Summary
Här presenterar vi ett protokoll, som syftar till att använda kemogenetiska verktyg för att manipulera aktiviteten av kortikala euron stamceller transplanteras in i cortex av tidiga postnatal möss.
Abstract
Neuronal utveckling regleras av en komplex kombination av miljömässiga och genetiska faktorer. Att bedöma den relativa bidraget av varje komponent är en komplicerad uppgift, vilket är särskilt svårt när det gäller utvecklingen av γ-aminosmörsyra (GABA) ergic kortikala interneuroner (CIs). CIs är de viktigaste hämmande nervceller i hjärnbarken, och de spelar nyckelroller i neuronala nätverk, genom att reglera både aktiviteten hos enskilda pyramidala nervceller, samt oscillatoriska beteendet hos neuronala ensembler. De genereras i övergående embryonala strukturer (mediala och caudal ganglieblockerande eminenser-MGE och CGE) som är mycket svåra att effektivt rikta med in utero elektroporation metoder. Interneuron progenitorer migrera långa sträckor under normal embryonal utveckling, innan de integreras i den kortikala kretsen. Denna anmärkningsvärda förmåga att skingra och integreras i ett utvecklande nätverk kan kapas genom att transplanera embryonala euron prekursorer till tidiga postnatal värd cortices. Här presenterar vi ett protokoll som tillåter genetisk modifiering av embryonala euron progenitorer med Focal ex vivo elektroporation. Dessa konstruerade euron prekursorer sedan transplanteras i tidig post-Natal värd cortices, där de kommer att mogna till lätt identifierbara CIS. Detta protokoll tillåter användning av flera genetiskt kodade verktyg, eller förmågan att reglera uttrycket av specifika gener i euron föregångare, för att undersöka effekterna av antingen genetiska eller miljömässiga variabler på mogningen och integrering av CIs.
Introduction
Funktionen av neuronala nätverk förlitar sig på förekomsten av ett balanserat komplement av excitatoriska projektion nervceller och hämmande interneuroner. Även kortikala interneuroner (CIS) representerar endast 20% av alla nervceller i däggdjurs cortices, underskott i deras antal eller funktion tros spela en viktig roll i patogenesen av neurologiska utvecklingsstörningar1,2. Studiet av CI utveckling är utmanande eftersom CIs genereras i övergående embryonala strukturer som är svåra att komma åt, och de följer en lång tangentiell migration innan de når pallium och utveckla sina mogna anatomiska och fysiologiska egenskaper3. Både genetiska och miljömässiga mekanismer är kända som reglerar CI utveckling4, men det har visat sig svårt att studera det relativa bidraget av flera faktorer.
Många insikter i CI utveckling erhölls med in vitro-kultur system efter isolering av stamceller från ganglieblockerande ur5,6. En av de stora fördelarna med dessa metoder är möjligheten att märka och genetiskt modifiera isolerade stamceller och följa deras differentiering i detalj, för att upptäcka cell-autonoma förändringar. Dessa metoder kan dock inte erbjuda information om samspelet mellan att utveckla interneuroner och ett aktivt nätverk. Vi har anpassat dessa protokoll genom transplantation av de modifierade prekursorer till tidig post-Natal cortex. Interneuron stamceller isolerade från embryonala ganglioniska eminenser kan överleva, skingra och integreras i värd nätverket vid transplantation till cortex7,8. Denna metod har använts för att minska svårighetsgraden av epileptiska anfall i genetiska musmodeller, och har föreslagits som en möjlig ny terapi för olika neurologiska utvecklingsstörningar9,10. Ett tidigare protokoll beskriver ett förfarande för att transduce dessa prekursorer med virala vektorer före transplantationer11. Det protokoll som vi beskriver här kan också genetisk modifiering av interneuroner, men kräver inte skapandet av en viral vektor, som endast kräver plasmid-DNA, vilket kraftigt ökar dess flexibilitet. Vissa studier rapporterade framgång i att använda in utero elektroporation att genetiskt modifiera euron stamceller i caudal ganglieblockerande ur (CGE)12, men denna metod har visat sig mycket svårt att reproducera.
I den representativa resultat avsnitt, illustrerar vi användningen av denna metod för att uttrycka designer receptorer uteslutande aktiveras av designer drugs (DREADDs13) i den transplanterade CIS, en metod som vi använde i en nyligen publikation14. Vi uttryckte hM3D (GQ), en konstruerad receptor baserad på den humana kolinerga receptorn CHRM3, som inte påverkar neuronala funktion om den inte binder dess specifika ligand klozapin-N-oxid (CNO). CNO administration utlöser selektivt aktivering av hM3D (GQ) uttrycker celler. Vi använde denna metod för att visa att cell autonom och övergående depolarisering är tillräcklig för att förhindra apoptos av CIs under utveckling14. Kombinerat med olika genetiskt kodade verktyg, detta protokoll har potential att upp-eller ner-reglera genuttryck, och visualisera eller manipulera cell aktivitet under olika stadier av euron differentiering.
Protocol
Djuren har fötts upp och inhysts i enlighet med lagen om djur (vetenskapliga förfaranden) i Förenade kungariket (1986).
Anmärkning: För generering av pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP konstruera, en SalI-StuI fragment, som innehåller den hM3D (GQ) sekvens, har isolerats från plasmid 50463 (Addgene), och infogas i uttrycket Vector pCAGGs-RFP (gåva från F. Guillemot) smält med XhoI-EcoRV.
1. förberedelse av mus embryo kortikala skivor
- Sterilisera laboratorieutrustning (t. ex. stereomikroskop) och ytor (t. ex. bänkar) med ett lämpligt rengöringsmedel och 70% etanol (EtOH) lösning i vatten (H2O).
- Använd dissektion verktyg som har autoklaverat och hålla dem hela tiden i 100% EtOH.
- Förbered 3 20 mL-alikvoter på 4% låg Gelling temperatur aguppstod i 1x fosfatbuffertlösning (PBS), i 50 mL rör, och förvara dem vid 55 ° c.
- Offra gravida möss av cervikal dislokation vid 13,5 eller 14,5 graviditets dagar (embryonal dag E 13,5-E 14,5).
- Med ett par dissektion sax, öppna buken av de gravida möss, ta bort livmoder hornen (med embryon) och placera dem i iskalla Krebs lösning (tabell 1), i en 90 mm petriskål.
- Med ett par raka student fina Pinkett, öppna fostervatten, ta bort embryon och överföra dem i färskt iskalla Krebs lösning, i en ny 90 mm petriskål. Dissekera mus embryot hjärnan (forebrain, mitthjärnan, hindbrain) från resten av embryot kroppen.
- Hålla dissekerade hjärnor från hindbrain, överföra dem i iskalla Krebs lösning i en ny 90 mm petriskål, och hålla dem på is.
- Med en vattentät penna, rita en rak linje på utsidan ytan, i mitten av den nedre delen av 6 35 mm petriskålar.
- Placera en 4% låg-Gelling aguppstod/PBS 20 mL alikvot vid 37 ° c i 5 min. omedelbart efteråt fattiga 10 mL i 2 35 mm petriskålar och bädda dissekerade hjärnor.
Anmärkning: Lukt lökarna bör vända nedåt (botten av petriskål). Bädda in 3-4 hjärnor per petriskål, anpassa dem i den raka linje som tidigare dragits. Lämna 3 − 5 mm mellanrum mellan vardera två hjärnor. - Upprepa steg 1,8 och 1,9 tills alla dissekerade hjärnor har bäddats in.
- Placera den inbäddade hjärnor vid 4 ° c, för att Agros att stelna, och därefter skära de tre hjärnor i ett enda block av lämplig storlek och orientering.
Anmärkning: Lämna cirka 3 mm runt kanterna på hjärn proven. Ändra orientering av hjärnor, med lukt lökar på toppen. - Limma blocket på ytan av en mikrotom bas och med hjälp av en kirurgisk blad skära hela vägen genom botten av blocket, mellan varje två hjärnor, för att skapa 3 oberoende block (varje mini-block som innehåller en hjärna).
- Avsnitt blocken, i Ice-Cold Krebs lösning, i 250 μm tjocka skivor, med hjälp av en vibrerande blad mikrotom.
- Med en böjd Flat-slutade mikro-spatel samla endast skivor som innehåller den mediala eller caudal ganglieblockerande ur (MGE eller CGE; Figur 1) och individuellt överföra dem till filtermembran (13 μm diameter, 8,0 μm porstorlek), flyter på minimalt viktigt medium (MEM, tabell 1) i polystyren Center-väl orgel kultur rätter (60 mm x 15 mm).
- Placera rätter i en CO2 vävnad kultur inkubator, vid 37 ° c, för 1 h, och förbereda sig för den fokala elektroporation.
2. akut hjärn skiva elektroporation
- Innan du påbörjar elektroporation förfarandet, förbereda 50 mL av 1% aguppstod gel i en 100 mm petriskål. Låt agaros gel stelna i rumstemperatur (RT) i cirka 30 minuter.
- Förbered små aguppar kolonner (1 mm diameter och 10 mm längd), stansade med en glaspipett (225 mm längd, 2 mL kapacitet) och överföra dem i iskalla Krebs lösningar.
Anmärkning: En gummipipett som lämpar sig för 2 mL-pipetter fästs på pipetten, och genom att trycka på den kan kolonnen frigöras från glaspipetten till Krebs-lösningen. - Med ett kirurgiskt blad, skära små aguppstod block av två storlekar: en liten en som kommer att passa på ytan av elektroden (se nedan) och en större, som kommer att användas som en bas för att utföra de fokala DNA injektioner i hjärnan skivor. Överföra aguppstod blocken i iskalla Krebs lösning också.
- Förbered uppsättningen för de fokala injektionerna och den akuta elektroporationen (figur 2).
Anmärkning: För injektionerna behövs följande utrustning: 1) ett ljust fält dissektion stereo-Mikroskop, 2) en pneumatisk Pico-pump injektor, 3) en micromanipulator, 4) ett magnetiskt stativ, och 5) en stål bottenplatta. För den akuta segmentet elektroporation, är följande utrustning som behövs: 1) en kvadrat platina 10 mm Petriskåda elektrod, 2) en kvadrat platina 10 mm täcka elektrod, 3) en micromanipulator, och 4) en elektroporator. -
Fokala DNA injektioner
- Förbered en DNA-blandning av uttryck vektorer: pCAGGs-IRES-GFP (Control Vector) + pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP, vid en koncentration av 1 μg/μL för varje vektor och tillsätt snabb grön lösning (lager 25 mg/mL) i en 1/10 utspädning.
- Fyll ett glas mikropipett (0,5 mm innerdiameter och 1 mm ytterdiameter) med 10 μL av DNA-blandningen och injicera små mängder (på intervallet 25-50 nL) i den valda regionen (MGE/CGE) i segmentet (figur 1 och figur 2).
-
Akut elektroporation
Anmärkning: Elektroporationen ska utföras omedelbart efter den fokala DNA-injektionen.- Placera den lilla Agam blocket på petriskål elektrod och fäst Agros kolumnen till den mobila kåpan elektroden med hjälp av en platt-slutade mikro-spatel.
- Överför segmentet med dess stödjande membran till againblocket och placera den övre elektroden med againkolonnen ovanpå den valda regionen (MGE/CGE) på segmentet.
Obs: Laddspänningar på 125 V (två pulser på 5 MS vardera, intervall 500 ms) ger en lyckad elektroporation (figur 3).
- Efter elektroporation, placera segmentet med dess stödjande membran i skålen och överföra skålen i en CO2 vävnad kultur inkubator, vid 37 ° c.
- Efter 1 h, utbyta MEM medium för ett grundläggande medium som lämpar sig för primära neuronala kulturer (neuron grundläggande medium; Tabell 1) och inkubera skivorna över natten, för ca 18-24 h.
3. beredning av cell-grafts
- Kontrollera effektiviteten i elektroporation i alla skivor. Välj endast de sektorer där ett godtagbart antal fluorescerande celler observeras (figur 3).
Anmärkning: Elektroporate cirka 30 skivor/per experiment för att förvärva lämpligt antal celler för ympning (se nedan). - Dissekera den valda regionen (MGE/CGE) från varje skiva och skär vävnaden i små bitar i iskallt Krebs lösning, under en fluorescerande dissektion stereo-Mikroskop.
- Under tiden, placera en 1,5 mL tub med 900 μL neuron bas medium i ett vattenbad vid 37 ° c.
- Överför vävnads bitarna med en P1000-mikropipettor till ett 1,5 mL-rör som innehåller 500 μL L15/DNase-medium som bereds genom tillsats av 100 μL 1 mg/mL DNase-lager i DMEM/F12-medium i 900 μL L15-medium. Tvätta vävnads bitarna genom att knacka.
- Tillsätt 100 μL DNase (lager 1 mg/mL i DMEM/F12 medium) i 900 μL neuron bas medium.
- Kassera L15/DNase-mediet och Omsuspendera vävnads bitarna i 200 μL neuron Basic/DNase medium berett i steg 3,5.
- Ställ en P200 multikanalmikropipett till 180 μl och mekaniskt separera vävnad bitar genom Pipettera upp och ner försiktigt, 20-30 gånger, tills en slät och "krämig" suspension erhålls.
- Tillsätt 200 μL av neuron Basic/DNase medium (slutlig total volym 400 μL) och Omsuspendera.
- Ta en 4 μL alikvot av celler, späd på lämpligt sätt och montera på en hemocytometer.
- Under ett ljust fält Mikroskop, kontrollera effektiviteten av dissociation och räkna antalet celler.
Anmärkning: Om dissociation är lyckad, ljusa (vid liv) enstaka celler och inte cell-aggregat kommer att observeras. - Centrifugera cellsuspension från steg 3,8, vid 1 000 rpm, vid RT, för 5 min, och därefter, ta bort supernatanten från röret och tillsätt lämpligt L15/DNase medium (vanligen 5-7 μL) så att den slutliga koncentrationen av celler kommer att vara 8 x 105-1,2 x 106 celler/μl.
Anmärkning: Under resuspension är det oerhört viktigt att undvika luftbubblor. - Placera cellen alikvot på is och har ytterligare L15/DNase medium för injektionerna.
4. intrakraniella injektioner
Anmärkning: Efter tillvägagångssätten äger rum i ett tillvägagångssätt rum inom den djura hus lättheten. Eftersom cellerna kommer att injiceras direkt till hjärnan av nyfödda ungar utan att utsätta hjärnan, aseptiska förhållanden hålls genom att sterilisera arbetsrymden med 70% EtOH lösning och använda autoklaverade glasnålar. Följande utrustning behövs för intrakraniella injektioner: 1) ett ljust fält dissektion stereo-Mikroskop, 2) en mikro-injektor, och 3) en värmedyna för mus återhämtning.
- Förbered en glasnål genom att dra nålar enligt tillverkarens rekommendationer. Glasnålar med en ytterdiameter på 80 μm, 40 μm innerdiameter och en 30 ° avfasning används i detta protokoll.
Anmärkning: Som nämnts ovan bör injektionsnålar autoklaveras före användning. - Återfyllning manuellt nålen med biologiskt inert olja med hjälp av en 30 G, 2 tums nål och en spruta.
- Montera och sätt in injektionsnålen i insprutnings enheten enligt tillverkarens anvisningar.
- Bestäm injektions inställningarna med maximal volym (69 nL) och en relativ långsam hastighet (23 nL/s).
- Töm nålen tills kolven är helt utdragen.
-
Fyll på nålen.
- Skär en liten bit från en ympning tejp och placera den under ett ljust fält dissektion stereo-Mikroskop. Med en P10-mikropipett, överför 5 μL från provet (cell Ali kvot) till tejpen, så att en sfärisk droppe bildas.
- Placera spetsen på nålen i provet och fyll på nålen (kolven dras tillbaka och ritar provet med det).
Anmärkning: Eftersom provet ska vara ganska trögflytande, Fyll nålen i små steg så att provet kommer att equilibrate, och i en långsam takt som förhindrar bubblor bildas. Provet ska vara jämnt och homogent i nålen. Om provet är för trögflytande och det inte är möjligt att fylla nålen, tillsätt så mycket L15/DNase medium som det krävs för att få rätt viskositet. Detta kommer dock att ändra koncentrationen av provet, och helst bör undvikas.
- Anaesthetize nyfödda pups (postnatal dag 0-2 [P0-P2]) på is för 2-5 min.
Anmärkning: Kontrollera att PUP-programmet inte rör sig. - Placera den anestetiserade PUP-programmet under det ljusa fältet dissektion stereo-Mikroskop.
- Utför 3-4 injektioner av 69 nL vardera i varje halvklotet.
Anmärkning: Injektionsstället är placerat ungefär 1 mm lateralt till mittlinjen, och mellan 1 mm caudal till bregma och 1 mm rostralt till den interaural linjen. Nålspetsen bör placeras ca 1 mm djup till den piala ytan. Efter varje injektion lämnas injektionsnålen på plats i cirka 30 s och tas ut i perioder. - Omedelbart efter injektionerna, placera PUP på en värmedyna med uppvärmningen vid dess lägsta inställning (37 ° c). När PUP återvinner överföra den till buren med sin mor.
Anmärkning: Lämna aldrig mamman utan pups i buren. Den helhet procedur (från flyttande den pup från dess littermates, till den er returnerat) skulle sist mindre en 10 min.
5. Clozapin-N-oxid injektioner
- Förbered DREADD ligand, CNO lagerlösning genom att späda 1 mg CNO i 50 μL av dimetylsulfoxid (DMSO) tills lösningen är genomskinlig. Top-upp till 10 mL med saltlösning så att den slutliga koncentrationen av CNO är 0,1 mg/mL.
Anmärkning: DMSO är giftigt. Undvik att använda den till en koncentration som är högre än 0,1%. Använd som kontroll en saltlösning som innehåller samma DMSO-koncentration som den CNO-lösning som innehåller lösningen. - Från postnatal dag 14 och för 3 konstitutivt dagar (P14-P16), i varje mus utföra två intraperitoneal (I.P.) injektioner av CNO (CNO koncentration: 1 mg/kg) eller 0,05% DMSO i saltlösning, per dag, 12 h isär.
- På den sista dagen (P17), utföra en enda injektion och offra möss av cervikal dislokation inom ett tidsfönster på 30 min-1 h.
Representative Results
Med hjälp av det förfarande som presenteras här, vi testade om överlevnaden av kortikala interneuroner under tidiga postnatal stadier regleras av aktivitet i en cell autonoma sätt. Vi utförde 3 Brain slice elektroporation experiment (12-16 embryon [E 14.5 embryon] per experiment) med pCAGGs-IRES-GFP (kontroll) och pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP uttryck vektorer, vid en koncentration av 1 μg/μL för varje konstruktion. I våra elektroporation experiment, bara en bråkdel (ca 50%; Figur 3) av GFP+ neuronerna Co-uttryckte HM3D (GQ) (RFP+) och därför GFP+RFP- populationen fungerade som en intern kontroll för effekten av dreadd ligands. Transfected kortikala embryonala interneuroner var mekaniskt dissocierade och den resulterande cellsuspensionen (8 x 105 celler/μl) ympas i cortex av P0-P1 vild typ möss. Vi hade utfört 6 injektioner per hjärna. I varje experiment injicerades minst 6 nyfödda ungar. Administrering av CNO ökade selektivt aktiviteten hos transfekterade RFP+ -celler, vilket framgår av uttrycket för det aktivitetsberoende proteinet cFos (figur 4). CNO behandling enligt det beskrivna protokollet (Administrera två gånger dagligen P14-P17) resulterade i en ökning av andelen GFP+ RFP+ i förhållande till GFP+RFP- celler, jämfört med vehikel (0,5% DMSO i saltlösning) administrerade littermates (figur 5).
Figur 1: representativa av skivor som används för akuta elektroporation experiment. (a-C) Telencephalic skivor erhålls vid tre distinkta sekventiella rostro-caudal nivåer, färgade med 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). LGE: lateral ganglieblockerande Eminence; MGE: medial ganglieblockerande Eminence; CGE: caudal ganglieblockerande Eminence. Skalstreck = 200 μm. De gula asteriskerna indikerar den elektroporation plats i varje segment. Den vita linjen markerar kanten av ganglieblockerande Eminence. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: schematisk representation av experiment arbetsflödet. (A) mushjärna skivor är elektroporated med lämpliga konstruktioner, och (B) efter 12 h modifierade kortikala euron (CI) prekursorer är isolerade och (C) transplanteras i pallium av nyfödda mus valpar (P0 − P2). För att ändra aktiviteten hos omogen CIs, P14 ungar som hade fått celltransplantationer injicerades med CNO eller fordon för fyra konstitutiva dagar enligt det presenterade protokollet. (A) Fotografi av den akuta mushjärna slice elektroporation set-up. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativ framgångsrik akut slice elektroporation experiment. A) representativ koronar sektion från en e 14.5 embryohjärna som transfekterade i CGE med både pcaggs-IRES-GFP (GFP) och pcaggs-hM3D (GQ)-IRES-RFP (RFP) plasmider och odlade i 12 timmar. Sektionen har varit immunostained för GFP (A, B, C) och RFP (A, B, D). Det inramade området i panel A är förstorat för att Visa uttrycket för både fluorescerande reportrar (B), GFP (C) och RFP endast (D). Den vita linjen markerar kanten av ganglieblockerande Eminence. B-D: samma foto, olika kanaler eller kombination av de två olika kanalerna. Skalstreck = 200 μm (A), 100 μm (B-D). Denna siffra har modifierats från Denaxa et al.14. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: cell autonom ökning av aktiviteten hos M3D (GQ)-uttrycker transplanterade CIS på CNO administration. (a-D) Representativa konfokalbilder av en koronar del av en P17-mus transplanteras i P1 med CI-prekursorer som transfekterade med både pcaggs-IRES-GFP (GFP) och pcaggs-hM3D (GQ)-IRES-RFP (RFP) plasmider och behandlas med CNO. Sektionen har varit immunostained för GFP (a), RFP (B) och cFos (C). Dden kombinerade bilden av a, B och C immunofluorescens (combo). Observera att endast CIs Co-uttrycker både plasmider (vita pilar i A-D) är också cFos+ jämfört med CIS uttrycker endast kontroll-GFP plasmid (gula pilar i a-d). (E) kvantifiering avcFos +RFP+ -celler som finns i pallium hos P17-möss som transplanterats vid P1 (normaliserat till den totala RFP+ -populationen) och som behandlats med vehikel eller CNO (N = 2). A-D: samma foto, olika kanaler eller en kombination av de tre olika kanalerna. Skalstreck = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Cell autonom ökning av aktiviteten hos CIS ökar överlevnaden . (a-D) Representativa konfokala bilder av somatosensoriska cortex koronala skivor av P17 möss transplanterade på P0-P2 med CI prekursorer transfekterade med både pcaggs-IRES-GFP (GFP) och pcaggs-hM3D (GQ)-IRES-RFP (RFP) plasmider och behandlas med fordon (a-B) eller CNO (C-D). (E) kvantifiering av RFP+ -celler som finns i förhjärnan hos P17-möss som transplanterats på P0-P2 (normaliserade till den totala GFP+ -populationen). RFP+(fordon) = 47% ± 3%, cno = 61% ± 3%, p = 0,01, elevens Parade prov t test, n = 3 fordon och 3 CNO, minst 150 celler räknas per hjärna. A och B: samma foto, olika kanaler. C och D: samma foto, olika kanaler. Skalstreck = 50 μm. Denna siffra har modifierats från Denaxa et al.14. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: ytterligare information om medier som används i detta protokoll.
Discussion
Här beskriver vi en allmänt tillgänglig metod för att genetiskt modifiera aktiviteten hos CI-prekursorer för att studera effekten av inneboende aktivitet på CI-mognad, och/eller effekten av aktivitetsmodulerade CIs på monteringen/funktionen av den integrerade kortikala Kretsar.
Förr i tiden, flera laboratorier, inklusive vår, hade utfört i Utero elektroporation experiment för att genetiskt modifiera projektion nervceller6. Men i Utero elektroporation till ganglieblockerande eminenser som inkluderar CI-stamceller är mycket svårt, på grund av elektrisk ledning väg problem. För att lösa detta problem, ett litet antal laboratorier utför ultraljud guidade injektioner följt av elektroporation, vilket är en krävande teknik som kräver dyr utrustning. Detta protokoll utgör ett alternativ till dessa metoder som är tillgängliga för majoriteten av vetenskapssamfundet.
En av de mest utmanande aspekt av detta protokoll är att maximera antalet celler som överlever i värden cortex till mogna stadier, när fenotypisk analys utförs vanligtvis (mycket beroende på experimentdesign, men typiskt äldre än P17). Det finns tre viktiga steg som prövaren bör uppmärksamma: (1) effektiviteten i elektroporation. Detta kan maximeras genom att säkerställa renheten hos DNA-plasmider. Endast högkvalitativa DNA-plasmider (an A260/a280 förhållandet 1,9-2,0) bör användas för detta förfarande. Vi erhåller sådana högkvalitativa DNA-preparat genom att använda cesium klorid DNA-rening. En annan avgörande faktor är promotorn som driver uttrycket av genen av intresse. Vi fann att pcaggs vektorn, som består av kyckling b-Actin promotorn, är extremt kraftfull och kan dramatiskt öka elektroporation effektivitet. (2) antalet startande donator embryon. Det är viktigt att se till att ett stort antal (12-16) av embryon i samma skede är electroporated. Detta antal kan ökas, om fler praktiker utför embryodissektioner och snittning tillsammans, eftersom det är viktigt att embryonala kortikala skivor erhålls, electroporated och överföras till inkubatorn så snart som möjligt. (3) det är viktigt att se till att ett stort antal celler injiceras i varje valp för att säkerställa en hög chans att transplanterade cellöverlevnad tills mogna stadier. Dessutom, detta kommer att dramatiskt förbättra sannolikheten för framgångsrika transplantationer eftersom låg densitet cell preparat kommer att resultera i ojämn blandning av cellerna med mediet, som kommer att ge betydande variation i den transplanterade hjärnor15 .
Det protokoll som beskrivs här var skräddarsydd för att undersöka rollen av verksamhet i regleringen CI överlevnad i ett cell-självständigt sätt. Den P14-P17 tid fönster för att utföra CNO injektioner valdes specifikt enligt publicerade data, som visar att toppen av transplanterade CI stamcells död inträffar under denna period16. Därför, denna tidsram eller frekvensen av CNO injektioner kanske inte gäller för andra celltyper eller regioner i hjärnan, och prövaren bör justera dessa parametrar enligt de specifika experimentella ändamål. Slutligen är den metod som beskrivs här för intrakraniella injektioner av CIs endast möjlig för P0-P5-pups (beroende också på mus linjens bakgrund). I princip, alla injektioner över P5 kommer att kräva gallring eller avlägsnande av skallen15.
En av de viktigaste fördelarna med detta protokoll är möjligheten att använda nya genetiskt kodade verktyg för att visualisera eller manipulera CIs verksamhet under olika stadier av differentiering när de integreras i ett utvecklingsnätverk. Med takten i upptäckten av nya genetiskt kodade spänning och kalcium sensorer, samt nya kemogenetiska och optogenetiska verktyg, detta protokoll tillåter forskare att använda dem inom veckor efter utsättning i plasmid förråd, såsom Addgene.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en ERC starter Grant (282047), en Wellcome Trust Investigator Award (095589/Z/11/Z), ett FP7 EG DESIRE Grant, och en lister Institute Prize till JB. Arbetet i V.P. laboratorium stöds av BBSRC (BB/L022974/1), UK Medical Research Council (MRC), och Francis Crick Institute (som erhåller finansiering från MRC, cancer Research UK, och Wellcome Trust). Forskningen inom MD Lab möjliggjordes genom bidraget från Stavros Niarchos stiftelse till B.S.R.C. "Alexander Fleming", som en del av stiftelsens initiativ att stödja den grekiska forskningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium/Supplements | |||
| B-27 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 175040-044 | |
| DMEM/F12 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21331-020 | |
| DNAse | SIGMA | DN15-100MG | |
| FBS | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 10270-098 | |
| 100x Glutamine | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 35050-061 | |
| L15 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 11415-049 | |
| MEM alpha, GlutaMAX | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 32561-029 | |
| Neurobasal medium | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21103-049 | Neuron basic medium |
| 100x P/S | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | |
| Equipment | |||
| Electroporator | BTX | ECM 830 generator | |
| Injector for acute slice electroporation | Eppendorf | FemtoJet Microinjector | |
| Injector for cell transplantation (I) | Visual Sonics | Vevo Injector System | |
| Injector for cell transplantation (II) | WPI | NANOLITER2010 | |
| Magnetic Stand | WPI | M10L Magnetic Stand | |
| Kite Manual Micromanipulator | WPI | KITE-M3-R | |
| Platinum Elecrode (I) | Protech International Inc. | CUY-700-1 | |
| Platinum Elecrode (II) | Protech International Inc. | CUY-700-2 | |
| Steel Base Plate | WPI | 5479 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Other Material | |||
| Glass capillaries for electroporation | VWR | 1B100-4 | |
| Glass capillaries for cell transplantation | Visual Sonics | provided by Visual Sonics | |
| Nuclepore 8 µm whatman membrane | SLS | 110414 | |
| Organ tissue culture dishes | BD Biosciences (Falcon) | 353037 |
References
- Marin, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Review Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
- Glausier, J. R., Lewis, D. A. GABA and schizophrenia: Where we stand and where we need to go. Schizophrenia Research. 181, 2-3 (2017).
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual Review Neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Wamsley, B., Fishell, G. Genetic and activity-dependent mechanisms underlying interneuron diversity. Nature Review Neuroscience. 18 (5), 299-309 (2017).
- Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. Journal of Neuroscience. 24 (11), 2612-2622 (2004).
- Denaxa, M., et al. Maturation-promoting activity of SATB1 in MGE-derived cortical interneurons. Cell Reports. 2 (5), 1351-1362 (2012).
- Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. Nature Neuroscience. 2 (5), 461-466 (1999).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. Journal of Neuroscience. 26 (28), 7380-7389 (2006).
- Baraban, S. C., et al. Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice. Proccedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15472-15477 (2009).
- Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344 (6180), 1240622 (2014).
- Vogt, D., et al. Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies. Journal of Visualized Experiments. (98), e52740 (2015).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Denaxa, M., et al. Modulation of Apoptosis Controls Inhibitory Interneuron Number in the Cortex. Cell Reports. 22 (7), 1710-1721 (2018).
- Quatrocolo, G., et al. Homochronic Transplatation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains. Journal of Visualized Experiments. (136), e57723 (2018).
- Southwell, D. G., et al. Intrinsically determined cell death of developning cortical interneurons. Nature. 491 (7422), 103-113 (2012).
