Summary
Her præsenterer vi en protokol, designet til at bruge kemo genetiske værktøjer til at manipulere aktiviteten af kortikale interneuron forfædre transplanteres i cortex af tidlige postnatale mus.
Abstract
Neuronal udvikling reguleres af en kompleks kombination af miljømæssige og genetiske faktorer. Vurdering af den relative bidrag af hver komponent er en kompliceret opgave, som er særligt vanskeligt med hensyn til udviklingen af γ-aminosmørsyre (GABA) erge kortikale interneuroner (CIs). CIs er de vigtigste hæmmende neuroner i hjernebarken, og de spiller nøgleroller i neuronal netværk, ved at regulere både aktiviteten af individuelle pyramideformede neuroner, samt den oscillatoriske opførsel af neuronal ensembler. De genereres i forbigående embryonale strukturer (mediale og caudale ganglioniske to-MGE og CGE), der er meget vanskeligt effektivt at målrette ved hjælp af utero elektroporation tilgange. Interneuron-progenitorer migrerer lange afstande under normal fosterudvikling, før de integreres i det kortikale kredsløb. Denne bemærkelsesværdige evne til at sprede og integrere sig i et udviklingsnetværk kan kapret ved at Trans plere embryonale interneuron prækursorer til tidlige postnatal vært kortices. Her præsenterer vi en protokol, der tillader genetisk modifikation af embryonale interneuron-progenitorer ved hjælp af fokal ex vivo-elektroporation. Disse konstruerede interneuron-prækursorer transplanteres derefter til tidlige postnatal værts kortikler, hvor de vil blive modne til let identificerbare CIs. Denne protokol tillader brug af flere genetisk kodede værktøjer eller evnen til at regulere ekspression af specifikke gener i interneuron-progenitorer med henblik på at undersøge virkningen af enten genetiske eller miljømæssige variabler på modning og integration af CIs.
Introduction
Funktionen af neuronal netværk er afhængig af eksistensen af en afbalanceret supplement af excitatoriske projektion neuroner og hæmmende interneuroner. Selvom kortikale interneuroner (CIs) kun repræsenterer 20% af alle neuroner i pattedyrs kortices, menes underskud i deres antal eller funktion at spille en vigtig rolle i patogenesen af neuroudviklingsmæssige lidelser1,2. Studiet af CI udvikling er udfordrende, fordi CIs er genereret i forbigående embryonale strukturer, der er svære at få adgang til, og de følger en lang tangentielle migration, før de når pallium og udvikle deres modne anatomiske og fysiologiske ejendomme3. Både genetiske og miljømæssige mekanismer er kendt, at regulere CI udvikling4, men det har vist sig vanskeligt at studere det relative bidrag af flere faktorer.
Mange indsigter inden for udvikling af CI blev opnået ved hjælp af in vitro-kultur systemer efter isolering af stamfader fra de ganglioniske to5,6. En af de store fordele ved disse metoder er potentialet til at mærke og genetisk modificere de isolerede forfædre og følge deres differentiering i detaljer, at opdage celle-autonome ændringer. Men disse metoder er ikke i stand til at tilbyde oplysninger om samspillet mellem at udvikle interneuroner og et aktivt netværk. Vi har tilpasset disse protokoller ved transplantation af de modificerede prækursorer i den tidlige postnatal cortex. Interneuron forfædre isoleret fra embryonale ganglioniske to er i stand til at overleve, sprede og integrere sig i værtsnetværket ved transplantation i cortex7,8. Denne metode er blevet brugt til at reducere sværhedsgraden af epileptiske anfald i genetiske musemodeller, og er blevet foreslået som en mulig ny behandling for forskellige neuroudviklingsmæssige lidelser9,10. En tidligere protokol beskriver en procedure til at transducare disse prækursorer med virale vektorer før transplantationer11. Den protokol, vi beskriver her, giver også mulighed for genetisk modifikation af interneuroner, men kræver ikke skabelse af en viral vektor, der kun kræver plasmid-DNA, hvilket øger fleksibiliteten betydeligt. Nogle undersøgelser rapporterede succes med at bruge i utero elektroporation til genetisk modificerer interneuron forfædre i den caudale ganglioniske to (CGE)12, men denne metode har vist sig meget vanskeligt at reproducere.
I den repræsentative resultater afsnit, vi illustrerer brugen af denne metode til at udtrykke designer receptorer udelukkende aktiveret af designer drugs (DREADDs13) i den transplanterede CIs, en metode, vi brugte i en nylig publikation14. Vi udtrykte hM3D (GQ), en manipuleret receptor baseret på den humane kolinerge receptor CHRM3, som ikke påvirker neuronal funktion, medmindre det binder sin specifikke ligand clozapin-N-oxid (CNO). CNO administration udløser selektivt aktivering af hM3D (GQ) udtrykker celler. Vi brugte denne metode til at vise, at celle autonome og forbigående depolarisering er tilstrækkelig til at forhindre apoptose af CIs under udvikling14. Kombineret med forskellige genetisk kodede værktøjer, denne protokol har potentiale til at op-eller ned-regulere genekspression, og visualisere eller manipulere celle aktivitet i forskellige stadier af interneuron differentiering.
Protocol
Dyrene blev opdrættet og opstaldet i henhold til loven om Det Forenede Kongeriges dyr (videnskabelige procedurer) (1986).
Bemærk: Til generering af pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP konstruere, en SalI-StuI fragment, der indeholder hM3D (GQ) sekvens, er blevet isoleret fra plasmid 50463 (Addgene), og indsat i udtrykket vektor pCAGGs-RFP (gave fra F. Guillemot) fordøjet med XhoI-EcoRV.
1. forberedelse af mus embryo kortikale skiver
- Steriliser laboratorieudstyr (f. eks. stereomikroskoper) og overflader (f. eks. bænke) med et passende opløsningsmiddel og 70% ethanol (EtOH) opløsning i vand (H2O).
- Brug dissektion værktøjer, der er blevet autoklaveres og holde dem hele tiden i 100% EtOH.
- 3 20 mL-aliquoter med 4% lav-gelling-temperatur agopstået i 1x fosfatstødpudeopløsning (PBS), i 50 mL rør, og opbevar dem ved 55 °C.
- Ofrer drægtige mus ved livmoderhals dislokation ved 13,5 eller 14,5 dages drægtigheden (embryon dag E 13.5-E 14.5).
- Med et par dissektion saks, åbne maven af de gravide mus, fjerne livmoder horn (med embryoner) og placere dem i is-kold Krebs løsning (tabel 1), i en 90 mm Petri skål.
- Med et par straight Student fine pincet, åbne de amniotiske SACs, fjerne embryoner og overføre dem i frisk is-kold Krebs løsning, i en ny 90 mm Petri skål. Dissekere mus embryon hjernen (forhjernen, midthjernen, hindbrain) fra resten af embryo kroppen.
- Holde de dissekeret hjerner fra hindhjernen, overføre dem i is-kold Krebs løsning i en ny 90 mm Petri skål, og holde dem på is.
- Med en vandtæt pen, tegne en lige linje på den udvendige overflade, i midten af den nederste del af 6 35 mm Petri skåle.
- Anbring en 4% lavgelerings ageret/PBS 20 mL alikvot ved 37 °C i 5 min. umiddelbart bagefter stakkels 10 mL i 2 35 mm Petri skåle og indkapsle de dissekterede hjerner.
Bemærk: De olfaktoriske pærer skal vende nedad (bunden af Petri skålen). Integrer 3-4 hjerner pr. Petri skål, Justér dem i den lige linje, der tidligere er tegnet. Efterlad 3 − 5 mm mellemrum mellem hver to hjerner. - Gentag trin 1,8 og 1,9, indtil alle dissekterede hjerner er blevet indlejret.
- Placer de indlejrede hjerner ved 4 °C, for at den agopstod at størkne, og derefter skære de tre hjerner i en enkelt blok af passende størrelse og orientering.
Bemærk: Efterlad ca. 3 mm omkring kanterne af hjerne prøverne. Ændre retningen af hjerner, med olfaktoriske pærer på toppen. - Lim blokken på overfladen af en mikrotomen base og ved hjælp af en kirurgisk klinge skåret hele vejen gennem bunden af blokken, mellem hver to hjerner, for at skabe 3 uafhængige blokke (hver mini blok, der indeholder en hjerne).
- Afsnit blokkene, i is-kold Krebs løsning, i 250 μm tykke skiver, ved hjælp af en vibrerende klinge mikrotom.
- Med en Bendt, flad endt mikro-spatel indsamler kun de skiver, der indeholder de mediale eller caudale ganglioniske to (MGE eller CGE; Figur 1) og overføre dem individuelt til filter membraner (13 μm diameter, 8,0 μm porestørrelse), flydende på minimal essentiel medium (MEM, tabel 1) i polystyren Center-Well organ kultur retter (60 mm x 15 mm).
- Placer skålene i en CO2 -vævs kulturinkubator ved 37 °c i 1 time, og Forbered dig på fokal elektroporation.
2. akut hjerne skive elektro Poration
- Før elektroporations proceduren påbegyndes, Forbered 50 mL 1% agopstået gel i en 100 mm Petri skål. Efterlad agrose gel for at størkne ved stuetemperatur (RT) i ca. 30 minutter.
- Forbered små agopstået søjler (1 mm diameter og 10 mm længde), slået med en glas pipette (225 mm længde; 2 ml kapacitet) og overføre dem i iskold Krebs løsninger.
Bemærk: En gummi dråbe pære egnet til 2 mL pipetter er fastgjort til pipetten, og ved at trykke på den kan kolonnen frigives fra glas pipetten til Krebs opløsningen. - Med en kirurgisk klinge, skåret små agopstået blokke af to størrelser: en lille en, der vil passe på overfladen af elektroden (se nedenfor) og en større en, som vil blive brugt som base for at udføre de fokale DNA injektioner i hjernen skiver. Overfør agantet blokke i iskold Krebs løsning samt.
- Forbered opsætning til fokale injektioner og akut elektroporation (figur 2).
Bemærk: Til injektionerne kræves følgende udstyr: 1) et lyst felt dissektion stereomikroskop, 2) en pneumatisk Pico-pumpe injektor, 3) en micromanipulator, 4) en magnetisk stander og 5) en stålbund plade. Til akut udsnitselektroporation kræves følgende udstyr: 1) en firkantet platin 10 mm Petri skål elektrode, 2) en kvadratisk platin 10 mm dækelektrode, 3) en micromanipulator og 4) en elektro porator. -
Fokale DNA-injektioner
- Forbered en DNA-blanding af udtryks vektorer: pCAGGs-IRES-GFP (Control Vector) + pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP, i en koncentration på 1 μg/μL for hver vektor og tilsæt hurtig grøn opløsning (bestand 25 mg/mL) i en 1/10 fortynding.
- Fyld en trukket glas mikropipette (0,5 mm indvendig diameter og 1 mm udvendig diameter) med 10 μL af DNA-blandingen, og Injicer små mængder (på 25-50 nL-området) ind i den valgte region (MGE/CGE) på skiven (figur 1 og figur 2).
-
Akut elektroporation
Bemærk: Elektroporationen skal udføres umiddelbart efter den fokale DNA-injektion.- Placer den lille agantet blok på Petri parabol elektroden og fastgør agmet-søjlen til den mobile dækelektrode ved hjælp af en flad endt mikro-spatel.
- Overfør udsnittet med den bærende membran på den agantet blok, og Placer den øverste elektrode med den agantet kolonne oven på den valgte region (MGE/CGE) på udsnittet.
Bemærk: opladnings spændinger på 125 V (to impulser på hver 5 MS, interval 500 MS) vil give en vellykket elektroporation (figur 3).
- Efter elektro portering placeres skiven med dens bærende membran i skålen og overføres skålen i en CO2 -vævs kulturinkubator ved 37 °c.
- Efter 1 h, udveksling af MEM medium for en grundlæggende medium passende for primære neuronal kulturer (neuron grundlæggende medium; Tabel 1) og Inkuber udsnittene natten over, i ca. 18-24 h.
3. fremstilling af celle-grafts
- Kontroller effektiviteten af elektro portering i alle skiver. Marker kun de udsnit, hvor der observeres et acceptabelt antal fluorescerende celler (figur 3).
Bemærk: Elektroporat ca. 30 skiver/pr eksperiment for at erhverve et passende antal celler til podning (se nedenfor). - Dissekere den valgte region (MGE/CGE) fra hver skive og skær vævet i små stykker i iskold Krebs løsning under et fluorescerende dissektion stereomikroskop.
- I mellemtiden, Placer et 1,5 mL rør med 900 μL neuron grundlæggende medium i et vandbad ved 37 °C.
- Vævs stykkerne overføres med en P1000-mikropipettor til et 1,5 mL-rør, der indeholder 500 μL L15/DNase-medium, som fremstilles ved tilsætning af 100 μL 1 mg/mL DNase-bestand i DMEM/F12-medium til 900 μL L15 medium. Vask vævs stykkerne ved at tappe.
- Tilsæt 100 μL DNase (bestand 1 mg/mL i DMEM/F12 medium) ind i 900 μL neuron Basic-mediet.
- Kassér L15/DNase-mediet, og resuspender vævs stykkerne i 200 μL neuron Basic/DNase-medium, som er forberedt i trin 3,5.
- Sæt en P200 mikropipettor til 180 μL og mekanisk dissociér vævs stykkerne ved pipettering op og ned forsigtigt, 20-30 gange, indtil der opnås en glat og "cremet" suspension.
- Tilsæt 200 μL neuron Basic/DNase medium (endelig total volumen 400 μL) og gensuspender.
- Tag en 4 μL alikvot celler, fortyndes korrekt og monter på et hæmatocytometer.
- Under en lys felt mikroskop, kontrollere effektiviteten af dissociation og tælle antallet af celler.
Bemærk: Hvis dissociationen er vellykket, vil lyse (levende) enkeltceller og ikke celle aggregater blive observeret. - Centrifuge cellesuspension fra trin 3,8, ved 1.000 rpm, ved RT, i 5 min, og derefter fjerne supernatanten fra røret og tilsæt passende L15/DNase medium (normalt 5-7 μL), således at den endelige koncentration af celler vil være 8 x 105-1,2 x 106 celler/μl.
Bemærk: Under opslæmning er det ekstremt vigtigt at undgå luftbobler. - Placer cellen alikvot på is og har yderligere L15/DNase medium til injektionerne.
4. intrakranielle injektioner
Bemærk: Følgende procedurer finder sted i et procedure rum i dyre huset facilitet. Da cellerne vil blive injiceret direkte til hjernen hos nyfødte unger uden at udsætte hjernen, holdes aseptiske forhold ved at sterilisere arbejdsrummet med 70% EtOH opløsning og ved hjælp af autoklaveres glas nåle. Følgende udstyr er nødvendig for intrakranielle injektioner: 1) en lys felt dissektion stereomikroskop, 2) en mikro-injektor, og 3) en varmepude til mus opsving.
- Forbered en glas nål ved at trækkenåle i henhold til producentens anbefalinger. I denne protokol anvendes glas nåle med en udvendig diameter på 80 μm, en indvendig diameter på 40 μm og en 30 ° facet.
Bemærk: Som nævnt ovenfor, nåle bør autoklave før brug. - Opfyldning manuelt nålen med biologisk inert olie ved hjælp af en 30 G, 2 tommer nål og en sprøjte.
- Kanylen monteres og indsættes i injektoren i henhold til producentens anvisninger.
- Bestem injektions indstillingerne ved maksimal lydstyrke (69 nL) og relativ langsom hastighed (23 nL/s).
- Tøm nålen, indtil stemplet er helt forlænget.
-
Fyld nålen.
- Skær et lille stykke fra en podning tape og placere det under en lys felt dissektion stereomikroskop. Med en P10-mikropipette overføres 5 μL fra prøven (celle-alikvot) på båndet, så der dannes et sfærisk fald.
- Anbring spidsen af nålen i prøven og fyld nålen (stemplet trækkes ud og trækker prøven med det).
Bemærk: Da prøven skal være ganske viskøs, fylde nålen i små trin, så prøven vil ækvibrere, og med en langsom hastighed, der forhindrer bobler fra dannelse. Prøven skal være glat og homogen i nålen. Hvis prøven er for viskøs, og det ikke er muligt at fylde nålen, tilsættes så meget L15/DNase medium, som det er nødvendigt for at opnå den korrekte viskositet. Ikke desto mindre vil dette ændre koncentrationen af prøven, og ideelt bør undgås.
- Anæstetize nyfødte unger (postnatale dag 0-2 [p0-P2]) på is til 2-5 min.
Bemærk: Sørg for, at pup ikke bevæger sig. - Placer den bedøvede hvalp under det lyse felt dissektion stereomikroskop.
- Udfør 3-4 injektioner af 69 nL hver på hver halvkugle.
Bemærk: Injektionsstederne er placeret ca. 1 mm lateral til midterlinjen og mellem 1 mm caudal til bregma og 1 mm rostral Columns til den Interaural linje. Spidsen af nålen skal placeres ca. 1 mm dybt til den piale overflade. Efter hver injektion, nålen er tilbage på plads for ca 30 s og trækkes tilbage i perioder. - Umiddelbart efter injektionerne placeres hvalpen på en varmepude med opvarmningen ved dens laveste indstilling (37 °C). Når pup genindvinder overføre det til buret med sin mor.
Bemærk: Efterlad aldrig moderen uden unger i buret. Hele proceduren (fra at fjerne pup fra sine littermates, indtil det returneres) bør vare mindre end 10 min.
5. clozapin-N-oxid injektioner
- Forbered DREADD ligand, CNO stamopløsning ved at fortynde 1 mg CNO i 50 μL dimethylsulfoxid (DMSO), indtil opløsningen er gennemskinnelige. Top-op til 10 mL med saltvand, således at den endelige koncentration af CNO er 0,1 mg/mL.
Bemærk: DMSO er giftigt. Undgå at bruge det til en koncentration højere end 0,1%. Brug som kontrol en saltvandsopløsning, der indeholder den samme DMSO-koncentration som den CNO-holdige opløsning. - Fra postnatale dag 14 og for 3 konstitutivt dage (P14-P16), i hver mus udføre to intraperitoneal (IP) injektioner af CNO (CNO koncentration: 1 mg/kg) eller 0,05% DMSO i saltvand, per dag, 12 h fra hinanden.
- På den sidste dag (P17), udføre en enkelt injektion og ofrer mus ved livmoderhals dislokation inden for et tidsvindue på 30 min-1 h.
Representative Results
Ved hjælp af den procedure, der præsenteres her, vi testede, om overlevelsen af kortikale interneuroner i de tidlige postnatale stadier er reguleret af aktivitet i en celle autonom måde. Vi udførte 3 hjerne skive elektro poration eksperimenter (12-16 embryoner [E 14.5 embryoner] per eksperiment) med pCAGGs-IRES-GFP (Control) og pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP Expression vektorer, i en koncentration på 1 μg/μL for hver konstruktion. I vores elektro poration eksperimenter, kun en brøkdel (ca. 50%; Figur 3) af GFP+ neuroner Co-udtrykte HM3D (GQ) (RFP+) og derfor gfp+RFP- populationen FUNGEREDE som en intern kontrol for effekten af dreadd ligands. Transfected kortikale embryonale interneuroner blev mekanisk dissocieret og den resulterende cellesuspension (8 x 105 celler/μl) podet i cortex af p0-P1 vildtype mus. Vi havde udført 6 injektioner pr. hjerne. I hvert eksperiment blev der injiceret mindst 6 nyfødte unger. Administration af CNO øgede selektivt aktiviteten af transficeret RFP+- celler, hvilket fremgår af ekspression af det aktivitets afhængige protein-cfos (figur 4). CNO behandling i henhold til den beskrevne protokol (administration to gange dagligt P14-P17) resulterede i en stigning i andelen af GFP+ RFP+ i forhold til gfp+RFP- celler, sammenlignet med køretøj (0,5% DMSO i saltvand) administrerede litterært hold (figur 5).
Figur 1: repræsentative telencephalic skiver anvendes til akutte elektro poration eksperimenter. (A-C) Telencephalic skiver opnået ved tre forskellige sekventielle Rostro-caudal niveauer, farvet med 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI). LGE: lateral ganglioniske eminence; MSÆ: mediale ganglioniske eminence; CGE: caudal ganglione eminence. Skala stænger = 200 μm. De gule asterisker angiver elektro porationstedet i hver skive. Den hvide linje markerer kanten af den ganglioniske eminence. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk gengivelse af den eksperimentelle arbejdsgang. (A) mus hjerne skiver er elektro porated med passende konstruktioner, og (B) efter 12 h modificeret kortikale INTERNEURON (CI) prækursorer er isoleret og (C) transplanteres i Pallium af nyfødte mus pup (p0 − P2). For at ændre aktiviteten af umodne CIs, P14 unger, der havde modtaget celletransplantationer blev injiceret med CNO eller køretøj for fire konstitutive dage i henhold til den præsenterede protokol. (A ') Fotografi af den akutte mus hjerne skive elektro poration set-up. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentativ vellykket akut skive elektroporation eksperiment. A) repræsentativ koronal del fra en e 14.5 embryon hjerne transficeret i CGE med både PCAGGS-IRES-GFP (gfp) og Pcaggs-HM3D (GQ)-IRES-RFP (RFP)-plasmider og dyrket i 12 timer. Afsnittet er blevet immun plettet for GFP (A, B, C) og RFP (A, B, D). Det boxed område i panel A forstørres for at vise udtryk for både fluorescerende journalister (B), gfp (C) og RFP (D). Den hvide linje markerer kanten af den ganglioniske eminence. B-D: samme foto, forskellige kanaler eller kombination af de to forskellige kanaler. Skala stænger = 200 μm (A), 100 μm (B-D). Dette tal er blevet ændret fra Denaxa et al.14. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: celle autonom stigning i aktiviteten af M3D (GQ)-udtrykke transplanterede CIs ved CNO administration. (A-D) Repræsentative konfokale billeder af en koronal del af en P17-mus, der blev transplanteret ved P1 med CI-prækursorer transficeret med både pCAGGs-IRES-GFP (GFP) og pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP (RFP)-plasmider og behandlet med CNO. Afsnittet er blevet immun plettet for GFP (A), RFP (B) og cfos (C). D) det kombinerede billede af A-, B-og C-immunofluorescens (combo). Bemærk, at kun CIS Co-udtrykke begge plasmider (hvide pile i a-d) er også cfos+ sammenlignet med CIS udtrykker kun kontrol-gfp plasmid (gule pile i a-d). E) kvantificering af cfos+RFP+- celler fundet i pallium af P17-mus, der blev transplanteret ved P1 (normaliseret til den totale RFP+- population) og behandlet med køretøj eller CNO (N = 2). A-D: samme foto, forskellige kanaler, eller kombination af de tre forskellige kanaler. Skala stænger = 50 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Celle autonome stigning i aktiviteten af CIs øger overlevelse . (A-D) Repræsentative konfokale billeder af somatosensoriske cortex koronalsektion skiver af P17 mus transplanterede på p0-P2 med CI-prækursorer transficeret med både pcaggs-IRES-gfp (gfp) og pcaggs-hM3D (GQ)-IRES-RFP (RFP) plasmider og behandlet med køretøj (A-B) eller CNO (C-D). E) kvantificering af RFP+- celler i forhjernen for P17-mus, som blev transplanteret ved p0-P2 (normaliseret til den totale gfp+ -population). RFP+(køretøj) = 47% ± 3%, cno = 61% ± 3%, p = 0,01, student's parret prøve t test, n = 3 køretøj og 3 CNO, et minimum af 150 celler tælles per hjerne. A og B: samme foto, forskellige kanaler. C og D: samme foto, forskellige kanaler. Skala stænger = 50 μm. Dette tal er blevet ændret fra Denaxa et al.14. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: supplerende oplysninger om de medier, der anvendes i denne protokol.
Discussion
Her beskriver vi en alment tilgængelig metode til genetisk modificerer aktiviteten af CI-prækursorer til undersøgelse af indvirkningen af iboende aktivitet på CI-modning og/eller virkningen af aktivitets modulerede CIs på samlingen/funktionen af den integrerede kortikale Kredsløb.
Tidligere, flere laboratorier, herunder vores, havde udført i utero elektro poration eksperimenter for at genetisk modificere projektion neuroner6. Men i utero elektroporation til ganglioniske to, der omfatter CI forfædre er meget vanskeligt, på grund af elektriske ledning vej problemer. For at løse dette problem, et lille antal laboratorier udfører ultralyd guidede injektioner efterfulgt af elektro poration, som er en krævende teknik, der kræver dyrt udstyr. Denne protokol er et alternativ til de metoder, der er tilgængelige for flertallet af forskersamfundet.
Et af de mest udfordrende aspekt af denne protokol er at maksimere antallet af celler, der overlever i Host cortex til modne stadier, når fænotypiske analyse er normalt udføres (meget afhængig af eksperimentet design, men typisk ældre end P17). Der er tre vigtige trin, som investigator skal være opmærksom på: (1) effektiviteten af elektro portering. Dette kan maksimeres ved at sikre renheden af DNA-plasmider. Der bør kun anvendes DNA-plasmider af høj kvalitet (en260/a280 ratio på 1,9-2,0) til denne procedure. Vi får sådanne høj kvalitet DNA præparater ved at ansætte cæsium chlorid DNA rensning. En anden afgørende faktor er arrangøren, der driver ekspression af genet af interesse. Vi fandt, at pCAGGs vektor, som består af kylling b-actin promotoren, er ekstremt kraftfuld og kan dramatisk øge elektro portering effektivitet. (2) antallet af start donor embryoner. Det er vigtigt at sikre, at et stort antal (12-16) embryoner fra samme stadie er elektro porteret. Dette antal kan øges, hvis flere eksperimenterer udfører embryo dissektioner og skæring sammen, da det er vigtigt, at embryonale kortikale skiver opnås, elektro porated og overføres til inkubator så hurtigt som muligt. (3) det er vigtigt at sikre, at et stort antal celler injiceres i hver hvalp for at sikre en høj chance for transplanteret celle overlevelse indtil modne stadier. Desuden vil dette dramatisk forbedre sandsynligheden for vellykkede transplantationer, da lav densitet celle præparater vil resultere i ujævn blanding af cellerne med mediet, som vil producere betydelig variation i den transplanterede hjerner15 .
Den protokol, der er beskrevet her, var skræddersyet til at undersøge aktivitetens rolle i reguleringen af CI-overlevelse i en celle autonom måde. P14-P17-tidsvinduet til udførelse af CNO-injektionerne blev specifikt valgt i henhold til publicerede data, hvilket viser, at toppen af transplanterede CI progenitors celledød forekommer i denne periode16. Derfor kan denne tidsramme eller hyppigheden af CNO-injektioner ikke være gældende for andre celletyper eller hjerneområder, og investigator bør justere disse parametre i henhold til de specifikke eksperimentelle formål. Endelig er den metode, der er beskrevet her for de intrakranielle injektioner af CIs, kun mulig for p0-P5-unger (afhængigt også af muse linjens baggrund). I princippet vil alle injektioner over P5 kræve udtynding eller fjernelse af kraniet15.
En af de vigtigste fordele ved denne protokol er evnen til at bruge nye genetisk kodede værktøjer til at visualisere eller manipulere CIs aktivitet i forskellige faser af differentiering, da de integreres i et udviklingsnetværk. Med tempoet i opdagelsen af nye genetisk kodet spænding og calcium sensorer, samt nye kemo genetiske og optogenetiske værktøjer, denne protokol giver forskerne mulighed for at bruge dem inden for uger efter frigivelse i plasmid depoter, såsom Addgene.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et ERC-start stipendium (282047), en Wellcome Trust investigator-pris (095589/Z/11/Z), et FP7-EF-ønske om tilskud og en lister instituts pris til JB. Arbejde i VP laboratorium er støttet af BBSRC (BB/L022974/1), det britiske Medical Research Council (MRC), og Francis Crick Institute (som modtager støtte fra MRC, Cancer Research UK, og Wellcome Trust). Forskningen i M.D. Lab blev muliggjort gennem Grant fra Stavros Niarchos Foundation til B.S.R.C. "Alexander Fleming", som en del af instituttets initiativ til at støtte den græske forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium/Supplements | |||
| B-27 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 175040-044 | |
| DMEM/F12 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21331-020 | |
| DNAse | SIGMA | DN15-100MG | |
| FBS | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 10270-098 | |
| 100x Glutamine | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 35050-061 | |
| L15 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 11415-049 | |
| MEM alpha, GlutaMAX | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 32561-029 | |
| Neurobasal medium | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21103-049 | Neuron basic medium |
| 100x P/S | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | |
| Equipment | |||
| Electroporator | BTX | ECM 830 generator | |
| Injector for acute slice electroporation | Eppendorf | FemtoJet Microinjector | |
| Injector for cell transplantation (I) | Visual Sonics | Vevo Injector System | |
| Injector for cell transplantation (II) | WPI | NANOLITER2010 | |
| Magnetic Stand | WPI | M10L Magnetic Stand | |
| Kite Manual Micromanipulator | WPI | KITE-M3-R | |
| Platinum Elecrode (I) | Protech International Inc. | CUY-700-1 | |
| Platinum Elecrode (II) | Protech International Inc. | CUY-700-2 | |
| Steel Base Plate | WPI | 5479 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Other Material | |||
| Glass capillaries for electroporation | VWR | 1B100-4 | |
| Glass capillaries for cell transplantation | Visual Sonics | provided by Visual Sonics | |
| Nuclepore 8 µm whatman membrane | SLS | 110414 | |
| Organ tissue culture dishes | BD Biosciences (Falcon) | 353037 |
References
- Marin, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Review Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
- Glausier, J. R., Lewis, D. A. GABA and schizophrenia: Where we stand and where we need to go. Schizophrenia Research. 181, 2-3 (2017).
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual Review Neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Wamsley, B., Fishell, G. Genetic and activity-dependent mechanisms underlying interneuron diversity. Nature Review Neuroscience. 18 (5), 299-309 (2017).
- Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. Journal of Neuroscience. 24 (11), 2612-2622 (2004).
- Denaxa, M., et al. Maturation-promoting activity of SATB1 in MGE-derived cortical interneurons. Cell Reports. 2 (5), 1351-1362 (2012).
- Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. Nature Neuroscience. 2 (5), 461-466 (1999).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. Journal of Neuroscience. 26 (28), 7380-7389 (2006).
- Baraban, S. C., et al. Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice. Proccedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15472-15477 (2009).
- Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344 (6180), 1240622 (2014).
- Vogt, D., et al. Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies. Journal of Visualized Experiments. (98), e52740 (2015).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Denaxa, M., et al. Modulation of Apoptosis Controls Inhibitory Interneuron Number in the Cortex. Cell Reports. 22 (7), 1710-1721 (2018).
- Quatrocolo, G., et al. Homochronic Transplatation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains. Journal of Visualized Experiments. (136), e57723 (2018).
- Southwell, D. G., et al. Intrinsically determined cell death of developning cortical interneurons. Nature. 491 (7422), 103-113 (2012).
