Här presenterar vi ett protokoll, som syftar till att använda kemogenetiska verktyg för att manipulera aktiviteten av kortikala euron stamceller transplanteras in i cortex av tidiga postnatal möss.
Neuronal utveckling regleras av en komplex kombination av miljömässiga och genetiska faktorer. Att bedöma den relativa bidraget av varje komponent är en komplicerad uppgift, vilket är särskilt svårt när det gäller utvecklingen av γ-aminosmörsyra (GABA) ergic kortikala interneuroner (CIs). CIs är de viktigaste hämmande nervceller i hjärnbarken, och de spelar nyckelroller i neuronala nätverk, genom att reglera både aktiviteten hos enskilda pyramidala nervceller, samt oscillatoriska beteendet hos neuronala ensembler. De genereras i övergående embryonala strukturer (mediala och caudal ganglieblockerande eminenser-MGE och CGE) som är mycket svåra att effektivt rikta med in utero elektroporation metoder. Interneuron progenitorer migrera långa sträckor under normal embryonal utveckling, innan de integreras i den kortikala kretsen. Denna anmärkningsvärda förmåga att skingra och integreras i ett utvecklande nätverk kan kapas genom att transplanera embryonala euron prekursorer till tidiga postnatal värd cortices. Här presenterar vi ett protokoll som tillåter genetisk modifiering av embryonala euron progenitorer med Focal ex vivo elektroporation. Dessa konstruerade euron prekursorer sedan transplanteras i tidig post-Natal värd cortices, där de kommer att mogna till lätt identifierbara CIS. Detta protokoll tillåter användning av flera genetiskt kodade verktyg, eller förmågan att reglera uttrycket av specifika gener i euron föregångare, för att undersöka effekterna av antingen genetiska eller miljömässiga variabler på mogningen och integrering av CIs.
Funktionen av neuronala nätverk förlitar sig på förekomsten av ett balanserat komplement av excitatoriska projektion nervceller och hämmande interneuroner. Även kortikala interneuroner (CIS) representerar endast 20% av alla nervceller i däggdjurs cortices, underskott i deras antal eller funktion tros spela en viktig roll i patogenesen av neurologiska utvecklingsstörningar1,2. Studiet av CI utveckling är utmanande eftersom CIs genereras i övergående embryonala strukturer som är svåra att komma åt, och de följer en lång tangentiell migration innan de når pallium och utveckla sina mogna anatomiska och fysiologiska egenskaper3. Både genetiska och miljömässiga mekanismer är kända som reglerar CI utveckling4, men det har visat sig svårt att studera det relativa bidraget av flera faktorer.
Många insikter i CI utveckling erhölls med in vitro-kultur system efter isolering av stamceller från ganglieblockerande ur5,6. En av de stora fördelarna med dessa metoder är möjligheten att märka och genetiskt modifiera isolerade stamceller och följa deras differentiering i detalj, för att upptäcka cell-autonoma förändringar. Dessa metoder kan dock inte erbjuda information om samspelet mellan att utveckla interneuroner och ett aktivt nätverk. Vi har anpassat dessa protokoll genom transplantation av de modifierade prekursorer till tidig post-Natal cortex. Interneuron stamceller isolerade från embryonala ganglioniska eminenser kan överleva, skingra och integreras i värd nätverket vid transplantation till cortex7,8. Denna metod har använts för att minska svårighetsgraden av epileptiska anfall i genetiska musmodeller, och har föreslagits som en möjlig ny terapi för olika neurologiska utvecklingsstörningar9,10. Ett tidigare protokoll beskriver ett förfarande för att transduce dessa prekursorer med virala vektorer före transplantationer11. Det protokoll som vi beskriver här kan också genetisk modifiering av interneuroner, men kräver inte skapandet av en viral vektor, som endast kräver plasmid-DNA, vilket kraftigt ökar dess flexibilitet. Vissa studier rapporterade framgång i att använda in utero elektroporation att genetiskt modifiera euron stamceller i caudal ganglieblockerande ur (CGE)12, men denna metod har visat sig mycket svårt att reproducera.
I den representativa resultat avsnitt, illustrerar vi användningen av denna metod för att uttrycka designer receptorer uteslutande aktiveras av designer drugs (DREADDs13) i den transplanterade CIS, en metod som vi använde i en nyligen publikation14. Vi uttryckte hM3D (GQ), en konstruerad receptor baserad på den humana kolinerga receptorn CHRM3, som inte påverkar neuronala funktion om den inte binder dess specifika ligand klozapin-N-oxid (CNO). CNO administration utlöser selektivt aktivering av hM3D (GQ) uttrycker celler. Vi använde denna metod för att visa att cell autonom och övergående depolarisering är tillräcklig för att förhindra apoptos av CIs under utveckling14. Kombinerat med olika genetiskt kodade verktyg, detta protokoll har potential att upp-eller ner-reglera genuttryck, och visualisera eller manipulera cell aktivitet under olika stadier av euron differentiering.
Här beskriver vi en allmänt tillgänglig metod för att genetiskt modifiera aktiviteten hos CI-prekursorer för att studera effekten av inneboende aktivitet på CI-mognad, och/eller effekten av aktivitetsmodulerade CIs på monteringen/funktionen av den integrerade kortikala Kretsar.
Förr i tiden, flera laboratorier, inklusive vår, hade utfört i Utero elektroporation experiment för att genetiskt modifiera projektion nervceller6. Men i Utero elektroporation till ganglieblockerande eminenser som inkluderar CI-stamceller är mycket svårt, på grund av elektrisk ledning väg problem. För att lösa detta problem, ett litet antal laboratorier utför ultraljud guidade injektioner följt av elektroporation, vilket är en krävande teknik som kräver dyr utrustning. Detta protokoll utgör ett alternativ till dessa metoder som är tillgängliga för majoriteten av vetenskapssamfundet.
En av de mest utmanande aspekt av detta protokoll är att maximera antalet celler som överlever i värden cortex till mogna stadier, när fenotypisk analys utförs vanligtvis (mycket beroende på experimentdesign, men typiskt äldre än P17). Det finns tre viktiga steg som prövaren bör uppmärksamma: (1) effektiviteten i elektroporation. Detta kan maximeras genom att säkerställa renheten hos DNA-plasmider. Endast högkvalitativa DNA-plasmider (an A260/a280 förhållandet 1,9-2,0) bör användas för detta förfarande. Vi erhåller sådana högkvalitativa DNA-preparat genom att använda cesium klorid DNA-rening. En annan avgörande faktor är promotorn som driver uttrycket av genen av intresse. Vi fann att pcaggs vektorn, som består av kyckling b-Actin promotorn, är extremt kraftfull och kan dramatiskt öka elektroporation effektivitet. (2) antalet startande donator embryon. Det är viktigt att se till att ett stort antal (12-16) av embryon i samma skede är electroporated. Detta antal kan ökas, om fler praktiker utför embryodissektioner och snittning tillsammans, eftersom det är viktigt att embryonala kortikala skivor erhålls, electroporated och överföras till inkubatorn så snart som möjligt. (3) det är viktigt att se till att ett stort antal celler injiceras i varje valp för att säkerställa en hög chans att transplanterade cellöverlevnad tills mogna stadier. Dessutom, detta kommer att dramatiskt förbättra sannolikheten för framgångsrika transplantationer eftersom låg densitet cell preparat kommer att resultera i ojämn blandning av cellerna med mediet, som kommer att ge betydande variation i den transplanterade hjärnor15 .
Det protokoll som beskrivs här var skräddarsydd för att undersöka rollen av verksamhet i regleringen CI överlevnad i ett cell-självständigt sätt. Den P14-P17 tid fönster för att utföra CNO injektioner valdes specifikt enligt publicerade data, som visar att toppen av transplanterade CI stamcells död inträffar under denna period16. Därför, denna tidsram eller frekvensen av CNO injektioner kanske inte gäller för andra celltyper eller regioner i hjärnan, och prövaren bör justera dessa parametrar enligt de specifika experimentella ändamål. Slutligen är den metod som beskrivs här för intrakraniella injektioner av CIs endast möjlig för P0-P5-pups (beroende också på mus linjens bakgrund). I princip, alla injektioner över P5 kommer att kräva gallring eller avlägsnande av skallen15.
En av de viktigaste fördelarna med detta protokoll är möjligheten att använda nya genetiskt kodade verktyg för att visualisera eller manipulera CIs verksamhet under olika stadier av differentiering när de integreras i ett utvecklingsnätverk. Med takten i upptäckten av nya genetiskt kodade spänning och kalcium sensorer, samt nya kemogenetiska och optogenetiska verktyg, detta protokoll tillåter forskare att använda dem inom veckor efter utsättning i plasmid förråd, såsom Addgene.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av en ERC starter Grant (282047), en Wellcome Trust Investigator Award (095589/Z/11/Z), ett FP7 EG DESIRE Grant, och en lister Institute Prize till JB. Arbetet i V.P. laboratorium stöds av BBSRC (BB/L022974/1), UK Medical Research Council (MRC), och Francis Crick Institute (som erhåller finansiering från MRC, cancer Research UK, och Wellcome Trust). Forskningen inom MD Lab möjliggjordes genom bidraget från Stavros Niarchos stiftelse till B.S.R.C. “Alexander Fleming”, som en del av stiftelsens initiativ att stödja den grekiska forskningen.
Medium/Supplements | |||
B-27 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 175040-044 | |
DMEM/F12 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21331-020 | |
DNAse | SIGMA | DN15-100MG | |
FBS | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 10270-098 | |
100x Glutamine | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 35050-061 | |
L15 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 11415-049 | |
MEM alpha, GlutaMAX | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 32561-029 | |
Neurobasal medium | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21103-049 | Neuron basic medium |
100x P/S | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | |
Equipment | |||
Electroporator | BTX | ECM 830 generator | |
Injector for acute slice electroporation | Eppendorf | FemtoJet Microinjector | |
Injector for cell transplantation (I) | Visual Sonics | Vevo Injector System | |
Injector for cell transplantation (II) | WPI | NANOLITER2010 | |
Magnetic Stand | WPI | M10L Magnetic Stand | |
Kite Manual Micromanipulator | WPI | KITE-M3-R | |
Platinum Elecrode (I) | Protech International Inc. | CUY-700-1 | |
Platinum Elecrode (II) | Protech International Inc. | CUY-700-2 | |
Steel Base Plate | WPI | 5479 | |
Vibratome | Leica | VT1200S | |
Other Material | |||
Glass capillaries for electroporation | VWR | 1B100-4 | |
Glass capillaries for cell transplantation | Visual Sonics | provided by Visual Sonics | |
Nuclepore 8 µm whatman membrane | SLS | 110414 | |
Organ tissue culture dishes | BD Biosciences (Falcon) | 353037 |