Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Høy-gjennomstrømning DNA plasmider multipleksing og Transfeksjoner bruke akustisk Nanodispensing teknologi

Published: August 8, 2019 doi: 10.3791/59570
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Institut Pasteur de Lille, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) U1177, Drugs and Molecules for Living Systems, Université de Lille, 2L'atelier du Développeur, Marquette lez Lille

Summary

Denne protokollen beskriver høy gjennomstrømming plasmider transfeksjoner av pattedyrceller i en 384-brønn plate ved hjelp av akustisk dråpe utstøting teknologi. Den tidkrevende, feilutsatte DNA-uttaket og-multipleksing, men også den transfeksjoner reagens uttaket, er programvare drevne og utføres av en nanodispenser enhet. Cellene blir deretter sådd i disse forhåndsutfylte brønnene.

Abstract

Cell transfeksjoner, uunnværlig for mange biologiske studier, krever kontrollerende mange parametre for en nøyaktig og vellykket prestasjon. Oftest utføres ved lav gjennomstrømning, er det dessuten tidkrevende og feil utsatt, enda mer når multipleksing flere plasmider. Vi utviklet en enkel, rask og nøyaktig metode for å utføre celle transfeksjoner i en 384 brønn plate layout ved hjelp av ADE-teknologi (akustisk dråpe utstøting). Den nanodispenser enheten som brukes i denne studien er basert på denne teknologien og gir presis nanovolume levering i høy hastighet fra en kilde brønn plate til en destinasjon en. Det kan dispensere og multiplex DNA og transfeksjoner reagens i henhold til et forhåndsutformet regneark. Her presenterer vi en optimal protokoll for å utføre ADE-baserte høykapasitets plasmider transfeksjoner som gjør det mulig å oppnå en effektivitet på opptil 90% og en nesten 100% cotransfection i cotransfection eksperimenter. Vi utvider innledende arbeid ved å foreslå en brukervennlig, regneark BAS ert makro som kan håndtere opptil fire plasmider/brønner fra et bibliotek som inneholder opptil 1 536 forskjellige plasmider, og et nettbrettbasert pipettering førings program. Makroen utformer de nødvendige malene for kildeplaten (e) og genererer filer som er klare til bruk for nanodispenser og nettbrettbasert program. De fire-trinn transfeksjoner protokollen innebærer i) en fortynningsvæske dispensere med en klassisk flytende handler, II) plasmider distribusjon og multipleksing, III) en transfeksjoner reagens dispensere av nanodispenser, og IV) celle plating på ferdigfylt brønner. Den beskrevne programvarebasert kontroll av ADE-plasmider multipleksing og transfeksjoner gjør at selv nonspecialists i felten kan utføre en pålitelig celle transfeksjoner på en rask og sikker måte. Denne metoden muliggjør rask identifisering av optimale innstillinger for en gitt celle type og kan forandres til høyere skala og manuelle tilnærminger. Protokollen Letter søknadene, som Human ORFeome protein (sette av åpen lesing rammens [ORFs] inne en Genova) gjengivelsen eller CRISPR-Cas9-basert gen funksjonen godkjenningen, inne nonpooled screening strategisk.

Introduction

Metoden som presenteres her beskriver i detalj hvordan man utfører DNA plasmider multipleksing og transfeksjoner i pattedyrceller ved høy gjennomstrømning ved hjelp av en akustisk-basert væske nanodispenser i en 384-brønn plate, selv for nonspecialists i feltet. Denne nylig publiserte metoden1 gjør det mulig å utføre så mye som 384 uavhengige plasmider DNA-multipleksing og transfeksjoner forhold i ett eksperiment, på mindre enn 1 time. enkle eller cotransfection eksperimenter var vellykkede, og nådde en nær 100% cotransfection innenfor transfekterte celler befolkningen. Denne protokollen gjør transfeksjoner enklere fordi de fleste av de kjedelige, tidkrevende og feilutsatte trinnene nå er programvare drevne (se figur 1 for en generell oversikt). Det er gjort ytterligere anstrengelser for å utvikle dedikerte verktøy for å forbedre brukervennligheten og samtidig unngå menneskelige feil under den generelle prosessen og for å fremme vellykket transfeksjoner selv for nonspecialists i felten. Den beskrevne protokollen inkluderer en "brukervennlig" makro regneark som vi utviklet for å administrere 384 uavhengige transfeksjoner forhold med multipleksing muligheter på opptil fire plasmider i hver brønn. Makroen automatisk utvikler mal av kilden tallerken () å belaste det ventet DNA plasmider kvantum fra igangsetting lager løsninger og filene krevde å kjøre det nanodispenser programvare på eksperimentelle tegning det er blitt angitt. Siden den manuelle uttaket av DNA i en 384 kilde plate er kjedelig og utsatt for feil, har vi også utviklet en dedikert nettbrettbasert applikasjon som veileder brukeren under uttaket av DNA-løsningen i henhold til malen.

Figure 1
Figur 1: eksperimentell arbeidsflyt. Skjematisk representasjon av den optimale automatiserte høy gjennomstrømming Reverse transfeksjoner protokoll (fra eksperimentell design til tilpassede biologiske analysen). Manuelle trinn indikeres av hånd symbolet, og omtrentlig tid for hvert trinn er skrevet i en rød boks. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Mange celle-baserte eksperimenter starter med plasmider DNA transfeksjoner, og selv om mange dedikerte reagenser har vært og fortsatt er under utvikling for å forbedre transfeksjoner effektivitet og/eller lette prosedyren, gjenstår mye å gjøre2,3 , 4. DNA plasmider celle transfeksjoner innebærer flere trinn for å nå høy effektivitet, for eksempel en innledende komplekse opptak, endosomal rømme, og cytoplasmatiske transport til nucleus5,6. I tillegg til kalsium nedbør eller fysiske teknikker som electroporation eller microinjection bruker dedikerte enheter7, moderne kjemiske metoder har fokusert på å forbedre DNA celle levering mens senke celle cytoxicity8, 9i. Bruken av lipider eller kationiske polymerer som danner liposome komplekser og, mer nylig, har nonliposomal polymer kjemi systemer gjort transfeksjoner enklere og mer effektiv10. Til tross for denne utviklingen, krever celle transfeksjoner fortsatt spesifikke ferdigheter for å være nøyaktig utført som de fleste av disse fysiske eller kjemiske transfeksjoner protokoller krever forskere å manuelt forberede hver DNA transfeksjoner reaksjons tilstand, og dermed svekke gjennomstrømming. For å omgå dette problemet har omvendt transfeksjoner protokoller blitt utviklet ved hjelp av kjemiske transfeksjoner reagenser11,12,13, slik at brukeren kan teste eller kombinere flere plasmider på en raskere måte. I disse protokollene dannes nukleinsyre syre komplekser med transfeksjoner reagenser før seeding cellene i komplekser. Imidlertid er disse omvendte protokoller fortsatt begrenset av manuell håndtering av DNA-løsninger og ved kombinasjonen av hver av de selvstendige forhold. Selv om det er mulig å utføre dem i en 96-brønn plateformat, vil DNA-preparatet og utleverer være kjedelige, og det vil trolig være feil. Når ulike mengder av flere DNA plasmider er nødvendig og multiplekset med hverandre, celle transfeksjoner blir enda vanskeligere å oppnå og mer tidkrevende, og menneskelige feil blir ganske uunngåelig. Skalering opp til 384-brønn plateformat i en omvendt transfeksjoner tilnærming, til tross for få multiplekset DNA transfeksjoner forhold, blir en umulig utfordring på grunn av følgende årsaker. i) volumene av DNA-mengder, transfeksjoner reagens eller reaksjons blanding er lavere enn 1 μL for hver brønn. II) multipleksing av plasmider for 384 selvstendige forhold blir ekstremt komplisert. Leveransen i hver av 384 brønner er også III) svært tidkrevende og IV) utsatt for feil. Faktisk, utlevering den riktige løsningen i de forventede brønnene er vanskelig å håndtere fordi de lave volumene som allerede er utlevert ikke tillater visuell overvåkning mellom de tomme og allerede fylte brønner. v) til slutt, det er en høy risiko for tørking av blandingen ved fordampning før cellene tilsettes på grunn av den tiden som trengs for å utføre de nødvendige dispenser trinnene. Oppsummert, den begrensende faktoren for å sette opp høy gjennomstrømming DNA plasmider transfeksjoner analyser synes å være miniatyrisering av analysen, som innebærer lavt volum multipleksing og styring som ikke kan håndteres manuelt lenger, men er også neppe oppnåelig i en pålitelig måte av klassisk peristatic flytende handlers.

Som et bevis på problemer med å automatize slike analyser og få høy gjennomstrømming, bare noen forsøk på å automatisere transfeksjoner har blitt publisert så langt: en 96-brønn plateformat ved hjelp av en kommersiell væske håndteringsenhet og kalsium fosfat nedbør14 og, mer nylig, en lipoplex reagens, og en mikrovæskebasert chip muliggjør 280 uavhengige transfections15 men krever spesialiserte ferdigheter på dette feltet. En annen metode, acoustophoresis, slik at flytende Levitation og fører til væske manipulasjon og miksing, ble brukt til å utføre DNA transfeksjoner i 24-til 96-brønn plateformater16. Til tross for gjennomførbart, denne adgang lide fra en ytterst lav produksjon idet det blander av celler med DNA transfeksjoner blanding behøver en 60 s inkubasjons for enhver enkelt punkt tidligere seeding. Dette innebærer en varighet på minst 96 min for en komplett 96-brønn plate. Videre er denne protokollen langt unna å være mottagelig for den samlede biologer ' publikum som dette arbeidet ble gjort med en in-House designet og produsert enhet som for øyeblikket ikke er tilgjengelig på markedet. Tvert imot, i de siste årene, en lett å bruke programvare drevet akustisk-basert dispenser teknologi har dukket opp med nanovolume dispenser enheter. Ved hjelp av fokusert akustisk energi, disse enhetene lar tett kontrollert utstøting av små flytende volumer fra 2,5 nL til 500 nL fra en kilde plate til en destinasjon en17. Denne teknologien, kalt akustisk dråpe utstøting (ADE), har mange fordeler: den er helautomatisk, kontaktløse, tipless, nøyaktig, presis og svært reproduserbar, og den har en høy gjennomstrømming på18. Først viet til å levere dimethyl sulfoxide (DMSO) løsninger, har innstillingene blitt forbedret for å dispensere vandige buffere19. Akustisk nanodispensers, så synes egnet for omvendt celle transfeksjoner protokoller og kunne omgå de fleste av de nevnte manuelle begrensninger. Siden ingen plasmider transfeksjoner forsøk tidligere ble beskrevet ved hjelp av denne teknologien, har vi nylig evaluert egnetheten av et akustisk BAS ert doseringssystem for å utføre omvendt celle transfeksjoner.

Dra nytte av nanodispenser gjennomstrømning og brukervennlighet, optimalisert vi en omvendt transfeksjoner protokoll for HeLa celler ved kryss-testing flere parametre som kan påvirke DNA transfeksjoner på en 384-brønn, enkelt plate, nemlig den totale DNA-beløpet og av kilde DNA, start konsentrasjon, fortynnings volum, transfeksjoner reagens og antall sprednings celler. Den utviklede protokollen omgår de ovennevnte manuelle begrensningene av celle transfeksjoner og presenterer flere fordeler fremfor andre automatiserte transfeksjoner forsøk. Først er det miniatyriserte, og dermed gir for kostnadseffektiv transfeksjoner reagens ved å spare DNA plasmider preparater og transfeksjoner reagens. Dernest er det mye mer høy gjennomstrømming og reproduserbar enn den manuelle protokollen (selv for nybegynnere), som transfeksjoner av en hel 384-brønn plate kan oppnås på mindre enn 1 t. Til slutt er det programvare drevet, slik at kontroll av det utlevert DNA-beløpet og multipleksing av flere plasmider. Takket være den nanodispenser programvaren (tabell over materialer), kan brukeren faktisk utarbeide en studieplan for å kontrollere volumene som skal føres ut fra en definert kilde brønn plate til en destinasjon.

Protokollen som presenteres her er i hovedsak ment for de som har tilgang til en nanodispenser og ønsker å sette opp transfeksjoner eksperimenter med høy gjennomstrømming, men også for de som ønsker å raskt optimalisere sine transfeksjoner parametere for en gitt celle type ved bruke denne protokollen til å kryss-teste flere parametere med høy gjennomstrømming. Vi har faktisk vist at optimaliserte parametre identifisert med denne nanoskala protokollen kan forandres til større skala og manuelle transfeksjoner eksperimenter. Til slutt, som transfeksjoner reagens som brukes i den foreliggende protokollen tillater DNA eller siRNA transfeksjoner i henhold til produsenten, er protokollen også av interesse for de som sikter på å utføre array tilnærminger for gen overuttrykte eller knockdown. Destinasjons platene forhåndsutfylt med DNA kan bevares inntil 7 dager før bruk i en transfeksjoner analyse uten tap av effekt, noe som er en annen fordel med følgende protokoll for denne typen program.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Advance forberedelser

  1. Utarbeidelse av peristaltisk flytende handler programmer
    Merk: for fortynnings-og celle doserings trinnene i protokollen, må et dedikert program være forberedt, og ta hensyn til høyden på uttaket til platen som brukes og skritt intensjonen.
    1. For 1 μL fortynningsvæske trinn monterer du en 1 μL kassett og klargjør et program med innstillingene som beskrevet i trinn 1.1.1.1 og 1.1.1.2.
      1. Juster flow rate parameteren til høy for best gjennomstrømming ettersom det ikke forventes noe biologisk materialskade i dette trinnet. Juster dispenser høyden til 9,6 mm (i henhold til cellekultur platen som brukes, supplerende figur 1) for å la 1 μL slippe å berøre bunnen av brønnene i løpet av evangelieutdelingen.
        Merk: dette trinnet er avgjørende for å unngå oppbevaring av dråpene på doserings hodet til det er tilstrekkelig volum til å falle.
      2. Juster plate klar høyde til 14,4 mm for å tillate fri forskyvning av uttaket over platen etter at hver rad er tatt ut. Kontroller de riktige innstillingene for den peristaltisk for væske hånd hodet: Pass på at ingen dråper blir beholdt på doserings tuppene mens du dispenser og kontroller at hodet er høyt nok til å tillate forskyvning av hodet etter uttak av hver rad.
        Merk: unngå drop oppbevaring er en viktig parameter som det vil svekke nøyaktigheten av volumet av evangelieutdelingen.
    2. For uttak av 40 μL celle fjæring, Monter en 10 μL kassett og klargjør et program med innstillingene som beskrevet i trinn 1.1.2.1-1.1.2.2.
      1. Juster parameteren for strømningshastighet til lav for å dispensere celler med lav hastighet for å unngå å fremme potensielle skader på cellene ved å skjær stress og høy effekt på bunnen av brønnene. Juster evangelieutdelingen høyden til 11,43 mm (i henhold til cellekultur platen som brukes, supplerende figur 1), høy nok til å senke celle påvirkningen på undersiden av brønnene under uttaket, men lavt nok til å unngå oppbevaring av dråpene på for uttaket. Juster platen klar høyde til 16 mm for å tillate fri forskyvning av doserings hodet over platen etter at hver rad er fordelt.
      2. Kontroller de riktige innstillingene for den peristaltisk for væske hånd hodet: Pass på at ingen dråper blir beholdt på doserings tuppene mens du dispenser og kontroller at hodet er høyt nok til å tillate forskyvning av hodet etter uttak av hver rad.
        Merk: å unngå drop oppbevaring er en viktig parameter som det vil føre til utlevering et upålitelig celle nummer.
  2. Forberedelse av DNA-plasmider (klassisk miniprep utvinnings protokoll)
    1. Grow en transformert DH5α bakterier stamme i LB medium supplert med 125 μg/mL Ampicillin utvalg antibiotika (tabell av materialer) over natten ved 37 ° c og under skånsom omrøring (200 RPM) på en orbital shaker (tabell av materialer).
    2. Harvest 2 mL av kulturen, pellet cellene ved sentrifugering i 5 min ved 6 000 x g, og kast supernatanten.
    3. Resuspend celle pellet med 250 μL av blanding buffer som inneholder RNase A (tabell av materialer). Tilsett 250 μL av lyseringsbuffer og ruge i 5 minutter ved romtemperatur, i henhold til produsentens anvisninger.
    4. Stopp lyse Rings reaksjonen ved å tilsette 300 μL av nøytralisering buffer (tabell av materialer) og vortexting kort tid. Sentrifuger rørene i 5 min ved 11 000 x g.
    5. Plasser en ny plasmider minicolumn (tabell av materialer) i en 2 ml samling rør og Dekanter supernatanten i kolonnen ved sentrifugering i 1 min ved 11 000 x g.
    6. Kast gjennomstrømning og plasser minicolumn tilbake i oppsamlings røret.
    7. Vask plasmider minicolumn med 500 μL av valgfri vaskebuffer (tabell av materialer) og sentrifuger i 1 min ved 11 000 x g, i henhold til produsentens anvisninger.
    8. Kast gjennomstrømning og plasser plasmider minicolumn tilbake i oppsamlings røret.
    9. Tilsett 700 μL vaskebuffer (tabell over materialer) supplert med etanol og sentrifuger i 1 min ved 11 000 x g, ifølge produsentens anvisninger.
    10. Kast gjennomstrømning og sentrifuger den plasmider minicolumn og samlerøret 1x mer for 2 min ved 11 000 x g til tørk silica membranen.
    11. Plasser de tørkede plasmider minicolumn i et nytt 1,5 mL rør og tilsett 30 μL destillert vann prewarmed ved 60 ° c, ruge den i 2 minutter ved romtemperatur, og sentrifuger den i 1 min ved 11 000 x g.
    12. Kast den plasmider minicolumn og behold eluatet som inneholder renset DNA-plasmider.
    13. Mål DNA konsentrasjonen av eluert DNA ved hjelp av en microvolume spektrofotometer (tabell over materialer).
      1. Slå på spektrofotometer og velg innstillingene for DNA-måling .
      2. Hev prøve armen på spektrofotometer og Pipetter 1 μL av vann på måle sokkelen for å utføre en blank kalibrering.
      3. Senk prøve armen, Start den tomme målingen og vent til den er ferdig.
      4. Hev prøve armen og tørk prøven fra den øvre og nedre sokler.
      5. Pipetter 1 μL av DNA-oppløsningen på den nedre sokkelen for å måle den.
      6. Senk prøve armen, start målingen av DNA-konsentrasjonen og vent til den er ferdig.
      7. Hev prøve armen og tørk prøven fra den øvre og nedre sokler.
      8. For ytterligere målinger av DNA-konsentrasjonen, Gjenta trinn 1.2.13.5-1.2.13.7.
    14. Når målingene er ferdige, Oppbevar DNA-løsningene ved 4 ° c til bruk.

2. eksperimentell design og generering av valglister for å drive ADE-baserte utleverer

Merk: en dedikert "brukervennlig" regneark makro ble utviklet for å håndtere DNA-mengder og bland opptil fire plasmider i et 384-brønn plateformat. Basert på den angitte eksperimentelle designen, genererer denne makroen de nødvendige filene for å drive ADE-baserte DNA transfeksjoner-protokollen ved nanodispenser. For å generere disse filene, flere felt må fylles i malen Sheet som vist i figur 2.

Figure 2
Figur 2 : Generering av valglister for å kjøre ADE-evangelieutdelingen ved hjelp av regneark makroen. Flere parametre må fylles, nemlig (1) TRANSFEKSJONER reagens (TR) og minimalt/maksimalt volum som skal brukes i kildeplaten, (2) de første plasmider konsentrasjonene som skal føres ut i kildeplaten, og (3) hel plate design, inkludert de forventede plasmider beløpene og multipleksing i hver av 384-brønnene. (4) Generer valglister aktivering lar de ulike feltene som skal verifiseres og, når de er riktig fylt, VALGLISTER for DNA og TR dispensasjon og den nødvendige kilde plate malen blir automatisk generert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Angi nanodispenser protokoll parametere i de rosa feltene. Still inn transfeksjoner reagens (TR)-blandings verdien til 500 nL. Still inn den minimale volum verdien i kilde plate brønnene til 4 μL. Still inn maksimalt volum i kilde plate brønnene til 11,25 μL.
    Merk: nanodispenser som brukes her, kan bare overføre maksimalt 500 nL i én kjøring av ADE. Disse rosa feltene er forhåndsutfylt med de anbefalte verdiene, men kan endres i henhold til brukerens behov.
  2. Angi 100-konsentrasjoner ng/μL DNA i de blå feltene som tilsvarer det underliggende DNA.
    Merk: denne verdien er den optimale konsentrasjonen som tidligere er definert, men kan imidlertid endres for ulike brukerbehov.
  3. Angi ønsket DNA-beløp i de grå/grønne feltene. Angi beløpene og plasmider navnene for 384 brønner, noe som sikrer samme stavemåte Hvis samme plasmider brukes i flere brønner.
  4. Generer kilde plate utformingen, de valglister filene og pipettering. Klikk på Generer valglister for å tillate at makroen genererer DNA-Picklist. csv,-Picklist. csv og de 384-Wells-pipetting-guide. CSV-filene fra data som samles inn i det tilsvarende arket. Hvis du blir bedt om det, retter du opp de oransje fylte celleverdiene slik at de angir feil eller volumer som ikke kan håndteres av nanodispenser.
  5. Skriv ut malen (e) fra kilde plate arket. Plasmider navn og minimalt volum for å fylle inn brønnene er indikert. På samme måte må transfeksjoner volumer som skal fylles ut i følgende brønner, indikeres som TR og uthevet i grønt.

3. DNA kilde plate forberedelse ved hjelp av 384-brønn pipettering guide program

  1. Fortynne de lagrede DNA-plasmider fra trinn 1.2.14 til 100 ng/μL med destillert vann.
  2. Kalibrer 384-brønn rutenettet til platen dimensjoner: åpne 384-brønn pipettering guide program på en tablett (Figur 3). Plasser kildeplaten på rutenettet på den nedre skjermen, og i den øvre venstre kalibrerings menyen, klikk + eller - (eller bruk den røde markøren) for å forbedre eller redusere størrelsen på rutenettet og brønner for å justere de grønne brønnene til de fire hjørne brønnene på platen .

Figure 3
Figur 3 : Bruk av 384-brønnen pipettering guide programmet. (1) kalibrering av 384-brønn rutenettet til plate størrelse; (2)) montering av en universell 3D-trykt plate adapter til tabletten ved hjelp av dobbeltsidig tape; (3) plassering av platen på adapteren; (4) forskyvning av nettet for å sentrere den til montert plate. (5) Lås av kalibrerings trinnet. (6) åpning av 384 brønner pipettering guide. CSV fil. (7) gitt fillisten, vil programmet indikere forventet kilde platenavn, REAGENS (DNA eller transfeksjoner reagens), konsentrasjonen, og volumet til å dispensere inn i målet brønner, som vil bli opplyst en etter en. (8) venstre og høyre piltaster lar brukeren følge pipettering guide for enkelt å dispensere reagensene i henhold til regnearket makro kilde plate mal (er). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Monter den 3D-trykte plate adapteren på skjermen for å unngå kilde plate bevegelser under uttaket, ved hjelp av dobbeltsidig tape. Hvis nødvendig, Flytt kalibrert rutenettet ved hjelp av rotasjons pilene og opp/ned/høyre/venstre- knappene for å justere rutenettet på skjermen til plate posisjon. En gang det gitter og frisk størrelsene er riktig kalibrering og lokalisert, sjekke av låsen kalibrering bokse med.
  2. Klikk på fil og åpne 384 brønner pipettering guide. csv fil. Følg instruksjonene på skjermen for å manuelt dispensere det indikerte volumet av den indikerte plasmider ved den angitte konsentrasjonen i den hvite uthevede brønnen som tilsvarer riktig mål destinasjon for den forventede platen. Bruk - eller + pilene for å gå tilbake eller videre i prosessen med DNA-uttak. Stopp uttaket når den første transfeksjoner reagens løsningen blir lastet inn.
  3. Når DNA-evangelieutdelinger er ferdig, fjerner du kildeplaten fra adapteren. Hvis det skal fylles flere kilde plater, må du plassere en ny kilde plate på adapteren og følge instruksjonene for uttaket. Når DNA-dispensasjon er ferdig, sentrifuger den DNA-fylte kildeplaten (e) (ved 1 500 x g for 2 min) for å sikre riktig væske utjevning og for å fjerne bobler som fører til unøyaktigheter i ADE-baserte overføringer.

4. peristaltisk flytende behandlingsprogram-basert 1 μL fortynnings dispensasjon i mål platen

Merk: Utfør trinn 4.1-4.5 i et biologisk sikkerhetskabinett.

  1. Desinfisere 1 μL kassett hode ved å spraye den med et sprøyte desinfeksjonsmiddel (tabell med materialer), og la denne løsningen komme inn i spiss holde ren. Absorber rest desinfeksjonsmiddel på absorberende papir. Monter 1 μL-kassetten på den peristaltisk væske behandlingsenheten. Slå på enheten og kontroller at kassett type innstillingen er riktig (1 μL), i tillegg til plateformatet (384 brønner).
  2. Desinfisere hele lumen av slangen: sett røret arrangøren (holder de åtte rørene sammen) i et sterilt fartøy og fyll den med 5 mL 70% alkohol. Ved hjelp av priming funksjon av peristaltisk væske handler, skyll først alkohol i slangen og skyll den ved å passere 5 mL destillert vann og 5 mL serum fritt medium (Dulbecco ' s modifiserte Eagle medium [DMEM] supplert med 100 U/mL penicillin-Streptomycin; Tabell av materiale), suksessivt å fylle ut det samme fartøyet. Pass på at ingen av tuppen er tilstoppet av visuelt inspeksjon av væskestrømmen fra dem alle.
  3. Prime slangen med serum fritt medium ved å fylle et nytt sterilt fartøy med 10 mL prewarmed serum fritt medium og dykke rør arrangøren i den. Trykk på Prime-knappen på den peristaltisk væske behandleren i ca 10 s. Igjen, sørg for at ingen tips er tilstoppet av visuelt inspisere væsken strømme fra dem alle.
  4. Fyll platen med 1 μL fortynningsvæske. Plasser en steril 384-brønn kultur plate (destinasjon) på den peristaltisk væske behandlings platen og fjern lokket.
  5. Kjør prekalibrerte programmet for å dispensere 1 μL i hver brønn på 384-brønn platen. Doserings tiden er ca. 8 s. Deretter byttes lokket på 384-brønn plate.
    Merk: Alternativt kan dette trinnet håndteres manuelt, i et sikkerhetskabinett, ved hjelp av en flerkanals micropipette.

5. resultatene av en undersøkelse for å kontrollere de manuelt utlevert volumene

Merk: for detaljer, se Figur 4.

  1. Kjør nanodispenser programmet, gå til diagnostiske kategorien, kryss av kildeplaten ut Box, Legg kildeplaten på plate holderen, og kryss av i for å gå inn i platen. Når du blir bedt om det, velger du 384LDV_AQ_B2 for å angi nanodispenser til den vandige buffer dispenser modus, og trykker på OK.
  2. Velg undersøkelse i diverse -menyen og klikk på Start. Velg de forhåndsutfylte brønnene for å analysere og klikk på Go -knappen. Kontroller at de målte volumene samsvarer med de forventede og sikre at ingen brønner er lastet med volumer på mer enn 12 μL, da dette vil unngå overføringer.

Figure 4
Figur 4 : Definere parametere for evalueringsprogramvare. (1) Start nanodispenser-programmet. (2) åpne diagnostikk -fanen. (3) sett kildeplaten ved å krysse av for kildeplaten og deretter i. (4) Definer kilde platetypen i menyen når du blir bedt om det. (5) i boksen diverse velger du undersøkelse i rullegardinmenyen. (6) Start Survey programmet ved å klikke på Start. (7) Velg de ferdigfylt brønnene som skal måles. (8) Start analysen ved å klikke på gå. (9) når undersøkelsen er utført, er de målte volumene skrevet i de tilsvarende valgte brønnene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

6. ADE-drevet DNA-dispensasjon til mål platen

  1. Kjør plukkliste programvaren, angi 384 kilde-og mål platetyper til henholdsvis 384_LDV og greiner 384PS_781096 (figur 5). Sett enheten til vandig buffer dispenser modus ved å velge 384LDV_AQ_B2, og rotete "Optimaliser overføring gjennomstrømning".

Figure 5
Figur 5 : Ytelse av valg-baserte evangelieutdelinger. (1) Start nanodispenser programvare. I kategorien protokoll velger du (2) eksempel plateformatet, (3) mål platetypen og (4) unticks "Optimaliser overførings gjennomstrømming". (5) Velg Plukkliste fanen. (6) klikk på import og velg riktig *. CSV-fil (DNA-nedtrekksmenyen eller T.R.-nedtrekksmenyen). (7) når valgt, klikker du på import. (8) klikk på Play og lagre protokollen. (9) utføre en evangelieutdeling simulering ved å klikke på simulere, eller (10) starte programmert dispensasjon ved å klikke på Kjør. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Velge "hakke liste" tab, falle i staver opp på import, velge det DNA-Picklist. csv arkiv. Klikk på Play og lagre protokollen. Klikk på Simuler for å utføre en simulering av de programmerte evangelieutdelinger for å sikre at plukklisten samsvarer med den forventede eksperimentelle designen. En gang fullført, falle i staver opp på slutte.
  2. Klikk på Play, og deretter kjøre, for å starte dispenser programmet: Når du blir spurt, sett den FORESPURTE kildeplaten (DNA-løsninger manuelt fylt) og destinasjonen plate (fortynningsmiddel fylt) i nanodispenser.
    Merk: doserings tiden er ca. 5-20 min for en komplett 384-brønn, avhengig av de valgte volumene og det totale antallet evangelieutdelinger i den eksperimentelle designen.
  3. Alternativt, pause protokollen her som fortynnings-og DNA-fylte platene kan håndtere tørr eller frossen lagring i opptil 7 dager. For tørr oppbevaring, la platene tørke på benken ved romtemperatur og lagre dem på samme måte. Tin og sentrifuger (ved 1 500 x g i 2 min) frosne lagrede plater før bruk i et transfeksjoner trinn (avsnitt 7).
     

7. ADE-drevet transfeksjoner reagens dispensasjon

  1. I et biosafety kabinett, extemporaneously fortynne lipopolyplex transfeksjoner reagens i serum fritt medium til en 1x endelig konsentrasjon. Vortex og umiddelbart dispensere denne transfeksjoner reagens blandingen i henhold til den forhåndsdefinerte kildeplaten (e) designet av makroen og bruker prekalibrerte 384-brønn pipettering guide som beskrevet i trinn 3,4.
    Merk: ikke sentrifuger kildeplaten når den er lastet med reagens som ingen transfeksjoner er lagt merke til etter sentrifugering.
  2. Kjør nanodispenser programmet for å utføre en "undersøkelse" som beskrevet i avsnitt 5, for å kontrollere volumene av alle de manuelt fylte TR -brønnene på kildeplaten (e) for å unngå doserings feil på grunn av volumer som overstiger 12 μL.
  3. Klikk på Tilbakestill for å fjerne eksempel listen for DNA-nedtrekksmenyen i plukkliste programvaren, og kontroller at enhetsparametrene fortsatt er satt til vandige buffere og til kilde-og mål platetypene som brukes, som i trinn 6,1.
  4. Klikk på Importer , og velg TR-Picklist. CSV-filen. Klikk på Play og lagre protokollen hvis du blir bedt om det, og (dette er valgfritt, men anbefales på det sterkeste) utføre en simulering av de programmerte transfeksjoner reagens blanding evangelieutdelinger for å sikre riktig utforming av evangelieutdelinger ved å klikke på Simuler -knappen. En gang fullført, falle i staver opp på slutte.
  5. Klikk på Play, og deretter kjøre knappen for å starte dispenser programmet: som forespurt, plassere kildeplaten (s) (TR-blanding-fylt) og destinasjonen plate (fortynnings-og DNA-fylt) i nanodispenser.
    Merk: doserings tiden er mindre enn 20 min for en komplett 384-brønn ved uttak av 500 nL av TR-blandingen.
  6. Ruge 15-30 min ved romtemperatur etter tilsetning av TR til DNA som indikert av produsentens protokoll.

8. peristaltisk av flytende handler-basert celle dispensasjon

  1. Klargjør den peristaltisk væske behandleren for dispenser celler. Desinfisere et 10 μL kassett hode ved å spraye det med Aniospray Surf 29 desinfiserende og absorbere rest på papir. Monter kassetten på den peristaltisk væske behandlingsenheten, endre kassett type innstillingen til 10 μL, og kontroller at plateformatet er satt til 384 brønner.
  2. Desinfisere 10 μL kassett slange som beskrevet tidligere i trinn 4,2. Dykk røret arrangøren i et sterilt fartøy og skyll slangen med 5 mL 70% alkohol, deretter med 5 mL destillert vann, og til slutt, med 5 mL serum fritt medium, suksessivt fylt i samme fartøy og til hvert rør er tom.
  3. Klargjør celle suspensjonen for å dispensere. Fra en confluent HeLa celle B10-kultur parabol, vaske cellene 1x med 1x fosfat-bufret saltvann (PBS) løsning, og deretter distansere cellene med Trypsin/EDTA for 5 min ved 37 ° c.
  4. Kontroller cellen dissosiasjon under et mikroskop og stoppe Trypsin/EDTA handling ved å legge 10 mL av komplett medium (DMEM supplert med 10% fosterets storfe serum og 100 U/mL penicillin-Streptomycin; se tabell over materiale) i kultur parabolen. Høste celler i en 50 mL rør og telle cellene under mikroskopet, ved hjelp av en Malassez celle eller en automatisk celle teller.
  5. Forbered minst 25 mL av jakten celle suspensjon ved en konsentrasjon av 37 500 celler/mL i komplett medium (dvs. 1 500 celler/40 μL) for en komplett 384-brønn plate, for å sikre rør priming og 40 μL/brønn dispensasjon.
  6. For å kvitte seg med cellene, fyll et nytt sterilt fartøy med klargjort celle fjæring og rør den for å unngå sedimentering som fører til unøyaktigheter i celle tettheten til evangelieutdelingen. Sett inn røret arrangøren i denne løsningen og trykk på Prime -knappen til celle suspensjonen begynner å spyle fra uttaket hodet. Kontroller at ingen av spissen er tilstoppet av visuelt inspisere væskestrømmen fra dem alle, og sikre at hvert rør er lastet med celle fjæring.
  7. Legg i DNA og TR-fylt 384-brønn mål plate på peristaltisk væske handler plate bærer og ta av lokket. Kjør prekalibrerte program for å dispensere 40 μL av celle suspensjonen på den komplette 384-brønn plate (dvs. 1 500 celler/brønn). Doserings tiden er ca. 8 s. sett lokket på 384-brønn platen tilbake.
    Merk: 40 μL-celle oppheng kan eventuelt føres ut manuelt ved hjelp av en flerkanals micropipette.

9. tilpasset biologiske analysen (celle transfeksjoner effektivitet overvåking)

Merk: Følg de eksperimentelle innstillingene og hensikten med eksperimentet ved å bruke de nødvendige metodene for luminescence, fluorescens, screening med høyt innhold og omvendt transkripsjon kvantitativ polymerase kjedere reaksjon (RT-qPCR). I denne delen av protokollen evalueres celle transfeksjoner effektivitet av automatiserte fluorescens mikroskopi og bildeanalyse.

  1. Ruge platen ved 37 ° c med 5% CO2 i en vann-mettet atmosfære og til riktig protein uttrykk.
    Merk: Her er en 48 h inkubasjonstid brukes for HeLa celler for å overvåke transfeksjoner effektivitet, ved hjelp av tdTomato-og mVenus-uttrykker plasmider.
  2. Fjern kultur mediet 48 post-transfeksjoner ved å invertere platen, tilsett 30 μL/brønn på 10% formalin ved hjelp av peristaltisk væskebehandling (10 μL kassett), og ruge i 15 min ved romtemperatur.
  3. Fjern formalin ved å invertere platen; deretter ruge cellene i 15 min ved romtemperatur med 0,1 ng/mL Hoechst fortynnet i 1x PBS løsning.
  4. Vask cellene 3x i 15 minutter med 80 μL av 1x PBS justert til pH = 8 for å gjenopprette det høye fluorescens signalet tapt av 6,9 pH i formalin løsning inkubasjons trinn.
  5. Ved hjelp av en automatisert fluorescerende mikroskop, tilegne seg bilder av to eller tre fluorescerende kanaler (Hoechst, tdTomato, og mVenus) sekvensielt med 10x mål og et riktig utslipp filter sett (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI], dsRed, og fluorescein isothiocyanate [FITC], henholdsvis).
  6. For å evaluere transfeksjoner effektivitet, bruk bildeanalyse programvare for å bestemme transfeksjoner effektivitet ved hjelp av skript analyse basert på kjerner farging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

fIn for å avgjøre om ADE-teknologien kan brukes til en automatisert omvendt transfeksjoner-protokoll, overvåket vi celle transfeksjoner effektivitet ved fluorescens mikroskopi, ved hjelp av en rød fluorescerende tdTomato som uttrykker plasmider. Først sikter på å bestemme de beste transfeksjoner parametrene, ulike fortynnings volumer og totale mengder DNA var kryss-testet. Fortynnings volum ble brukt til å tillate DNA-dråpene, en gang utlevert, å spre over hele brønnene for å omgå inhomogen transfeksjoner observert i foreløpige eksperimenter (dvs. bare i sentrum av brønnene). Som vist i figur 6a, var Transfeksjoner av HeLa celler som bruker lipopolyplex reagens20 vellykket. Interessant, ved hjelp av en 1 μL fortynnings volum, DNA-beløpene varierer fra 5 til 30 ng viste samme effektivitet og opptil 90% celle transfeksjoner sammenlignet med høyere beløp, for eksempel 50 og 100 ng, som en brå nedgang ble observert. Vi prøvde forskjellige fortynnings volumer fra 15 nL til 4 μL og identifiserte 1 μL for å være den beste forutsetningen, som i betydelig grad var et eksempel på bruk av 30 ng med DNA.

Figure 6
Figur 6 : Representative resultater. (A) VIRKNINGEN av DNA-beløpet og fortynnings volum på transfeksjoner effektivitet. Jakten celler var omvendt transfekterte bruker nanodispenser enheten og lipopolyplex, ved hjelp av en 1x konsentrasjon som anbefalt av produsenten. Av anbefalt fortynningsmiddel (serum fritt medium), ble 15-4000 nL brukt med 10-100 ng mengder rød-fluorescerende-uttrykker plasmider (tdTomato). Transfeksjoner effektivitet ble fastslått 48 h post-transfeksjoner ved hjelp av bildebasert analyseprogramvare. Resultatene uttrykkes som en prosentandel av transfekterte celler for det økende DNA-beløpet, og fortynnings volumet viser optimale forhold: 30 ng av totalt DNA med et økende fortynnings volum og 1 μL fortynningsvæske med økende DNA-beløp. Feil stolpene representerer SEM med n ≥ 4. Toveis ANOVA og Bonferroni etter test ble brukt til statistisk analyse. *p < 0,05 sammenlignet med andre prikker. (B) stabiliteten av forberedt DNA platene. Fortynnings MIDlet (1 μL) ble utlevert ved bruk av peristaltisk væskebehandling, og 30 ng av DNA ble utlevert og umiddelbart transfekterte ved hjelp av lipopolyplex reagens som ble utlevert av ADE (kontroll) eller lagret ved romtemperatur en gang tørr eller frosset ved-20 ° c. Ved dag 0, 2, eller 7, ble tørt DNA rehydrert med 1 μL av fortynningsvæske som ble utlevert ved hjelp av peristaltisk flytende behandling, og frosne plater ble tint ved romtemperatur og sentrifugert (ved 1 500 x g i 2 min). Celler ble deretter sådd ved hjelp av peristaltisk flytende handler i henhold til den beskrevne protokollen. Feil stolpene representerer SEM med n ≥ 3. Toveis ANOVA og Bonferroni etter test ble brukt til statistisk analyse. NS = nonsignificantly annerledes. (C) plasmider DNA cotransfection effektivitet. Jakten celler ble transfekterte med 30 ng av mVenus-og tdTomato-uttrykker plasmider lastet i to separate kilde brønner (ved hjelp av en 1,7 ratio av mVenus over tdTomato for å nivå deres relative fluorescens output). Transfeksjoner effektivitet sammenlignet 48 transfeksjoner ved hjelp av bildebasert analyseprogramvare og ble uttrykt som en prosentandel av transfekterte celler og en prosentandel av cotransfected celler innenfor transfekterte befolkning. Prosentandelen av cotransfected celler ble bestemt ved å beregne den grønne-fluorescens-uttrykker celle nummer i den røde fluorescerende befolknings celler. Feil stolpene representerer SEM med n ≥ 3. Toveis ANOVA og Bonferroni etter test ble brukt til statistisk analyse. NS = nonsignificantly annerledes. (D) representative felt av fluorescens mikroskopi fra bildet oppkjøpet vist i panel C ved hjelp av tre fluorescerende kanaler (Hoechst, tdTomato, og mVenus) sekvensielt ervervet av en tenkelig plattform (tabell av materialer ), bruker 10x mål og et riktig utslipps filter sett (DAPI, dsRed, og FITC, henholdsvis). Dette tallet har blitt modifisert fra Colin et al.1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

For å ytterligere forbedre gjennomstrømningen av denne protokollen, vi neste undersøkt om en kilde plate lagring forhåndsutfylt med DNA og fortynningsmiddel løsninger kan lagres og brukes på et senere stadium. To måter å effektivt lagre DNA ble testet, nemlig tørr lagring av platen ved å la den tørke på benken eller frossen lagring (ved-20 ° c). Begge lagrings metodene førte ikke til signifikant forskjellige resultater enn nylig utlevert DNA-løsning lagret i opptil 7 dager (figur 6b), og begge metodene gjorde det mulig å utføre transfeksjoner fra lagrede DNA ferdigfylt plater, for eksempel en bank av Plasmider.

Til slutt, som plasmider transfeksjoner oftest skjer ved hjelp av minst to forskjellige plasmider, vi neste undersøkte DNA multipleksing evne til protokollen som presenteres her ved hjelp av de best identifiserte forhold (1 μL av fortynningsmiddel og 30 ng av DNA). Den tidligere brukte tdTomato rød-fluorescerende-protein-uttrykker plasmider ble modifisert til å uttrykke mVenus, en lys gul fluorescerende protein, og begge ble deretter brukt i cotransfection forsøk. Rød-eller grønn-fluorescerende-positiv celle analyse (figur 6C) viste transfeksjoner effektivitet å være ca 80%; men i den røde befolkningen, var nesten 100% av cellene også cotransfected med mVenus-uttrykker plasmider som kan sees i den representative programvarebasert bildeanalyse av figur 6D.

Supplerende figur 1: diag viser en passende dispenser høyde for fall til å berøre bunnen av brønnen for å unngå å beholde den på doserings spissen. På venstre side gjør de riktige innstillingene det mulig å spre seg på brønn overflaten for å unngå at den beholder sin oppbevaring på doserings tuppene. På høyre, dårlige innstillinger føre til dråpe oppbevaring som kan observeres under hodet bevegelse til neste rå. Vennligst klikk her for å laste ned denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Etablering og optimalisering av en nøyaktig høy gjennomstrømming transfeksjoner metode for en gitt cellelinje krever forskere til å følge noen viktige parametre som er beskrevet i denne delen. Vi oppfordrer sterkt starter med de anbefalte verdiene i hele protokollen som disse innstillingene optimalisert for jakten celler viste seg også å være effektiv for HEK celler. Men, som de beste parametrene kan avhenge av cellelinjer og transfeksjoner reagenser, kan optimale forhold defineres ved å variere celle nummer, fortynnings volum, totalt DNA-beløp, og transfeksjoner reagens natur, konsentrasjon, eller til og med volum brukt som var tilfelle under optimalisering av denne protokollen for HeLa celler1.

Den generelle protokollen som presenteres her er utviklet og ytterligere optimalisert for å tillate celle transfeksjoner selv av nybegynnere i feltet. For å nå dette målet, viktige verktøy for å gjengi protokollen så enkel som mulig og unngå menneskelige feil har blitt utviklet: en brukervennlig regneark makro for enkelt å designe eksperimentet og en tavle-programmet til å veilede brukeren til riktig fylle kilden platen (e).

Således, for å sikre påliteligheten av protokollen, bare noen få viktige skritt må kontrolleres: i) en skikkelig eksperimentell design; II) de riktige peristaltisk evangelieutdelinger fra den klassiske peristaltisk flytende handler; III) riktig DNA og transfeksjoner reagens akustisk-baserte evangelieutdelinger; IV) unngå sentrifugering av kildeplaten før transfeksjoner reagens evangelieutdeling som det syntes å svekke transfeksjoner. Etter disse få anbefalingene ville sikre effektiv transfeksjoner av cellene.

Riktig eksperimentell design

Den eksperimentelle oppsett har blitt gjort brukervennlig av utviklingen av makro regneark som bare må fylles med forventet DNA plasmider navn, ønsket beløp, og noen viktige parameterverdier. Når den er fylt, analyserer makroen først de angitte parameterne for å oppdage potensielle feil, for eksempel passende minimale og maksimalt antall volumer som er angitt for kilde brønnene og det transfeksjoner reagens evangelieutdelingen. I tillegg, basert på DNA-konsentrasjonene som er angitt i hver av de fire mulige radene og det plasmider antallet som er angitt i de underliggende feltene, kontrollerer makroen om det forventede volumet for å dispensere er multiplum av 2,5 nL (volumet av dråpene som nanodispenser). Når en sjekk for eventuelle feil er utført, beregner makroen den totale mengden av hvert DNA-eksempel som må føres ut, og deretter utformer kilde plate malen (ved å sortere DNA-navnene i alfabetisk rekkefølge). Volumene som er angitt i kildeplaten (e), tar hensyn til arbeids volumene som forventes i en kilde brønn (beregnet fra de minimale og maksimalt volum verdiene som er fylt ut i mal arket). Alle de forventede DNA-evangelieutdelinger i hver av brønnene er så skrevet på DNA-nedtrekksmenyen arket. Listen over DNA-transfekterte brønner brukes deretter til å skrive TR-nedtrekksmenyen ark ved hjelp av transfeksjoner reagens volumet som er angitt på mal arket. Volumene som beregnes på kilde plate arket blir deretter overført til 384-brønn pipettering førings ark. Data fra DNA-nedtrekksmenyen, TR-nedtrekksmenyen og 384-brønn-pipettering-guiden brukes deretter til å generere de tilsvarende filene i *. csv-formatet.

Korrekt DNA-og TR-dispensasjon på kildeplaten

Som dosering på en 384 brønn kilde plate, og mer spesifikt, finne målet brønnen kan fremme feil og er videre tidkrevende, har vi utviklet en dedikert Tablet-basert program som ligner på iPipet21. I motsetning iPipet, den som er beskrevet her kan brukes med Android (bare Android versjon 4,4 og opp støttes). Basert på 384--Wells-Pipetting-Guide. CSV-filen som genereres av makro regnearket, hjelper det brukeren i den totale doserings prosessen. Mens bruken av noen evangelieutdelinger ikke er verdt det, kan det være interessant å spare tid og unngå feil hvis et stort antall av DNA-og TR-evangelieutdelinger forventes. CSV-filen må inneholde godt, plate, navn, konsentrasjon og voluminformasjon. Dette programmet kan deretter brukes til andre programmer, for eksempel dispenser løsninger (reagenser, fargestoff, sammensatte, etc.) i målet godt, i henhold til en bruker dedikert CSV-fil. Videre tillater det brukeren å belyse en hel rad eller linje ved å skrive inn relevant informasjon i mål brønnen kolonnen bruker dette forventede formatet: Row_1 (til 24) eller Line_A (til P).

Feilsøking dårlig celle transfeksjoner effektivitet

Flere parametere beskrevet nedenfor kan svekke celle transfeksjoner i den beskrevne ADE-baserte protokollen og må kontrolleres individuelt og omgås i tilfelle effektivitets problemer.

En av de første viktige parametrene for transfeksjoner er kvaliteten på cellene og tettheten som brukes under såing. Selv om hver celle type vil kreve forskjellige parametre, må noen av dem respekteres for å sikre en vellykket transfeksjoner. Først av alt må celle suspensjonen være forberedt extemporaneously fra en subconfluent plate for å unngå celle stress før transfeksjoner, og de bør ikke stå liggende på benken for lenge (2 h maksimum). For det andre, seeding tettheten av cellene må være lav nok for to grunner: å unngå mobilnettet kontakter og fremme en høy celle overflate gang spredt, men også fordi aktivt dele celler bedre ta opp utenlandske nukleinsyre acid22,23. Dessverre, den optimale celle tettheten for transfeksjoner varierer avhengig av celletyper og transfeksjoner teknologi og må fastsettes for hver cellelinje. Dette er viktige parametre for å sikre effektiv transfeksjoner.

En annen viktig parameter som kan modulere transfeksjoner effektivitet er cellen passasje nummer24. Faktisk er celler i kultur kontinuerlig utsatt for evolusjon på grunn av konkurranse og naturlig utvalg. Det er velkjent at differensial genuttrykk mellom lave og høye celle passasje tall er forventet i de fleste cellelinjer på grunn av dedifferentiation som passasjen antallet øker. Etter dette fenomenet kan transfeksjoner effektivitet også bli påvirket. Imidlertid har Passage-relaterte effekter vist å være sterkt avhengig av cellelinjen og kultur forholdene. På toppen av det, er det som betraktes som en "høy" passasje nivå varierer fra en cellelinje til en annen. Dette betyr at passasjen nummerområdet under hvilke et sett av eksperimenter kan være pålitelig utført må fastsettes for hver gitt cellelinje.

En annen parameter som forsterker vanskeligheten med å bestemme de beste forutsetningene for transfeksjoner er at kulturen medium sammensetning også spiller en avgjørende rolle siden tilstedeværelsen av serum og/eller antibiotika modulere transfeksjoner effektivitet. Faktisk, de fleste kommersielle protokoller anbefaler bruk av serum fritt medium under transfeksjoner trinn for å øke effektiviteten eller omgå problemer med dårlig effektivitet3,25,26,27. Imidlertid er denne parameteren faktisk mer komplisert å pågripe som det har vist seg at for en gitt cellelinje, tidlig versus sene passasjer kan forsterke eller lavere effektivitet avhengig av serum tilstedeværelse eller fravær i kulturen medium28. Andre forskere preconize bruk av antibiotika-fri medium for passering før transfeksjoner når dyrking celler, for å oppnå høy kvalitet celler for transfeksjoner29. For å konkludere, når optimalisere transfeksjoner forhold for en gitt celle type, hver av disse parametrene bør testes: tidlig eller sent passasje celler og bruk av medium med eller uten serum under den siste passasjen før høsting cellene og/eller under transfeksjoner trinn selv.

Under optimaliseringen av protokollen som presenteres her, to typer reagens ble brukt: en liposomal reagens forming liposome komplekser og lipopolyplex reagens, en nonliposomal polymer sammensatt1. Mens vi hadde suksess i årevis manuelt transfecting HeLa celler med den første, var dårlig transfeksjoner effektivitet observert i dagens automatiserte protokollen. Dette skyldtes sannsynligvis et nødvendig virvlingen trinn ved blanding av DNA med transfeksjoner reagens som ikke kan utføres i 384-brønn plateformatet. Lipopolyplex trenger ikke et slikt trinn, og derfor førte til høyere transfeksjoner effektivitet i alle innstillingene testet. Selv om dette ikke har blitt bekreftet i dagens studie, unngår transfeksjoner reagenser som krever et fysisk blandings trinn slik har pipettering eller virvlingen vil trolig føre til bedre resultater.

Vi anbefaler også bruk av en transfeksjoner reagens som er kompatibel med omvendt transfeksjoner som den presenterte protokollen er basert på en omvendt transfeksjoner. Noen celler er kjent for å være vanskelig å transfect og noen dedikerte kjemiske forbindelser er utviklet for å fremme høyere transfeksjoner effektivitet30,31. Hvis du sikter på transfecting hard-to-transfect celler, anbefaler vi testing av gitte celle-type eller celle-line-dedikerte transfeksjoner reagenser, forutsatt at revers transfeksjoner er gjennomførbart med disse seg.

Flere parametre som er beskrevet i de underliggende avsnittene kan ha en innvirkning og noe svekke ADE-prosessen, muligens ødelegge det endelige eksperimentet.

Nanodispenser ble utviklet for å dispensere 2,5 nL dråper fra kilde brønner fylt med 3-12 μL av vandig buffer (dvs. 9 μL arbeidsvolum). Den nanodispenser enheten som brukes i denne studien integrerer en dynamisk væske analyse teknologi for fastsettelse av væske sammensetning og væske høyde i kildeplaten for å kontrollere kraften som trengs for å løse ut 2,5 nL dråper19. Mens fylle kildeplaten manuelt eller ved hjelp av en klassisk peristaltisk flytende handler, volumene er oftest ikke så nøyaktig enn de som bestemmes av dynamisk væske analyse. Dette er et viktig punkt å ta hensyn til ettersom enheten ikke er i stand til å dispensere fra kilde brønner lastet med mer enn 12 μL. Dermed vil deres tilstedeværelse kompromiss eksperimentet. En liste over utførte evangelieutdelinger kan selvfølgelig genereres på slutten av programmet, men dette krever at brukeren justerer volumer og kjører et program for å gjenopprette bare de tapte evangelieutdelinger. For å unngå disse uenigheter, er det anbefalt å utføre en "undersøkelse" når DNA plasmider har blitt lastet for å verifisere forventet volum i hver berørte godt.

En avgjørende parameter for dråpe utstøting er variasjonen i flytende overflatespenning17,32. Vann-DNA-løsninger er kjent for sin viskositet; Dette kan svekke uttaket med ADE. Mens de fysiske parametrene ikke ble bestemt i vår forrige studie1, høyere DNA løsnings konsentrasjoner i kildeplaten resulterte i lavere transfeksjoner effektivitet, selv for den samme totale MENGDEN av DNA utlevert, sannsynligvis på grunn av dette Fenomen. Derfor anbefaler vi å bruke en plasmider fortynning av 100 ng/μL for best resultat, selv om andre konsentrasjoner kan testes for bruker bekvemmelighet. For å sikre riktig ADE med den bruker tiltrengte DNA-konsentrasjonen, kan et fargestoff legges til løsningen for å overvåke dråpe utstøting i brønnene eller, enda bedre, på plate lokket. Som den presenterte protokollen første mål var å få høy gjennomstrømming, billige minicolumn-baserte plasmider DNA minipreparation kits kompatible med plate-basert høy gjennomstrømming plasmider rensing protokoller ble brukt. Mens det fungerte riktig under utførelsen av eksperimentet, i tilfelle av lav effektivitet og dårlig celle levedyktighet etter transfeksjoner, anbefales det å bruke høyere kvalitet DNA rensing metoder som MIDI-eller Maxi-preparater eller til og med endotoksin-fri kommersielt tilgjengelige kits som ville sikre en bedre DNA renhet og lavere toksisitet for cellene33.

Feilsøking inhomogen celle transfeksjoner over brønnen overflaten

Første forsøk når du setter opp protokollen førte til celle transfeksjoner bare i sentrum av brønnene, hvor dråpene ble sendt av ADE. Faktisk, la vi merke til at DNA og transfeksjoner blandingen ikke var sprer seg over hele brønnen overflaten og var tørking før celle tillegg på grunn av de lave volumene utlevert (knapt 500 nL). For å omgå dette problemet ble det lagt til et doseringstrinn for fortynningsmiddel for å la DNA/TR-blandingen spres over hele brønnene før celle tilsetning. Dette resulterte i en homogen celle transfeksjoner i brønnen. Således, når reprodusere eksperimentet og DNA/TR blandingen ikke spres over hele brønnene, kan fortynnings volumet justeres i henhold til brukerens behov.

Som den akustiske væsken handler kan distribuere volumer i nanoliter området, den beskrevne metoden potensielt ikke har noen tekniske begrensninger. Men, la vi merke til at vandige-løsning-fylte brønner er underlagt fordampning, som kan representere en begrensning. Hvis de nøyaktige volumene som skal føres ut, senkes med denne fordampning, vil nanodispensing ikke bli utført til Forventet slutt. I dette tilfellet genereres en feilrapport av nanodispenser. For å omgå dette problemet, bruk høyere volumer enn forventet mens du bor i akseptabelt øvre området (faktisk, lavere enn 12 μL). Men hvis fordampning fører til svekkelse av noen evangelieutdelinger, genereres en feilrapport av nanodispenser. Denne filen kan brukes til å fylle kildeplaten med ny reagens som skal føres ut på de berørte destinasjons brønnene. Å gjøre dette i en kort tidsintervall ikke synes å svekke transfeksjoner effektivitet.

Protokollen som beskrives her, er den første som får tak i en slik gjennomstrømming for uavhengige DNA-plasmider transfections. Beste prisene nådde før var for 288 ulike forhold som krevde høyt spesialiserte ferdigheter som skal utføres samtidig15. Dette, bortsett fra den høye gjennomstrømning, har den nåværende protokollen andre betydelige fordeler som den samlede prosessen er optimalisert for å tillate bruk av nonspecialists og verktøy har blitt utviklet for å unngå feil, nemlig i) en dedikert regneark makro som tillater den enkle utformingen av den eksperimentelle malen, II) den automatiske generasjonen av tilsvarende DNA og transfeksjoner reagens kilde plate (er) mal av denne makroen, III) generasjonen av to klare til bruk filer for å kontrollere programvare drevne evangelieutdelinger av DNA og transfeksjoner reagens av nanodispenser enheten, og IV) eksport av en "384-brønn pipettering guide"-fil som tilsvarer kildeplaten (e) designet, som skal brukes av en dedikert tablett-basert applikasjon også utviklet for å unngå menneskelige feil mens og uttaket i 384 kildeplaten (e).

Fremtidige forbedringer av protokollen

For å øke gjennomstrømningen og reproduserbarhet, kan kildeplaten som er fylt med plasmider oppbevares ved 4 ° c eller fryses som vanlig for DNA-lager løsninger. Videre viste vi at den forhåndslastede destinasjonen plate ferdigfylt med DNA kan også oppbevares tørt eller frosset i minst 7 dager før du legger til transfeksjoner reagens og celler, som fører til styrking av den samlede gjennomstrømning og enkel protokollen. DNA bevaring i mer enn 4 år har tidligere blitt rapportert ved hjelp av optimaliserte medier34 og bør derfor testes i sammenheng med denne protokollen som det vil presse det et skritt videre, slik at langtidslagring av plater forhåndsutfylte med banker av plasmider og klar til bruk i transfeksjoner eksperimenter.

Vi viste tidligere at de identifiserte optimale transfeksjoner forhold kunne overføres til høyere-skala eksperimenter, fra 96-brønn til 10 cm kultur retter1, ved å beregne DNA-beløpet, transfeksjoner reagens volum, og celle tetthet som bør brukes basert på den optimaliserte 384-brønn plate protokollen. Som 1536-brønn plate dispensasjon er håndterlig av nanodispenser også, kan protokollen også utføres på en lavere skala, og dermed øke sin gjennomstrømming. Men en stor begrensning for å nå dette formatet er evnen til å dispensere celler og administrere den endelige lese-ut i en slik miniatyriserte format. Celle dosering av ADE har allerede blitt utført i 1536-brønn plateformat35 ved hjelp av en løsning av nøytral tetthet som forhindret celle seeding og sørget for lik celle tetthet i tid. Basert på celle nummeret som brukes her og overflate forholdet på 384 (0,056 cm2) versus 1536 brønner (0,025 cm2), ville 500-650 celler bli utlevert i dette siste formatet. En slik celle dispensasjon tall serien har vist å være svært pålitelig hvis 14%-18% konsentrert løsning av nøytral tetthet brukes. Under disse innstillingene vil 100 nL av celle suspensjon fordeles over 1536 brønner. Med en fungerende løsning på 5-8 μL i slike brønner, vil det å legge til 5-8 μL av kultur medium ved hjelp av klassiske peristaltisk flytende handlers fortynne den antiseeding løsningen til mindre enn 0,3%, og dermed gi riktig celle seeding. Transfecting celler på en så lav skala synes derfor teknisk mulig; effekten av den gjenværende konsentrasjonen av den nøytrale tetthets løsningen på transfeksjoner effektivitet gjenstår imidlertid å bli bestemt av videre arbeid.

Ved hjelp av kilde platetyper som bærer høyere arbeids volumer å dispensere celler, for eksempel 384-brønn polypropylen kilde plater har et fungerende volum på 45 μL, ville tillate 100 nL celle løsning evangelieutdelinger fra bare fire kilde brønner for en samlet 1536-brønn plate. Videre, nye nanodispensers er i stand til å dispensere dråper 25 nL i stedet for 2,5 nL som ble brukt i denne protokollen. Denne dråpestørrelse, deretter, skiller 10-fold uttaket tid, men innebærer å bruke flere av 25 nL volumer som imidlertid holde seg kompatibel med de ulike volumene utlevert i protokollen som presenteres her.

Basert på disse siste verk og teknologiske forbedringer, et ytterligere ADE-celle doseringstrinn for å oppnå en 1536-brønn plate transfeksjoner kan lett legges til den gjeldende protokollen. Men å nå slike miniaturizations er bare verdt det hvis fotokarsinogenetisk er samtidig gjennomførbart i en slik miniatyriserte format.

Som konklusjon utviklet vi en enkel, høy gjennomstrømming og nøyaktig transfeksjoner metode som bærer flere fordeler på grunn av miniatyrisering: (1) senke kostnadene ved transfeksjoner reagens; (2) redusere avfall av DNA preparater; (3) sikre at selv nybegynnere kan med hell utføre celle transfeksjoner. Det krever faktisk bare noen få enkle manuelle trinn, nemlig fortynning av DNA til 100 ng/μL, utlevering det på en kilde plate (en plasmider/brønn) i henhold til regneark gener ert mal og ved hjelp av den Tablet-baserte pipettering guide, og forberede cellen suspensjon før seeding. Den ADE-baserte nanodispenser er ansvarlig for den tidkrevende og feilutsatte dose leveringen og multipleksing av plasmider, i henhold til den gitte malen for eksperimentet.

Videre, mens denne protokollen kan sikre de fleste av de grunnleggende biologiske hensikter klassiske transfeksjoner eksperimenter, kan det også åpne opp nye måter for array-baserte eksperimenter. For eksempel, uttrykke eller banke ned hver Human protein-koding genet fra den menneskelige ORFeome samlingen36 eller CRISPR-Cas9 bibliotek-baserte tilnærminger37, henholdsvis ville kreve mindre enn 24 h på en dedikert automatisert plattform (53 x 384- brønn plater), snarere enn 2-3 dager med menneskelig arbeid, forutsatt bruk av en DNA-forhåndslastet plate bank. På grunn av sin høye effektivitet og høy gjennomstrømming ytelse, protokollen som presenteres her kan selv være i stand til å oppnå nye nonpooled tilnærminger for CRISPR-Cas9 basert-studier med gRNA Libraries/CRISPR-Cas9-uttrykker plasmider. Faktisk, milde cellulære fenotype endringer, som i dag ikke kan tillate de nødvendige celle-sortering trinn, ville endelig være overkommelig, som en brønn vil representere en banket genet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne avslørte en kvittering på følgende økonomisk støtte til forskning, forfatterskap, og/eller publisering av denne artikkelen: INSERM, lille University, lille Pasteur Institute, Conseil Régional du Nord, og PRIM-HCV1 og 2 (Pôle de Recherche Interdisciplinaire Sur Le Médicament), Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-EQPX-04-01), Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) og det europeiske samfunnet (ERC-STG INTRACELLTB n ° 260901). Forfatterne ønsker å takke Dr. S. Moureu, Dr. B. Villemagne, Dr. R. Ferru-Clément, og Dr. H. Groult for deres kritiske gjennomgang og rettelser av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384LDV Microplate Labcyte LP-0200
384-well Microplate μClear Black Greiner 781906
Ampicilin Sigma A9393-5G Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector
Android Tablet Samsung Galaxy Note 8 used to guide the user while the source plate manual dispense
Aniospray Surf 29 Anios 2421073 disinfectant to clean the MicroFlo head
Columbus software Perkin Elmer image analysis software
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10566032 cell culture medium
Echo Cherry Pick 1.5.3 software Labcyte Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software
Echo550 Labcyte ADE-based dispenser
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 to add in cell culture medium
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L to fix cell
HeLa cells ATCC HeLa (ATCC® CCL-2™)
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570 10 mg/mL Solution in Water
INCell Analyzer 6000 GE Healthcare 29043323 automated laser-based confocal imaging platform
LB medium Thermoischer Scientific
LB Broth Base (Lennox L Broth Base)®, powder		 12780052 culture medium for bacteria growth
Lysis Buffer (A2)  Macherey-Nagel 740912.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
MicroFlo 10µL cassette Biotek Instruments Inc 7170013 to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo 1μL cassette Biotek Instruments Inc 7170012 to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo Dispenser Biotek Instruments Inc 7171000 peristaltic pump-based liquid handler device
Microvolume spectrophotometer Denovix DS-11 Spectrophotometer Measure the DNA concentration of samples
mVenus plasmid mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus
Neutralization Buffer (A3)  Macherey-Nagel 740913.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
NucleoSpin Plasmid kit Macherey-Nagel 740588.50 used to prepare plasmid from bacterial culture
Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
optional Wash bufferWash Buffer (A4) Macherey-Nagel 740914.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
orbital shaker  incubated large capacity shaker 444-7084 Used to grow bacteria under gentle agitation and 37°C
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 10,000 U/mL
Phosphate-Buffered Saline Thermo Fisher Scientific 10010001
Plasmid mini-columns Macherey-Nagel 740499.250 Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture
Resuspension Buffer (A1)  Macherey-Nagel 740911.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
RNAse A Macherey-Nagel 740505 Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
tdTomato-N1 plasmid Addgene Plasmid #54642 Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato 
TransIT-X2 Dynamic Delivery System Mirus Bio MIR 6000
Wash Buffer (AW) Macherey-Nagel 740916.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
3D printer Creality CR10S used to print the plate adapter
Blender Software   https://www.blender.org/
Free software under GNU General Public License (GPL).		 version 2.79b used to design the plate adapter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Colin, B., Deprez, B., Couturier, C. High-Throughput DNA Plasmid Transfection Using Acoustic Droplet Ejection Technology. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. , 2472555218803064 (2018).
  2. Mirus Bio. Optimising Transfection Performance. , (2019).
  3. Thermo Fisher Scientific. Factors Influencing Transfection Efficiency | Thermo Fisher Scientific - FR. , https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics/factors-influencing-transfection-efficiency.html (2019).
  4. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  5. Figueroa, E., et al. A mechanistic investigation exploring the differential transfection efficiencies between the easy-to-transfect SK-BR3 and difficult-to-transfect CT26 cell lines. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 36 (2017).
  6. Kirchenbuechler, I., Kirchenbuechler, D., Elbaum, M. Correlation between cationic lipid-based transfection and cell division. Experimental Cell Research. 345 (1), 1-5 (2016).
  7. Zhang, Z., Qiu, S., Zhang, X., Chen, W. Optimized DNA electroporation for primary human T cell engineering. BMC Biotechnology. 18 (1), 4 (2018).
  8. Cao, D., et al. Transfection activity and the mechanism of pDNA-complexes based on the hybrid of low-generation PAMAM and branched PEI-1.8k. Molecular bioSystems. 9 (12), 3175-3186 (2013).
  9. Bos, A. B., et al. Development of a semi-automated high throughput transient transfection system. Journal of Biotechnology. 180, 10-16 (2014).
  10. Colosimo, A., et al. Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells. BioTechniques. 29 (2), 314-318 (2000).
  11. Villa-Diaz, L. G., Garcia-Perez, J. L., Krebsbach, P. H. Enhanced transfection efficiency of human embryonic stem cells by the incorporation of DNA liposomes in extracellular matrix. Stem Cells and Development. 19 (12), 1949-1957 (2010).
  12. Sabatini, D. M. Reverse transfection method. , WO2001020015A1 (2001).
  13. Raymond, C., et al. A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods (San Diego, CA). 55 (1), 44-51 (2011).
  14. Junquera, E., Aicart, E. Recent progress in gene therapy to deliver nucleic acids with multivalent cationic vectors. Advances in Colloid and Interface Science. 233, 161-175 (2016).
  15. Woodruff, K., Maerkl, S. J. A High-Throughput Microfluidic Platform for Mammalian Cell Transfection and Culturing. Scientific Reports. 6, 23937 (2016).
  16. Vasileiou, T., Foresti, D., Bayram, A., Poulikakos, D., Ferrari, A. Toward Contactless Biology: Acoustophoretic DNA Transfection. Scientific Reports. 6, 20023 (2016).
  17. Hadimioglu, B., Stearns, R., Ellson, R. Moving Liquids with Sound: The Physics of Acoustic Droplet Ejection for Robust Laboratory Automation in Life Sciences. Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 4-18 (2016).
  18. Grant, R. J., et al. Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology. Journal of Biomolecular Screening. 14 (5), 452-459 (2009).
  19. Sackmann, E. K., et al. Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection. Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 166-177 (2016).
  20. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society Reviews. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  21. Zielinski, D., Gordon, A., Zaks, B. L., Erlich, Y. iPipet: sample handling using a tablet. Nature Methods. 11 (8), 784-785 (2014).
  22. Brunner, S., et al. Cell cycle dependence of gene transfer by lipoplex, polyplex and recombinant adenovirus. Gene Therapy. 7 (5), 401-407 (2000).
  23. Nii, T., et al. Single-Cell-State Culture of Human Pluripotent Stem Cells Increases Transfection Efficiency. BioResearch Open Access. 5 (1), 127-136 (2016).
  24. Noonan, D. J., Henry, K., Twaroski, M. L. A High-Throughput Mammalian Cell-Based Transient Transfection Assay. Signal Transduction Protocols. 284, 051-066 (2004).
  25. Transfection | TransIT Transfection Reagents | Mirus Bio. , https://www.mirusbio.com/products/transfection (2015).
  26. American Type Culture Collection. General protocol for transfection of stem cells, primary cells, and continuous cell lines with ATCC TransfeX Transfection Reagent. , https://www.atcc.org/~/media/Transfection%20protocols/TransfeX/TransfeX%20General%20Protocol%20on%20letterhead.ashx (2017).
  27. American Type Culture Collection. Transfection Reagents for Nucleic Acid Transfer into ATCC Cells. , http://www.lgcstandards-atcc.org/~/media/PDFs/Marketing%20Material/Cell%20Biology/Transfection%20reagents%20for%20nucleic%20acid.ashx (2017).
  28. de Los Milagros Bassani Molinas, M., Beer, C., Hesse, F., Wirth, M., Wagner, R. Optimizing the transient transfection process of HEK-293 suspension cells for protein production by nucleotide ratio monitoring. Cytotechnology. 66 (3), 493-514 (2014).
  29. Promega. FuGENE® 6 Transfection Reagent. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/fugene-6-transfection-reagent-protocol.pdf (2019).
  30. Olden, B. R., Cheng, Y., Yu, J. L., Pun, S. H. Cationic polymers for non-viral gene delivery to human T cells. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 282, 140-147 (2018).
  31. Park, E., Cho, H. B., Takimoto, K. Effective gene delivery into adipose-derived stem cells: transfection of cells in suspension with the use of a nuclear localization signal peptide-conjugated polyethylenimine. Cytotherapy. 17 (5), 536-542 (2015).
  32. Wood, R. W., Loomis, A. L. The physical and biological effects of high-frequency sound-waves of great intensity. The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 4 (22), 417-436 (1927).
  33. Eliminating Endotoxin at the Source - A Novel Competent Cell Line with Modified Lipopolysaccharide for Low-Endotoxin Plasmid Production. Mamat, U., et al. 28th Annual Symposium of the Protein Society, San Diego, CA, , (2014).
  34. Ivanova, N. V., Kuzmina, M. L. Protocols for dry DNA storage and shipment at room temperature. Molecular Ecology Resources. 13 (5), 890-898 (2013).
  35. Lesnick, J., Lejeune-Dodge, A., Ruppert, N., Jarman, C. High-Precision Cell Dispensing with the Labcyte Echo® Liquid Handler. , https://www.labcyte.com/content/applications/high-precision-cell-dispensing-with-the-labcyte-echo-liquid-handler (2017).
  36. Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nature Methods. 8 (8), 659-661 (2011).
  37. Peng, J., Zhou, Y., Zhu, S., Wei, W. High-throughput screens in mammalian cells using the CRISPR-Cas9 system. The FEBS journal. 282 (11), 2089-2096 (2015).

Tags

Tilbaketrekking akustisk dråpe utstøting høy gjennomstrømming transfeksjoner DNA-plasmider pattedyrceller væskehåndtering fluorescerende protein
Høy-gjennomstrømning DNA plasmider multipleksing og Transfeksjoner bruke akustisk Nanodispensing teknologi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Colin, B., Rocq, N., Deprez, B.,… More

Colin, B., Rocq, N., Deprez, B., Couturier, C. High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology. J. Vis. Exp. (150), e59570, doi:10.3791/59570 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter