M., et al. Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers. Cell Death and Disease. 9 (2), 21 (2018).
- Evans, B. C., et al. Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs. Journal of Visualized Experiments. (73), e50166 (2013).
- Werfel, T., et al. Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo. Journal of Controlled Release. , (2017).
- Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes. Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).
- Kilchrist, K. V., et al. Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability. ACS Nano. , (2019).
