Summary
Aquí presentamos un protocolo, diseñado para utilizar herramientas quimiogenéticas para manipular la actividad de los progenitores interneuronales corticales trasplantados a la corteza de los primeros ratones postnatales.
Abstract
El desarrollo neuronal está regulado por una compleja combinación de factores ambientales y genéticos. Evaluar la contribución relativa de cada componente es una tarea complicada, que es particularmente difícil en lo que respecta al desarrollo de las interneuronas corticales (CC) de ácido aminobutírico (GABA). Los IC son las principales neuronas inhibitorias en la corteza cerebral, y desempeñan un papel clave en las redes neuronales, regulando tanto la actividad de las neuronas piramidales individuales, como el comportamiento oscilatoria de los conjuntos neuronales. Se generan en estructuras embrionarias transitorias (eminencias gangliónicas mediales y caudales - MGE y CGE) que son muy difíciles de apuntar eficientemente utilizando en enfoques de electroporación utero. Los progenitores interneuronales migran largas distancias durante el desarrollo embrionario normal, antes de integrarse en el circuito cortical. Esta notable capacidad de dispersión e integración en una red en desarrollo puede ser secuestrada mediante el trasplante de precursores interneuronas embrionarios en córticos de huésped postnatal temprano. Aquí, presentamos un protocolo que permite la modificación genética de progenitores interneuronas embrionarias utilizando electroporación focal ex vivo. Estos precursores interneuronas de ingeniería se trasplantan a cortices de acogida postnatal tempranos, donde madurarán en cIS fácilmente identificables. Este protocolo permite el uso de múltiples herramientas genéticamente codificadas, o la capacidad de regular la expresión de genes específicos en progenitores interneuronas, con el fin de investigar el impacto de variables genéticas o ambientales en la maduración y integración de los IC.
Introduction
La función de las redes neuronales se basa en la existencia de un complemento equilibrado de neuronas de proyección excitatoria e interneuronas inhibitorias. Aunque las interneuronas corticales (CI) sólo representan el 20% de todas las neuronas en los cortices de mamíferos, se cree que los déficits en su número o función juegan un papel clave en la patogénesis de los trastornos del neurodesarrollo1,2. El estudio del desarrollo de CI es difícil porque los CI se generan en estructuras embrionarias transitorias de difícil acceso, y siguen una larga migración tangencial antes de llegar al palio y desarrollar su madura anatómica y fisiológica propiedades3. Se conocen tanto mecanismos genéticoscomo ambientales que regulan el desarrollo de CI 4, pero ha resultado difícil estudiar la contribución relativa de múltiples factores.
Muchos conocimientos en el desarrollo de CI se obtuvieron utilizando sistemas de cultivo invitro después del aislamiento de los progenitores de las eminencias gangliónicas 5,6. Una de las grandes ventajas de estos métodos es el potencial de etiquetar y modificar genéticamente a los progenitores aislados y seguir su diferenciación en detalle, para detectar cambios autónomos de células. Sin embargo, estos métodos no pueden ofrecer información sobre las interacciones entre el desarrollo de interneuronas y una red activa. Hemos adaptado estos protocolos, mediante el trasplante de los precursores modificados en la corteza postnatal temprana. Los progenitores interneuronales aislados de las eminencias gangliónicas embrionarias son capaces de sobrevivir, dispersarse e integrarse en la red huésped tras el trasplante en la corteza7,8. Este método se ha utilizado para reducir la gravedad de las convulsiones epilépticas en modelos genéticos de ratón, y se ha propuesto como una posible nueva terapia para diferentes trastornos del neurodesarrollo9,10. Un protocolo anterior describe un procedimiento para transducir estos precursores con vectores virales antes de los trasplantes11. El protocolo que describimos aquí también permite la modificación genética de las interneuronas, pero no requiere la creación de un vector viral, que requiere sólo ADN plásmido, lo que aumenta en gran medida su flexibilidad. Algunos estudios informaron de éxito en el uso en electroporación utero para modificar genéticamente los progenitores interneuronales en las eminencias gangliónicas caudales (CGE)12,pero este método ha demostrado ser muy difícil de reproducir.
En la sección de resultados representativos, ilustramos el uso de este método para expresar los receptores de diseño activados exclusivamente por los medicamentos de diseño (DREADDs13) en los DI trasplantados, un método que utilizamos en una publicación reciente14. Expresamos hM3D (Gq), un receptor diseñado basado en el receptor colinérgico humano CHRM3, que no afecta a la función neuronal a menos que se une a su ligando específico clozapina-N-óxido (CNO). La administración de CNO activa selectivamente la activación de las células de expresión hM3D(Gq). Utilizamos este método para mostrar que la despolarización celular autónoma y transitoria es suficiente para evitar la apoptosis de los CI durante el desarrollo14. Combinado con diferentes herramientas codificadas genéticamente, este protocolo tiene el potencial de regular hacia arriba o hacia abajo la expresión génica, y visualizar o manipular la actividad celular durante diferentes etapas de diferenciación interneurona.
Protocol
Los animales fueron criados y alojados de conformidad con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Reino Unido (1986).
NOTA: Para la generación de la construcción pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, un fragmento SalI-StuI, que contiene la secuencia hM3D(Gq), se ha aislado del plásmido 50463 (Addgene), y se ha insertado en el vector de expresión pCAGGs-RFP (regalo de F. Guilmot) digerido con digestión con XhoI-EcoRV.
1. Preparación de rodajas corticales de embriones de ratón
- Esterilizar equipos de laboratorio (por ejemplo, microscopios estéreo) y superficies (por ejemplo, bancos) con un disolvente detergente adecuado y una solución de etanol al 70% (EtOH) en agua (H2O).
- Utilice herramientas de disección que hayan sido autoclavedas y manténgalas todo el tiempo en 100% EtOH.
- Preparar tres alícuotas de 20 ml de agarosa de temperatura baja en 1x a 5o C en 1x solución tampón de fosfato (PBS), en tubos de 50 ml, y mantenerlas a 55 oC.
- Sacrificar ratones embarazadas por luxación cervical a los 13,5 o 14,5 días de gestación (día embrionario E13.5-E14.5).
- Con un par de tijeras de disección, abra el abdomen de los ratones embarazadas, retire los cuernos uterinos(con los embriones) y colóquelos en una solución de Krebs helada (Tabla 1), en un plato Petri de 90 mm.
- Con un par de fórceps finos para estudiantes rectos, abra los sacos amnióticos, retire los embriones y transfieralos en una solución fresca de Krebs heladas, en un nuevo plato Petri de 90 mm. Diseccionar el cerebro del embrión de ratón (forebrain, midbrain, hindbrain) del resto del cuerpo embrionario.
- Sosteniendo los cerebros diseccionados del cerebro trasero, transfiéralos en una solución Krebs helada en un nuevo plato Petri de 90 mm y guárdalos en hielo.
- Con una pluma impermeable, dibuje una línea recta en la superficie exterior, en el centro de la parte inferior de seis platos Petri de 35 mm.
- Colocar un 4% de agarosa baja en gel/PBS 20 ml a 37 oC durante 5 min. Inmediatamente después de unos 10 ml pobres en dos platos Petri de 35 mm e incrustar los cerebros diseccionados.
NOTA: Las bombillas olfativas deben mirar hacia abajo (parte inferior de la placa Petri). Incruste 3-4 cerebros por plato Petri, alinee en la línea recta previamente dibujada. Deje espacio de 3 a 5 mm entre cada dos cerebros. - Repita los pasos 1.8 y 1.9 hasta que todos los cerebros diseccionados estén incrustados.
- Colocar los cerebros incrustados a 4 oC, para que la agarosa se solidifique, y posteriormente tallar los tres cerebros en un solo bloque de tamaño y orientación apropiados.
NOTA: Deje aproximadamente 3 mm alrededor de los bordes de las muestras cerebrales. Cambiar la orientación de los cerebros, con las bombillas olfativas en la parte superior. - Pega el bloque en la superficie de una base de microtome y usando una cuchilla quirúrgica cortada hasta la parte inferior del bloque, entre cada dos cerebros, con el fin de crear 3 bloques independientes (cada mini bloque que contiene un cerebro).
- Secciona los bloques, en solución de Krebs helada, en rodajas de 250 m de espesor, usando un microtome de cuchilla vibratoria.
- Con una microespátula de extremo plano doblada recoger sólo las rodajas que contienen las eminencias gangliónicas mediales o caudales (MGE o CGE; Figura 1) y transferirlas individualmente a membranas filtrantes (13 m de diámetro, 8,0 m de tamaño de poro), flotando en un medio esencial mínimo (MEM, Tabla 1) en platos de cultivo de órganos de poliestireno centro-pozo (60 mm x 15 mm).
- Colocar los platos en una incubadora de cultivo de tejido CO 2, a 37oC, durante 1 h, y prepararse para la electroporación focal.
2. Electroporación de corte cerebral agudo
- Antes de comenzar el procedimiento de electroporación, prepare 50 ml de gel de agarosa al 1% en una placa Petri de 100 mm. Deje que el gel de agarosa se solidifique a temperatura ambiente (RT) durante aproximadamente 30 minutos.
- Prepare pequeñas columnas de agarosa (1 mm de diámetro y 10 mm de longitud), perforadas con una pipeta de vidrio (225 mm de longitud; capacidad de 2 ml) y transfieralas en soluciones Krebs heladas.
NOTA: Una bombilla cuentagotas de goma adecuada para pipetas de 2 ml se une a la pipeta, y al presionarla la columna se puede liberar de la pipeta de vidrio a la solución Krebs. - Con una cuchilla quirúrgica, cortar pequeños bloques de agarosa de dos tamaños: uno pequeño que cabe en la superficie del electrodo (ver más abajo) y uno más grande, que se utilizará como base para realizar las inyecciones focales de ADN en las rodajas de cerebro. Transfiera también los bloques de agarosa en una solución de Krebs helada.
- Preparar la configuración para las inyecciones focales y la electroporación aguda (Figura 2).
NOTA: Para las inyecciones, se necesita el siguiente equipo: 1) un microscopio estéreo de disección de campo brillante, 2) un inyector neumático pico-bomba, 3) un micromanipulador, 4) un soporte magnético y 5) una placa base de acero. Para la electroporación aguda de la rebanada, se necesita el siguiente equipo: 1) un electrodo de plato Petri de platino cuadrado de 10 mm, 2) un electrodo de cubierta de platino cuadrado de 10 mm, 3) un micromanipulador y 4) un electroporator. -
Inyecciones focales de ADN
- Preparar una mezcla de ADN de vectores de expresión: pCAGGs-IRES-GFP (vector de control) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, a una concentración de 1 g/l para cada vector y añadir una solución verde rápida (stock 25 mg/mL) en una dilución de 1/10.
- Llenar una micropipeta de vidrio tirado (0,5 mm de diámetro interior y 1 mm de diámetro exterior) con 10 ml de la mezcla de ADN e inyectar pequeñas cantidades (en el rango de 25-50 nL) en la región seleccionada (MGE/CGE) de la rebanada (Figura1 y Figura 2).
-
Electroporación aguda
NOTA: La electroporación debe realizarse inmediatamente después de la inyección focal de ADN.- Coloque el pequeño bloque de agarosa en el electrodo de la placa Petri y adjunte la columna de agarosa al electrodo de cubierta móvil con la ayuda de una microespátula plana.
- Transfiera la rebanada con su membrana de soporte al bloque de agarosa y coloque el electrodo superior con la columna de agarosa en la parte superior de la región seleccionada (MGE/CGE) de la rebanada.
NOTA: Los voltajes de carga de 125 V (dos pulsos de 5 ms cada uno, intervalo 500 ms) producirán una electroporación exitosa (Figura3).
- Después de la electroporación, coloque la rebanada con su membrana de soporte en el plato y transfiera el plato en una incubadora de cultivo de tejido CO 2, a 37 oC.
- Después de 1 h, cambie el medio MEM por un medio básico apropiado para cultivos neuronales primarios (medio básico de neurona; Tabla 1) e incubar las rodajas durante la noche, durante aproximadamente 18-24 h.
3. Preparación de injertos celulares
- Compruebe la eficiencia de la electroporación en todas las rodajas. Seleccione solo los sectores en los que se observa un número aceptable de celdas fluorescentes (Figura 3).
NOTA: Electroportar aproximadamente 30 rodajas/por experimento para adquirir el número adecuado de células para el injerto (ver más abajo). - Diseccionar la región seleccionada (MGE/CGE) de cada rebanada y cortar el tejido en trozos pequeños en solución de Krebs helada, bajo un estereomicroscopio de disección fluorescente.
- Mientras tanto, coloque un tubo de 1,5 ml con un medio básico de neurona de 900 ml en un baño de agua a 37 oC.
- Transfiera las piezas de tejido con un micropipetador P1000 a un tubo de 1,5 ml que contenga 500 ml de medio L15/DNase preparado añadiendo 100 ml de 1 mg/ml de dnase en medio DMEM/F12 a 900 ml de medio L15. Lave las piezas de tejido tocando.
- Añadir 100 l de DNase (stock 1 mg/ml en medio DMEM/F12) en el medio básico de la neurona de 900 l.
- Deseche el medio L15/DNase y resuspenda las piezas de tejido en un medio básico/DNase de neurona de 200 l preparado en el paso 3.5.
- Ajuste un micropipetador P200 a 180 l y disocia mecánicamente las piezas de tejido pipeteando hacia arriba y hacia abajo suavemente, 20-30 veces, hasta obtener una suspensión suave y "cremosa".
- Añadir 200 l de medio básico/DNase de la neurona (volumen total final 400 l) y resuspender.
- Tomar una alícuota de 4 l de células, diluir adecuadamente y montar en un hemocitómetro.
- Bajo un microscopio de campo brillante, compruebe la eficiencia de la disociación y cuente el número de células.
NOTA: Si la disociación es exitosa, se observarán células individuales brillantes (vivas) y no agregados de células. - Suspensión de celda de centrífuga del paso 3.8, a 1.000 rpm, a RT, durante 5 min, y posteriormente, retire el sobrenadante del tubo y agregue el medio L15/DNase apropiado (generalmente 5-7 l) para que la concentración final de las células sea de 8 x 105-1.2 x 106 células/L.
NOTA: Durante la resuspensión, es extremadamente importante evitar las burbujas de aire. - Coloque la alícuota celular sobre hielo y tenga un medio adicional De15/DNase para las inyecciones.
4. Inyecciones intracraneales
NOTA: Los siguientes procedimientos tienen lugar en una sala de procedimientos dentro de la Instalación de la Casa de Animales. Dado que las células se inyectarán directamente en el cerebro de los cachorros recién nacidos sin exponer el cerebro, las condiciones asépticas se mantienen esterilizando el espacio de trabajo con 70% de solución EtOH y utilizando agujas de vidrio autoclave. Se necesita el siguiente equipo para las inyecciones intracraneales: 1) un estereomicroscopio de disección de campo brillante, 2) un microinyector y 3) una almohadilla de calentamiento para la recuperación del ratón.
- Prepare una aguja de vidrio tirando de agujas de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. En este protocolo se utilizan agujas de vidrio con un diámetro exterior de 80 m, un diámetro interior de 40 m y un bisel de 30o.
NOTA: Como se mencionó anteriormente, las agujas deben ser autoclavedas antes de su uso. - Rellene manualmente la aguja con aceite biológicamente inerte utilizando una aguja de 30 G, 2 pulgadas y una jeringa.
- Montar e insertar la aguja en la unidad inyector de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Determine los ajustes de inyección al volumen máximo (69 nL) y a una velocidad relativa lenta (23 nL/s).
- Vacíe la aguja hasta que el émbolo esté completamente extendido.
-
Llene la aguja.
- Corta una pequeña pieza de una cinta de injerto y colóquela bajo un microscopio estéreo de disección de campo brillante. Con un micropipeta P10, transfiera 5 l de la muestra (alícuota celular) a la cinta, de modo que se forme una gota esférica.
- Coloque la punta de la aguja en la muestra y llene la aguja (el émbolo se retrae y dibuja la muestra con ella).
NOTA: Dado que la muestra debe ser bastante viscosa, llene la aguja en pequeños pasos para que la muestra se equilibre, y a una velocidad lenta que impida la formación de burbujas. La muestra debe ser lisa y homogénea dentro de la aguja. Si la muestra es demasiado viscosa y no es posible llenar la aguja, añada tanto medio L15/DNase como sea necesario para obtener la viscosidad correcta. Sin embargo, esto cambiará la concentración de la muestra, e idealmente debe evitarse.
- Anestesiar cachorros recién nacidos (día postnatal 0-2 [P0-P2]) sobre hielo durante 2-5 min.
NOTA: Asegúrese de que el cachorro no se está moviendo. - Coloque el cachorro anestesiado bajo el microscopio estéreo de disección de campo brillante.
- Realizar 3-4 inyecciones de 69 nL cada una en cada hemisferio.
NOTA: Los sitios de inyección se encuentran aproximadamente 1 mm lateral a la línea media, y entre 1 mm caudal a bregma y 1 mm rostral a la línea interaural. La punta de la aguja debe colocarse aproximadamente 1 mm de profundidad en la superficie pial. Después de cada inyección, la aguja se deja en su lugar durante aproximadamente 30 s y se retira en períodos. - Inmediatamente después de las inyecciones, coloque el cachorro en una almohadilla de calentamiento con la calefacción en su ajuste más bajo (37 oC). Cuando el cachorro se recupera transferirlo a la jaula con su madre.
NOTA: Nunca dejes a la madre sin cachorros en la jaula. Todo el procedimiento (de retirar el cachorro de sus camadas, hasta que se devuelve) debe durar menos de 10 minutos.
5. Inyecciones de clozapina-N-óxido
- Preparar el ligando DREADD, solución de cNO mediante la dilución de 1 mg de CNO en 50 l de dimetil sulfóxido (DMSO) hasta que la solución sea translúcida. Recarga hasta 10 ml con salina para que la concentración final de CNO sea de 0,1 mg/ml.
NOTA: DMSO es tóxico. Evitar usarlo a una concentración superior a 0,1%. Utilizar como control una solución salina que contenga la misma concentración de DMSO que la solución que contiene CNO. - A partir del día postnatal 14 y durante 3 días constitutivamente (P14-P16), en cada ratón realizar dos inyecciones intraperitoneales (I.P.) de CNO (concentración CNO: 1 mg/kg) o 0,05% DMSO en solución salina, por día, 12 h de separación.
- En el último día (P17), realizar una sola inyección y sacrificar ratones por luxación cervical dentro de una ventana de tiempo de 30 min-1 h.
Representative Results
Usando el procedimiento presentado aquí, probamos si la supervivencia de las interneuronas corticales durante las primeras etapas postnatales está regulada por la actividad de una manera autónoma celular. Realizamos 3 experimentos de electroporación por rebanadas cerebrales (12-16 embriones [E14.5 embriones] por experimento) con los vectores de expresión pCAGGs-IRES-GFP (control) y pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, a una concentración de 1 g/L para cada construcción. En nuestros experimentos de electroporación, sólo una fracción (aproximadamente 50%; Figura 3) de la GFP+ neuronas co-expresadas hM3D(Gq) (RFP+) y por lo tanto la población GFP+RFP- sirvió como un control interno para el efecto de los ligandos DREADD. Las interneuronas embrionarias corticales transinfectadas se disociaron mecánicamente y la suspensión celular resultante (8 x 105 células/L) se injertó en la corteza de ratones de tipo salvaje P0-P1. Habíamos realizado 6 inyecciones por cerebro. En cada experimento, se inyectaron un mínimo de 6 cachorros recién nacidos. La administración de CNO aumentó selectivamente la actividad de las células RFP+ transinfectadas, como lo demuestra la expresión de la proteína cFos dependiente de la actividad (Figura4). El tratamiento CNO de acuerdo con el protocolo descrito (administrar dos veces al día P14-P17) dio lugar a un aumento en la proporción de GFP+RFP+ en relación con GFP+RFP- células, en comparación con el vehículo (0,5% DMSO en salina) littermates administrados (Figura5).
Figura 1: Rebanadas telencéfalas representativas utilizadas para experimentos de electroporación aguda. (A-C) Rebanadas telencéfalas obtenidas en tres niveles secuenciales distintos de rostro-caudal, teñidas con 4o,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). LGE: eminencia gangliónica lateral; MGE: eminencia gangliónica medial; CGE: eminencia gangliónica caudal. Barras de escala a 200 m. Los asteriscos amarillos indican el sitio de electroporación en cada rebanada. La línea blanca marca el borde de la eminencia gangliónica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Representación esquemática del flujo de trabajo experimental. (A) Las rebanadas de cerebro de ratón se electroporanan con construcciones apropiadas, y (B ) después de 12 h de que los precursores de la interneurona cortical (CI) modificados se aíslan y (C) se trasplantan en el palio de los cachorros de ratón recién nacidos (P0-P2). Con el fin de modificar la actividad de los CI inmaduros, los cachorros P14 que habían recibido trasplantes celulares fueron inyectados con CNO o vehículo durante cuatro días constitutivos de acuerdo con el protocolo presentado. (A') Fotografía de la configuración aguda de electroporación de corte cerebral de ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Experimento representativo de electroporación aguda de rebanadas agudas. (A) Sección coronal representativa de un cerebro embrionario E14.5 transpinfectado en el CGE con plCAGS-IRES-GFP (GFP) y pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP (RFP) plásmidos y cultivados durante 12 h. La sección ha sido inmunomanchada para GFP (A, B, C) y RFP (A, B, D). El área en caja del panel A se magnifica para mostrar la expresión de ambos reporteros fluorescentes (B), GFP (C) y RFP solamente (D). La línea blanca marca el borde de la eminencia gangliónica. B-D: misma foto, diferentes canales o combinación de los dos canales diferentes. Barras de escala a 200 m (A), 100 m (B-D). Esta cifra ha sido modificada de Denaxa et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Aumento autónomo celular de la actividad de m3D(Gq)-expressing transplanted CI on CNO administration. (A-D) Imágenes confocales representativas de una sección coronal de un ratón P17 trasplantado en P1 con precursores de CI transpirados con plCAGGs-IRES-GFP (GFP) y pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP (RFP) plásmidos y tratados con CNO. La sección ha sido inmunonicada para GFP (A), RFP (B) y cFos (C). (D) La imagen combinada de inmunofluorescencia A, B y C (combo). Tenga en cuenta que sólo los CI que co-expresan ambos plásmidos (flechas blancas en A-D) también son cFos+ en comparación con cIs que expresan sólo el plásmido control-GFP (flechas amarillas en A-D). (E) Cuantificación de cFos+RFP+ células encontradas en el palio de ratones P17 trasplantados a P1 (normalizados al total de RFP+ población) y tratados con vehículo o CNO (N.o 2). A-D: misma foto, diferentes canales o combinación de los tres canales diferentes. Barras de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: El aumento autónomo celular de la actividad de los CI mejora la supervivencia . (A-D) Imágenes confocales representativas de rodajas coronales de corteza somatosensorial de ratones P17 trasplantados en P0-P2 con precursores de CI transpirados con plCAGGs-IRES-GFP (GFP) y pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP (RFP) plásmidos y tratados con plásmidos de vehículo (A-B)o CNO (C-D). (E) Cuantificación de RFP+ células encontradas en el anteceo de ratones P17 trasplantados a P0-P2 (normalizado al total de GFP+ población). RFP+(vehículo) - 47% a 3%, CNO a 61% a 3%, p a 0,01, Prueba t de muestra emparejada del estudiante, n a 3 vehículos y 3 CNO, un mínimo de 150 células contadas por cerebro. A y B: misma foto, diferentes canales. C y D: misma foto, diferentes canales. Barras de escala a 50 m. Esta cifra ha sido modificada de Denaxa et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Información adicional relativa a los medios utilizados en este protocolo.
Discussion
Aquí describimos una metodología ampliamente accesible para modificar genéticamente la actividad de los precursores de CI para estudiar el impacto de la actividad intrínseca en la maduración de la CI, y/o el efecto de la actividad modulada CI en el montaje/función del cortical integrado Circuitos.
En el pasado, varios laboratorios, incluyendo el nuestro, habían realizado en experimentos de electroporación utero con el fin de modificar genéticamente las neuronas de proyección6. Sin embargo, en el útero la electroporación en eminencias gangliónicas que incluyen progenitores de CI es muy difícil, debido a problemas de trayectoria de conducción eléctrica. Con el fin de resolver este problema, un pequeño número de laboratorios están realizando inyecciones guiadas por ultrasonido seguido de electroporación, que es una técnica exigente que requiere equipos caros. Este protocolo ofrece una alternativa a estas metodologías que es accesible a la mayoría de la comunidad científica.
Uno de los aspectos más desafiantes de este protocolo es maximizar el número de células que sobreviven en la corteza host a etapas maduras, cuando normalmente se realiza el análisis fenotípico (muy dependiente del diseño del experimento, pero normalmente más antiguo que P17). Hay tres pasos clave que el investigador debe prestar atención: (1) La eficiencia de la electroporación. Esto se puede maximizar asegurando la pureza de los plásmidos de ADN. Sólo se deben utilizar plásmidos de ADN de alta calidad (una relación A260/A280 de 1,9-2,0) para este procedimiento. Obtenemos tales preparaciones de ADN de alta calidad mediante el empleo de purificación de ADN de cloruro de cesio. Otro factor crucial es el promotor que impulsa la expresión del gen de interés. Encontramos que el vector pCAGGs, que consiste en el promotor de la b-actina de pollo, es extremadamente potente y puede aumentar dramáticamente la eficiencia de la electroporación. (2) El número de embriones de donantes iniciales. Es importante asegurarse de que un gran número (12-16) de embriones de la misma etapa estén electroportados. Este número puede aumentarse, si más experimentadores están realizando disecciones embrionarias y seccionándose juntos, ya que es importante que se obtengan rebanadas corticales embrionarias, electroporadas y transferidas a la incubadora tan pronto como sea posible. (3) Es importante asegurarse de que se inyecta un gran número de células en cada cachorro para asegurar una alta probabilidad de supervivencia celular trasplantada hasta etapas maduras. Además, esto mejorará dramáticamente la probabilidad de trasplantes exitosos ya que las preparaciones celulares de baja densidad darán lugar a una mezcla desigual de las células con el medio, lo que producirá una variabilidad significativa en los cerebros trasplantados15 .
El protocolo descrito aquí se adaptó para investigar el papel de la actividad en la regulación de la supervivencia de CI de manera autónoma de células. El plazo P14-P17 para realizar las inyecciones de CNO se eligió específicamente según los datos publicados, que muestran que el pico de la muerte celular de los progenitores de CI trasplantados se produce durante este período16. Por lo tanto, este marco de tiempo o la frecuencia de las inyecciones de CNO podría no ser válido para otros tipos de células o regiones cerebrales, y el investigador debe ajustar estos parámetros de acuerdo con los propósitos experimentales específicos. Por último, la metodología descrita aquí para las inyecciones intracraneales de CI sólo es factible para los cachorros P0-P5 (dependiendo también del fondo de la línea del ratón). En principio, cualquier inyección sobre P5 requerirá adelgazamiento o eliminación del cráneo15.
Una de las principales ventajas de este protocolo es la capacidad de utilizar nuevas herramientas codificadas genéticamente para visualizar o manipular la actividad de los C Durante las diferentes etapas de diferenciación a medida que se integran en una red en desarrollo. Con el ritmo de descubrimiento de nuevos sensores de voltaje y calcio codificados genéticamente, así como nuevas herramientas quimiogenéticas y optogenéticas, este protocolo permite a los investigadores utilizarlos en semanas de su liberación en repositorios plásmidos, como Addgene.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una beca ERC Starter Grant (282047), un Wellcome Trust Investigator Award (095589/Z/11/Z), una subvención FP7 EC DESIRE y un Lister Institute Prize a JB. El trabajo en el laboratorio de V.P. cuenta con el apoyo del BBSRC (BB/L022974/1), el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido (MRC) y el Instituto Francis Crick (que recibe fondos del MRC, Cancer Research UK y Wellcome Trust). La investigación en el laboratorio de M.D. fue posible gracias a la subvención de la Fundación Stavros Niarchos a la B.S.R.C. "Alexander Fleming", como parte de la iniciativa de la Fundación para apoyar la investigación griega.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium/Supplements | |||
| B-27 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 175040-044 | |
| DMEM/F12 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21331-020 | |
| DNAse | SIGMA | DN15-100MG | |
| FBS | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 10270-098 | |
| 100x Glutamine | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 35050-061 | |
| L15 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 11415-049 | |
| MEM alpha, GlutaMAX | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 32561-029 | |
| Neurobasal medium | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21103-049 | Neuron basic medium |
| 100x P/S | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | |
| Equipment | |||
| Electroporator | BTX | ECM 830 generator | |
| Injector for acute slice electroporation | Eppendorf | FemtoJet Microinjector | |
| Injector for cell transplantation (I) | Visual Sonics | Vevo Injector System | |
| Injector for cell transplantation (II) | WPI | NANOLITER2010 | |
| Magnetic Stand | WPI | M10L Magnetic Stand | |
| Kite Manual Micromanipulator | WPI | KITE-M3-R | |
| Platinum Elecrode (I) | Protech International Inc. | CUY-700-1 | |
| Platinum Elecrode (II) | Protech International Inc. | CUY-700-2 | |
| Steel Base Plate | WPI | 5479 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Other Material | |||
| Glass capillaries for electroporation | VWR | 1B100-4 | |
| Glass capillaries for cell transplantation | Visual Sonics | provided by Visual Sonics | |
| Nuclepore 8 µm whatman membrane | SLS | 110414 | |
| Organ tissue culture dishes | BD Biosciences (Falcon) | 353037 |
References
- Marin, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Review Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
- Glausier, J. R., Lewis, D. A. GABA and schizophrenia: Where we stand and where we need to go. Schizophrenia Research. 181, 2-3 (2017).
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual Review Neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Wamsley, B., Fishell, G. Genetic and activity-dependent mechanisms underlying interneuron diversity. Nature Review Neuroscience. 18 (5), 299-309 (2017).
- Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. Journal of Neuroscience. 24 (11), 2612-2622 (2004).
- Denaxa, M., et al. Maturation-promoting activity of SATB1 in MGE-derived cortical interneurons. Cell Reports. 2 (5), 1351-1362 (2012).
- Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. Nature Neuroscience. 2 (5), 461-466 (1999).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. Journal of Neuroscience. 26 (28), 7380-7389 (2006).
- Baraban, S. C., et al. Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice. Proccedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15472-15477 (2009).
- Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344 (6180), 1240622 (2014).
- Vogt, D., et al. Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies. Journal of Visualized Experiments. (98), e52740 (2015).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).
- Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs): chemogenetic tools with therapeutic utility. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 399-417 (2015).
- Denaxa, M., et al. Modulation of Apoptosis Controls Inhibitory Interneuron Number in the Cortex. Cell Reports. 22 (7), 1710-1721 (2018).
- Quatrocolo, G., et al. Homochronic Transplatation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains. Journal of Visualized Experiments. (136), e57723 (2018).
- Southwell, D. G., et al. Intrinsically determined cell death of developning cortical interneurons. Nature. 491 (7422), 103-113 (2012).
