Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

High-throughput DNA plasmide multiplexing en transfectie met behulp van akoestische nano doseertechnologie

Published: August 8, 2019 doi: 10.3791/59570
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Institut Pasteur de Lille, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) U1177, Drugs and Molecules for Living Systems, Université de Lille, 2L'atelier du Développeur, Marquette lez Lille

Summary

Dit protocol beschrijft een hoge doorvoer plasmide transfectie van zoogdiercellen in een 384-goed plaat met behulp van akoestische druppel ejectie technologie. De tijdrovende, foutgevoelige DNA-afgifte en multiplexing, maar ook de transfectie-reagens afgifte, zijn softwaregestuurd en worden uitgevoerd door een nanodispenser apparaat. De cellen worden vervolgens in deze voorgevulde putten gesest.

Abstract

Celtransfectie, onmisbaar voor veel biologische studies, vereist het beheersen van vele parameters voor een nauwkeurige en succesvolle prestatie. Meestal uitgevoerd bij lage doorvoer, het is bovendien tijdrovend en foutgevoelig, nog meer als multiplexing verschillende plasmiden. We ontwikkelden een eenvoudige, snelle en nauwkeurige methode om celtransfectie uit te voeren in een 384-well plate layout met behulp van Acoustic druppel uitwerp (ADE) technologie. De nano dispenser apparaat gebruikt in deze studie is gebaseerd op deze technologie en maakt nauwkeurige nano volume levering op hoge snelheid van een bron goed plaat naar een bestemming een. Het kan DNA-en transfectie-reagens verdelen en multiplex volgens een vooraf ontworpen spreadsheet. Hier presenteren we een optimaal protocol om op ADE gebaseerde plasmide transfectie met hoge doorvoer uit te voeren, wat het mogelijk maakt om een efficiëntie van maximaal 90% en een bijna 100% cotransfectie in cotransfection experimenten te bereiken. We breiden het initiële werk uit door een gebruiksvriendelijke macro op spreadsheet voor te stellen, die maximaal vier plasmiden/putten kan beheren uit een bibliotheek met maximaal 1.536 verschillende plasmiden en een Tablet-gebaseerde Pipetteer hulplijn toepassing. De macro ontwerpt de noodzakelijke template (s) van de bron plaat (en) en genereert de kant-en-klare bestanden voor de nano dispenser en Tablet-based applicatie. Het transfectie-Protocol van vier stappen omvat i) een verdunningsmiddel dat met een klassieke vloeistofhandler, II) plasmide distributie en multiplexing, III) een transfectie-reagens van de nano dispenser, en IV) celplating op de voorgevulde putten. De beschreven software-gebaseerde controle van ADE plasmide multiplexing en transfectie maakt het zelfs niet-specialisten in het veld mogelijk om een betrouwbare celtransfectie op een snelle en veilige manier uit te voeren. Deze methode maakt snelle identificatie van optimale instellingen voor een bepaald celtype mogelijk en kan worden omgezet naar een hogere schaal en handmatige benaderingen. Het protocol vergemakkelijkt toepassingen, zoals humaan ORFeome eiwit (set van open Lees kaders [Orf's] in een genoom) expressie of CRISPR Cas9 gebaseerde genfunctie validatie, in niet-gepoolde screening strategieën.

Introduction

De hier gepresenteerde methode beschrijft in detail hoe DNA-plasmide multiplexing en transfectie in zoogdiercellen bij hoge doorvoer te voeren met behulp van een akoestische vloeibare nano dispenser in een 384-well plaat, zelfs voor niet-specialisten in het veld. Deze onlangs gepubliceerde methode1 maakt het uitvoeren van zoveel 384 onafhankelijke plasmide DNA multiplexing en transfectie voorwaarden in één experiment, in minder dan 1 h. enkelvoudige of cotransfectie experimenten waren succesvol en bereikten een nabije 100% cotransfectie binnen de populatie van de getransfunteerde cellen. Dit protocol maakt transfectie gemakkelijker omdat de meeste vervelende, tijdrovende en foutgevoelige stappen nu software-gedreven zijn (Zie afbeelding 1 voor een algemeen overzicht). Er zijn verdere inspanningen geleverd om speciale instrumenten te ontwikkelen om het gebruiksgemak te verbeteren en tegelijkertijd menselijke fouten tijdens het algehele proces te voorkomen en om succesvolle Transfectie te bevorderen, zelfs voor niet-specialisten in het veld. Het beschreven protocol bevat een "gebruiksvriendelijk" macro-spreadsheet dat we hebben ontwikkeld om 384 onafhankelijke transfectie condities te beheren met multiplexing mogelijkheden van maximaal vier plasmiden in elke put. De macro genereert automatisch sjablonen van de bron plaat (en) om het verwachte DNA-plasmide volume te laden bij het starten van voorraadoplossingen en de bestanden die nodig zijn om de nanodispenser software te best Epen op het experimentele ontwerp dat is ingevoerd. Omdat het handmatig doseren van DNA in een 384-bron plaat vervelend en foutgevoelig is, ontwikkelden we ook een speciale Tablet-gebaseerde applicatie om de gebruiker te begeleiden tijdens het doseren van de DNA-oplossing volgens de sjabloon.

Figure 1
Figuur 1: experimentele workflow. Schematische weergave van het optimale geautomatiseerde omgekeerde transfectie protocol met hoge doorvoer (van experimenteel ontwerp tot aangepaste biologische assay). Handmatige stappen worden aangegeven door het hand symbool en de geschatte tijd voor elke stap wordt in een rood vak geschreven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Veel op cellen gebaseerde experimenten beginnen met plasmide DNA-transfectie, en zelfs als veel speciale reagentia zijn en nog steeds worden ontwikkeld om de transfectie-efficiëntie te verbeteren en/of de procedure te verlichten, moet er nog veel worden gedaan2,3 , 4. DNA plasmide celtransfectie omvat verschillende stappen om een hoog rendement te bereiken, zoals een initiële complexe opname, endosomale ontsnapping en cytoplasmisch transport naar de Nucleus5,6. Naast calcium neerslag of fysische technieken zoals elektroporation of Microinjection met behulp van speciale apparaten7, moderne chemische methoden hebben gericht op het verbeteren van DNA-cel levering terwijl het verlagen van de cel cytoxiciteit8, 9. Het gebruik van lipiden of kationische polymeren die liposomen-achtige complexen vormen en, meer recentelijk, nonliposomale polymere chemie systemen heeft transfectie gemakkelijker en efficiënter gemaakt10. Ondanks deze ontwikkelingen vereist celtransfectie nog steeds dat specifieke vaardigheden nauwkeurig worden uitgevoerd, omdat de meeste van deze fysische of chemische transfectie protocollen wetenschappers verplichten om handmatig elke DNA-transfectie reactie voorwaarde voor te bereiden, dus de doorvoer aantasten. Om dit probleem te omzeilen, zijn reverse transfectie-protocollen ontwikkeld met behulp van chemische transfectie reagentia11,12,13, waardoor de gebruiker meerdere plasmiden op een snellere manier kon testen of combineren. In deze protocollen worden nucleïnezuur complexen met transfectie reagentia gevormd voordat de cellen op de complexen worden zaaien. Deze omgekeerde protocollen worden echter nog steeds beperkt door de manuele behandeling van DNA-oplossingen en door de combinatie van elk van de onafhankelijke voorwaarden. Hoewel het haalbaar is om ze uit te voeren in een 96-goed plaat formaat, zullen de DNA-voorbereiding en-bedeling vervelend zijn en zullen er waarschijnlijk fouten zijn. Wanneer verschillende hoeveelheden van verschillende DNA plasmiden nodig zijn en Multiplexed met elkaar, wordt celtransfectie nog moeilijker te bereiken en meer tijdrovende, en menselijke fouten worden heel onvermijdelijk. Opschalen naar de 384-well plate formaat in een omgekeerde transfectie aanpak, ondanks enkele Multiplexed DNA transfectie omstandigheden, wordt een onmogelijke uitdaging om de volgende redenen. i) de DNA-bedragen, het transfectiereagens of het reactiemengsel dat moet worden beheerd, zijn voor elke put lager dan 1 μL. II) de multiplexing van plasmiden voor 384 onafhankelijke omstandigheden wordt uiterst ingewikkeld. De levering in elk van de 384 Wells is ook III) zeer tijdrovend en IV) foutgevoelig. Inderdaad, het doseren van de juiste oplossing in de verwachte putten is moeilijk te beheren omdat de lage volumes die al zijn gedoseerd geen visuele controle tussen de lege en reeds gevulde putten toestaan. v) ten slotte is er een hoog risico op het drogen van het mengsel door verdamping voordat de cellen worden toegevoegd als gevolg van de tijd die nodig is om de nodige doseerstappen uit te voeren. Samengevat, de beperkende factor voor het instellen van een hoge doorvoer DNA plasmide transfectie-assays lijkt de miniaturisatie van de assay te zijn, wat een laag volume multiplexing en beheer inhoudt dat niet meer handmatig kan worden afgehandeld, maar ook nauwelijks haalbaar is in een betrouwbare manier door klassieke peristatische vloeistof behandellers.

Als een bewijs van moeilijkheden om dergelijke testen te automatiseren en hoge doorvoer te krijgen, zijn er tot nu toe slechts een paar pogingen om Transfectie te automatisering gepubliceerd: a 96-well plate Format met behulp van een commerciële vloeistof handling apparaat en calciumfosfaat neerslag14 en, meer recentelijk, een lipoplex-reagens en een microfluïdische chip die 280 onafhankelijke transfecties mogelijk maakt15 , maar die gespecialiseerde vaardigheden op dit gebied vereisen. Een andere methode, acoustophoresis, die vloeistof levitatie mogelijk maakt en leidt tot vloeiende manipulatie en menging, werd gebruikt om DNA-transfectie uit te voeren in 24-tot 96-well plate formaten16. Hoewel haalbaar, deze aanpak lijdt aan een extreem lage doorvoer als het mengen van cellen met DNA-transfectie mengsel vereist een 60 s incubatie voor elk afzonderlijk punt voor het zaaien. Dit impliceert een duur van minstens 96 min voor een complete 96-well plaat. Bovendien is dit protocol verre van vatbaar voor het publiek van de algemene biologen, omdat dit werk werd gedaan met een in-House ontworpen en gefabriceerd apparaat dat momenteel niet op de markt verkrijgbaar is. Integendeel, in de afgelopen jaren is een eenvoudig te gebruiken software-gestuurde, op akoestiek gebaseerde doseertechnologie ontstaan met nano volume dispenser apparaten. Met behulp van gerichte akoestische energie, kunnen deze apparaten de strak gecontroleerde ejectie van kleine vloeibare volumes van 2,5 nL naar 500 nL van een bron plaat naar een bestemming één17. Deze technologie, genaamd Acoustic druppel uitwerp (ADE), heeft tal van voordelen: het is volledig geautomatiseerd, contactloos, tipless, nauwkeurig, nauwkeurig en zeer reproduceerbaar, en heeft een hoge doorvoer18. Voor het eerst gewijd aan het leveren van Dimethylfumaraat sulfoxide (DMSO) oplossingen, zijn de instellingen verbeterd om water buffers te doseren19. Akoestische nano dispensers lijken dan geschikt voor Reverse Cell transfectie protocols en kunnen de meeste van bovengenoemde handmatige beperkingen omzeilen. Omdat er voorheen geen plasmide transfectie pogingen werden beschreven met behulp van deze technologie, evalueerden we onlangs de geschiktheid van een akoestisch-gebaseerd doseersysteem om omgekeerde celtransfectie uit te voeren.

Door de doorvoer en het gebruiksgemak van de nano dispenser te benutten, hebben we een reverse transfectie-protocol voor HeLa-cellen geoptimaliseerd door verschillende parameters te cross-testen die de DNA-trans fectie op een 384-put, één plaat kunnen beïnvloeden, namelijk de totale DNA-hoeveelheid en Bron-DNA start concentratie, verdunnings vloeistofvolume, transfectie reagens, en aantal verspreidings cellen. Het ontwikkelde protocol omzeilt de hierboven beschreven handmatige beperkingen van celtransfectie en presenteert verschillende voordelen ten opzichte van andere geautomatiseerde transfectie pogingen. Ten eerste wordt het geminiaturiseerd, waardoor kostenbesparend transfectie-reagens kan worden bespaard door DNA-plasmide preparaten en transfectie-reagens op te slaan. Ten tweede, het is veel meer hoge doorvoer en reproduceerbare dan de handmatige Protocol (zelfs voor beginners), als transfectie van een hele 384-goed plaat kan worden bereikt in minder dan 1 h. Tot slot, het is software-gedreven, waardoor de controle van de gedoseerde DNA-hoeveelheid en de multiplexing van verschillende plasmiden. Inderdaad, dankzij de nano dispenser software (tabel van de materialen), kan de gebruiker een studie plan uitwerken om de volumes te controleren die van een gedefinieerde bron goed plaat naar een bestemming worden gedoseerd.

Het protocol dat hier wordt gepresenteerd, is vooral bedoeld voor diegenen die toegang hebben tot een nano dispenser en die transfectie experimenten willen opzetten met een hoge doorvoer, maar ook voor diegenen die hun transfectie parameters voor een bepaald celtype snel willen optimaliseren door Dit protocol toepassen om verschillende parameters bij hoge doorvoer te cross-testen. Inderdaad, we hebben aangetoond dat geoptimaliseerde parameters geïdentificeerd met dit nanoschaal protocol kunnen worden omgezet in grotere schaal en handmatige transfectie experimenten. Ten slotte, aangezien het in dit Protocol gebruikte transfectie reagens DNA of siRNA transfectie toestaat volgens de fabrikant, is het protocol ook van belang voor diegenen die zich richten op het uitvoeren van array benaderingen voor genoverexpressie of knockdown. De bestemmings platen die met DNA zijn gevuld, kunnen tot 7 dagen voor gebruik in een transfectie test worden bewaard zonder verlies van werkzaamheid, wat een ander voordeel is van het volgende protocol voor dit soort toepassingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voorbereidingen

  1. Bereiding van de peristaltische vloeistofhandler Programma's
    Opmerking: voor de stappen van het verdunningsmiddel en de celdosering van het protocol moet een speciaal programma worden opgesteld, rekening houdend met de hoogte van de doseer kop tot de gebruikte plaat en de stap intentie.
    1. Monteer voor de 1 μL verdunnings vloeistof doseerstap een 1 μL cassette en bereid een programma voor met de instellingen zoals beschreven in de stappen 1.1.1.1 en 1.1.1.2.
      1. Pas de stroomsnelheid parameter op hoog voor de beste doorvoer als er geen biologische materiële schade wordt verwacht in deze stap. Stel de doseer hoogte in op 9,6 mm (afhankelijk van de gebruikte celkweek plaat, aanvullend figuur 1) zodat de druppel van 1 μL de bodem van de putjes tijdens de dispensatie kan aanraken.
        Opmerking: deze stap is cruciaal om te voorkomen dat de druppeltjes op de doseer kop worden vastgehouden totdat er voldoende volume is om te laten vallen.
      2. Stel de plaat duidelijke hoogte in op 14,4 mm om een vrije verplaatsing van de doseer kop over de plaat toe te laten na elke rij. Visuele controle van de juiste instellingen van de peristaltische vloeistof handler hoofd hoogte: Zorg ervoor dat er geen druppels worden vastgehouden op de doseer tips tijdens het doseren en controleer of het hoofd hoog genoeg is om verplaatsing van het hoofd na het doseren van elke rij.
        Opmerking: het vermijden van druppel retentie is een cruciale parameter omdat het de nauwkeurigheid van het volume van de dispensatie zal aantasten.
    2. Voor de afgifte van de celsuspensie van 40 μL, Monteer een cassette van 10 μL en bereid een programma voor met de instellingen zoals beschreven in de stappen 1.1.2.1-1.1.2.2.
      1. Pas de stroomsnelheid parameter op laag om cellen te doseren met een lage snelheid om te voorkomen dat het bevorderen van potentiële schade aan de cellen door shear stress en hoge impact op de bodem van de putten. Stel de dispensatie hoogte in op 11,43 mm (volgens de gebruikte celkweek plaat, aanvullend figuur 1), hoog genoeg om de celimpact op de bodem van de putjes tijdens het doseerproces te verlagen, maar laag genoeg om retentie van de druppels op de Doseer kop. Stel de plaat met een duidelijke hoogte in op 16 mm, zodat de doseer kop vrij kan worden Verplaatsbaar na elke rij.
      2. Visuele controle van de juiste instellingen van de peristaltische vloeistof handler hoofd hoogte: Zorg ervoor dat er geen druppels worden vastgehouden op de doseer tips tijdens het doseren en controleer of het hoofd hoog genoeg is om verplaatsing van het hoofd na het doseren van elke rij.
        Opmerking: het vermijden van drop retentie is een cruciale parameter, omdat het zal leiden tot het doseren van een onbetrouwbaar celnummer.
  2. DNA plasmide preparaat (klassieke miniprep extractie Protocol)
    1. Groeien een getransformeerde DH5α bacteriestam in LB medium aangevuld met 125 μg/mL ampicillaire selectie antibioticum (tabel van de materialen) 's nachts bij 37 °c en onder zachte opwinding (200 rpm) op een rondschudapparaat (tabel van materialen).
    2. Oogst 2 mL van de cultuur, pellet de cellen door te centrifugeren gedurende 5 minuten bij 6.000 x g, en gooi de supernatant.
    3. Hervat de celpellet met 250 μL resuspensie buffer met RNase A (tabel metmaterialen). Voeg 250 μL lysisbuffer toe en incuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, volgens de instructies van de fabrikant.
    4. Stop de lysisreactie door het toevoegen van 300 μL neutralisatie buffer (tabel met materialen) en vortexting kort. Centrifugeer de buisjes gedurende 5 min bij 11.000 x g.
    5. Plaats een nieuw plasmide minicolumn (tabel met materialen) in een 2 ml opvang buisje en decanteer het supernatant in de kolom door gedurende 1 minuut te centrifugeren bij 11.000 x g.
    6. Gooi de doorstroom weg en plaats de minicolumn terug in het opvang buisje.
    7. Was het plasmide minicolumn met 500 μL optionele wasbuffer (tabel met materialen) en Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 11.000 x g, volgens de instructies van de fabrikant.
    8. Gooi de doorstroming weg en plaats het plasmide minicolumn terug in het opvang buisje.
    9. Voeg aan de hand van de instructies van de fabrikant 700 μL wasbuffer (tabel met materialen) toe, aangevuld met ethanol en Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 11.000 x g.
    10. Gooi de doorstroming weg en Centrifugeer het plasmide minicolumn en zijn opvang buis 1x meer gedurende 2 minuten bij 11.000 x g om het silica membraan te drogen.
    11. Plaats het gedroogde plasmide minicolumn in een nieuwe tube van 1,5 mL en Voeg 30 μL gedistilleerd water toe, voorverwarmd bij 60 °C, inbroed het gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en Centrifugeer het gedurende 1 minuut bij 11.000 x g.
    12. Gooi het plasmide minicolumn weg en houd het eluaat met het gezuiverde DNA plasmide.
    13. Meet de DNA-concentratie van het eluteerde DNA met behulp van een microvolume spectrofotometer (tabel met materialen).
      1. Schakel de spectrofotometer in en kies de instellingen voor de DNA-meting .
      2. Verhoog de monsternemings arm van de spectrofotometer en Pipetteer 1 μL water op het maat voetstuk om een blanco kalibratie uit te voeren.
      3. Verlaag de bemonsterings groep, start de lege meting en wacht tot de voltooiing is voltooid.
      4. Til de monsternemings-arm omhoog en veeg het monster af van de bovenste en onderste sokkels.
      5. Pipetteer 1 μL van de DNA-oplossing op het onderste voetstuk om het te meten.
      6. Verlaag de bemonsterings groep, start de meting van de DNA-concentratie en wacht tot de voltooiing is voltooid.
      7. Til de monsternemings-arm omhoog en veeg het monster af van de bovenste en onderste sokkels.
      8. Herhaal stap 1.2.13.5-1.2.13.7 voor verdere DNA-concentratiemetingen.
    14. Nadat de metingen zijn voltooid, bewaart u de DNA-oplossingen bij 4 °C tot het gebruik.

2. experimenteel ontwerp en generatie van de selectielijsten om de ade-gebaseerde afziet te stimuleren

Opmerking: een speciale "gebruiksvriendelijke" spreadsheet macro is ontwikkeld om DNA-bedragen te beheren en tot vier plasmiden te mengen in een 384-well plate-formaat. Op basis van het ingevoerde experimentele ontwerp genereert deze macro de benodigde bestanden om het op ADE gebaseerde DNA-transfectie Protocol van nano dispenser te stimuleren. Om deze bestanden te genereren, moeten verschillende velden worden ingevuld in het sjabloon blad zoals weergegeven in afbeelding 2.

Figure 2
Figuur 2 : Het genereren van de selectielijsten om de ade-dispensatie te stimuleren met behulp van de werkblad macro. Er moeten verschillende parameters worden ingevuld, namelijk (1) het transfectiereagens (tr) en de minimale/maximale volumes die in de bron plaat moeten worden gebruikt (2) de aanvankelijke plasmide concentraties die in de bron plaat moeten worden afgeleverd, en (3) de geheel plaat ontwerp, met inbegrip van de verwachte plasmide bedragen en multiplexing in elk van de 384-Wells. (4) bij activering van selectielijsten kunnen de verschillende velden worden geverifieerd en, eenmaal correct ingevuld, piclijsten voor DNA-en TR-dispensatie en de noodzakelijke bron plaat sjabloon worden automatisch gegenereerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

  1. Voer de parameters voor het nanodispenser protocol in de roze velden in. Stel de waarde van het mengsel van transfectie reagens (tr) in op 500 nl. Stel de minimale volume waarde in de bron plaat putjes in op 4 μL. Stel het maximale volume in de bron plaat in op 11,25 μL.
    Opmerking: de hier gebruikte nano dispenser kan slechts een maximum van 500 nL in één run van ADE overdragen. Deze roze velden zijn vooraf gevuld met de aanbevolen waarden, maar kunnen worden aangepast volgens de behoeften van de gebruiker.
  2. Voer 100 ng/μL DNA start concentraties in de blauwe velden die overeenkomen met het onderliggende DNA.
    Opmerking: deze waarde is de optimale concentratie die eerder is gedefinieerd, maar kan echter worden aangepast voor verschillende gebruikersbehoeften.
  3. Voer de gewenste DNA-hoeveelheid in de grijze/groene velden in. Voer de hoeveelheden en plasmide namen in voor de 384 Wells en zorg voor dezelfde spelling als dezelfde plasmide in verschillende putjes wordt gebruikt.
  4. Genereer het bron plaat ontwerp, de picklijsten-bestanden en het Pipetteer hulplijn bestand. Klik op picklijsten genereren om toe te staan dat de macro de DNA-picklist. CSV, de T. R.-picklist. CSV en de 384-Wells-Pipetting-Guide. CSV-bestanden genereert van gegevens die zijn verzameld op het bijbehorende blad. Corrigeer desgevraagd de oranje gevulde celwaarden, omdat deze fouten of volumes aangeven die niet door de nano dispenser kunnen worden afgehandeld.
  5. Print de sjabloon (en) uit het blad van de bron plaat . Plasmide namen en minimaal volume om de putjes in te vullen zijn geïndiceerd. Evenzo, transfectie reagens mengsel volumes die volgende moeten worden ingevuld in de volgende putten worden aangegeven als tr en gemarkeerd in het groen.

3. DNA-bron plaat voorbereiding met behulp van de 384-well Pipetteer Guide applicatie

  1. Verdun het opgeslagen DNA plasmide van stap 1.2.14 tot 100 ng/μL met gedestilleerd water.
  2. Kalibreer de 384-well grid naar de afmetingen van de plaat: Open de toepassing 384-well Pipetteer Guide op een Tablet (Figuur 3). Plaats de bron plaat in het raster op het onderste scherm en klik in het kalibratiemenu linksboven op + of - (of gebruik de rode cursor) om de grootte van het raster en de putten te verbeteren of te verkleinen om de groene putjes aan te passen aan de vierhoek putten van de plaat .

Figure 3
Figuur 3 : Gebruik van de 384-well Pipetteer Guide-applicatie. (1) kalibratie van de 384-well grid naar de plaatgrootte; (2)) bevestiging van een universele 3D-printed Plate adapter op de Tablet met behulp van dubbelzijdige tape; (3) plaatsing van de plaat op de adapter; (4) verplaatsing van het rooster om het op de gemonteerde plaat te centreren. (5) vergrendeling van de kalibratie stap. (6) opening van het 384 Wells Pipetteer Guide. CSV-bestand. (7) gezien de bestandslijst zal de aanvraag de verwachte naam van de bron plaat, het reagens (DNA-of transfectiereagens), de concentratie en het volume van de doel putten aangeven, die één voor één zullen worden verlicht. (8) met de linker-en rechter pijltjestoetsen kan de gebruiker de Pipetteer gids volgen om de reagentia eenvoudig te doseren volgens de template (s) van de werkblad macro bron plaat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

  1. Monteer met dubbelzijdige tape de 3D-geprinte plaat adapter op het scherm om bron plaat bewegingen tijdens het doseren te voorkomen. Verplaats indien nodig het gekalibreerde raster met behulp van de knoppen rotatie pijlen en omhoog/omlaag/rechts/links om het raster op het scherm aan te passen aan de plaat positie. Zodra het rooster en de goede maten goed zijn gekalibreerd en zich bevinden, vinkt u het vakje kalibratie vergrendelen aan.
  2. Klik op bestand en open het bestand 384 Wells Pipetteer Guide. CSV . Volg de instructies op het scherm om het aangegeven volume van het aangegeven plasmide bij de aangegeven concentratie in het witte, gemarkeerde goed dat overeenkomt met de juiste Doelbestemming van de verwachte plaat, handmatig te doseren. Gebruik - of + pijlen om terug te gaan of verder in het DNA-doseerproces. Stop met doseren bij het bereiken van de eerste Transfection reagens oplossing om te laden.
  3. Zodra de DNA-bedelingen zijn voltooid, verwijdert u de bron plaat van de adapter. Als er meerdere bron platen moeten worden gevuld, plaatst u een nieuwe bron plaat op de adapter en volgt u de doseer instructies. Zodra de DNA-dispensatie is voltooid, centrifugeer je de DNA-gevulde bron plaat (en) (bij 1.500 x g gedurende 2 minuten) om een goede vloeistof nivellering te garanderen en bubbels te verwijderen die leiden tot onnauwkeurigheid in de ade-gebaseerde transfers.

4. peristaltische vloeistofhandler-gebaseerde 1 μL verdunningsmiddel-dispensatie in de bestemmings plaat

Opmerking: Voer de stappen 4.1-4.5 in een biologische veiligheidskast uit.

  1. Desinfecteer de 1 μL-cassette kop door deze te spuiten met een sproei ontsmettingsmiddel (tabel met materialen) en laat deze oplossing de tiphouder binnengaan. Absorbeer het restant ontsmettingsmiddel op absorberend papier. Monteer de 1 μL-cassette op de peristaltische vloeistof handlerinrichting. Schakel het apparaat in en zorg ervoor dat de instelling van het cassette type correct is (1 μL), evenals het plaat formaat (384 Wells).
  2. Desinfecteer het gehele lumen van de slang: plaats de buis Organizer (die de acht buisjes bij elkaar houdt) in een steriel vat en vul deze met 5 mL 70% alcohol. Gebruik de priming-functie van de peristaltische vloeistof behandelaar, spoel eerst de alcohol in de slang en spoel het vervolgens door 5 mL gedestilleerd water en 5 mL serumvrij medium door te geven (Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium [DMEM] aangevuld met 100 U/mL penicillaire-streptomycine; Van het materiaal), opeenvolgend in hetzelfde vat vullen. Zorg ervoor dat geen van de tip is verstopt door visueel inspecteren van de vloeistof stroom van alle van hen.
  3. Prime de slang met serumvrij medium door het vullen van een nieuw steriel vat met 10 mL voorverwarmde serum-vrij medium en duiken de tube Organizer erin. Druk voor ongeveer 10 sec. op de Prime-knop van de peristaltische vloeistof behandelaar. Nogmaals, zorg ervoor dat er geen tip is verstopt door het visueel inspecteren van de vloeistof stroom van alle van hen.
  4. Vul de plaat met 1 μL verdunningsmiddel. Plaats een steriele 384-put cultuur plaat (bestemming) op de peristaltische vloeistof handler plaat drager en verwijder het deksel.
  5. Voer het voorgekalibreerde programma uit om 1 μL te doseren in elke put van de 384-well plate. De doseer tijd is ongeveer 8 sec. Vervang dan de deksel van de 384-well plate.
    Opmerking: als alternatief kan deze stap handmatig worden afgehandeld, in een veiligheidskast, met behulp van een multichannel micropipet.

5. uitvoering van een enquête om de handmatig uitgebeerde volumes te beheren

Opmerking: Zie afbeelding 4voor meer informatie.

  1. Voer het nanodispenser programma uit, ga naar het tabblad diagnostisch, Vink het vakje bron plaat uit , laad de bron plaat op de plaathouder en vink aan om de plaat in te voeren. Wanneer u hierom wordt gevraagd, selecteert u 384Ldv_aq_b2 om de nano dispenser in te stellen op de waterbuffer Doseer modus en drukt u op OK.
  2. Selecteer enquête in het menu Diversen Klik op starten. Selecteer de vooraf ingevulde putten om te analyseren en klik op de knop Ga naar . Controleer of de gemeten volumes overeenkomen met de verwachte hoeveelheden en zorg ervoor dat er geen putjes zijn geladen met volumes van meer dan 12 μL, omdat dit overdrachten vermijdt.

Figure 4
Figuur 4 : De parameters van de enquête software definiëren. (1) start het nanodispenser programma. (2) Open het tabblad Diagnostische gegevens . (3) Steek de bron plaat door het uittikken van de bron plaat en vervolgens, in. (4) Definieer het type bron plaat in het menu wanneer hierom wordt gevraagd. (5) Selecteer in het vak Diversen enquête in het vervolgkeuzemenu. (6) start het enquête programma door op startente klikken. (7) Selecteer de vooraf ingevulde putjes om te meten. (8) start de analyse door op Go te klikken. (9) zodra de enquête is uitgevoerd, worden de gemeten volumes in de desbetreffende geselecteerde putjes geschreven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

6. ADE-gedreven DNA-dispensatie in de bestemmings plaat

  1. Voer de selectielijst software uit, stel de 384-bron-en doelplaat typen in op respectievelijk 384_LDV en Greiner 384PS_781096 (Figuur 5). Stel het apparaat in op een waterige buffer Doseer modus door 384ldv_aq_b2te selecteren en vink "Optimaliseer overdrachts doorvoer" uit.

Figure 5
Figuur 5 : Prestaties van de op selectielijst gebaseerde bedelingen. (1) start de nanodispenser software. Selecteer op het tabblad Protocol (2) het monster plaat formaat, (3) het type doelplaat en (4) "Optimaliseer overdrachts doorvoer". (5) Selecteer het tabblad picklijst . (6) Klik op importeren en selecteer het juiste *. CSV-bestand (DNA-picklist of T.R.-selectielijst). (7) eenmaal geselecteerd, klik op import. (8) Klik op afspelen en sla het protocol op. (9) Voer een dispensatie simulatie uit door te klikken op simuleren, of (10) start de geprogrammeerde dispensatie door te klikken op uitvoeren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

  1. Selecteer het tabblad "picklijst", klik op importeren, selecteer het bestand DNA-picklist. CSV. Klik op afspelen en sla het protocol op. Klik op simuleren om een simulatie van de geprogrammeerde bedelingen uit te voeren om ervoor te zorgen dat de selectielijst overeenkomt met het verwachte experimentele ontwerp. Eenmaal voltooid, klikt u op sluiten.
  2. Klik op afspelenen vervolgens op uitvoerenom het Doseer programma te starten: wanneer u hierom wordt gevraagd, plaatst u de gevraagde bron plaat (DNA-oplossingen handmatig gevuld) en de bestemmings plaat (verdunningsmiddel gevuld) in de nano dispenser.
    Opmerking: de doseer tijd is ongeveer 5-20 min voor een complete 384-well plaat, afhankelijk van de geselecteerde volumes en het totale aantal bedelingen in het experimentele ontwerp.
  3. U het protocol ook hier pauzeren, omdat het verdunningsmiddel en de met DNA gevulde platen gedurende maximaal 7 dagen kunnen worden verwerkt in droge of bevroren opslag. Voor droge opslag, laat de platen op de Bank drogen op kamertemperatuur en bewaar ze vervolgens op dezelfde manier. Ontdooien en centrifugeren (bij 1.500 x g gedurende 2 min) bevroren opgeslagen platen voor gebruik in een transfectie stap (rubriek 7).
     

7. ADE-gedreven transfectie reagens dispensatie

  1. In een bioveiligheid Cabinet, extemporaal verdund lipopolyplex transfectie reagens in serumvrij medium tot een 1x eindconcentratie. Vortex en breng deze transfectie-reagens mengsel onmiddellijk aan volgens de vooraf gedefinieerde bron plaat (en) die door de macro is ontworpen en met behulp van de toepassing voor geprealibreerde 384-well Pipetteer Guide zoals beschreven in stap 3,4.
    Let op: Centrifugeer de bron plaat niet nadat deze met het reagens is geladen, omdat er na centrifugeren geen transfectie wordt opgemerkt.
  2. Voer het nanodispenser programma uit om een "onderzoek" uit te voeren zoals beschreven in punt 5, om de volumes van alle handmatig gevulde tr -putten van de bron plaat (en) te regelen om afgifte fouten te voorkomen als gevolg van een volume van meer dan 12 μL.
  3. Klik op resetten om de voorbeeld lijst van de DNA-selectie List in de selectielijst-software te wissen en controleer of de apparaatparameters nog steeds zijn ingesteld op waterige buffers en op de gebruikte bron-en bestemmings plaat typen, zoals in stap 6,1.
  4. Klik op importeren en kies het bestand tr-picklist. CSV. Klik op afspelen en sla het protocol op als hierom wordt gevraagd, en (optioneel maar sterk aanbevolen) Voer een simulatie uit van de geprogrammeerde transfectie reagens mengsel bedelingen om een goed ontwerp van de bedelingen te garanderen door te klikken op de Knop simuleren . Eenmaal voltooid, klikt u op sluiten.
  5. Klik op afspelenen vervolgens op de knop uitvoeren om het Doseer programma te starten: plaats, zoals gevraagd, de bron plaat (en) (tr-mengsel-gevuld) en de bestemmings plaat (verdunningsmiddel-en DNA-gevuld) in de nano dispenser.
    Let op: de doseer tijd is minder dan 20 min voor een complete 384-well plate bij afgifte 500 nL van TR mengsel.
  6. Incuberen 15-30 min bij kamertemperatuur na toevoeging van het TR aan het DNA zoals aangegeven door het Protocol van de fabrikant.

8. celdispensatie op basis van peristaltische vloeistof behandelaar

  1. Bereid de peristaltische vloeistof handler voor het doseren van cellen. Desinfecteer een cassette hoofd van 10 μL door het te spuiten met Aniospray Surf 29 desinfecterende middelen en het restant op papier te absorberen. Monteer de cassette op het apparaat van de peristaltische vloeistof handler, wijzig de cassette type-instelling in 10 μL en zorg ervoor dat het plaat formaat is ingesteld op 384 Wells.
  2. Desinfecteer de cassette slang van 10 μL zoals eerder beschreven in stap 4,2. Duik de tube Organizer in een steriel vat en spoel de slang met 5 mL 70% alcohol, vervolgens met 5 mL gedistilleerd water en ten slotte met 5 mL serumvrij medium, achtereenvolgens gevuld in hetzelfde vat en tot elke buis leeg is.
  3. Bereid de celsuspensie uit om te doseren. Was vanuit een confluente HeLa Cell B10-Culture Dish de cellen 1x met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en dissocier vervolgens de cellen met trypsine/EDTA gedurende 5 minuten bij 37 °C.
  4. Controleer de celdissociatie onder een microscoop en stop de trypsine/EDTA-actie door 10 mL volledig medium toe te voegen (DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum en 100 U/mL penicillaire-streptomycine; Zie de materiaallijst) in de kweek schaal. Oogst cellen in een buis van 50 mL en Tel de cellen onder de microscoop met behulp van een Malassez-cel of een automatische celteller.
  5. Bereid ten minste 25 mL HeLa celsuspensie bij een concentratie van 37.500 cellen/mL in volledig medium (d.w.z. 1.500 cellen/40 μL) voor een volledige 384-goed plaat, om te zorgen voor het primen van de buis en 40 μL/put-dispensatie.
  6. Om de cellen te doseren, vult u een nieuw steriel vat met de bereide celsuspensie en roer het om sedimentatie te voorkomen die leidt tot onnauwkeurigheid in de celdichtheid van de dispensatie. Plaats de tube Organizer in deze oplossing en druk op de Prime -knop totdat de celsuspensie begint te spoelen vanaf de doseer kop. Zorg ervoor dat geen van de tip verstopt is door de vloeistofstroom van alle van hen visueel te inspecteren en ervoor te zorgen dat elke buis is geladen met celsuspensie.
  7. Laad het DNA en de TR-gevulde 384-put bestemmings plaat op de peristaltische vloeistof handler plaat drager en verwijder het deksel. Voer het voorgekalibreerde programma uit om 40 μL van de celsuspensie op de volledige 384-goed plaat te doseren (d.w.z. 1.500 cellen/goed). De doseer tijd is ongeveer 8 sec. Vervang de deksel van de 384-well plate.
    Opmerking: als alternatief kan de celsuspensie van 40 μL handmatig worden afgeleverd met behulp van een multikanaalmicropipet.

9. aangepaste biologische assay (Cell transfectie efficiency monitoring)

Opmerking: Volg de experimentele instellingen en intentie van het experiment, gebruik de vereiste methoden voor luminescentie, fluorescentie, High-content screening en omgekeerde transcriptie kwantitatieve polymerase kettingreactie (RT-qPCR). In deze sectie van het protocol wordt de efficiëntie van de celtransfectie geëvalueerd door geautomatiseerde fluorescentiemicroscopie en beeldanalyse.

  1. Inbroed de plaat bij 37 °C met 5% CO2 in een met water verzadigde atmosfeer en tot een juiste proteïne-expressie.
    Opmerking: hier wordt een incubatietijd van 48 uur gebruikt voor HeLa-cellen om de transfectie-efficiëntie te bewaken met behulp van tdTomato-en mVenus-uitdrukken plasmiden.
  2. Verwijder het kweekmedium 48 h na transfectie door de plaat om te inverteren, Voeg 30 μL/goed van 10% formaline toe met behulp van de peristaltische vloeistof behandelaar (10 μL cassette) en incuberen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Verwijder de formaline door de plaat te inverteren; vervolgens incuberen de cellen 15 min bij kamertemperatuur met 0,1 ng/mL Hoechst verdund in 1x PBS-oplossing.
  4. Was de cellen 3x gedurende 15 minuten met 80 μL 1x PBS, aangepast aan pH = 8 om het hoge fluorescentie signaal te herstellen dat verloren gaat door de 6,9 pH van de incubatie stap van de formaline-oplossing.
  5. Met behulp van een geautomatiseerde fluorescerende Microscoop, het verwerven van beelden van twee of drie fluorescerende kanalen (Hoechst, tdtomato, en mvenus) opeenvolgend met 10x doelstellingen en een juiste emissie filter set (4 ′, 6-diamidino-2-fenylindole [DAPI], dsred, en fluoresceïne respectievelijk isothiocyanaat [FITC]).
  6. Om de transfectie-efficiëntie te evalueren, gebruikt u Image Analysis software om de transfectie-efficiëntie te bepalen met behulp van script analyse op basis van kernen-kleuring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

fIn order om te bepalen of de ade-technologie kan worden gebruikt voor een geautomatiseerd reverse transfectie-protocol, bewaken we de efficiëntie van de celtransfectie door fluorescentiemicroscopie, met behulp van een rood fluorescerende tdtomato die plasmide uitdrukt. Eerst gericht op het bepalen van de beste transfectie parameters, verschillende verdunnings vloeistofvolumes en totale hoeveelheden DNA werden Kruis getest. Het volume van het verdunningsmiddel werd gebruikt om de DNA-druppeltjes, eenmaal afgeleverd, over de putjes te verspreiden om inhomogene Transfectie te omzeilen die werd waargenomen bij voorbereidende experimenten (d.w.z. alleen in het midden van de putjes). Zoals weergegeven in Figuur 6a, was de transfectie van HeLa-cellen met behulp van lipopolyplex reagens20 succesvol. Interessant is dat, door het gebruik van een 1 μL verdunningsvolume, DNA-hoeveelheden variërend van 5 tot 30 ng dezelfde efficiëntie vertoonden en tot 90% celtransfectie vergeleken met hogere bedragen, zoals 50 en 100 ng, waarvoor een abrupte afname werd waargenomen. We probeerden verschillende verdunnings volumes variërend van 15 nL tot 4 μL en identificeerden 1 μL als de beste conditie, zoals hier significant geïllustreerd met behulp van 30 ng van DNA.

Figure 6
Figuur 6 : Representatieve resultaten. A) het effect van de DNA-hoeveelheid en het verdunningsvolume op de transfectie-efficiëntie. HeLa-cellen werden met behulp van het nanodispenser apparaat en lipopolyplex omgekeerd met behulp van een 1x-concentratie, zoals aanbevolen door de fabrikant. Van het aanbevolen verdunningsmiddel (serumvrij medium), werd 15-4000 nL gebruikt met 10-100 ng hoeveelheden rood-fluorescerende-uitdrukken plasmide (tdTomato). Transfectie-efficiëntie werd vastgesteld 48 h post-transfectie met behulp van image-based analyse software. De resultaten worden uitgedrukt als een percentage van getranssinfecteerde cellen voor de toenemende DNA-hoeveelheid, en het verdunningsvolume toont de optimale omstandigheden: 30 ng van het totale DNA met een toenemend verdunningsmiddel volume en 1 μL verdunningsmiddel met toenemende DNA-bedragen. De foutbalken vertegenwoordigen de SEM met n ≥ 4. Voor statistische analyse werden twee richtings-ANOVA en Bonferroni-post-test gebruikt. *p < 0,05 in vergelijking met andere stippen. B) stabiliteit van de bereide DNA-platen. Verdunningsmiddel (1 μL) werd afgeleverd met behulp van de peristaltische vloeistof behandelaar en 30 ng van het DNA werd afgeleverd en onmiddellijk getransffecteerd met behulp van een lipopolyplex-reagens dat door ADE (controle) werd afgeleverd of opgeslagen bij kamertemperatuur, eenmaal droog of bevroren bij-20 °C. Op dag 0, 2 of 7 werd droog DNA gerehydrateerd met 1 μL verdunningsmiddel dat werd afgeleverd met behulp van de peristaltische vloeistof behandelaar, en bevroren platen werden ontdooid bij kamertemperatuur en gecentrifugeerd (bij 1.500 x g gedurende 2 min). Vervolgens werden cellen met behulp van de peristaltische vloeistof behandelaar volgens het beschreven protocol geseeid. De foutbalken vertegenwoordigen de SEM met n ≥ 3. Voor statistische analyse werden twee richtings-ANOVA en Bonferroni-post-test gebruikt. NS = niet significant verschillend. C) de efficiëntie van plasmide DNA-cotransfectie. HeLa-cellen werden met 30 ng van mVenus-en tdTomato-uitdrukken plasmide geladen in twee afzonderlijke bron putten (met een 1,7-verhouding van mVenus over tdTomato om hun relatieve fluorescentie-uitgang te bepalen). De transfectie-efficiëntie werd vergeleken met 48 h post-transfectie met behulp van beeld-gebaseerde analyse software en werden uitgedrukt als een percentage van getransfunteerde cellen en een percentage van door de transport geperfectioneerde cellen binnen de getransffecteerde populatie. Het percentage van de samengevlagelde cellen werd bepaald door de berekening van het groen-fluorescentie-uitdrukken van het celgetal in de rode fluorescerende populatie cellen. De foutbalken vertegenwoordigen de SEM met n ≥ 3. Voor statistische analyse werden twee richtings-ANOVA en Bonferroni-post-test gebruikt. NS = niet significant verschillend. D) representatieve velden van fluorescentiemicroscopie van de afbeelding die in deel C wordt weergegeven met behulp van drie fluorescerende kanalen (Hoechst, Tdtomato en mvenus) die opeenvolgend zijn verworven door een beeldvormings platform (tabel met materialen ), met behulp van 10x-doelstellingen en een deugdelijke emissie Filterset (respectievelijk DAPI, dsRed en FITC). Dit cijfer is gewijzigd van Colin et al.1. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Om de doorvoer van dit Protocol verder te verbeteren, onderzochten we vervolgens of een bron plaat opslag met een voorgevuld DNA-en verdunnings oplossing in een later stadium kon worden opgeslagen en gebruikt. Twee manieren om DNA efficiënt op te slaan werden getest, namelijk het droog opbergen van de plaat door deze droog te laten drogen op de Bank of bevroren opslag (bij-20 °C). Beide opslagmethoden leidde niet tot significant andere resultaten dan de vers gedoseerde DNA-oplossing die tot 7 dagen bewaard werd (Figuur 6b), en beide methoden maakten het mogelijk om transfectie uit opgeslagen DNA-voorgevulde platen te voeren, zoals een bank van Plasmiden.

Ten slotte, omdat plasmide transfectie meestal gebeurt met behulp van ten minste twee verschillende plasmiden, onderzochten we vervolgens het DNA-multiplexing vermogen van het hier gepresenteerde protocol aan de hand van de best geïdentificeerde omstandigheden (1 μL oplosmiddel en 30 ng van DNA). De eerder gebruikte tdTomato rood-fluorescerende-eiwit-uitdrukken plasmide werd aangepast om mVenus, een fel geel fluorescerende eiwit, te uiten en beiden werden vervolgens gebruikt in cotransfectie pogingen. Rood-of groen-fluorescerende-positieve celanalyse (figuur 6C) toonde aan dat de transfectie-efficiëntie ongeveer 80% bedroeg; in de rode populatie werd echter ook bijna 100% van de cellen met de mVenus-uitverwoorde plasmide geanalyseerd, zoals te zien is in de representatieve op software gebaseerde beeldanalyse van figuur 6d.

Aanvullend Figuur 1: diagram met een geschikte Doseer hoogte voor de druppel om de bodem van de put aan te raken om te voorkomen dat deze op de doseer punt wordt vastgehouden. Aan de linkerkant zorgen de juiste instellingen ervoor dat de druppel zich verspreidt over het oppervlak, waardoor het vasthouden van de doseer tips wordt vermeden. Aan de rechterkant, slechte instellingen leiden tot druppel retentie die kan worden waargenomen tijdens de hoofd beweging naar de volgende RAW. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het opzetten en optimaliseren van een nauwkeurige hoge doorvoer transfectie methode voor een bepaalde cellijn vereisen wetenschappers om een aantal belangrijke parameters beschreven in deze sectie te volgen. We moedigen ten zeerste aan om te beginnen met de aanbevolen waarden in het Protocol, omdat deze instellingen die zijn geoptimaliseerd voor HeLa-cellen ook efficiënt bleken te zijn voor HEK-cellen. Aangezien de beste parameters echter afhankelijk kunnen zijn van de cellijnen en transfectie reagentia, kunnen optimale condities worden gedefinieerd door het aantal cellen, het volume van het verdunningsmiddel, het totale DNA-bedrag en het transfectie reagens, de aard, de concentratie of zelfs het volume te variëren, net als de bij de optimalisering van dit protocol voor HeLa-cellen1.

Het algemene protocol dat hier wordt gepresenteerd is ontwikkeld en verder geoptimaliseerd om celtransfectie mogelijk te maken, zelfs door beginners in het veld. Om dit doel te bereiken, zijn belangrijke tools om het protocol zo eenvoudig mogelijk te maken en menselijke fouten te vermijden ontwikkeld: een gebruiksvriendelijke spreadsheet macro om eenvoudig het experiment en een Tablet applicatie te ontwerpen om de gebruiker te begeleiden om de bron goed te vullen plaat (en).

Om de betrouwbaarheid van het protocol te waarborgen, moeten dus slechts een paar kritische stappen worden gecontroleerd: i) een goed experimenteel ontwerp; II) de juiste peristaltische bedelingen van de klassieke peristaltische vloeistof behandelaar; III) de juiste DNA-en transfectie-reagens akoestische bedelingen; IV) het vermijden van de centrifugeren van de bron plaat vóór de transfectie reagens bedeling als dat leek te belemmeren transfectie. Het volgen van deze paar aanbevelingen zou zorgen voor de efficiënte transfectie van de cellen.

Goed experimenteel ontwerp

De experimentele Setup is gebruiksvriendelijk gemaakt door de ontwikkeling van de macro-spreadsheet die alleen moet worden gevuld met de verwachte DNA-plasmiden naam, de gewenste hoeveelheid en enkele belangrijke parameterwaarden. Eenmaal gevuld analyseert de macro eerst de ingevoerde parameters om mogelijke fouten te detecteren, zoals geschikte minimale en maximale volumes die zijn ingevoerd voor de bron putten en het transfectie-reagens dispensatie volume. Bovendien, op basis van de DNA-concentraties die zijn ingevoerd in elk van de vier mogelijke rijen en de plasmide hoeveelheid die in de onderliggende velden is ingevoerd, verifieert de macro of de verwachte volumes die moeten worden gedoseerd, veelvouden van 2,5 nL zijn (volume van de druppels die door de Nano dispenser). Zodra een controle op fouten is uitgevoerd, berekent de macro de totale hoeveelheid van elk DNA-monster dat moet worden afgeleverd en ontwerpt vervolgens de sjabloon voor de bron plaat (door de DNA-namen in alfabetische volgorde te sorteren). De volumes die in de bron plaat (en) worden aangegeven, houden rekening met de werkvolumes die in een bron goed worden verwacht (berekend op basis van de minimale en maximale volume waarden die in het sjabloon blad zijn ingevuld). Alle verwachte DNA-bedelingen in elk putje worden vervolgens op het DNA-selectielijst blad geschreven. De lijst met DNA-getransfunde putten wordt vervolgens gebruikt om het TR-selectielijst blad te schrijven met behulp van het transfectie-reagensvolume dat op het sjabloon blad wordt aangegeven. De volumes die op het bron plaat blad worden berekend, worden vervolgens overgebracht naar het 384-well Pipetteer Guide Sheet. Gegevens uit de DNA-picklist, tr-picklist en 384-well Pipetteer Guide worden vervolgens gebruikt om de corresponderende bestanden in de *. CSV formaat te genereren.

Juiste DNA-en TR-dispensatie op de bron plaat

Als het doseren op een 384-bron plaat en, meer in het bijzonder, het lokaliseren van het doel goed kan fouten te bevorderen en zijn verder tijdrovend, hebben we een speciale Tablet-gebaseerde applicatie ontwikkeld vergelijkbaar met iPipet21. In tegenstelling tot iPipet, kan degene die hier wordt beschreven worden gebruikt met Android (alleen Android-versie 4,4 en omhoog wordt ondersteund). Op basis van de 384-Wells-Pipetting-Guide. CSV-bestand gegenereerd door de macro-werkblad, het helpt de gebruiker in het totale doseerproces. Terwijl het gebruik ervan voor een paar bedelingen niet de moeite waard is, kan het interessant zijn om tijd te besparen en fouten te voorkomen als een groot aantal DNA-en TR-bedelingen wordt verwacht. Het CSV-bestand moet goed, plaat, naam, concentratie en volume-informatie bevatten. Deze toepassing kan vervolgens worden gebruikt voor andere toepassingen, zoals doseeroplossingen (reagentia, kleurstof, Compound, enz.) in het doel goed, volgens een gebruiker dedicated CSV-bestand. Bovendien kan de gebruiker een hele rij of lijn verlichten door de relevante informatie in de kolom doelbron in te voeren met behulp van deze verwachte indeling: Row_1 (naar 24) of Line_A (naar P).

Problemen met de efficiëntie van slechte celtransfectie oplossen

Verschillende parameters die hieronder worden beschreven, kunnen de celtransfectie in het beschreven ADE-protocol nadelig beïnvloeden en moeten afzonderlijk worden gecontroleerd en omzeild in geval van efficiëntie problemen.

Een van de eerste belangrijke parameters voor transfectie is de kwaliteit van de cellen en de dichtheid die tijdens het zaaien wordt gebruikt. Hoewel elk celtype verschillende parameters nodig heeft, moeten sommige van hen worden gerespecteerd om een succesvolle Transfectie te garanderen. Allereerst moet de celsuspensie voorbereid worden van een subconfluente plaat om celbelasting vóór Transfectie te voorkomen, en ze mogen niet te lang op de bank liggen (maximaal 2 uur). Ten tweede moet de zaai dichtheid van de cellen om twee redenen laag genoeg zijn: om cellulaire contacten te vermijden en een hoog celoppervlak te bevorderen na verspreiding, maar ook omdat actief verdelen van cellen beter het buitenlands nucleïnezuur22,23innemen. Helaas varieert de optimale celdichtheid voor Transfectie afhankelijk van de celtypen en de transfectie technologie en moet voor elke cellijn worden bepaald. Dit zijn cruciale parameters om een doeltreffende Transfectie te waarborgen.

Een andere belangrijke parameter die transfectie efficiëntie kan moduleren is de cel passage nummer24. Inderdaad, cellen in cultuur worden voortdurend onderworpen aan evolutie als gevolg van concurrentie en natuurlijke selectie. Het is bekend dat differentiële genexpressie tussen lage en hoge celpassage in de meeste cellijnen wordt verwacht als gevolg van dedifferentiatie naarmate het passage nummer toeneemt. Na dit verschijnsel kan de efficiëntie van transfectie ook worden aangetast. Echter, passage-gerelateerde effecten zijn aangetoond dat sterk afhankelijk zijn van de cellijn en de voorwaarden van de cultuur. Op de top van dat, wat wordt beschouwd als een "hoge" passage niveau varieert van de ene cel lijn naar de andere. Dit betekent dat het nummerbereik van de passage waaronder een reeks experimenten betrouwbaar kan worden uitgevoerd, voor elke gegeven cellijn moet worden bepaald.

Een andere parameter die de moeilijkheid bij het bepalen van de beste voorwaarden voor Transfectie verbetert, is dat cultuurmedium samenstelling speelt ook een cruciale rol sinds de aanwezigheid van serum en/of antibiotica transfectie efficiëntie moduleren. Inderdaad, de meeste commerciële protocollen bevelen het gebruik van serumvrij medium aan tijdens de transfectie stap om de efficiëntie te verbeteren of problemen met slechte efficiëntie te omzeilen3,25,26,27. Echter, deze parameter is inderdaad complexer te vatten zoals is aangetoond dat, voor een bepaalde cellijn, vroege versus late passages kunnen verbeteren of lagere efficiëntie afhankelijk van de aanwezigheid van het serum of afwezigheid in het cultuurmedium28. Andere onderzoekers preconize het gebruik van antibiotica-vrij medium voor de passage vóór de transfectie bij het kweken van cellen, om te verkrijgen van hoge kwaliteit cellen voor Transfectie29. Tot slot, bij het optimaliseren van de transfectie voorwaarden voor een bepaald celtype, moeten elk van deze parameters worden getest: vroege of late passage cellen en het gebruik van medium met of zonder serum tijdens de laatste passage vóór het oogsten van de cellen en/of tijdens de transfectie stap zelf.

Tijdens de optimalisatie van het hier gepresenteerde protocol werden twee soorten reagens gebruikt: een liposomaal reagens dat liposomen-achtige complexen en lipopolyplex-reagens vormt, een niet-liposomaal polymere verbinding1. Terwijl we jarenlang succes hadden met het handmatig transfecteren van HeLa-cellen met de eerste, werd een slechte transfectie-efficiëntie waargenomen in het huidige geautomatiseerde protocol. Dit was waarschijnlijk te wijten aan een vereiste grondig stap bij het mengen van DNA met transfectie reagens dat niet kan worden uitgevoerd in de 384-well plate formaat. Het lipopolyplex heeft een dergelijke stap niet nodig en leidde daarom tot hogere transfectie-efficiëntie in alle geteste instellingen. Hoewel dit niet is bevestigd in de huidige studie, zal het vermijden van transfectie reagentia die een fysieke Meng stap vereisen, zoals pipetteren of grondig, waarschijnlijk tot betere resultaten leiden.

We bevelen ook het gebruik van een transfectie-reagens aan dat compatibel is met omgekeerde transfectie, omdat het gepresenteerde protocol is gebaseerd op een omgekeerde transfectie. Sommige cellen zijn bekend dat ze moeilijk te transfect zijn en sommige speciale chemische verbindingen zijn ontwikkeld om hogere transfectie-efficiëntie te bevorderen30,31. Als het gericht is op het transfecteren van moeilijk-naar-transfect cellen, raden we aan om de gegeven cel-of cellenregelspecifieke transfectie reagentia te testen, ervan uitgaande dat omgekeerde transfectie haalbaar is met deze.

Verschillende parameters die in de onderliggende alinea's zijn beschreven, kunnen een impact hebben en het ADE-doseerproces enigszins aantasten, wat het uiteindelijke experiment mogelijk verpest.

De nano dispenser werd ontwikkeld om 2,5 nL druppels te doseren uit bron putten gevuld met 3-12 μL waterige buffer (d.w.z. 9 μL werkvolume). Het nanodispenser apparaat dat in deze studie wordt gebruikt, integreert een dynamische Vloeistofanalyse technologie voor het bepalen van de vloeistof samenstelling en de vloeistof hoogte in de bron plaat om het vermogen te beheersen dat nodig is om 2,5 nL druppels te werpen19. Tijdens het vullen van de bron plaat handmatig of met behulp van een klassieke peristaltische vloeistof handler, de volumes zijn meestal niet zo nauwkeurig zijn dan die bepaald door de dynamische Vloeistofanalyse. Dit is een cruciaal punt om rekening mee te houden als het apparaat niet kan afzien van bron putten die met meer dan 12 μL zijn geladen. Hun aanwezigheid zou dus het experiment in gevaar brengen. Natuurlijk kan een lijst van de uitgevoerde bedelingen aan het einde van het programma worden gegenereerd, maar dit vereist dat de gebruiker volumes aanpast en een programma uitvoert om alleen de gemiste bedelingen te herstellen. Om deze meningsverschillen te vermijden, is het aanbevolen om een "onderzoek" uit te voeren zodra de DNA-plasmiden zijn geladen om het verwachte volume in elk betrokken gebied goed te controleren.

Een cruciale parameter voor het uitwerpen van druppel druppeltjes is de variatie in vloeistof oppervlaktespanning17,32. Water-DNA-oplossingen staan bekend om hun viscositeit; Dit kan het doseerproces door ADE aantasten. Terwijl de fysische parameters niet werden bepaald in onze vorige studie1, resulteerden hogere DNA-oplossing concentraties in de bron plaat in een lagere transfectie-efficiëntie, zelfs voor dezelfde totale hoeveelheid DNA die werd afgeleverd, waarschijnlijk vanwege deze Fenomeen. Daarom raden we aan een plasmide verdunning van 100 ng/μL te gebruiken voor de beste resultaten, hoewel andere concentraties kunnen worden getest op gebruiksgemak. Om een goede ADE met de door de gebruiker benodigde DNA-concentratie te garanderen, kan een kleurstof aan de oplossing worden toegevoegd om de druppel uitwerpen in de putten te bewaken of, nog beter, op het deksel van het plaatje. Als eerste doel van het gepresenteerde protocol was om een hoge doorvoer te krijgen, goedkope op minicolumn gebaseerde plasmide DNA-minipreparatiekits die compatibel zijn met plaat-gebaseerde plasmide-zuiverings protocollen met hoge doorvoer werden gebruikt. Overwegende dat het tijdens de uitvoering van het experiment naar behoren heeft gewerkt, in geval van een lage efficiëntie en een slechte cellevens vatbaarheid na transfectie, wordt aanbevolen om gebruik te maken van hoogwaardige DNA-zuiverings methoden zoals MIDI-of Maxi-preparaten of zelfs endotoxine vrij in de handel verkrijgbare kits die zorgen voor een betere DNA-zuiverheid en lagere toxiciteit voor de cellen33.

Problemen oplossen inhomogene celtransfectie over het goed oppervlak

Eerste pogingen bij het opzetten van het protocol leidde tot celtransfectie alleen in het midden van de putten, waar de druppels werden verzonden door ADE. Sterker nog, we merkten dat het DNA en het transfectie mengsel zich niet over het oppervlak verspreidde en droog was vóór de toevoeging van de cel door de lage volumes die werden afgeleverd (amper 500 nL). Om dit probleem te omzeilen, werd een doseerstap voor het verdunningsmiddel toegevoegd om het DNA/TR-mengsel over de putjes te spreiden voordat de celtoevoeging werd toegestaan. Dit resulteerde in een homogene celtransfectie in de put. Wanneer de reproductie van het experiment en het DNA/TR-mengsel zich dus niet over de putjes verspreidt, kan het volume van het verdunningsmiddel worden aangepast aan de behoeften van de gebruiker.

Aangezien de akoestische vloeistof behandelaar volumes in het nanoliter-bereik kan distribueren, heeft de beschreven methode mogelijk geen technische beperkingen. We merkten echter op dat waterige-oplossing gevulde putten onderhevig zijn aan verdamping, wat een beperking zou kunnen betekenen. Als de exacte volumes die moeten worden afgeleverd, worden verlaagd door deze verdamping, wordt de nano dosering niet naar het verwachte uiteinde uitgevoerd. In dit geval wordt een foutrapport gegenereerd door de nano dispenser. Om dit probleem te omzeilen, gebruikt u hogere volumes dan verwacht tijdens een verblijf in het acceptabele bovenste bereik (inderdaad, lager dan 12 μL). Als de verdamping echter leidt tot een verslechtering van sommige bedelingen, wordt een foutrapport gegenereerd door de nano dispenser. Dit bestand kan worden gebruikt om de bron plaat te vullen met een nieuw reagens dat moet worden afgeleverd op de betreffende bestemmings putten. Dit doen in een kort tijdsinterval leek de transfectie-efficiëntie niet nadelig te beïnvloeden.

Het hier beschreven protocol is de eerste die een dergelijke doorvoer voor onafhankelijke DNA-plasmide transfecties verkrijgt. Beste tarieven bereikt vóór waren voor 288 verschillende omstandigheden die vereist zeer gespecialiseerde vaardigheden gelijktijdig worden uitgevoerd15. Dit, afgezien van de hoge doorvoer, heeft het huidige protocol andere belangrijke voordelen, omdat het algehele proces is geoptimaliseerd om het gebruik ervan door niet-specialisten en tools te laten zijn ontwikkeld om fouten te voorkomen, namelijk i) een speciale spreadsheet macro waarmee het eenvoudige ontwerp van het experimentele template, II) het automatisch genereren van de corresponderende DNA en transfectie reagens bron plaat (en) Template door deze macro, III) het genereren van twee kant-en-klare bestanden om de softwaregestuurde bedelingen van DNA te beheersen en transfectie reagens door het Nano dispenser-apparaat, en IV) de export van een "384-well Pipetteer Guide"-bestand dat overeenkomt met de bron plaat (en) die is ontworpen, om te worden gebruikt door een speciale Tablet-gebaseerde applicatie, ook ontwikkeld om menselijke fouten te voorkomen, terwijl afgifte in de 384-bron plaat (en).

Toekomstige verbeteringen van het Protocol

Om de doorvoer en reproduceerbaarheid te verbeteren, kan de bron plaat gevuld met plasmiden op 4 °C worden bewaard of zoals gebruikelijk worden bevroren voor DNA-voorraadoplossingen. Bovendien toonden we aan dat de vooraf geladen bestemmings plaat die met DNA is gevuld, ook gedurende ten minste 7 dagen droog of bevroren kan worden opgeslagen voordat het transfectie-reagens en de cellen worden toegevoegd, wat leidt tot de verbetering van de algehele doorvoer en het gemak van het protocol. DNA-instandhouding van meer dan 4 jaar is eerder gerapporteerd met behulp van geoptimaliseerde media34 en moet daarom in het kader van dit protocol worden getest, omdat het een stap verder zal zetten, waardoor de lange termijn opslag van platen die vooraf zijn gevuld met banken van plasmiden en klaar voor gebruik in Transfectie experimenten.

We toonden eerder aan dat de geïdentificeerde optimale transfectie omstandigheden konden worden overgebracht naar grootschalige experimenten, van 96-tot 10 cm cultuur gerechten1, door het berekenen van de DNA-hoeveelheid, transfectie reagensvolume, en celdichtheid die worden gebruikt op basis van het geoptimaliseerde 384-well plate-protocol. Aangezien 1536-put-plaat bedeling beheersbaar is door de nano dispenser, kan het protocol ook op een lagere schaal worden uitgevoerd, waardoor de doorvoer ervan wordt vergroot. Een belangrijke beperking om dit formaat te bereiken, is echter de mogelijkheid om cellen af te wijzen en de uiteindelijke uitlezen in een zo geminiaturiseerd formaat te beheren. De afgifte van cellen door ADE is al met succes uitgevoerd in de 1536-well plate formaat35 met behulp van een oplossing van neutrale dichtheid die voorkomen celseeding en zorgde voor gelijke celdichtheid in de tijd. Op basis van het hier gebruikte celnummer en de oppervlakteverhouding van 384 (0,056 cm2) versus 1536 wells (0,025 cm2), zouden 500-650 cellen in dit laatste formaat worden afgeleverd. Een dergelijke celdispensatie nummerbereik is zeer betrouwbaar gebleken als 14%-18% geconcentreerde oplossing van neutrale dichtheid wordt gebruikt. Onder deze instellingen, 100 nL van celsuspensie zou worden verdeeld over 1536 Wells. Met een werkoplossing van 5-8 μL in dergelijke putten zou het toevoegen van 5-8 μL kweekmedium met behulp van klassieke peristaltische vloeistof behandellers de antiseeding oplossing tot minder dan 0,3% verdunnen, waardoor de juiste celseeding mogelijk wordt. Transfecterende cellen op zo'n lage schaal lijken dus technisch mogelijk; het effect van de residuele concentratie van de neutrale-dichtheids oplossing op de transfectie-efficiëntie moet echter nog worden bepaald door verder werk.

Met behulp van bron plaat typen die hogere werkvolumes dragen om cellen af te geven, zoals 384-boorput polypropyleen bron platen met een werkend volume van 45 μL, zou de 100 nL celoplossingbedelingen van slechts vier bron putten voor een algemene 1536-boorput plaat. Bovendien kunnen nieuwe nano dispensers druppels van 25 nL in plaats van de 2,5 nL die in dit protocol werd gebruikt, afleveren. Deze druppelgrootte verdeelt vervolgens 10-voudige de doseer tijd, maar impliceert dat er meerdere volumes van 25 nL moeten worden gebruikt, die echter compatibel blijven met de verschillende volumes die in het hier gepresenteerde protocol worden afgeleverd.

Op basis van deze nieuwste werken en technologische verbeteringen, kan een verdere doseerstap voor het realiseren van een 1536-well plate transfectie eenvoudig aan het huidige protocol worden toegevoegd. Het bereiken van dergelijke miniaturisaties is echter alleen de moeite waard als de bioassay gelijktijdig haalbaar is in een dergelijk geminiaturiseerd formaat.

Kortom, we ontwikkelden een eenvoudige, hoge doorvoer en nauwkeurige transfectie methode met verschillende voordelen als gevolg van miniaturisatie: (1) verlaging van de kosten van transfectie reagens; 2) vermindering van het afval van DNA-preparaten; (3) ervoor zorgen dat zelfs beginners met succes celtransfectie kunnen uitvoeren. Inderdaad, het vereist slechts een paar eenvoudige handmatige stappen, namelijk het verdunen van DNA naar 100 ng/μL, het doseren op een bron plaat (een plasmide/well) volgens de spreadsheet gegenereerde sjabloon en het gebruik van de Tablet-gebaseerde Pipetteer gids, en het voorbereiden van de celsuspensie voor het zaaien. De op ADE gebaseerde nano dispenser is belast met de tijdrovende en foutgevoelige dosis afgifte en de multiplexing van de plasmiden, volgens de gegeven sjabloon van het experiment.

Bovendien, terwijl dit protocol de meeste elementaire biologische intenties van klassieke transfectie experimenten zou kunnen garanderen, zou het ook nieuwe manieren kunnen openen voor array-gebaseerde experimenten. Bijvoorbeeld, het uitdrukken of kloppen van elk humaan eiwit coderings-gen uit de Human ORFeome Collection36 of Crispr Cas9 library-based benaderingen37, zou minder dan 24 uur vergen op een speciaal geautomatiseerd platform (53 x 384- in plaats van 2-3 dagen van menselijk werk, uitgaande van het gebruik van een met DNA voorgeladen plaat Bank. Vanwege de hoge efficiëntie en prestaties met hoge doorvoer kan het hier gepresenteerde protocol zelfs nieuwe, niet-gepoolde benaderingen voor CRISPR Cas9-gebaseerde studies met gRNA libraries/CRISPR-Cas9-uitdrukken plasmiden bereiken. Inderdaad, milde cellulaire fenotype veranderingen, die momenteel niet de vereiste cel-Sorteer stap toestaan, zou eindelijk beheersbaar zijn, omdat één goed één klopte gen zou vertegenwoordigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs onthulde een ontvangst van de volgende financiële steun voor het onderzoek, het auteurschap en/of de publicatie van dit artikel: INSERM, Universiteit van Lille, Lille Pasteur Institute, Conseil Régional du Nord, PRIM-HCV1 en 2 (Pôle de recherche Interdisciplinaire sur le Médicament), Agence nationale de la recherche (ANR-10-EQPX-04-01), de Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) en de Europese Gemeenschap (ERC-STG INTRACELLTB n ° 260901). De auteurs willen Dr. S. Moureu, Dr. B. Villemagne, Dr. R. Ferru-Clément en Dr. H. Groult bedanken voor hun kritische beoordeling en correcties van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384LDV Microplate Labcyte LP-0200
384-well Microplate μClear Black Greiner 781906
Ampicilin Sigma A9393-5G Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector
Android Tablet Samsung Galaxy Note 8 used to guide the user while the source plate manual dispense
Aniospray Surf 29 Anios 2421073 disinfectant to clean the MicroFlo head
Columbus software Perkin Elmer image analysis software
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10566032 cell culture medium
Echo Cherry Pick 1.5.3 software Labcyte Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software
Echo550 Labcyte ADE-based dispenser
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 to add in cell culture medium
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L to fix cell
HeLa cells ATCC HeLa (ATCC® CCL-2™)
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570 10 mg/mL Solution in Water
INCell Analyzer 6000 GE Healthcare 29043323 automated laser-based confocal imaging platform
LB medium Thermoischer Scientific
LB Broth Base (Lennox L Broth Base)®, powder		 12780052 culture medium for bacteria growth
Lysis Buffer (A2)  Macherey-Nagel 740912.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
MicroFlo 10µL cassette Biotek Instruments Inc 7170013 to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo 1μL cassette Biotek Instruments Inc 7170012 to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo Dispenser Biotek Instruments Inc 7171000 peristaltic pump-based liquid handler device
Microvolume spectrophotometer Denovix DS-11 Spectrophotometer Measure the DNA concentration of samples
mVenus plasmid mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus
Neutralization Buffer (A3)  Macherey-Nagel 740913.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
NucleoSpin Plasmid kit Macherey-Nagel 740588.50 used to prepare plasmid from bacterial culture
Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
optional Wash bufferWash Buffer (A4) Macherey-Nagel 740914.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
orbital shaker  incubated large capacity shaker 444-7084 Used to grow bacteria under gentle agitation and 37°C
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 10,000 U/mL
Phosphate-Buffered Saline Thermo Fisher Scientific 10010001
Plasmid mini-columns Macherey-Nagel 740499.250 Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture
Resuspension Buffer (A1)  Macherey-Nagel 740911.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
RNAse A Macherey-Nagel 740505 Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
tdTomato-N1 plasmid Addgene Plasmid #54642 Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato 
TransIT-X2 Dynamic Delivery System Mirus Bio MIR 6000
Wash Buffer (AW) Macherey-Nagel 740916.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
3D printer Creality CR10S used to print the plate adapter
Blender Software   https://www.blender.org/
Free software under GNU General Public License (GPL).		 version 2.79b used to design the plate adapter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Colin, B., Deprez, B., Couturier, C. High-Throughput DNA Plasmid Transfection Using Acoustic Droplet Ejection Technology. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. , 2472555218803064 (2018).
  2. Mirus Bio. Optimising Transfection Performance. , (2019).
  3. Thermo Fisher Scientific. Factors Influencing Transfection Efficiency | Thermo Fisher Scientific - FR. , https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics/factors-influencing-transfection-efficiency.html (2019).
  4. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).
  5. Figueroa, E., et al. A mechanistic investigation exploring the differential transfection efficiencies between the easy-to-transfect SK-BR3 and difficult-to-transfect CT26 cell lines. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 36 (2017).
  6. Kirchenbuechler, I., Kirchenbuechler, D., Elbaum, M. Correlation between cationic lipid-based transfection and cell division. Experimental Cell Research. 345 (1), 1-5 (2016).
  7. Zhang, Z., Qiu, S., Zhang, X., Chen, W. Optimized DNA electroporation for primary human T cell engineering. BMC Biotechnology. 18 (1), 4 (2018).
  8. Cao, D., et al. Transfection activity and the mechanism of pDNA-complexes based on the hybrid of low-generation PAMAM and branched PEI-1.8k. Molecular bioSystems. 9 (12), 3175-3186 (2013).
  9. Bos, A. B., et al. Development of a semi-automated high throughput transient transfection system. Journal of Biotechnology. 180, 10-16 (2014).
  10. Colosimo, A., et al. Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells. BioTechniques. 29 (2), 314-318 (2000).
  11. Villa-Diaz, L. G., Garcia-Perez, J. L., Krebsbach, P. H. Enhanced transfection efficiency of human embryonic stem cells by the incorporation of DNA liposomes in extracellular matrix. Stem Cells and Development. 19 (12), 1949-1957 (2010).
  12. Sabatini, D. M. Reverse transfection method. , WO2001020015A1 (2001).
  13. Raymond, C., et al. A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods (San Diego, CA). 55 (1), 44-51 (2011).
  14. Junquera, E., Aicart, E. Recent progress in gene therapy to deliver nucleic acids with multivalent cationic vectors. Advances in Colloid and Interface Science. 233, 161-175 (2016).
  15. Woodruff, K., Maerkl, S. J. A High-Throughput Microfluidic Platform for Mammalian Cell Transfection and Culturing. Scientific Reports. 6, 23937 (2016).
  16. Vasileiou, T., Foresti, D., Bayram, A., Poulikakos, D., Ferrari, A. Toward Contactless Biology: Acoustophoretic DNA Transfection. Scientific Reports. 6, 20023 (2016).
  17. Hadimioglu, B., Stearns, R., Ellson, R. Moving Liquids with Sound: The Physics of Acoustic Droplet Ejection for Robust Laboratory Automation in Life Sciences. Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 4-18 (2016).
  18. Grant, R. J., et al. Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology. Journal of Biomolecular Screening. 14 (5), 452-459 (2009).
  19. Sackmann, E. K., et al. Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection. Journal of Laboratory Automation. 21 (1), 166-177 (2016).
  20. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society Reviews. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  21. Zielinski, D., Gordon, A., Zaks, B. L., Erlich, Y. iPipet: sample handling using a tablet. Nature Methods. 11 (8), 784-785 (2014).
  22. Brunner, S., et al. Cell cycle dependence of gene transfer by lipoplex, polyplex and recombinant adenovirus. Gene Therapy. 7 (5), 401-407 (2000).
  23. Nii, T., et al. Single-Cell-State Culture of Human Pluripotent Stem Cells Increases Transfection Efficiency. BioResearch Open Access. 5 (1), 127-136 (2016).
  24. Noonan, D. J., Henry, K., Twaroski, M. L. A High-Throughput Mammalian Cell-Based Transient Transfection Assay. Signal Transduction Protocols. 284, 051-066 (2004).
  25. Transfection | TransIT Transfection Reagents | Mirus Bio. , https://www.mirusbio.com/products/transfection (2015).
  26. American Type Culture Collection. General protocol for transfection of stem cells, primary cells, and continuous cell lines with ATCC TransfeX Transfection Reagent. , https://www.atcc.org/~/media/Transfection%20protocols/TransfeX/TransfeX%20General%20Protocol%20on%20letterhead.ashx (2017).
  27. American Type Culture Collection. Transfection Reagents for Nucleic Acid Transfer into ATCC Cells. , http://www.lgcstandards-atcc.org/~/media/PDFs/Marketing%20Material/Cell%20Biology/Transfection%20reagents%20for%20nucleic%20acid.ashx (2017).
  28. de Los Milagros Bassani Molinas, M., Beer, C., Hesse, F., Wirth, M., Wagner, R. Optimizing the transient transfection process of HEK-293 suspension cells for protein production by nucleotide ratio monitoring. Cytotechnology. 66 (3), 493-514 (2014).
  29. Promega. FuGENE® 6 Transfection Reagent. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/fugene-6-transfection-reagent-protocol.pdf (2019).
  30. Olden, B. R., Cheng, Y., Yu, J. L., Pun, S. H. Cationic polymers for non-viral gene delivery to human T cells. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 282, 140-147 (2018).
  31. Park, E., Cho, H. B., Takimoto, K. Effective gene delivery into adipose-derived stem cells: transfection of cells in suspension with the use of a nuclear localization signal peptide-conjugated polyethylenimine. Cytotherapy. 17 (5), 536-542 (2015).
  32. Wood, R. W., Loomis, A. L. The physical and biological effects of high-frequency sound-waves of great intensity. The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 4 (22), 417-436 (1927).
  33. Eliminating Endotoxin at the Source - A Novel Competent Cell Line with Modified Lipopolysaccharide for Low-Endotoxin Plasmid Production. Mamat, U., et al. 28th Annual Symposium of the Protein Society, San Diego, CA, , (2014).
  34. Ivanova, N. V., Kuzmina, M. L. Protocols for dry DNA storage and shipment at room temperature. Molecular Ecology Resources. 13 (5), 890-898 (2013).
  35. Lesnick, J., Lejeune-Dodge, A., Ruppert, N., Jarman, C. High-Precision Cell Dispensing with the Labcyte Echo® Liquid Handler. , https://www.labcyte.com/content/applications/high-precision-cell-dispensing-with-the-labcyte-echo-liquid-handler (2017).
  36. Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nature Methods. 8 (8), 659-661 (2011).
  37. Peng, J., Zhou, Y., Zhu, S., Wei, W. High-throughput screens in mammalian cells using the CRISPR-Cas9 system. The FEBS journal. 282 (11), 2089-2096 (2015).

Tags

Intrekking afgifte 150 akoestische druppel uitwerpen hoge doorvoer transfectie DNA-plasmide zoogdiercellen vloeistof behandeling fluorescerende eiwitten
High-throughput DNA plasmide multiplexing en transfectie met behulp van akoestische nano doseertechnologie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Colin, B., Rocq, N., Deprez, B.,… More

Colin, B., Rocq, N., Deprez, B., Couturier, C. High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology. J. Vis. Exp. (150), e59570, doi:10.3791/59570 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter