Summary
שיטות להכין ולאפיין את המאפיינים הפיסיוכימיים ואת אתריים של מחויב נייטרליים, מגיב pH-תגובה sirna מוצגים. הקריטריונים של siRNA nanomedicines מוצלחת כגון גודל, מורפולוגיה, טעינה משטח, העמסה siRNA, והשתקה גנים נדונים.
Abstract
ההצלחה של siRNA כרפואה מולקולרית ממוקד תלויה המסירה cytosolic יעיל שלה תאים בתוך רקמת הפתולוגיה. הצלחה קלינית לטיפול בעבר "undruggable" מטרות מחלות הכבד עם siRNA הושג. עם זאת, מסירה יעילה siRNA הגידול מחייבת שיקולים עיצוב נוספים פרמקוקינטיים, כולל זמן מחזור ארוך, התחמקות של איברי הסיווג (למשל, כבד וכליות), וחדירה לגידול ושמירה. כאן, אנו מתארים את ההכנה ומבחינה גופנית פיסיופיזיולוגיה/ביולוגיים אפיון של חלקיקים פולימריים מיועד משלוח siRNA יעיל, במיוחד רקמות שאינן הכבד כגון גידולים. חלקיקים siRNA מוכנים על ידי complexation אלקטרוסטטית של siRNA ואת diblock סומד פולי (אתילן גליקול-b-[2-(dimethylamino) אתיל מתיונין-co-בוטיל מתיונין) (יתד-DB) כדי ליצור מתחמי polyion ( פוליפלסים) כאשר siRNA ממוקם בתוך הליבה פוליפקס ו-פג צורות של הידרופיפילית, הקורונה הטעונה באופן נייטרליים. יתר על כן, בלוק DB הופך ממברנה-lytic כמו שלפוחיות של המסלול endolysoזומacidify (< pH 6.8), מפעיל בריחה אנדוזומטית ו ציטוסולג משלוח של siRNA. שיטות לאפיון המאפיינים הפיסיוכימיים של חלקיקים siRNA כגון גודל, משטח המטען, החלקיקים מורפולוגיה, ואת הטעינה siRNA מתוארים. Bioactivity של חלקיקים siRNA נמדד באמצעות לוציפראז כמו גן מודל בתוך מהירה, תפוקה גבוהה של גנים השתקה שיטת. עיצובים אשר עוברים אלה המבחנים הראשוניים (כגון מבוססי יתד-DB פוליפלסים) נחשבים מתאימים תרגום למחקרים בעלי חיים טרום קלינית הערכת המסירה של siRNA כדי גידולים או אתרים אחרים של פתולוגיה.
Introduction
בגלל sirnas לעכב את התרגום של חלבונים מ-mrna רצפים, הם יכולים תיאורטית לשמש סמים כל הפתווגיות ידוע1,2,3,4,5. עם זאת, השימוש sirna ברפואה מוגבל על ידי הפרופיל הטוב ביותר הפרמקוקינטיים של sirna מולקולות6,7. כאשר מוזרק באופן מהיר, sirnas מתנקה במהירות דרך הכליות ו/או מושפל על ידי נוקלאוסים8,9. בשל גודלו הגדול וחיוב שלילי, siRNA לא יכול להיכנס לתאים או לברוח מסלול endolysosomal כדי לגשת לקומפלקס השתקה מושרה RNA (RISC) שנמצא בתוך הציטוזול10,11,12, . שלוש עשרה כך, מאמץ נרחב התמקד בעיצוב ויישום של אסטרטגיות משלוח siRNA14. מאמץ זה התמקד בעיקר בפיתוח של חלקיקי השומנים, פולימר מבוסס חלקיקים אשר חבילת siRNA, להגן עליו מפני הרשאה והשפלה ב vivo, וליזום ספיגת הסלולר ולהימלט אנדוזומתית דרך ionizable, הקבוצות מאמין. הצלחות טרום קליני רבים דווחו ולאחרונה, ההצלחה הקלינית הראשונה דווחה עבור משלוח ננו-חלקיק הכבד מבוסס siRNA לטיפול transthyretin תורשתי-תיווך (חטאר) עמילואידוזיס15.
ישנם הרבה סרטן גרימת הגנים כי הם כרגע "undruggable" על ידי פרמקולוגיה קונבנציונלי (כלומר, תרופות מולקולה קטנה), מוטיבציה העיצוב של חלקיקים מפולימר siRNA (si-NPs) לטיפול בסרטן16. עם זאת, יש קבוצה נפרדת של פרמטרי עיצוב שיש לשקול עבור משלוח siRNA לא הכבד. מערכת המסירה חייבת להגן על המטען המאסור של הפוליפקס שגורם להצמנות בתוך המחזור הסיסטמי17,18,19. עבור משלוח הגידול, במיוחד, si-NP יציבות חיונית כדי להעניק מחזור ארוך ולכן הצטברות מוגברת בתוך גידולים דרך חדירות משופרות ושמירה (epr) אפקט20,21. יתר על כן, שליטה על גודל si-NP הוא חיוני מאז רק חלקיקים כ 20-200 ננומטר קוטר בגודל מינוף EPR22, וקטן יותר Si-NPs (~ 20 – 50 בקוטר nm) התערוכה חדירה משופרת הגידול על חלקיקים בגודל גדול יותר מיקרוחלקיקים23.
כדי לטפל אלה אילוצי העיצוב הנוספים עבור המסירה גידול מערכתית של siRNA בעקבות והעברת המינהל, באופן נייטרליים טעונה, pH-תגובה si-NPs פותחו (איור 1)24. הג-NPs האלה הם מנובטים, או לאחרונה, Zwitterionated25, עבור טעינה משטח נייטרלי ועמידות לספיחה חלבונים וopsonization במחזור הדם. כיוון שהם לא יכולים להסתמך אך ורק על האופי לנהוג משלוח תאיים, בריחה יעילה מאוד אנדוזומלית היא הכרחית להשגת גנים חזקים השתקה. לפיכך, הליבה של אלה si-NPs מורכב ליבה אנדוסומאין מאוד, אשר הוא אינרטי ב-pH מסחטות (7.4), אבל אשר מופעלת בצורה כמו מתג בתנאים acidified של מסלול endolysoזומבית [pH 6.8 (מוקדם אנזומים) – 5.0 ( ליסוזומים)]. לבסוף, תערובת של תכנים הידרוליים ומופובי בליבת סי-NPs מספקים הן כוחות הייצוב האלקטרוסטטית והן של ואן דר ואלס, שיפור יציבותו של ה-si-NPs בדם לעומת מערכות המזרות בלבד.
שילוב של פונקציות רבות לתוך עיצוב פשוט יחסית ניתן להשתמש בתוספת הפיכה שרשרת פיצול (רפסודה) מבוקרת לייצר פולימרים עם ארכיטקטורה מורכבת וקומפוזיציה מדויקת. כדי לייצר si-NPs עם המטען הנייטרלי הקרקע, pH-תגובתיות, ו NP יציבות, הרפסודה משמש לסנתז פולי (אתילן גליקול-b-[2-(dimethylamino) אתיל מתיונין-co-בוטיל מתיונין) (יתד-DB; איור 1A). יתד-DB הוא אלקטרוסטטי משלימה עם siRNA, ויוצרים si-NPs עם הקורונה יתד ו DB/siRNA core (איור 1B). פג יוצרת שכבת הידרופיפילית. לא מופעלת על הקורונה סי-NP בלוק DB מורכב מ-50:50 היחס הטוחנת של 2-(dimethylamino) אתיל מתיונין (DMAEMA) ו בוטיל מתיונין (BMA). מכלולי מערכות בעלי מבנה סטטי מחויב siRNA. BMA שותפים עצמאיים בתוך ליבת NP על ידי האינטראקציות ואן דר ואלס, הגדלת יציבות NP. ביחד, DMAEMA ו-BMA להקנות השומנים תלויי-pH בלהה-lytic התנהגות לחסום את הפולימר DB. ב-pH מסחטות, בלוק DB מובאת si-NP הליבה והוא האינרטי bilayers השומנים. תחת תנאים חומציים, כגון אלה בתוך מסלול endolysoזוממה, ionizable DMAEMA בתוך בלוק DB מקלה על אפקט ספוג פרוטונים, שם מאגרים אנדוזומאים מוביל אוסמוטי נפיחות וקרע26. בנוסף, BMA הידרופובי moieties בתוך בלוק DB באופן פעיל להשתלב ו lyse השומנים bilayers, וכתוצאה מכך אנדוסווליזיס חזק. Thus, siRNA היא משלימה עם יתד-DB לטופס si-NPs כי הם נייטרליים טעונה ויציבה מאוד ב-pH מסירה אבל אשר משבש bilayers השומנים ב pH חומצי, להבטיח משלוח ציטוסולג של המטען siRNA.
להלן מתוארים ההליכים הניסיוניים להפקת si-NPs מ-יתד-DB. שיטות לאפיון הפרמטרים הפיזיקליים והביופעילות של סי-NPs מוצגים ודנים. על מנת להעריך במהירות את הפעילות הביוגנטית של si-NP, לוציפראז משמש כגן מודל עבור המשך הלימודים. גחלילית לluciferase הוא החלבון האחראי ' זוהר ' של גחליליות27. בהתאם לכך, תאים של מיונקים המזוהמים בגנים הלוצילזיים של גחלילית מייצרים "זוהר" ביולוגינט שניתן ללכוד באמצעות לימלומטר כדי לכמת את רמות הביטוי של לוציפראז. כאן, אנו משתמשים לוציפראז כדי להעריך אתריים של si-NPs על ידי אספקת sirna נגד לluciferase וכימות הפחתת המקבילה בביולומינסנציה ב-לוציפראז-הבעת תאים לעומת תאים המקבלים sirna מעורבל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה ואפיון של סי-NPs
- הכנת סי-NP
- התמוססות פולימר ב 10 מ"מ חומצת לימון מאגר (pH 4.0) ב 3.33 mg/mL. פולימר יכול להיות הומס הראשון בריכוז 10x ב אתנול כדי להבטיח פירוק.
הערה: פולימר יכול להיות מומס בריכוזים נמוכים יותר, אבל להשתמש בריכוזים מעל 3.33 mg/mL יכול למנוע מערך NP הומוגנית. - הוסף siRNA (50 μM ב-diH2O) לתוצאה N+:P- יחס של 10. לערבב פתרונות פולימר ו siRNA ביסודיות על ידי ליטוף ולתת דגירה עבור 30 דקות. היחס N+:P מייצג את מספר קבוצות האמין הטעונות באופן חיובי על הפולימר למספר קבוצות הפוספט הטעונות לרעה ב-sirna ומחושב על-ידי הנוסחה שלהלן:
שם, מול פול הוא כמות טוחנת של פולימר, RU amine הוא מספר יחידות חוזרות של אמינים טעונה חיובי לכל פולימר, מול sirna הוא כמות טוחנת של sirna, ו sirna bp הוא מספר צמדי בסיס לכל מולקולה sirna. - הוסף 5 מקפלים עודף של 10 מ"מ מאגר פוספט (pH 8.0) ולערבב בעדינות על ידי ליטוף או היפוך הצינור. כדי לוודא כי ה-pH הסופי הוא נייטרלי (~ 7.2-7.5), פיפטה 10 μL של si-NP פתרון על רצועות pH מבחן.
הערה: חומצת לימון ומאגרי פוספט מוכנים בהתאם לתרשימי מרכז סיגמא של מיליפור.
- התמוססות פולימר ב 10 מ"מ חומצת לימון מאגר (pH 4.0) ב 3.33 mg/mL. פולימר יכול להיות הומס הראשון בריכוז 10x ב אתנול כדי להבטיח פירוק.
- האפיון הפיזיוכימי של סי-NPs
- הקלט את גודל השטח והטעינה של התוצאה של si-NPs באמצעות פיזור אור דינאמי (DLS). להכין דגימת DLS על ידי סינון 1 מ ל של si-NPs (0.1 – 1.0 mg/ml) דרך 0.45 יקרומטר בגודל הנקבוביות מסנני מזרק לתוך קוורץ מרובע או פוליסטירן קובט. מדידות גודל הרשומה וגובה השטח באמצעות כלי DLS בהתאם למפרטי היצרן.
- לאשר את הגודל והמבנה של si-NPs על ידי ניתוח הדמיה באמצעות שידור אלקטרון מיקרוסקופ (TEM).
- הוסף 5 μL של הפתרון si-NP ב 1 מ"ג/mL לרשתות TEM ו-דגירה עבור 60 s. כתם יבש עבור 3 s.
- הוסף 5 μL של 3% uranyl אצטט פתרון ו הדגירה של 20 s. כתם יבש לשלושה. רשתות יבשות לילה. תחת התייבשות
- רשתות תמונה בהתאם לפרוטוקול שהוקם עבור המיקרוסקופ הספציפי לשימוש.
- אפיון הטעינה של siRNA ב-si-NPs ב-N+:P שונים- יחסי באמצעות פיגור ג'ל.
- כדי לייצר 2% agarose ג'ל, להוסיף 2 g של כיתה של אלקטרופורזה ברמה אבקה כדי 100 mL של 1 x טאה (טריס-אצטט-EDTA) מאגר ב-pH 8.0. מערבבים כדי להשעות את הצמח. החום נחשף במיקרוגל עד להגבולו מומס (1-3 דקות).
- מקורר פעם, להוסיף 5 μL של אתידיום ברומיד (10 מ"ג/mL ב H2O), ומערבבים היטב. יוצקים אגקם לתוך מגש ג'ל מקום מסרק לייצר בארות, לאפשר יבש 30 דקות. בזהירות להסיר את המסרק כדי להשאיר מאחורי בארות טעינת, ולמלא את מגש ג'ל לתוך קו המילוי המרבי עם מאגר 1 x טאה.
- צור si-NPs (לפי הנוהל לעיל) ב 0, 1, 2, 5, 7, 10, 20, ו 40 N+:P- יחס. מקום 2 μL של צבע העמסה (ללא SDS והפחתת סוכנים) על סרט פרפין עבור כל ניסוח si-NP. מערבבים 10 μL של הפתרון si-NP עם לטעון צבע על הסרט פרפין על ידי פיפטה.
- הוסף/י את פתרונות הצבע של סי-NP/הטענת לבארות. הפעל מקור מתח ב 100 V עבור 35 דקות (או עד הדגימות עברו 80% של אורך ג'ל).
- הדמיה siRNA להקות על משדר UV על פי מפרט היצרן.
- לאשר את הגודל והמבנה של si-NPs על ידי ניתוח הדמיה באמצעות שידור אלקטרון מיקרוסקופ (TEM).
2. קביעת הפעילות הביוביולוגית של סי-NPs
- הסתרה של המודל הגן לוציפראאז
- צור ללוציפראז si-nps (על פי ההליך לעיל) באמצעות ללוציפראז sirna ו מקושקשות si-NPs באמצעות רצף sirna מעורבל כפקד. במקביל גם si-NPs ביחס הסופי של N+:P וביחס האופטימלי המזוהה על ידי לימודי הפיגור של ג'ל. לדוגמה רצפי siRNA נכללים בטבלת החומרים.
- זרעים לוציפראז-הבעת תאים [מד א-ל-231/לוציפראז (Bsd) תאים יציבים] ב 96-היטב לוחות שחור חומה בצפיפות של 2,000 תאים בבאר. אפשר לדבוק בלילה במדיה המלאה (DMEM, 10% FBS) באינקובטור (37 ° c, 5% CO2, 95% לחות).
- לדלל si-NPs לתוך מדיה סרום מלא עבור נפח הסופי של 100 μL לכל טוב ו siRNA ריכוז של 100 nM. לטפל בתאים 24 שעות עם si-NPs.
- לאחר 24 שעות, להסיר טיפולים להחליף מדיה עם מדיה סרום מלא המכיל 150 μg/mL D-לluciferin. התאים דגירה עבור 5 דקות לפני מדידת האור על קורא צלחת או במערכת דימות אופטי vivo על פי מפרטים של היצרן.
- החלפת מדיה לוציפראב המכילים מדיה טרייה, סרום מלא, ו-מודדת 24 שעות יותר. חזור על השלב לעיל, הסרת מדיה והחלפה עם מדיה סרום מלא המכיל 150 μg/mL D-לluciferin, ואחריו 5 דקות דגירה לפני מדידת לומינציה ב 48 h timepoint.
- למחקרים על האורך, לשמור על תאים בתנאים סטריליים תוך מדידת האור. המשך להתרבות במדיה הטרייה והמלאה בין המדידות לאחר החלפת התותב לוצין.
הערה: ריכוז siRNA המתאים ישתנה עם מולקולות si-NPs שונות. בעת שימוש בפוליפנט מחויב נייטרליים עם ליבה אנדוסומלי (g., פג-DB), 100 nM הוא בדרך כלל נסבל היטב על ידי התאים ומייצרת > 75% ללוציפראז הסתרה. היחס ההמוני של יתד-DB כדי siRNA ב 10 N+:P- יחס ו 100 ננומטר טיפולים sirna (בהנחה 26 bp sirna) הוא 23.3, כלומר, להוסיף 23.3 NG של יתד-DB עבור כל ה1.0 של sirna. לדוגמה, להוסיף 1.16 μL של 3.33 mg/mL עבור 166.5 ng של siRNA לטיפול אחד טוב בשנת 100 nM ב-הצלחת 96-באר (מדיה בנפח המדיה mL לכל טוב).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כמה מאפיינים חיוניים של ה-si-NPs יעיל עבור במסירה vivo siRNA הם בגודל הנכון (~ 20 – 200 ננומטר בקוטר), אריזה siRNA, והשתקה גנים ביולוגית. אמנם זו אינה רשימה ממצה (כפי שנדונה בדיון), מאפיינים בסיסיים אלה יש לאשר לפני שוקל בדיקה נוספת של ניסוח.
איור 2 ממחיש את האפיון של גודל סי-NP וגובה השטח על ידי ניסוח. DLS ו-TEM משמשות כשיטות משלימות להתבוננות בגודל si-NP (שניהם), פולידיסטיטיות (DLS) ומורפולוגיה (TEM). מדידות DLS מראות כי si-NP 1 יש קוטר ממוצע של 35 ננומטר, התפלגות חד מודאלית המצוינת על ידי נוכחות של שיא יחיד, ומפזרים נמוך המצוין על ידי רוחב השיא הצר יחסית (איור 2A). מדידות TEM לאשר את מידת גודל מ DLS, מציעים נוכחות של אוכלוסיה אחידה של si-NPs, ולגלות את המבנה כדורית של si-NPs (איור 2C). DLS ו-TEM מדידות של si-NP 2 לגלות כי יש לו גודל בלתי רצוי (> 200 ננומטר בקוטר) של קוטר ממוצע 1,500 ננומטר, האוכלוסייה מרובת מודאלי ופוליהתפזר, ואגרגטים בפתרון, ויוצרים לא מורפולוגיה חלקיקים ברורים (איור 2B, D ). הן si-NPs 1 ו-2 מציגות טעינה ניטראלית של המשטח, המצוינת על-ידי כמעט אפס ערכים פוטנציאליים של זטה (איור 2E).
טעינת היעילות של siRNA לתוך si-NPs מאופיינת בשיטת הפיגור של ג'ל. מתחם המלון מעביר את הג באמצעות ג'ל והוא מדמיין (בשל הכריכה של אתידיום ברומיד) בתחתית ג'ל. כאשר siRNA היא משלימה עם פולימר לטופס si-NPs, הגירה דרך ג'ל agarose חסום ו siRNA הוא דמיינו את העליון ג'ל (או איפה הוא נטען לתוך בארות). עבור יתד-DB מבוסס si-NPs, complexation מגדיל עם הגדלת N+:P- יחסי עד מלא complexation מושגת ב ~ 10-20 N +:P יחס (איור 3).
לוציפראז משמש כגן מודלים להערכה מהירה של הגנים הביואקטיביים של סי-NP. ביולומינסנציה מדידות באמצעות קורא צלחת או במערכת הדמיה אופטית vivo לאפשר את מהירה, תפוקה גבוהה בדיקת חלבון של ביטוי חלבונים של לוציפראז בפורמט צלחת היטב. טכניקה זו היא מהירה בהרבה, זולה יותר, ופחות בורדנית מאשר ניתוח גנים השתקה באמצעות ניתוחים מולקולריים מסורתיים כגון ה-PCR (ביטוי הגנים) והכתם המערבי (ביטוי החלבון). בשיטה זו, לוציפראז המבטא תאים מטופלים עם ללוציפראז si-nps ו-מקושקשות si-nps (כפקד), ו% לוציפראז פעילות מחושבת על ידי השוואת אות לומינסנציה לתאים לא מטופלים. Bioactive ללוציפראז si-NPs התערוכה פחתה משמעותית% לוציפראז פעילות בהשוואה ישירות לבקרת si-np מעורבל, כפי שניתן לראות עבור si-np 1 באיור 4. לעומת זאת, לוציאז סי-NPs שאינם מפחיתים את% הפעילות הלוציפראז בהשוואה לבקרת מקושקשות של סי-NP (כגון סי-NP 2) אינן נחשבות לביואקטיביות (איור 4). לעתים קרובות 48 h הוא הזמן של גנים מקסימלית השתקה (איור 4), אבל הבחנו גנים משמעותיים השתקה בנקודות זמן החל 24 h כדי 240 h לאחר הטיפול.
איור 1. כימיה פולימריים ו סי-NP סכימטי. (א) הרכב כימי של יתד-DB diblock מלחין si-NPs ו עניק משטח נייטרלי מטען (בלוק יתד) ו-pH-תגובה התנהגות (בלוק DB). (ב) הרכבה עצמית של סי-NPs. ב-pH 4.0, בלוק DB מסיסים במים כי dmaema שלישוני אמינים הם מאוד protonated. חיובי בלוק DB לחסום אלקטרוסטטי מכלולי טעונה שלילית מולקולות siRNA. ה-pH מותאם אז ל ~ 7.4 על ידי תוספת של 5x pH 8.0 פוספט מאגר, וכתוצאה מכך "hydrophobization" של בלוק DB ו קיבוע על של siRNA ו-DB בתוך הליבה של si-NPs. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. אפיון DLS ו-TEM בגודל si-NP, בעלות משטח ובמבנה מורפולוגיה. (א, ג) סי-np 1 מייצג דגם אחיד עם הגודל המתאים (~ 50-100 בקוטר nm), ואילו (ב, ד) סי-np 2 הקימו אגרגטים לא רצויים, גדולים ופולהתפזר. (ה) Si-NPs מציגים מטען קרוב-משטח נייטרלי (הפוטנציאל זטה). קווי שגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. Agarose ג'ל שיטת הערכה כדי להעריך את סי-NP siRNA טעינת יעילות. היעלמותו של להקות siRNA בתחתית ג'ל מציינים complexation של siRNA כדי פולימר. פולימר משלימה siRNA אינו מסוגל לעבור דרך הג, ולכן דמיינו בחלק העליון של הג הסמוכה את בארות הטעינה. כמו N+:P- יחס גדל, sirna complexation עליות, כפי שמצוין על ידי ירידה בעוצמת הלהקה sirna בתחתית ג'ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. סי-NP-תיווך מאוורר את הגן מודל לוציפראז ב לוציפראז מד א-MB-231 תאים. לוציפראז פעילות ב (A) 24 h ו (ב) 48 h לאחר הטיפול עם מקושקשות si-nps או לוציפראז Si-NPs 10 N+:P- יחס ו 100 מינון הסירק nM. % לוציפראז פעילות מחושבת על ידי חלוקת אות האור של דגימות הטיפול (מעורבל ו לוציפראז) על ידי אות האור של תאים לא מטופל. הערה: סי-NP 1 מייצג ניסוח אפקטיבי עם פעילות ביולוגית של גנים, ואילו si-NP 2 מייצג ניסוח ללא פעילות השתקה גנטית. (*) מציין הבדל משמעותי סטטיסטית (p < 0.05) לעומת הקבוצה מקושקשות עבור ניסוח בנקודת זמן נתונה. קווי שגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ה-si-NPs המתואר כאן מיוצרים על ידי האגודה האלקטרוסטטית של הארגון האנייוני והפולימרים הניגיים לתוך polyion מתחמי (פוליפוניים). Complexing אלקטרוסטטית של siRNA ואת בלוק DB הנתונים של הפולימרים יתד-DB הוא הקלה על ידי ערבוב ב-pH נמוך (4.0). ב-pH 4.0, DMAEMA הוא מאוד protonated, וכתוצאה מכך בלוק DB טעונה מאוד. זה מבטיח כי הפולימרים להתמוסס כמו unimers בפתרון בניגוד מיקרולים ויוצרים כי DB מתחמי ביעילות עם siRNA. לאחר מכן, ה-ph של הפתרון מותאם נייטרלי (pH 7.4), גורם ' הידרופוטביזציה ' של בלוק DB, מיצלה היווצרות, ומלכודת של sirna המלא בתוך הליבה של הפוליפסים וכתוצאה מכך. הפוליפונים האלה מעוצבים כך ש-יתד יוצר הידרופיפילית, פגז אדיש סביב DB/siRNA core, וכתוצאה מכך מטען נייטרלי הכרחי לניהול מערכתית. הכימיה פולימר התהליך של היווצרות פוליפקס מתוארים באיור 1.
האפיון הפיזי הקפדני של si-NPs חיוני כדי לקבוע אם ניסוחים מתאימים לעבור לתוך בדיקות ביולוגיות. גודל, גובה משטח וצורת חלקיקים/מורפולוגיה הם כל הפרמטרים החשובים שיכולים להשפיע על ביצועים ביולוגיים. עבור מסירה מערכתית לגידולים, הגודל si-NP צריך ליפול בין 20 – 200 ננומטר קוטר22, והמחקרים האחרונים מציעים 20 – 50 חלקיקים בקוטר ננומטר הם אידיאליים23. מטען השטח צריך להיות נייטרלי או שלילי מעט כדי למזער את ספיחה החלבון ואת opsonization28. מחקרים חקרו את הקשר בין צורת החלקיקים ואת הסיווג פרמקוקינטיקה/חלקיקים, מציע חלקיקים עם יחס גובה-רוחב גבוה רצוי מעל חלקיקים כדוריים29,30,31. עם זאת, לתאריך חלקיקים כדוריים הם עדיין הנפוצים ביותר, ועל הידע שלנו, הם הצורה היחידה חלקיקים שתורגמו למחקרים אנושיים באונקולוגיה.
חשוב לציין שהמערך האחיד והעקבי של הפוליפסים, כגון ה-si-NPs המוצג כאן, תלוי במגוון של פרמטרים פיזיקליים. מצאנו מדעית כי הריכוז פוליפקס, pH של הפתרון, ואת היחס של פולימר siRNA (N+:P- יחס) כל השפעה דרסטית היווצרות פוליפקס. בידיים שלנו, ריכוז siRNA אין השפעה גדולה על היווצרות פוליפקס, אבל באמצעות ריכוזי פולימר עודף של 3.33 מ"ג/mL התוצאות היווצרות של אגרגטים גדולים וגודל פוליפקס לא עקבי. כמו si-NPs אלה הם pH-תגובה, מגוון של בעיות יכול להיווצר כאשר pH הסופי של פתרונות si-NP הוא חומצי מדי (< pH 7.2). שתי דרכים כדי למנוע את הסיבוכים האלה הם ליאופליז פולימרים טהורים2O, כך שאין מלחים לשנות את הרכב המאגר על פירוק וכלה מחדש להפוך מאגרים לעתים קרובות כדי למנוע "נסחף" של pH מאגר לאורך זמן. כדי להיות זהירים, יש לאשר את ה-pH של מאגרים בכל פעם לפני הפיכת si-NPs, והחומציות הסופית של פתרונות si-NP תמיד צריכה להיות מאומתת. בסופו של דבר, N+:P- יחס של si-NPs משפיע sirna טעינת יעילות ו פוליפקס פרמטרים פיזיקליים. יש בדרך כלל קיים האידיאל N+:P- יחס שבו כל sirna טעון אבל אין הרבה בשפע של פולימר בלתי מושלם אשר יוצר אוכלוסיות נפרדות של מיקרולים ומגביר את הרעילות. עבור ה-si-NPs המוצג כאן, N+:P- 10-20 הוא הטווח שבו נצפו עקביות וביצועים אופטימליים.
קווי תא כתב לוציפראז משמשים כאן לניתוח מהיר ותפוקה גבוהה של פעילות ביולוגית של סי-NP. יש ליצור או לרכוש קווי תא כתב לוציפראז לפני שמתחילים בניתוח אתריים, ובכך דורשים השקעה ראשונית בזמן ובהוצאות. עם זאת, השימוש בתאי הכתב לוציפראז להערכת הגן השתקה הוא מהיר יותר, מיותר לניתוח בתפוקה גבוהה, וזול יותר לאורך זמן מאשר ביצוע RT-PCR (כדי למדוד ביטוי mrna) או הכלים המערבי (כדי למדוד ביטוי חלבון). למשל, מדידת האור בתוך שיטת הפעולה הזאת אורכת בדרך כלל רק מספר דקות בניגוד לתהליכים של יום שלם או רב-היום הנחוצים לביצוע RT-PCR או blots מערביים. יתר על כן, מדידות האור יכול להתבצע על צלחות היטב, המאפשר את הקוונפיקציה בו של דגימות רבות (עד 96-הצלחות גם שימשו על ידי המחברים). לבסוף, D-לluciferin הוא מגיב היחיד הדרוש מעל ומעבר טיפוסי התרבות התא ריאגנטים, מה שהופך את השיטה הרבה יותר סבירים מאשר RT-PCR או מערבי בכתם. יש לציין עם זאת, כי שיטת לוציפראז כתבת תא מוגבלת רק להערכת גנים השתקה של גן המודל ללוציפראז ולא ניתן להשתמש כדי למדוד גנים השתקה של אחרים "גנים טיפוליים" של עניין. לפיכך, המחברים מתייחסים לקוראים למספר מחקרים שבהם השתמשו ב-RT-PCR ו/או באבן החשופה המערבית כדי להעריך גנים השתקה של גנים טיפוליים של ריבית24,32,33,34.
בנוסף לפעילות ביו-אקטיביות, על החוקרים לשקול באופן אידיאלי מגוון כולל של בדיקות ביולוגיות מבחינה חוץ-גופית לאפיון ביצועי סי-NP. הכדאיות הלוציפראז שתוארה לעיל יכול לשמש גם כדי להעריך את יכולת התאים על ידי השוואת האות האור של מקושקשות si-NP תאים מטופלים לתאים לא מטופלים. מאז siRNA הוא רצף לא מיקוד, כל שינוי האור יכול להיות מיוחס השפעה לא ספציפית של ה-si-NPs על הכדאיות התא, אפקט זה תלוי בדרך כלל על כימיה פולימר וכמות טוחנת. טכניקות בזרימה cy, ומיקרוסקופ פלורסנט ניתן להשתמש כדי להעריך את ספיגת התא של si-NPs באמצעות התווית siRNAs, פולימרים, או שניהם. בנוסף, טכניקות מולקולריות כגון ה-PCR לולאה הגבעול ו ארגונאוט 2 immunoprecipitation יכול לשמש כדי למדוד בדיוק את רמות siRNA התאיים. מאז sirna הוא רק אקטיביים אם נמסר ציטוסול, שם הוא נטען אל risc, si-NPs חייב להפעיל בריחה אנדוזומלית של sirna פעם הפנימו על ידי התא. Assays המשמש לבריחה מדידה אנדוזומלית כוללים את המוסיס תא דם אדום שיטת המוליזה (תיאר בפרוטרוט על ידי אוונס et al.35), הדמיה פלואורסצנט של לוקליזציה של מטען סי-NP ומטענים LysoTracker36, ו לאחרונה, הדמיה פלואורסצנטית של גיוס של galectin 8 כדי מנוקב שלפוחיות37,38. איסוף נתונים וסינתזה את התוצאות מתוך ניסויים מחוץ ליכולת התפקוד התאי, ספיגת תאים, בריחה אנדוזומלית וביואקטיביות מספקות לחוקר פיסות מידע משלימות שממנה יש לשרטט פרשנויות ומכניסטיות תובנה על si-NP (בתוך) יעילות.
בסכום, חלקיקים המסוגלים לספק ביעילות siRNA יש פוטנציאל עצום לטיפול במחלות. לדוגמה, באונקולוגיה, גנים רבים הגורמים התקדמות הסרטן, עמידות לטיפול, גרורות הם ' undruggable ' על ידי פרמקולוגיה קונבנציונלי אבל יכול להיות מטופלים באמצעות siRNA. עם זאת, דרישה מוקדמת לשימוש שלהם במודלים של בעלי חיים של מחלות, siRNA nanomedicines (המכונה כאן si-NPs) דורשים אפיון פיזי מקיף וביולוגי כדי להבטיח הן בטיחות ואפקטיביות. לשם כך, השיטות תוארו בזאת על מנת לייצר ולאפיין את סי-NPs בתוך מבחנה, שממנה ניתן להעריך את ה-si-NPs על התאמתו להמשיך בלימודי בעלי חיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מוסרים קונפליקטים פוטנציאליים של עניין.
Acknowledgments
המחברים אסירי תודה לג. קרייג דובאל ורבקה קוק לגישה למידע ולמשאבי מעבדה לניהול מחקר זה. המחברים אסירי תודה למכון ואנדרבילט למדע ננו-סקאלה והנדסה (VINSE) עבור גישה DLS ו-TEM (NSF EPS 1004083) כלים. המחברים אסירי תודה לקרן המדע הלאומית לתמיכה בתוכנית המלגות למחקר בוגר (NSF 1445197). המחברים אסירי תודה למכון הלאומי לבריאות לתמיכה כספית (NIH R01 EB019409). המחברים אסירי תודה למחלקה להגנת Congressionally ביים תוכנית מחקר רפואי לתמיכה כספית (משרד ההגנה CDMRP OR130302).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm pore-size syringe filters | Thermo Fisher Scientific | F25133 | 17 mm diameter, PTFE membrane |
| 0-14 pH test strips | Millipore Sigma | P4786 | |
| 10x TAE buffer | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | AM9869 | |
| 6-7.7 pH test strips | Millipore Sigma | P3536 | |
| 96-well black walled plates | Corning | 3603 | Tissue-culture treated |
| Agarose Powder | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 16500 | |
| Citric acid monohydrate | Millipore Sigma | C1909 | |
| dibasic sodium phosphate dihydrate | Millipore Sigma | 71643 | |
| D-luciferin | Thermo Fisher Scientific | 88294 | Monopotassium Salt |
| DMEM | Gibco | 11995065 | High glucose and pyruvate |
| Ethanol | Millipore Sigma | 459836 | |
| ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | 15585011 | |
| FBS | Gibco | 26140079 | |
| loading dye | Thermo Fisher Scientific/Invitrogen | R0611 | |
| Luciferase siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: GAGGAGUUCAUUAUCAGUGC AAUUGUU Sense Strand Sequense: CAAUUGCACU GAUAAUGAACUCCT*C* *DNA bases |
| MDA-MB-231 / Luciferase (Bsd) stable cells | GenTarget Inc | SC059-Bsd | Luciferase-expressing cells sued to assess si-NP bioactivity |
| monobasic sodium phosphate monohydrate | Millipore Sigma | S9638 | |
| Scarmbled siRNA | IDT | N/A | Antisense Strand Sequense: AUACGCGUAUU AUACGCGAUUAACGAC Sense Strand Sequense: CGUUAAUCGCGUAUAAUAC GCGUA*T* *DNA bases |
| square polystyrene cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-129 | 4.5 mL capacity |
| TEM grids | Ted Pella, Inc. | 1GC50 | PELCO Center-Marked Grids, 50 mesh, 3.0mm O.D., Copper |
| Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804 | |
| uranyl acetate | Polysciences, Inc. | 21447-25 |
References
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411 (6836), 494-498 (2001).
- Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 432 (7014), 173-178 (2004).
- Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244 (2002).
- Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs. Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).
- Wittrup, A., Lieberman, J. Knocking down disease: a progress report on siRNA therapeutics. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 543 (2015).
- Li, H. E., Nelson, C. C., Evans, B., Duvall, C. Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies. Current Pharmaceutical Design. 17 (3), 293-319 (2011).
- Bartlett, D. W., Davis, M. E. Effect of siRNA nuclease stability on the in vitro and in vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing. Biotechnology and Bioengineering. 97 (4), 909-921 (2007).
- Zuckerman, J. E., Choi, C. H., Han, H., Davis, M. E. Polycation-siRNA nanoparticles can disassemble at the kidney glomerular basement membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (8), 3137-3142 (2012).
- Dominska, M., Dykxhoorn, D. M. Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape. Journal of Cell Science. 123 (Pt 8), 1183-1189 (2010).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle–mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638 (2013).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nature Biotechnology. 33 (8), 870-876 (2015).
- Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
- Adams, D., et al. Patisiran, an RNAi Therapeutic, for Hereditary Transthyretin Amyloidosis. New England Journal of Medicine. 379 (1), 11-21 (2018).
- Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews Cancer. 17 (8), 502 (2017).
- Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles. Molecular Pharmaceutics. 5 (4), 505-515 (2008).
- Verbaan, F. J., et al. The fate of poly(2-dimethyl amino ethyl)methacrylate-based polyplexes after intravenous administration. International Journal of Pharmaceutics. 214 (1-2), 99-101 (2001).
- Lv, H., Zhang, S., Wang, B., Cui, S., Yan, J. Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. Journal of Controlled Release. 114 (1), 100-109 (2006).
- Shi, J., Kantoff, P. W., Wooster, R., Farokhzad, O. C. Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities. Nature Reviews Cancer. 17 (1), 20 (2016).
- Torchilin, V. Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (3), 131-135 (2011).
- Duncan, R. The dawning era of polymer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (5), 347 (2003).
- Tang, L., et al. Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (43), 15344-15349 (2014).
- Nelson, C. E., et al. Balancing Cationic and Hydrophobic Content of PEGylated siRNA Polyplexes Enhances Endosome Escape, Stability, Blood Circulation Time, and Bioactivity in vivo. ACS Nano. 7 (10), 8870-8880 (2013).
- Jackson, M. A., et al. Zwitterionic Nanocarrier Surface Chemistry Improves siRNA Tumor Delivery and Silencing Activity Relative to Polyethylene Glycol. ACS Nano. , (2017).
- Akinc, A., Thomas, M., Klibanov, A. M., Langer, R. Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis. The Journal of Gene Medicine. 7 (5), 657-663 (2005).
- de Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).
- Aggarwal, P., Hall, J. B., McLeland, C. B., Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Nanoparticle interaction with plasma proteins as it relates to particle biodistribution, biocompatibility and therapeutic efficacy. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 428-437 (2009).
- Geng, Y., et al. Shape effects of filaments versus spherical particles in flow and drug delivery. Nature Nanotechnology. 2 (4), 249 (2007).
- Chauhan, V. P., et al. Fluorescent nanorods and nanospheres for real-time in vivo probing of nanoparticle shape-dependent tumor penetration. Angewandte Chemie International Edition. 50 (48), 11417-11420 (2011).
- Chu, K. S., et al. Plasma, tumor and tissue pharmacokinetics of Docetaxel delivered via nanoparticles of different sizes and shapes in mice bearing SKOV-3 human ovarian carcinoma xenograft. Nanomedicine. 9 (5), 686-693 (2013).
- Werfel, T. A., et al. Selective mTORC2 Inhibitor Therapeutically Blocks Breast Cancer Cell Growth and Survival. Cancer Research. 78 (7), 1845-1858 (2018).
- Sarett, S. M., et al. Lipophilic siRNA targets albumin in situ and promotes bioavailability, tumor penetration, and carrier-free gene silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (32), E6490-E6497 (2017).
- Williams, M. M., et al. Intrinsic apoptotic pathway activation increases response to anti-estrogens in luminal breast cancers. Cell Death and Disease. 9 (2), 21 (2018).
- Evans, B. C., et al. Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs. Journal of Visualized Experiments. (73), e50166 (2013).
- Werfel, T., et al. Combinatorial Optimization of PEG Architecture and Hydrophobic Content Improves siRNA Polyplex Stability, Pharmacokinetics, and Potency In vivo. Journal of Controlled Release. , (2017).
- Kilchrist, K. V., Evans, B. C., Brophy, C. M., Duvall, C. L. Mechanism of Enhanced Cellular Uptake and Cytosolic Retention of MK2 Inhibitory Peptide Nano-polyplexes. Cellular and Molecular Bioengineering. 9 (3), 368-381 (2016).
- Kilchrist, K. V., et al. Gal8 Visualization of Endosome Disruption Predicts Carrier-Mediated Biologic Drug Intracellular Bioavailability. ACS Nano. , (2019).
