Her præsenterer vi en protokol, designet til at bruge kemo genetiske værktøjer til at manipulere aktiviteten af kortikale interneuron forfædre transplanteres i cortex af tidlige postnatale mus.
Neuronal udvikling reguleres af en kompleks kombination af miljømæssige og genetiske faktorer. Vurdering af den relative bidrag af hver komponent er en kompliceret opgave, som er særligt vanskeligt med hensyn til udviklingen af γ-aminosmørsyre (GABA) erge kortikale interneuroner (CIs). CIs er de vigtigste hæmmende neuroner i hjernebarken, og de spiller nøgleroller i neuronal netværk, ved at regulere både aktiviteten af individuelle pyramideformede neuroner, samt den oscillatoriske opførsel af neuronal ensembler. De genereres i forbigående embryonale strukturer (mediale og caudale ganglioniske to-MGE og CGE), der er meget vanskeligt effektivt at målrette ved hjælp af utero elektroporation tilgange. Interneuron-progenitorer migrerer lange afstande under normal fosterudvikling, før de integreres i det kortikale kredsløb. Denne bemærkelsesværdige evne til at sprede og integrere sig i et udviklingsnetværk kan kapret ved at Trans plere embryonale interneuron prækursorer til tidlige postnatal vært kortices. Her præsenterer vi en protokol, der tillader genetisk modifikation af embryonale interneuron-progenitorer ved hjælp af fokal ex vivo-elektroporation. Disse konstruerede interneuron-prækursorer transplanteres derefter til tidlige postnatal værts kortikler, hvor de vil blive modne til let identificerbare CIs. Denne protokol tillader brug af flere genetisk kodede værktøjer eller evnen til at regulere ekspression af specifikke gener i interneuron-progenitorer med henblik på at undersøge virkningen af enten genetiske eller miljømæssige variabler på modning og integration af CIs.
Funktionen af neuronal netværk er afhængig af eksistensen af en afbalanceret supplement af excitatoriske projektion neuroner og hæmmende interneuroner. Selvom kortikale interneuroner (CIs) kun repræsenterer 20% af alle neuroner i pattedyrs kortices, menes underskud i deres antal eller funktion at spille en vigtig rolle i patogenesen af neuroudviklingsmæssige lidelser1,2. Studiet af CI udvikling er udfordrende, fordi CIs er genereret i forbigående embryonale strukturer, der er svære at få adgang til, og de følger en lang tangentielle migration, før de når pallium og udvikle deres modne anatomiske og fysiologiske ejendomme3. Både genetiske og miljømæssige mekanismer er kendt, at regulere CI udvikling4, men det har vist sig vanskeligt at studere det relative bidrag af flere faktorer.
Mange indsigter inden for udvikling af CI blev opnået ved hjælp af in vitro-kultur systemer efter isolering af stamfader fra de ganglioniske to5,6. En af de store fordele ved disse metoder er potentialet til at mærke og genetisk modificere de isolerede forfædre og følge deres differentiering i detaljer, at opdage celle-autonome ændringer. Men disse metoder er ikke i stand til at tilbyde oplysninger om samspillet mellem at udvikle interneuroner og et aktivt netværk. Vi har tilpasset disse protokoller ved transplantation af de modificerede prækursorer i den tidlige postnatal cortex. Interneuron forfædre isoleret fra embryonale ganglioniske to er i stand til at overleve, sprede og integrere sig i værtsnetværket ved transplantation i cortex7,8. Denne metode er blevet brugt til at reducere sværhedsgraden af epileptiske anfald i genetiske musemodeller, og er blevet foreslået som en mulig ny behandling for forskellige neuroudviklingsmæssige lidelser9,10. En tidligere protokol beskriver en procedure til at transducare disse prækursorer med virale vektorer før transplantationer11. Den protokol, vi beskriver her, giver også mulighed for genetisk modifikation af interneuroner, men kræver ikke skabelse af en viral vektor, der kun kræver plasmid-DNA, hvilket øger fleksibiliteten betydeligt. Nogle undersøgelser rapporterede succes med at bruge i utero elektroporation til genetisk modificerer interneuron forfædre i den caudale ganglioniske to (CGE)12, men denne metode har vist sig meget vanskeligt at reproducere.
I den repræsentative resultater afsnit, vi illustrerer brugen af denne metode til at udtrykke designer receptorer udelukkende aktiveret af designer drugs (DREADDs13) i den transplanterede CIs, en metode, vi brugte i en nylig publikation14. Vi udtrykte hM3D (GQ), en manipuleret receptor baseret på den humane kolinerge receptor CHRM3, som ikke påvirker neuronal funktion, medmindre det binder sin specifikke ligand clozapin-N-oxid (CNO). CNO administration udløser selektivt aktivering af hM3D (GQ) udtrykker celler. Vi brugte denne metode til at vise, at celle autonome og forbigående depolarisering er tilstrækkelig til at forhindre apoptose af CIs under udvikling14. Kombineret med forskellige genetisk kodede værktøjer, denne protokol har potentiale til at op-eller ned-regulere genekspression, og visualisere eller manipulere celle aktivitet i forskellige stadier af interneuron differentiering.
Her beskriver vi en alment tilgængelig metode til genetisk modificerer aktiviteten af CI-prækursorer til undersøgelse af indvirkningen af iboende aktivitet på CI-modning og/eller virkningen af aktivitets modulerede CIs på samlingen/funktionen af den integrerede kortikale Kredsløb.
Tidligere, flere laboratorier, herunder vores, havde udført i utero elektro poration eksperimenter for at genetisk modificere projektion neuroner6. Men i utero elektroporation til ganglioniske to, der omfatter CI forfædre er meget vanskeligt, på grund af elektriske ledning vej problemer. For at løse dette problem, et lille antal laboratorier udfører ultralyd guidede injektioner efterfulgt af elektro poration, som er en krævende teknik, der kræver dyrt udstyr. Denne protokol er et alternativ til de metoder, der er tilgængelige for flertallet af forskersamfundet.
Et af de mest udfordrende aspekt af denne protokol er at maksimere antallet af celler, der overlever i Host cortex til modne stadier, når fænotypiske analyse er normalt udføres (meget afhængig af eksperimentet design, men typisk ældre end P17). Der er tre vigtige trin, som investigator skal være opmærksom på: (1) effektiviteten af elektro portering. Dette kan maksimeres ved at sikre renheden af DNA-plasmider. Der bør kun anvendes DNA-plasmider af høj kvalitet (en260/a280 ratio på 1,9-2,0) til denne procedure. Vi får sådanne høj kvalitet DNA præparater ved at ansætte cæsium chlorid DNA rensning. En anden afgørende faktor er arrangøren, der driver ekspression af genet af interesse. Vi fandt, at pCAGGs vektor, som består af kylling b-actin promotoren, er ekstremt kraftfuld og kan dramatisk øge elektro portering effektivitet. (2) antallet af start donor embryoner. Det er vigtigt at sikre, at et stort antal (12-16) embryoner fra samme stadie er elektro porteret. Dette antal kan øges, hvis flere eksperimenterer udfører embryo dissektioner og skæring sammen, da det er vigtigt, at embryonale kortikale skiver opnås, elektro porated og overføres til inkubator så hurtigt som muligt. (3) det er vigtigt at sikre, at et stort antal celler injiceres i hver hvalp for at sikre en høj chance for transplanteret celle overlevelse indtil modne stadier. Desuden vil dette dramatisk forbedre sandsynligheden for vellykkede transplantationer, da lav densitet celle præparater vil resultere i ujævn blanding af cellerne med mediet, som vil producere betydelig variation i den transplanterede hjerner15 .
Den protokol, der er beskrevet her, var skræddersyet til at undersøge aktivitetens rolle i reguleringen af CI-overlevelse i en celle autonom måde. P14-P17-tidsvinduet til udførelse af CNO-injektionerne blev specifikt valgt i henhold til publicerede data, hvilket viser, at toppen af transplanterede CI progenitors celledød forekommer i denne periode16. Derfor kan denne tidsramme eller hyppigheden af CNO-injektioner ikke være gældende for andre celletyper eller hjerneområder, og investigator bør justere disse parametre i henhold til de specifikke eksperimentelle formål. Endelig er den metode, der er beskrevet her for de intrakranielle injektioner af CIs, kun mulig for p0-P5-unger (afhængigt også af muse linjens baggrund). I princippet vil alle injektioner over P5 kræve udtynding eller fjernelse af kraniet15.
En af de vigtigste fordele ved denne protokol er evnen til at bruge nye genetisk kodede værktøjer til at visualisere eller manipulere CIs aktivitet i forskellige faser af differentiering, da de integreres i et udviklingsnetværk. Med tempoet i opdagelsen af nye genetisk kodet spænding og calcium sensorer, samt nye kemo genetiske og optogenetiske værktøjer, denne protokol giver forskerne mulighed for at bruge dem inden for uger efter frigivelse i plasmid depoter, såsom Addgene.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af et ERC-start stipendium (282047), en Wellcome Trust investigator-pris (095589/Z/11/Z), et FP7-EF-ønske om tilskud og en lister instituts pris til JB. Arbejde i VP laboratorium er støttet af BBSRC (BB/L022974/1), det britiske Medical Research Council (MRC), og Francis Crick Institute (som modtager støtte fra MRC, Cancer Research UK, og Wellcome Trust). Forskningen i M.D. Lab blev muliggjort gennem Grant fra Stavros Niarchos Foundation til B.S.R.C. “Alexander Fleming”, som en del af instituttets initiativ til at støtte den græske forskning.
Medium/Supplements | |||
B-27 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 175040-044 | |
DMEM/F12 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21331-020 | |
DNAse | SIGMA | DN15-100MG | |
FBS | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 10270-098 | |
100x Glutamine | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 35050-061 | |
L15 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 11415-049 | |
MEM alpha, GlutaMAX | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 32561-029 | |
Neurobasal medium | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21103-049 | Neuron basic medium |
100x P/S | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | |
Equipment | |||
Electroporator | BTX | ECM 830 generator | |
Injector for acute slice electroporation | Eppendorf | FemtoJet Microinjector | |
Injector for cell transplantation (I) | Visual Sonics | Vevo Injector System | |
Injector for cell transplantation (II) | WPI | NANOLITER2010 | |
Magnetic Stand | WPI | M10L Magnetic Stand | |
Kite Manual Micromanipulator | WPI | KITE-M3-R | |
Platinum Elecrode (I) | Protech International Inc. | CUY-700-1 | |
Platinum Elecrode (II) | Protech International Inc. | CUY-700-2 | |
Steel Base Plate | WPI | 5479 | |
Vibratome | Leica | VT1200S | |
Other Material | |||
Glass capillaries for electroporation | VWR | 1B100-4 | |
Glass capillaries for cell transplantation | Visual Sonics | provided by Visual Sonics | |
Nuclepore 8 µm whatman membrane | SLS | 110414 | |
Organ tissue culture dishes | BD Biosciences (Falcon) | 353037 |