Summary
Her presenterer vi en protokoll, designet for å bruke chemogenetic verktøy for å manipulere aktiviteten til kortikale interneuron forfedre transplantert inn i cortex av tidlige postnatal mus.
Abstract
Neuronal utvikling er regulert av en kompleks kombinasjon av miljømessige og genetiske faktorer. Vurdering av relative bidrag av hver komponent er en komplisert oppgave, som er spesielt vanskelig i forhold til utviklingen av γ-aminobutyric acid (GABA) ergic kortikale interneurons (CIs). CIs er de viktigste hemmende neurons i hjernebarken, og de spiller nøkkelroller i neuronal nettverk, ved å regulere både aktiviteten til individuelle pyramideformet neurons, samt oscillasjon atferden til neuronal ensembler. De er generert i forbigående embryonale strukturer (midtre og caudal ganglionic forrang-MGE og CGE) som er svært vanskelig å effektivt målrette bruke i Utero electroporation tilnærminger. Interneuron forfedre migrere lange avstander under normale embryoutvikling, før de integreres i kortikale kretsen. Denne bemerkelsesverdige evnen til å spre seg og integreres i et utviklende nettverk kan bli kapret av transplantere embryonale interneuron forløpere til tidlig post-Natal vert barken. Her presenterer vi en protokoll som tillater genetisk modifisering av embryonale interneuron forfedre ved hjelp av fokal ex vivo electroporation. Disse konstruerte interneuron forløpere blir deretter transplantert inn i tidlig post-Natal vert barken, hvor de vil modnes i lett identifiserbare CIs. Denne protokollen tillater bruk av flere genetisk kodede verktøy, eller evnen til å regulere uttrykk for spesifikke gener i interneuron forfedre, for å undersøke virkningen av enten genetiske eller miljømessige variabler på modning og integrering av CIs.
Introduction
Funksjonen til neuronal nettverk er avhengig av eksistensen av en balansert komplement av eksitatoriske projeksjon neurons og hemmende interneurons. Selv om kortikale interneurons (CIs) bare representerer 20% av alle neurons i pattedyr barken, er underskudd i antall eller funksjon antatt å spille en sentral rolle i patogenesen av neurodevelopmental lidelser1,2. Studiet av CI utvikling er utfordrende fordi CIs er generert i forbigående embryonale strukturer som er vanskelig å få tilgang til, og de følger en lang tangential migrasjon før de når pallium og utvikle sine modne anatomiske og fysiologiske egenskaper3. Både genetiske og miljømessige mekanismer er kjent som regulerer CI utvikling4, men det har vist seg vanskelig å studere den relative bidrag av flere faktorer.
Mange innsikter i CI utvikling ble innhentet ved hjelp in vitro kultur systemer etter isolering av forfedre fraganglionic forrang. En av de store fordelene med disse metodene er potensialet for å merke og genetisk modifisere de isolerte forfedre og følge deres differensiering i detalj, for å oppdage celle-autonome endringer. Disse metodene kan imidlertid ikke tilby informasjon om samspillet mellom utvikling av interneurons og et aktivt nettverk. Vi har tilpasset disse protokollene, ved transplantasjon av de modifiserte forløpere til tidlig post-Natal cortex. Interneuron forfedre isolert fra embryonale ganglionic forrang er i stand til å overleve, spre og integreres i verts nettverket ved transplantasjon i cortex7,8. Denne metoden har blitt brukt til å redusere alvorlighetsgraden av epileptiske anfall i genetiske Mouse modeller, og har blitt foreslått som en mulig ny terapi for ulike neurodevelopmental lidelser9,10. En tidligere protokoll beskriver en prosedyre for å overfører disse forløpere med viral vektorer før Sygehus11. Protokollen vi beskriver her også tillater genetisk modifisering av interneurons, men krever ikke etableringen av en viral vektor, som krever bare plasmider DNA, som i stor grad øker sin fleksibilitet. Noen studier rapporterte suksess i å bruke i Utero electroporation å genetisk modifisere interneuron forfedre i caudal ganglionic forrang (CGE)12, men denne metoden har vist seg svært vanskelig å reprodusere.
I representative resultater delen illustrerer vi bruken av denne metoden til å uttrykke designer reseptorer utelukkende aktiveres av designer narkotika (DREADDs13) i den transplanterte CIs, en metode vi brukte i en nylig publikasjon14. Vi uttrykte hM3D (GQ), en konstruert reseptor basert på den menneskelige kolinerge reseptoren CHRM3, som ikke påvirker neuronal funksjon med mindre den binder sin spesifikke ligand Clozapine-N-oksid (CNO). CNO administrasjon selektivt utløser aktivering av hM3D (GQ) uttrykker celler. Vi brukte denne metoden for å vise at celle autonome og forbigående depolarization er tilstrekkelig for å hindre apoptose av CIs under utvikling14. Kombinert med ulike genetisk kodede verktøy, denne protokollen har potensial til opp-eller ned-regulere genuttrykk, og visualisere eller manipulere celle aktivitet under ulike stadier av interneuron differensiering.
Protocol
Dyr ble avlet og plassert i samsvar med Storbritannia Animals (vitenskapelige prosedyrer) Act (1986).
Merk: For generering av pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP konstruere, en SalI-StuI fragment, som inneholder hM3D (GQ) sekvens, har blitt isolert fra plasmider 50463 (Addgene), og settes inn i uttrykket vektor pCAGGs-RFP (gave fra F. lomvi) fordøyd med XhoI-EcoRV.
1. utarbeidelse av Mouse embryo kortikale skiver
- Sterilisering av laboratorieutstyr (f.eks. stereo mikroskop) og overflater (f.eks. benker) med egnet vaskemiddel løsemiddel og 70% etanol (EtOH) i vann (H2O).
- Bruk disseksjon verktøy som har blitt autoklaveres og holde dem hele tiden i 100% EtOH.
- Forbered 3 20 mL alikvoter på 4% lav-gelling temperatur agarose i 1x fosfat buffer løsning (PBS), i 50 mL rør, og oppbevar dem ved 55 ° c.
- Ofre gravide mus ved cervical forvridning på 13,5 eller 14,5 dager i svangerskapet (embryonale dagen E 13,5-E 14.5).
- Med et par disseksjon saks, åpne magen av gravide mus, fjerne livmor hornene (med embryo) og legg dem i iskald Krebs løsning (tabell 1), i en 90 mm Petri parabolen.
- Med et par straight student fin tang, åpne fostervann SACs, fjerne embryo og overføre dem i frisk iskald Krebs løsning, i en ny 90 mm Petri parabolen. Analysere musen embryo hjernen (forebrain, mellomhjernen, hindbrain) fra resten av embryo kroppen.
- Holding The dissekert hjernen fra hindbrain, overføre dem i iskald Krebs løsning i en ny 90 mm Petri parabol, og holde dem på isen.
- Med en vanntett penn, tegne en rett linje på utsiden overflaten, i midten av den nederste delen av 6 35 mm Petri retter.
- Plasser en 4% lav-gelling agarose/PBS 20 mL alikvot ved 37 ° c i 5 min. umiddelbart etterpå stakkars 10 mL i 2 35 mm Petri retter og legge inn dissekert hjerner.
Merk: Den olfactory pærer skal vende nedover (nederst på Petri parabolen). Embed 3-4 hjerner per Petri parabol, justere dem i rett linje tidligere trukket. La det være 3 − 5 mm mellomrom mellom hver to hjerne. - Gjentagelse skritt 1,8 og 1,9 til alle dissekert hjerne ha blitt lagt ned i.
- Plasser den innebygde hjerner ved 4 ° c, for at agarose skal stivne, og deretter skjære de tre hjerner i en enkelt blokk med passende størrelse og orientering.
Merk: La ca 3 mm rundt kantene av hjernen prøvene. Endre retningen på hjernen, med olfactory pærer på toppen. - Lim blokken på overflaten av en mikrotomen base og ved hjelp av et kirurgisk blad kuttet hele veien gjennom bunnen av blokken, mellom hver to hjerner, for å skape 3 uavhengige blokker (hver mini blokk med en hjerne).
- § Blokkene, i iskald Krebs løsning, i 250 μm tykke skiver, ved hjelp av en vibrerende blad mikrotomen.
- Med en bøyde flat-endte mikro-spatel samler bare skiver som inneholder midtre eller caudal ganglionic forrang (MGE eller CGE; Figur 1) og individuelt overføre dem til filter membraner (13 μm diameter, 8,0 μm pore størrelse), flytende på minimal viktig medium (MEM, tabell 1) i polystyren senter-vel orgel kultur retter (60 mm x 15 mm).
- Plasser rettene i en CO2 vev kultur inkubator, ved 37 ° c, for 1 t, og forberede seg på fokal electroporation.
2. akutt Brain Slice electroporation
- Før du begynner med electroporation prosedyren, klargjør du 50 mL 1% agarose gel i en 100 mm Petri-tallerken. La agarose gel stivne i romtemperatur (RT) i ca. 30 minutter.
- Forbered små agarose søyler (1 mm diameter og 10 mm lengde), stemplet med et glass pipette (225 mm lengde; 2 mL kapasitet) og overføre dem i iskald Krebs løsninger.
Merk: En gummi dråpe pære egnet for 2 mL Pipetter er festet til pipette, og ved å trykke på den kan kolonnen frigjøres fra glass pipette til Krebs løsning. - Med et kirurgisk blad, kutt små agarose blokker av to størrelser: en liten en som vil passe på overflaten av elektroden (se nedenfor) og en større en, som vil bli brukt som base for å utføre fokal DNA injeksjoner i hjernen skiver. Overfør agarose blokkene i iskald Krebs løsning også.
- Klargjør oppsettet for fokal injeksjoner og akutt electroporation (figur 2).
Merk: For injeksjoner, følgende utstyr er nødvendig: 1) et lyst felt disseksjon stereo-mikroskop, 2) en pneumatisk Pico-pumpe injeksjonsvæske, 3) en micromanipulator, 4) en magnetisk stativ, og 5) en stål bunnplate. For den akutte skive electroporation, følgende utstyr er nødvendig: 1) en firkantet platina 10 mm Petri parabol elektrode, 2) en firkantet platina 10 mm deksel elektrode, 3) en micromanipulator, og 4) en electroporator. -
Fokal DNA-injeksjoner
- Forbered en DNA-blanding av uttrykks vekt Orer: pCAGGs-IRES-GFP (Control Vector) + pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP, ved en konsentrasjon på 1 μg/μL for hver vektor og tilsett rask grønn løsning (Stock 25 mg/mL) i en 1/10 fortynning.
- Fyll en trukket glass micropipette (0,5 mm indre diameter og 1 mm ytre diameter) med 10 μL av DNA-blandingen og Injiser små mengder (på 25-50 nL-området) i den valgte regionen (MGE/CGE) av stykket (figur 1 og figur 2).
-
Akutt electroporation
Merk: Electroporation skal utføres umiddelbart etter at DNA-injeksjonen er i fokus.- Plasser den lille agarose blokken på Petri parabol elektroden og fest agarose kolonnen til den mobile deksel elektroden ved hjelp av en flat-endte mikro-spatel.
- Overfør stykket med støtte membran på agarose blokken og plasser den øverste elektroden med agarose-kolonnen på toppen av den valgte regionen (MGE/CGE) av stykket.
Merk: lade spenninger på 125 V (to pulser på 5 MS hver, intervall 500 MS) vil gi en vellykket electroporation (Figur 3).
- Etter electroporation, plasserer skive med støtte membran i fatet og overføre parabolen i en CO2 vev kultur inkubator, ved 37 ° c.
- Etter 1 time, utveksle MEM medium for en grunnleggende medium som passer for primære neuronal kulturer (Nevron grunnleggende medium; Tabell 1) og ruge skiver over natten, for ca 18-24 h.
3. utarbeidelse av Cell-
- Kontroller effektiviteten til electroporation i alle sektorer. Merk bare sektorene der det er observert et akseptabelt antall fluorescerende celler (Figur 3).
Merk: Electroporate ca 30 skiver/per eksperiment for å erverve riktig antall celler for pode (se nedenfor). - Analysere den valgte regionen (MGE/CGE) fra hver skive og skjær vevet i små biter i iskald Krebs løsning, under et fluorescerende disseksjon stereo-mikroskop.
- I mellomtiden, plassere en 1,5 mL rør med 900 μL Nevron grunnleggende medium i et vannbad ved 37 ° c.
- Overfør vevs bitene med en P1000-micropipettor til et 1,5 mL rør som inneholder 500 μL av L15/DNase-medium fremstilt ved å tilsette 100 μL av 1 mg/mL DNase lager i DMEM/F12-medium til 900 μL av L15 medium. Vask vevs bitene ved å trykke.
- Tilsett 100 μL av DNase (lager 1 mg/mL i DMEM/F12 medium) i 900 μL Nevron grunnleggende medium.
- Kast L15/DNase medium og resuspend vevet brikkene i 200 μL Nevron Basic/DNase medium forberedt i trinn 3,5.
- Sett en P200 micropipettor til 180 μL og mekanisk distansere av vevs bitene ved å pipettering opp og ned forsiktig, 20-30 ganger, til en glatt og "kremet" suspensjon oppnås.
- Legg 200 μL av Nevron Basic/DNase medium (endelig totalt volum 400 μL) og resuspend.
- Ta en 4 μL alikvot av celler, fortynne hensiktsmessig og montere på en haemocytometer.
- Under et skarpt felt kan du kontrollere effektiviteten til dissosiasjon og telle antall celler.
Merk: Hvis dissosiasjon er vellykket, vil lyse (levende) enkeltceller og ikke celle aggregater observeres. - Sentrifuge celle suspensjon fra trinn 3,8, ved 1 000 RPM, ved RT, i 5 min, og deretter fjerne supernatanten fra røret og tilsett riktig L15/DNase medium (vanligvis 5-7 μL) slik at den endelige konsentrasjonen av celler vil være 8 x 105-1,2 x 106 celler/μL.
Merk: Under blanding er det svært viktig å unngå luftbobler. - Plasser celle alikvot på is og har ekstra L15/DNase medium for injeksjoner.
4. intrakraniell injeksjoner
Merk: Følgende prosedyrer finner sted i et prosedyre rom i Animal House Facility. Siden cellene vil bli injisert direkte til hjernen av nyfødte valper uten å utsette hjernen, aseptisk forhold holdes ved sterilisering arbeidsplass med 70% EtOH løsning og bruker autoklaveres glass nåler. Følgende utstyr er nødvendig for intrakraniell injeksjoner: 1) et lyst felt disseksjon stereo-mikroskop, 2) en mikro-injeksjons, og 3) en oppvarming pad for mus utvinning.
- Forbered en glass nål ved å trekke nåler i henhold til produsentens anbefalinger. Glass nåler med en 80 μm ytre diameter, 40 μm indre diameter, og en 30 ° skråkant brukes i denne protokollen.
Merk: Som nevnt ovenfor, bør nåler være autoklaveres før bruk. - Tilbakefylling manuelt nålen med biologisk inert olje ved hjelp av en 30 G, 2 tommer nål og en sprøyte.
- Monter og sett nålen på injeksjons enheten i henhold til produsentens anvisninger.
- Bestem injeksjons innstillingene på høyeste volum (69 nL) og en relativ langsom hastighet (23 nL/s).
- Tøm nålen til stempelet er helt forlenget.
-
Fyll nålen.
- Skjær et lite stykke fra en pode tape og legg den under et lyst felt disseksjon stereo-mikroskop. Med en P10 micropipette, overføring 5 μL fra prøven (celle alikvot) på båndet, slik at en sfærisk dråpe dannes.
- Plasser tuppen av nålen inn i prøven og fyll nålen (stempelet trekkes og tegner prøven med den).
Merk: Siden prøven skal være ganske tyktflytende, fyll nålen i små trinn slik at prøven vil likevekt, og i en langsom hastighet som hindrer bobler fra forming. Prøven skal være jevn og homogen i nålen. Hvis prøven er for tyktflytende og det ikke er mulig å fylle nålen, tilsett så mye L15/DNase medium som det er nødvendig for å oppnå riktig viskositet. Likevel, dette vil endre konsentrasjonen av prøven, og ideelt sett bør unngås.
- Dop ny født pups (postnatal dag 0-2 [p0-P2]) opp på isen for 2-5 min.
Merk: Sikre det det pup flytter ikke. - Plasser anesteserte valpen under lyse feltet disseksjon stereo-mikroskop.
- Utfør 3-4 injeksjoner av 69 nL hver på hver halvkule.
Merk: Injeksjonsstedene er plassert ca 1 mm lateral til midtlinjen, og mellom 1 mm caudal til bregma og 1 mm rostral til interaural linjen. Tuppen av nålen skal plasseres ca 1 mm dyp til den saify overflaten. Etter hver injeksjon, er nålen igjen på plass i ca 30 s og trekkes tilbake i perioder. - Umiddelbart etter injeksjoner, plassere pup på en oppvarming pad med oppvarming på det laveste innstillingen (37 ° c). Når valpen gjenoppretter overføre den til buret med sin mor.
Merk: Aldri avreise moren med nei pups inne byrået. Det hele fremgangsmåte (fra fjerner det pup fra dens littermates, til det er en kommet tilbake) burde vare mindre enn 10 min.
5. Clozapine-N-oksid injeksjoner
- Klargjør DREADD ligand, CNO lagerløsning ved å fortynne 1 mg CNO i 50 μL av dimethyl sulfoxide (DMSO) til løsningen er gjennomskinnelig. Topp-opp til 10 mL med saltvann slik at den endelige konsentrasjonen av CNO er 0,1 mg/mL.
Merk: DMSO er giftig. Unngå å bruke den til en konsentrasjon høyere enn 0,1%. Bruk som en kontroll en saltoppløsning som inneholder samme DMSO-konsentrasjon som CNO som inneholder løsningen. - Fra postnatal dag 14 og for 3 constitutively dager (P14-P16), i hver mus utføre to intraperitoneal (IP) injeksjoner av CNO (CNO konsentrasjon: 1 mg/kg) eller 0,05% DMSO i saltvann, per dag, 12 h fra hverandre.
- På den siste dagen (P17), utføre en enkelt injeksjon og ofre mus ved cervical forvridning innen en tid vindu på 30 min-1 t.
Representative Results
Ved hjelp av prosedyren som presenteres her, testet vi om overlevelse av kortikale interneurons under tidlige postnatal stadier er regulert av aktivitet i en celle autonom måte. Vi utførte tre Brain Slice electroporation eksperimenter (12-16 embryo [E 14.5 embryo] per eksperiment) med pCAGGs-IRES-GFP (kontroll) og pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP uttrykk vektorer, ved en konsentrasjon på 1 μg/μL for hver konstruksjon. I våre electroporation eksperimenter, bare en brøkdel (ca 50%; Figur 3) av GFP+ neurons co-uttrykt HM3D (GQ) (RFP+) og derfor GFP+RFP- befolkning FUNGERTE som en intern kontroll for effekten av DREADD ligander. Transfekterte kortikale embryonale interneurons var mekanisk dissosiert og den resulterende celle suspensjonen (8 x 105 celler/μL) podet i cortex på p0-P1 Wild type mus. Vi hadde utført 6 injeksjoner per hjerne. Inne hver eksperiment, en minst mulig av 6 ny født pups var injisert. Administrasjon av CNO selektivt økt aktiviteten av transfekterte RFP+ celler, som demonstrert av uttrykk for aktivitet-avhengige protein cFos (Figur 4). CNO behandling i henhold til den beskrevne protokollen (administrere to ganger daglig P14-P17) resulterte i en økning i andelen GFP+RFP+ i forhold til GFP+RFP- Cells, i forhold til kjøretøyet (0,5% DMSO i saltvann) administrert littermates (figur 5).
Figur 1: representative telencephalic skiver som brukes til akutte electroporation eksperimenter. (A-C) Telencephalic skiver innhentet på tre distinkte sekvensielle Rostro-caudal nivåer, beiset med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). LGE: lateral ganglionic dominans; MGE: midtre ganglionic dominans; CGE: caudal ganglionic dominans. Skala stolper = 200 μm. De gule stjernene angir det electroporation området i hver sektor. Den hvite linjen markerer kanten av ganglionic dominans. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: skjematisk fremstilling av den eksperimentelle arbeidsflyten. (A) mus hjerne skiver er electroporated med egnede konstruksjoner, og (B) etter 12 h MODIFISERTE kortikale interneuron (CI) forløpere er isolert og (C) transplantert i pallium av nyfødte mus valper (p0 − P2). For å endre aktiviteten til umodne CIs, P14 valper som hadde fått celle Sygehus ble injisert med CNO eller kjøretøy for fire konstituerende dager i henhold til den presenterte protokollen. (A ') Fotografi av den akutte musen hjernen skive electroporation satt opp. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representative vellykket akutt skive electroporation eksperiment. (A) representative koronale delen fra en e 14.5 embryo hjerne TRANSFEKTERTE i CGE med både PCAGGS-IRES-GFP (GFP) og PCAGGs-HM3D (GQ)-IRES-RFP (RFP) plasmider og kultivert for 12 h. Seksjonen er immunostained for GFP (A, B, C) og RFP (A, B, D). Den boks område i panel A er forstørret for å vise uttrykk for både fluorescerende journalister (B), GFP (C) og RFP bare (D). Den hvite linjen markerer kanten av ganglionic dominans. B-D: samme bilde, ulike kanaler eller kombinasjon av de to forskjellige kanaler. Skala stolper = 200 μm (A), 100 μm (B-D). Dette tallet har blitt modifisert fra Denaxa et al.14. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Cell autonome økning i aktiviteten til M3D (GQ)-uttrykker transplantert CIs upon CNO administrasjon. (A-D) Representative konfokalmikroskopi bilder av en koronale del av en P17 Mouse transplantert på P1 med CI forløpere transfekterte med både pCAGGs-IRES-GFP (GFP) og pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP (RFP) plasmider og behandlet med CNO. Seksjonen er immunostained for GFP (A), RFP (B), og cFos (C). (D) det kombinerte bildet av A, B og C immunofluorescence (combo). Note det bare CIs tilpasse-uttrykker begge to plasmider (hvit pilene inne en-D) er likeledes cFos+ sammenlignet med CIs uttrykker bare kontrollen-GFP plasmider (gul pilene inne en-d). (E) kvantifisering av cFos+RFP+ celler grunnlegge inne pallium av P17 mus transplantert for P1 (normalisert å det sum RFP+ befolkning) og behandlet med kjøretøy eller CNO (N = 2). A-D: samme bilde, forskjellige kanaler, eller kombinasjon av de tre forskjellige kanaler. Skala bars = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Cell autonom økning i aktiviteten til CIs øker overlevelse . (A-D) Representative konfokalmikroskopi bilder av somatosensory cortex koronale skiver av P17 mus transplantert på p0-P2 med CI forløpere transfekterte med både pCAGGs-IRES-GFP (GFP) og pCAGGs-hM3D (GQ)-IRES-RFP (RFP) plasmider og behandlet med kjøretøy (A-B) eller CNO (C-D). (E) KVANTIFISERING av RFP+ celler funnet i forebrain av P17 mus transplantert til p0-P2 (NORMALISERT til den totale GFP+ befolkning). RFP+(kjøretøy) = 47% ± 3%, CNO = 61% ± 3%, p = 0,01, student ' s sammenkoblede sample t test, n = 3 kjøretøy og 3 CNO, et minimum av 150 celler telles per hjerne. A og B: samme bilde, ulike kanaler. C og D: samme bilde, forskjellige kanaler. Skala stolper = 50 μm. Dette tallet har blitt modifisert fra Denaxa et al.14. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: tilleggsinformasjon om medier som brukes i denne protokollen.
Discussion
Her beskriver vi en allment tilgjengelig metodikk for å genetisk modifisere aktiviteten til CI-forløpere for å studere virkningen av egen aktivitet på CI-modning, og/eller effekten av aktivitets modulert CIs på montering/funksjon av den integrerte kortikale Kretser.
I det siste, flere laboratorier, inkludert vår, hadde utført i Utero electroporation eksperimenter for å genetisk endre projeksjon neurons6. Imidlertid, inne Utero electroporation i ganglionic forrang det inkludere CI forfedre er meget vanskelig, på grunn av elektrisk ledning sti problemer. For å løse dette problemet, er et lite antall laboratorier utfører ultralyd guidet injeksjoner etterfulgt av electroporation, som er en krevende teknikk som krever dyrt utstyr. Denne protokollen gir et alternativ til disse metodene som er tilgjengelig for flertallet av det vitenskapelige samfunnet.
En av de mest utfordrende aspektet av denne protokollen er å maksimere antall celler som overlever i verten cortex til modne stadier, når fenotypiske analyse er vanligvis utføres (svært avhengig av eksperimentet design, men vanligvis eldre enn P17). Det er tre viktige trinn som etterforsker bør ta hensyn: (1) effektiviteten av electroporation. Dette kan maksimeres ved å sikre renheten av DNA-plasmider. Bare DNA-plasmider av høy kvalitet (en A260/a280 ratio på 1,9-2.0) bør brukes for denne prosedyren. Vi får slike DNA-preparater av høy kvalitet ved å bruke cesium klorid DNA-rensing. En annen viktig faktor er arrangøren som driver uttrykk for det genet av interesse. Vi fant at pCAGGs vektor, som består av kylling b-utgangen promoter, er ekstremt kraftig og kan dramatisk øke electroporation effektivitet. (2) antall starter donor embryo. Det er viktig å sørge for at et stort antall (12-16) av embryo på samme scene er electroporated. Dette tallet kan økes, hvis flere forskere utfører embryo dissections og snitting sammen, da det er viktig at embryonale kortikale skiver er innhentet, electroporated og overført til inkubator så snart som mulig. (3) det er viktig å sørge for at et stort antall celler injiseres i hver valp for å sikre en høy sjanse for transplantert celle overlevelse til modne etapper. I tillegg vil dette dramatisk øke sannsynligheten for vellykkede transplantasjon siden lav tetthet celle preparater vil resultere i ujevn blanding av cellene med mediet, noe som vil gi betydelig variasjon i den transplanterte hjernen15 .
Protokollen beskrevet her var skreddersydd for å undersøke rollen til aktivitet i å regulere CI overlevelse i en celle-autonom måte. P14-P17 tid vindu for å utføre CNO injeksjoner ble spesielt valgt i henhold til publiserte data, som viser at toppen av transplantert CI forfedre ' celle død oppstår i denne perioden16. Derfor denne tidsrammen eller hyppigheten av CNO injeksjoner kan ikke holde sant for andre celletyper eller hjernen regioner, og etterforsker bør justere disse parametrene i henhold til spesifikke eksperimentelle formål. Til slutt, metodikken beskrevet her over for intrakraniell injeksjoner av CIs er bare gjennomførbart for p0-P5 pups (avhenger likeledes på musen line miljøet). I prinsippet vil eventuelle injeksjoner over P5 kreve tynning eller fjerning av skallen15.
En av de viktigste fordelene med denne protokollen er muligheten til å bruke nye genetisk kodede verktøy for å visualisere eller manipulere aktiviteten til CIs under ulike stadier av differensiering som de integreres i et utviklingsland nettverk. Med tempoet av oppdagelsen av ny genetisk kodet Voltage og kalsium sensor, likeledes idet ny chemogenetic og optogenetic verktøy, denne protokollen innrømmer forskning å bruk seg innen ukens av løslate i plasmider repositories, som Addgene.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en ERC starter Grant (282047), en Wellcome Trust etterforsker Award (095589/Z/11/Z), en FP7 EC DESIRE Grant, og en lister Institute prisen til JB. Arbeidet i V.P. laboratorium er støttet av BBSRC (BB/L022974/1), The UK Medical Research Council (MRC), og Francis Crick Institute (som mottar midler fra MRC, Cancer Research UK, og Wellcome Trust). Forskningen i MD Lab ble gjort mulig gjennom stipend fra Stavros Niarchos Foundation til B.S.R.C. "Alexander Fleming", som en del av stiftelsen initiativ for å støtte den greske forskningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium/Supplements | |||
| B-27 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 175040-044 | |
| DMEM/F12 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21331-020 | |
| DNAse | SIGMA | DN15-100MG | |
| FBS | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 10270-098 | |
| 100x Glutamine | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 35050-061 | |
| L15 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 11415-049 | |
| MEM alpha, GlutaMAX | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 32561-029 | |
| Neurobasal medium | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21103-049 | Neuron basic medium |
| 100x P/S | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | |
| Equipment | |||
| Electroporator | BTX | ECM 830 generator | |
| Injector for acute slice electroporation | Eppendorf | FemtoJet Microinjector | |
| Injector for cell transplantation (I) | Visual Sonics | Vevo Injector System | |
| Injector for cell transplantation (II) | WPI | NANOLITER2010 | |
| Magnetic Stand | WPI | M10L Magnetic Stand | |
| Kite Manual Micromanipulator | WPI | KITE-M3-R | |
| Platinum Elecrode (I) | Protech International Inc. | CUY-700-1 | |
| Platinum Elecrode (II) | Protech International Inc. | CUY-700-2 | |
| Steel Base Plate | WPI | 5479 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Other Material | |||
| Glass capillaries for electroporation | VWR | 1B100-4 | |
| Glass capillaries for cell transplantation | Visual Sonics | provided by Visual Sonics | |
| Nuclepore 8 µm whatman membrane | SLS | 110414 | |
| Organ tissue culture dishes | BD Biosciences (Falcon) | 353037 |
References
- Marin, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Review Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
- Glausier, J. R., Lewis, D. A. GABA and schizophrenia: Where we stand and where we need to go. Schizophrenia Research. 181, 2-3 (2017).
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual Review Neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Wamsley, B., Fishell, G. Genetic and activity-dependent mechanisms underlying interneuron diversity. Nature Review Neuroscience. 18 (5), 299-309 (2017).
- Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. Journal of Neuroscience. 24 (11), 2612-2622 (2004).
- Denaxa, M., et al. Maturation-promoting activity of SATB1 in MGE-derived cortical interneurons. Cell Reports. 2 (5), 1351-1362 (2012).
- Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. Nature Neuroscience. 2 (5), 461-466 (1999).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. Journal of Neuroscience. 26 (28), 7380-7389 (2006).
- Baraban, S. C., et al. Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice. Proccedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15472-15477 (2009).
- Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344 (6180), 1240622 (2014).
- Vogt, D., et al. Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies. Journal of Visualized Experiments. (98), e52740 (2015).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Denaxa, M., et al. Modulation of Apoptosis Controls Inhibitory Interneuron Number in the Cortex. Cell Reports. 22 (7), 1710-1721 (2018).
- Quatrocolo, G., et al. Homochronic Transplatation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains. Journal of Visualized Experiments. (136), e57723 (2018).
- Southwell, D. G., et al. Intrinsically determined cell death of developning cortical interneurons. Nature. 491 (7422), 103-113 (2012).
