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Genetics

Plasmid di DNA ad alto throughput e trasfezione utilizzando la tecnologia di nanoedispensing acustico

Published: August 8, 2019 doi: 10.3791/59570
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Institut Pasteur de Lille, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) U1177, Drugs and Molecules for Living Systems, Université de Lille, 2L'atelier du Développeur, Marquette lez Lille

Summary

Questo protocollo descrive la trasflessazione di plasmide ad alto rendimento delle cellule dei mammiferi in una piastra di 384 pozzetto che utilizza la tecnologia di espulsione acustica delle goccioline. L'erogazione e il multiplexing del DNA, che richiedono molto tempo e richiedono errori, ma anche il reagente di trasfezione, sono basati su software ed eseguiti da un dispositivo nanodispenser. Le cellule vengono poi semiate in questi pozzi precompilati.

Abstract

La trasfezione cellulare, indispensabile per molti studi biologici, richiede il controllo di molti parametri per un risultato accurato e di successo. Il più delle volte eseguita a bassa velocità effettiva, è inoltre dispendiosa in termini di tempo e soggetto a errori, ancora di più quando si multiplano diversi plasmidi. Abbiamo sviluppato un metodo semplice, veloce e preciso per eseguire la trasfezione cellulare in un layout a piastre a 384 pozze utilizzando la tecnologia di espulsione acustica delle goccioline (ADE). Il dispositivo nanodispenser utilizzato in questo studio si basa su questa tecnologia e consente la consegna precisa di nanovolume ad alta velocità da una piastra di pozzo di origine a una di destinazione. Può erogare e multispensare il DNA e il reagente di trasfezione secondo un foglio di calcolo pre-progettato. Qui presentiamo un protocollo ottimale per eseguire la trasfezione ad alta velocità basata su ADE che consente di raggiungere un'efficienza fino al 90% e una cotransfezione quasi al 100% negli esperimenti di cotransfezione. Estendiamo il lavoro iniziale proponendo una macro basata su fogli di calcolo user-friendly, in grado di gestire fino a quattro plasmidi/pozzi da una libreria contenente fino a 1.536 diversi plasmidi e un'applicazione di guida al pipettaggio basata su tablet. La macro progetta i modelli necessari delle lastre di origine e genera i file pronti all'uso per il nanodispenser e l'applicazione basata su tablet. Il protocollo di trasfezione a quattro fasi coinvolge i) un dispense diluente con un gestore di liquidi classico, ii) distribuzione del plasmide e multiplexing, iii) un reagente di trasfezione erosi dal nanodispense, e iv) placcatura cellulare sui pozzi precompilati. Il controllo basato su software descritto di ADE plasmide multiplexing e trasfezione consente anche ai non specialisti del settore di eseguire una trasfezione cellulare affidabile in modo rapido e sicuro. Questo metodo consente di ottenere rapidamente l'identificazione delle impostazioni ottimali per un determinato tipo di cellula e può essere trasposto in approcci manuali e su scala più elevata. Il protocollo facilita le applicazioni, come la proteina UMANA ORFeome (insieme di frame di lettura aperti [ORF] in un genoma) espressione o la convalida della funzione genica basata su CRISPR-Cas9, in strategie di screening non di pool.

Introduction

Il metodo qui presentato descrive in dettaglio come eseguire il plasmide del DNA e la trasfezione nelle cellule dei mammiferi ad alta produttività utilizzando un nanodispenser liquido a base acustica in una piastra di 384 pozze, anche per i non specialisti del settore. Questo metodopubblicato di recente 1 permette di eseguire fino a 384 condizioni indipendenti di multiplexing e trasfezione del DNA plasmide in un esperimento, in meno di 1 h. Gli esperimenti di cotrafezione o singolo hanno avuto successo, raggiungendo un quasi 100% cotrafezione all'interno della popolazione di cellule trasfette. Questo protocollo semplifica la trasfezione perché la maggior parte dei passaggi noiosi, dispendiosi in termini di tempo e soggetti a errori sono ora guidati dal software (vedere Figura 1 per una panoramica generale). Ulteriori sforzi sono stati fatti per sviluppare strumenti dedicati per migliorare la facilità d'uso evitando gli errori umani durante il processo complessivo e per promuovere la trasfezione di successo anche per i non specialisti nel campo. Il protocollo descritto include un foglio di calcolo macro "user-friendly" che abbiamo sviluppato al fine di gestire 384 condizioni di trasfezione indipendenti con possibilità di multiplexing fino a quattro plasmidi in ogni pozzo. La macro genera automaticamente modelli delle lastre di origine per caricare il volume di plasmid di DNA previsto dall'avvio di soluzioni di stock e i file necessari per guidare il software nanodispenser sul progetto sperimentale che è stato inserito. Poiché l'erogazione manuale del DNA in una piastra sorgente 384-well è noiosa e soggetta a errori, abbiamo anche sviluppato un'applicazione dedicata basata su tablet per guidare l'utente durante l'erogazione della soluzione di DNA secondo il modello.

Figure 1
Figura 1: flusso di lavoro sperimentale. Rappresentazione schematica del protocollo di trasfezione inversa automatizzato ottimale ad alta velocità effettiva (dalla progettazione sperimentale al test biologico personalizzato). I passaggi manuali sono indicati dal simbolo della mano e il tempo approssimativo per ogni passo è scritto in una casella rossa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Molti esperimenti basati sulle cellule iniziano con la trasfezione del DNA plasmida, e anche se molti reagenti dedicati sono stati e sono ancora in fase di sviluppo per migliorare l'efficienza della trasfezione e/o facilitare la procedura, molto resta da fare2,3 , 4. La trasfezione cellulare plasmida di DNA prevede diversi passaggi per raggiungere un'elevata efficienza, come un assorbimento complesso iniziale, fuga endosomica e trasporto citoplasmatico al nucleo5,6. Oltre alla precipitazione di calcio o tecniche fisiche come elettroporazione o microiniezione utilizzando dispositivi dedicati7, i moderni metodi chimici si sono concentrati sul miglioramento della somministrazione di cellule del DNA, abbassando la citossicità cellulare8, 9. L'uso di lipidi o polimeri cationici che formano complessi simili a liposomi e, più recentemente, sistemi chimici polimerici non liposomici ha reso la trasfezione più facile e più efficiente10. Nonostante questi sviluppi, la trasfezione cellulare richiede ancora competenze specifiche per essere eseguita con precisione poiché la maggior parte di questi protocolli di trasfezione fisica o chimica richiedono agli scienziati di preparare manualmente ogni condizione di reazione alla trasfezione del DNA, compromissione della velocità effettiva. Per aggirare questo problema, sono stati sviluppati protocolli di trasfezione inversa utilizzando reagenti di trasfezione chimica11,12,13, consentendo all'utente di testare o combinare diversi plasmidi in modo più veloce. In questi protocolli, si formano complessi di acido nucleico con reagenti di trasfezione prima di seminare le cellule sui complessi. Tuttavia, questi protocolli inversi sono ancora limitati dalla gestione manuale delle soluzioni del DNA e dalla combinazione di ciascuna delle condizioni indipendenti. Anche se è possibile eseguirli in un formato di piastra 96-well, la preparazione del DNA e dispensa sarà noioso, e probabilmente ci saranno errori. Quando sono necessarie e multiplexed con l'altro diverse quantità di diversi plasmidi di DNA, la trasfezione cellulare diventa ancora più difficile da raggiungere e gli errori umani diventano abbastanza inevitabili. Scalare fino al formato a 384 pozze in un approccio di trasfezione inverso, nonostante poche condizioni di trasfezione del DNA multiplexed, diventa una sfida impossibile a causa dei seguenti motivi. i) I volumi di DNA, reagente di trasfezione o miscela di reazione da gestire sono inferiori a 1 -L per ogni pozzo. ii) Il multiplexing di plasmidi per 384 condizioni indipendenti diventa estremamente complicato. La consegna in ciascuno dei 384 pozzi è anche iii) molto dispendioso in termini di tempo e iv) soggetto a errori. Infatti, erogare la soluzione giusta nei pozzi attesi è difficile da gestire perché i bassi volumi già erogati non consentono il monitoraggio visivo tra i pozzi vuoti e quelli già riempiti. v) Infine, c'è un alto rischio di essiccazione della miscela per evaporazione prima che le cellule vengano aggiunte a causa del tempo necessario per eseguire le fasi di erogazione necessarie. In sintesi, il fattore limitante per impostare analisi di trasfezione del DNA ad alto consumo sembra essere la miniaturizzazione dell'analisi, che implica multiplexing e gestione a basso volume che non possono più essere gestiti manualmente, ma sono anche difficilmente raggiungibili in un affidabile dai classici gestori di liquidi peristatici.

Come prova di difficoltà per automatizzare tali saggi e ottenere un alto rendimento, solo pochi tentativi di automatizzare la trasfezione sono stati pubblicati finora: un formato di piastra di 96 pozzetti che utilizza un dispositivo di movimentazione dei liquidi commerciali e precipitazioni di fosfato di calcio14 e, più recentemente, un reagente lipoplex e un chip microfluidico che consentono 280 trasfettazioni indipendenti15 ma richiedono competenze specializzate in questo campo. Un altro metodo, l'acoustoforesi, che consente la levitazione liquida e porta alla manipolazione e miscelazione dei fluidi, è stato utilizzato per eseguire la trasfezione del DNA nei formati da 24 a 96 pozzi16. Anche se fattibile, questo approccio soffre di una produttività estremamente bassa in quanto la miscela di cellule con miscela di trasfezione del DNA richiede un'incubazione di 60 s per ogni singolo punto prima della semina. Ciò implica una durata di almeno 96 min per una piastra completa di 96 pozze. Inoltre, questo protocollo è ben lungi dall'essere suscettibile al pubblico generale dei biologi in quanto questo lavoro è stato fatto con un dispositivo progettato e fabbricato in-house che attualmente non è disponibile sul mercato. Al contrario, negli ultimi anni, è emersa una tecnologia di erogazione basata sull'acustica basata su software di facile utilizzo con dispositivi di dispenser nanovolume. Utilizzando energia acustica focalizzata, questi dispositivi consentono l'espulsione strettamente controllata di piccoli volumi di liquidi da 2,5 nL a 500 nL da una piastra di origine a una destinazione17. Questa tecnologia, chiamata espulsione acustica delle goccioline (ADE), presenta numerosi vantaggi: è completamente automatizzata, senza contatto, senza punta, precisa e altamente riproducibile, e ha un alto throughput18. In primo luogo dedicato alla fornitura di soluzioni di zolfo dimetilico (DMSO), le impostazioni sono state migliorate per erogare tamponi acquosi19. I nanodispenser acustici, quindi, sembrano adatti per i protocolli di trasfezione inversa delle cellule e potrebbero aggirare la maggior parte delle limitazioni manuali di cui sopra. Poiché in precedenza non sono stati descritti tentativi di trasfezione plasmida utilizzando questa tecnologia, abbiamo recentemente valutato l'idoneità di un sistema di erogazione basato su acustica per eseguire la trasfezione inversa delle celle.

Approfittando della velocità effettiva dei nanodispenser e della facilità d'uso, abbiamo ottimizzato un protocollo di trasfezione inversa per le cellule HeLa verificando diversi parametri che possono influenzare la trafezione del DNA su una piastra singola di 384 pozzetto, vale a dire la quantità totale di DNA e concentrazione iniziale del DNA sorgente, volume diluente, reagente di trasfezione e numero di cellule di diffusione. Il protocollo sviluppato aggira i limiti manuali sopra descritti della trasfezione cellulare e presenta diversi vantaggi rispetto ad altri tentativi di trasfezione automatizzati. In primo luogo, è miniaturizzato, consentendo così un reagente di trasfezione conveniente salvando i preparati del plasmide del DNA e il reagente di trasfezione. In secondo luogo, è molto più ad alto rendimento e riproducibile rispetto al protocollo manuale (anche per i principianti), in quanto la trasfezione di un'intera piastra di 384 pozzetto può essere ottenuta in meno di 1 h. Infine, è basato sul software, consentendo il controllo della quantità di DNA erogato e il multiplexing di diversi plasmidi. Infatti, grazie al software nanodispenser (Tabella dei materiali), l'utente può elaborare un piano di studio per controllare i volumi da erogare da una piastra di origine definita a una di destinazione.

Il protocollo qui presentato è destinato principalmente a coloro che hanno accesso a un nanodispenser e vorrebbero impostare esperimenti di trasfezione ad alta produttività, ma anche per coloro che vogliono ottimizzare rapidamente i loro parametri di trasfezione per un determinato tipo di cellula l'applicazione di questo protocollo per eseguire il cross-test di diversi parametri a velocità effettiva elevata. In effetti, abbiamo dimostrato che i parametri ottimizzati identificati con questo protocollo su nanoscala possono essere trasposti in esperimenti di trasfezione su larga scala e manuali. Infine, poiché il reagente di trasfezione utilizzato nel presente protocollo consente la trasfezione del DNA o del siRNA secondo il produttore, il protocollo è anche di interesse per coloro che mirano a eseguire approcci di array per la sovraespressione genica o il knockdown. Le piastre di destinazione precompilate con DNA possono essere conservate fino a 7 giorni prima dell'uso in un saggio di trasfezione senza perdita di efficacia, che è un altro vantaggio del seguente protocollo per questo tipo di applicazione.

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Protocol

1. Preparazione anticipata

  1. Preparazione dei programmi di gestione dei liquidi peristaltici
    NOTA: Per le fasi di diluente e di erogazione cellulare del protocollo, è necessario preparare un programma dedicato, tenendo conto dell'altezza della testa di erogazione alla piastra utilizzata e dell'intento di passo.
    1. Per il passo di diluente 1 L, montare una cassetta da 1 ll e preparare un programma con le impostazioni come descritto nei passaggi 1.1.1.1 e 1.1.1.2.
      1. Regolare il parametro della portata su Alta per ottenere la migliore velocità effettiva, in quanto non sono previsti danni materiali biologici in questo passaggio. Regolare l'altezza di erogatore a 9,6 mm (secondo la piastra di coltura cellulare utilizzata, Figura supplementare 1) per consentire alla caduta di 1 -L di toccare il fondo dei pozzi durante la dispensazione.
        NOTA: Questo passaggio è fondamentale per evitare la ritenzione delle goccioline sulla testa di erogazione fino a raggiungere un volume sufficiente per cadere.
      2. Regolare l'altezza di compensazione della piastra a 14,4 mm per consentire uno spostamento libero della testa di erogazione sopra la piastra dopo l'erogazione di ogni riga. Controlla visivamente le impostazioni corrette dell'altezza della testa del gestore liquido peristale: assicurati che non vengano mantenute gocce sulle punte di erogazione durante l'erogazione e verifica che la testa sia sufficientemente alta da consentire lo spostamento della testa dopo l'erogazione di ogni riga.
        NOTA: Evitare la ritenzione di caduta è un parametro cruciale in quanto comprometterà l'accuratezza del volume della dispensazione.
    2. Per l'erogazione delle sospensioni a celle da 40,l, montare una cassetta da 10 l e preparare un programma con le impostazioni descritte nei passaggi 1.1.2.1-1.1.2.2.
      1. Regolare il parametro della portata su Bassa per erogare le cellule a bassa velocità per evitare di promuovere potenziali danni alle cellule da stress di taglio e un alto impatto sul fondo dei pozzi. Regolare l'altezza di dispensa a 11,43 mm (secondo la piastra di coltura cellulare utilizzata, Figura supplementare 1), abbastanza alta da ridurre l'impatto cellulare sul fondo dei pozzetti durante il processo di erogazione, ma abbastanza bassa da evitare la ritenzione delle goccioline sul testa di erogazione. Regolare l'altezza di cancellazione della piastra a 16 mm per consentire lo spostamento libero della testa di erogazione sopra la piastra dopo l'erogazione di ogni riga.
      2. Controlla visivamente le impostazioni corrette dell'altezza della testa del gestore liquido peristale: assicurati che non vengano mantenute gocce sulle punte di erogazione durante l'erogazione e verifica che la testa sia sufficientemente alta da consentire lo spostamento della testa dopo l'erogazione di ogni riga.
        NOTA: Evitare la ritenzione di goccia è un parametro cruciale in quanto porterà all'erogazione di un numero di cella inaffidabile.
  2. Preparazione del plasmide del DNA (protocollo di estrazione miniprep classico)
    1. Coltivare un ceppo di batteri Trasformati dH5 in mezzo LB integrato con 125 g/mL ampicillin selection antibiotic (Tabella dei materiali) durante la notte a 37 gradi centigradi e sotto agitazione delicata (200 giri/) su uno shaker orbitale ( Tabella deimateriali).
    2. Raccogliere 2 mL della coltura, pellet le cellule da centrifugando per 5 min a 6.000 x g, e scartare il supernatante.
    3. Risospendere il pellet cellulare con 250 litri di buffer di sospensione contenente RNase A (Tabella dei materiali). Aggiungere 250 l di tampone di lisi e incubare per 5 min a temperatura ambiente, secondo le istruzioni del produttore.
    4. Interrompere la reazione di lisi aggiungendo 300 l di buffer di neutralizzazione (Tabella dei materiali) e vorriccio a breve. Centrifugare i tubi per 5 min a 11.000 x g.
    5. Posizionare una nuova minicolonna plasmide (Tabella dei materiali) in un tubo di raccolta da 2 mL e decantare il supernatale nella colonna centrifugando per 1 min a 11.000 x g.
    6. Eliminare il flusso attraverso e riporre la minicolonna nel tubo di raccolta.
    7. Lavare la minicolonna plasmide con 500 l di tampone di lavaggio opzionale (Table of Materials) e centrifugare per 1 min a 11.000 x g, secondo le istruzioni del produttore.
    8. Eliminare il flusso attraverso e posizionare la minicolonna plasmide indietro nel tubo di raccolta.
    9. Aggiungere 700 l di washing buffer (Table of Materials) integrati con etanolo e centrifuga per 1 min a 11.000 x g, secondo le istruzioni del produttore.
    10. Scartare il flusso attraverso e centrifugare la minicolonna plasmide e il suo tubo di raccolta 1x più per 2 min a 11.000 x g per asciugare la membrana di silice.
    11. Mettere la minicolonna di plasmide essiccata in un nuovo tubo da 1,5 mL e aggiungere 30 -L di acqua distillata preriscaldata a 60 gradi centigradi, incubarla per 2 min a temperatura ambiente, quindi centrificarla per 1 min a 11.000 x g.
    12. Scartare la minicolonna del plasmide e mantenere l'eluato contenente il plasmide di DNA purificato.
    13. Misurare la concentrazione di DNA del DNA eluito utilizzando uno spettrofotometro a microvolume (Tabella dei materiali).
      1. Accendere lo spettrofotometro e scegliere le impostazioni di misurazione del DNA.
      2. Sollevare il braccio di campionamento dello spettrofotometro e della pipetta 1 -L di acqua sul piedistallo di misurazione per eseguire una calibrazione in bianco.
      3. Abbassare il braccio di campionamento, avviare la misurazione in bianco e attendere il completamento.
      4. Sollevare il braccio di campionamento e pulire il campione dai piedistalli superiore e inferiore.
      5. Pipetta 1 - L della soluzione del DNA sul piedistallo inferiore per misurarlo.
      6. Abbassare il braccio di campionamento, avviare la misurazione della concentrazione del DNA e attendere il completamento.
      7. Sollevare il braccio di campionamento e pulire il campione dai piedistalli superiore e inferiore.
      8. Per ulteriori misurazioni della concentrazione del DNA, ripetere i passaggi 1.2.13.5-1.2.13.7.
    14. Una volta che le misurazioni sono finite, conservare le soluzioni di DNA a 4 gradi centigradi fino all'uso.

2. Progettazione sperimentale e generazione dei picklist per guidare le erogate adE

NOTA: è stata sviluppata una macro di foglio di calcolo "user-friendly" dedicata per gestire le quantità di DNA e mescolare fino a quattro plasmidi in un formato a 384 pozze. Sulla base della progettazione sperimentale inserita, questa macro genera i file necessari per guidare il protocollo di trasfezione del DNA basato su ADE da nanodispenser. Per generare questi file, è necessario compilare diversi campi nel foglio modello, come illustrato nella Figura 2.

Figure 2
Figura 2 : generazione degli elenchi a discesa per guidare la dispensazione ADE utilizzando la macro del foglio di calcolo. Diversi parametri devono essere riempiti, vale a dire (1) il reagente di refezione di trasfezione (TR) e i volumi minimi/massimi da utilizzare nella piastra di origine, (2) le concentrazioni di plasmide iniziali da erogare nella piastra di origine e (3) il design intero, comprese le quantità di plasmide previste e multiplexing in ciascuno dei 384-pozzi. (4) L'attivazione di Generate Picklists consente di verificare i diversi campi e, una volta compilati correttamente, vengono generati automaticamente elenchi a discesa per la snidatura del DNA e del TR e il necessario modello di piastra sorgente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Immettere i parametri del protocollo nanodispenser nei campi rosa. Impostare il valore della miscela TR (Transfection reagent) su 500 nL. Impostare il valore minimo del volume nei pozzi della piastra di origine su 4. Impostare il volume massimo nei pozzi della piastra di origine a 11,25.
    NOTA: il nanodispenser qui utilizzato può trasferire solo un massimo di 500 nL in una corsa di ADE. Questi campi rosa sono precompilati con i valori consigliati, ma possono essere modificati in base alle esigenze dell'utente.
  2. Nei campi blu corrispondenti al DNA sottostante, inserite 100 concentrazioni di inizio DNA ng/L.
    NOTA: questo valore è la concentrazione ottimale definita in precedenza, ma può tuttavia essere modificato per esigenze utente diverse.
  3. Immettere la quantità di DNA desiderata nei campi grigio/verde. Inserire gli importi e i nomi dei plasmi per i 384 pozzi, garantendo la stessa ortografia se lo stesso plasmide viene utilizzato in diversi pozzi.
  4. Generare il progetto della piastra di origine, i file degli elenchi a discesa e il file guida di pipettaggio. Fare clic su Genera elenchi di selezione per consentire alla macro di generare il FILE DNA-Picklist.csv, T.R.-Picklist.csv e 384-Wells-Pipetting-Guide.csv dai dati raccolti nel foglio corrispondente. Se richiesto, correggere i valori delle celle piene di arancia in quanto indica errori o volumi che non possono essere gestiti dal nanodispenser.
  5. Stampare i modelli dal foglio Piastra di origine. Sono indicati i nomi di plasmide e il volume minimo per riempire i pozzi. Allo stesso modo, i volumi di miscela reagente di trasfezione che dovranno essere riempiti nei seguenti pozzi sono indicati come TR ed evidenziati in verde.

3. Preparazione della piastra di origine del DNA mediante l'applicazione guida di tubazione 384 pozzetti

  1. Diluire il plasmide di DNA immagazzinato dal punto 1.2.14 a 100 ng/L utilizzando acqua distillata.
  2. Calibrare la griglia 384-po per le dimensioni piastra: aprire l'applicazione guida tubo 384-po 'su un tablet (Figura 3). Posizionare la piastra di origine sulla griglia sullo schermo inferiore, e nel menu di calibrazione in alto a sinistra, fare clic su o - (o utilizzare il cursore rosso) per migliorare o ridurre le dimensioni della griglia e dei pozzi al fine di regolare i pozzetti verdi ai quattro pozzetti d'angolo della piastra .

Figure 3
Figura 3 : Utilizzo dell'applicazione di guida di pipettaggio a 384 pozzetti. (1) Calibrazione della griglia 384-well alla dimensione della piastra; (2) Montaggio di un adattatore universale di lamiere stampata in 3D sulla tavoletta utilizzando nastro adesivo a doppio lato; (3) Posizionamento della piastra sull'adattatore; (4) Spostamento della griglia per centrarla alla piastra montata. (5) Blocco della fase di calibrazione. (6) Apertura del file 384 wells pipetting guide.csv. (7) Dato l'elenco dei file, l'applicazione indicherà il nome della piastra di origine previsto, il reagente (DNA o reagente di trasfezione), la concentrazione e il volume da erogare nei pozzi bersaglio, che saranno illuminati uno per uno. (8) I pulsanti freccia sinistra e destra consentono all'utente di seguire la guida alla cattura per erogare facilmente i reagenti in base al modello di piastra di origine macro del foglio di calcolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Utilizzando il nastro fronte/retro, montare l'adattatore di lamiera stampato in 3D sullo schermo per evitare movimenti della lastra di origine durante l'erogazione. Se necessario, spostare la griglia calibrata utilizzando le frecce di rotazione e i pulsanti Su/Giù/Destra/Sinistra per regolare la griglia sullo schermo alla posizione della lamiera. Una volta che le dimensioni della griglia e dei pozzi sono correttamente calibrate e posizionate, spuntare la casella Blocca calibrazione.
  2. Fare clic su FILE e aprire il file 384 wells pipetting guide.csv. Seguire le istruzioni dello schermo per erogare manualmente il volume indicato del plasmide indicato alla concentrazione indicata nel pozzo bianco evidenziato corrispondente alla destinazione di destinazione appropriata della piastra prevista. Utilizzare le frecce - o per tornare indietro o oltre nel processo di erogazione del DNA. Interrompere l'erogazione quando si raggiunge la prima soluzione reagente trasfusione da caricare.
  3. Una volta completati i deportanti del DNA, rimuovere la piastra sorgente dall'adattatore. Se devono essere riempite più piastre di origine, posizionare una nuova piastra di origine sull'adattatore e seguire le istruzioni di erogazione. Una volta terminata la dispensazione del DNA, centrificare le lastre di sorgente riempite di DNA (a 1.500 x g per 2 min) per garantire un adeguato livellamento del liquido e rimuovere le bolle che portano all'imprecisione nei trasferimenti basati su ADE.

4. Dispensazione diluente del gestore di liquidi peristaltica 1 svalutazione diluente nella piastra di destinazione

NOTA: Eseguire i passaggi 4.1-4.5 in un armadio di sicurezza biologico.

  1. Disinfettare la testa della cassetta 1 L spruzzandola con un disinfettante spray (Tabella dei materiali) e consentire a questa soluzione di entrare nel supporto della punta. Assorbire il disinfettante residuo sull'assorbimento della carta. Montare la cassetta 1 L sul dispositivo di gestione del liquido peristaltico. Accendere il dispositivo e assicurarsi che l'impostazione del tipo di cassetta sia corretta (1 o L), così come il formato della piastra (384 pozzi).
  2. Disinfettare l'intero lume del tubo: inserire l'organizzatore del tubo (tenendo insieme gli otto tubi) in un recipiente sterile e riempirlo con 5 mL di alcool del 70%. Utilizzando la funzione di innesco del gestore liquido peristale, prima lavare l'alcol nel tubo e poi risciacquarlo passando 5 mL di acqua distillata e 5 mL di mezzo senza sieri (il mezzo di Eagle modificato di Dulbecco [DMEM] integrato con 100 U/mL penicillina-streptomycin; Tabella del materiale), riempiendo successivamente lo stesso recipiente. Assicurarsi che nessuna punta sia intasata ispezionando visivamente il flusso di liquido da tutti.
  3. Prime il tubo con mezzo senza sieri riempiendo un nuovo recipiente sterile con 10 mL di mezzo preriscaldato senza siero e immergendosi l'organizzatore del tubo in esso. Premere il pulsante primo del gestore liquido perificato per circa 10 s. Ancora una volta, assicurarsi che nessuna punta sia intasata ispezionando visivamente il flusso di liquido da tutti.
  4. Riempire la piastra con 1 -L di diluente. Posizionare una piastra di coltura sterile 384-well (destinazione) sul supporto peristaltico della piastra di gestione liquida e rimuovere il coperchio.
  5. Eseguire il programma precalibrato per erogare 1 ll in ogni pozzetto della piastra 384-po. Il tempo di erogazione è di circa 8 s. Quindi sostituire il coperchio della piastra 384-pozzetto.
    NOTA: In alternativa, questo passaggio può essere gestito manualmente, in un armadio di sicurezza, utilizzando una micropipetta multicanale.

5. Esecuzione di un'indagine per controllare i volumi erogati manualmente

NOTA: per informazioni dettagliate, vedere la figura 4.

  1. Eseguire il programma nanodispenser, andare alla scheda diagnostica, selezionare la piastra di origine Fuori scatola, caricare la piastra di origine sul supporto piastra, e spuntare In per inserire la piastra. Quando richiesto, selezionare 384LDV_AQ_B2 per impostare il nanodispenser sulla modalità di erogazione del buffer acquosa, quindi premere OK.
  2. Selezionare Sondaggio nel menu Varie e fare clic su Avvia. Selezionare i pozzi precompilati da analizzare e fare clic sul pulsante Vai. Verificare che i volumi misurati corrispondano a quelli previsti e assicurarsi che non siano stati caricati pozzi con volumi superiori a 12 gradi, in quanto ciò eviterà trasferimenti.

Figure 4
Figura 4 : definizione dei parametri software del sondaggio. (1) Avviare il programma di nanodispenser. (2) Aprire la scheda Diagnostica. (3) Inserire la piastra di origine spuntando fuori per la piastra di origine e quindi, In. (4) Quando richiesto, definire il tipo di piastra di origine nel menu. (5) Nella casella Varie, selezionare Sondaggio nel menu a discesa. (6) Avviare il programma di rilevamento facendo clic su Avvia. (7) Selezionare i pozzi precompilati da misurare. (8) Avviare l'analisi facendo clic su Vai. (9) Una volta eseguita l'indagine, i volumi misurati sono scritti nei pozzi corrispondenti selezionati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Smilata dal DNA ADE nella piastra di destinazione

  1. Eseguire il software picklist, impostare i tipi di piastra di origine e di destinazione a 384_well su 384_LDV e Greiner 384PS_781096, rispettivamente (Figura 5). Impostare il dispositivo su una modalità di erogazione del buffer acquosa selezionando 384LDV_AQ_B2e deselezionare "ottimizza la velocità effettiva di trasferimento".

Figure 5
Figura 5 : esecuzione delle dispensazioni basate su elenchi a discesa. (1) Avviare il software nanodispenser. Nella scheda Protocollo selezionare (2) il formato della piastra di esempio, (3) il tipo di piastra di destinazione e (4) viene deselezionata "Ottimizza velocità effettiva trasferimento". (5) Selezionare la scheda Distinta di prelievo. (6) Fare clic su Importa e selezionare il file .csv appropriato (DNA-PickList o T.R.-Picklist). (7) Una volta selezionato, fare clic su Importa. (8) Fare clic su Riproduci e salvare il protocollo. (9) Eseguire una simulazione di srogazione facendo clic su Simula, o (10) Avviare la dispensazione programmata facendo clic su Esegui. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Selezionare la scheda "Lista di prelievo", fare clic su Importa, selezionare il file DNA-Picklist.csv. Fare clic su Riproduci e salvare il protocollo. Fare clic su Simula per eseguire una simulazione delle dispensazioni programmate per assicurarsi che il elenco a discesa corrisponda al progetto sperimentale previsto. Una volta completato, fare clic su Chiudi.
  2. Fare clic su Riproduci, quindi Esegui, per avviare il programma di erogazione: quando richiesto, inserire la piastra sorgente richiesta (soluzioni DNA riempite manualmente) e la piastra di destinazione (riempita con diluente) nel nanodispenser.
    NOTA: Il tempo di erogazione è di circa 5-20 minuti per una piastra completa di 384 pozze, a seconda dei volumi selezionati e del numero totale di dispensazioni nel progetto sperimentale.
  3. In alternativa, mettere in pausa il protocollo qui come le piastre diluenti e piene di DNA in grado di gestire lo stoccaggio asciutto o congelato per un massimo di 7 giorni. Per lo stoccaggio a secco, lasciare asciugare i piatti sul banco a temperatura ambiente e poi conservarli allo stesso modo. Scongelare e centrifugare (a 1.500 x g per 2 min) piastre conservate congelate prima dell'uso in una fase di trasfezione (sezione 7).
     

7. Dispensazione reagente di trasfusione guidata da ADE

  1. In un armadietto di biosicurezza, reagente di trasfezione lipopoliplex estemporaneamente diluito nel mezzo senza siero a una concentrazione finale di 1x. Vortice e immediatamente erogare questa miscela reagente trasfezione secondo le piastre di origine predefinite progettate dalla macro e utilizzando l'applicazione guida di pipettaggio 384 ben descritta come descritto nel passaggio 3.4.
    NOTA: Non centrifugare la piastra di origine una volta caricata con il reagente in quanto non si nota alcuna trasfezione dopo la centrifugazione.
  2. Eseguire il programma nanodispenser per eseguire un "sondaggio" come descritto nella sezione 5, al fine di controllare i volumi di tutti i pozzi TR riempiti manualmente delle piastre di origine per evitare errori di erogazione dovuti a volumi superiori a 12 .
  3. Fare clic su Reimposta per cancellare l'elenco di selezione del DNA nel software di selezione e verificare che i parametri del dispositivo siano ancora impostati su buffer acquosi e sui tipi di piastra di origine e di destinazione utilizzati, come nel passaggio 6.1.
  4. Fare clic su Importa e scegliere il file TR-Picklist.csv. Fare clic su Riproduci e salvare il protocollo, se richiesto, e (questo è opzionalmente ma fortemente raccomandato) eseguire una simulazione delle dispensazioni miscela reagente di trasfusione programmata per garantire la corretta progettazione dei dispensazioni facendo clic sul Pulsante Simula. Una volta completato, fare clic su Chiudi.
  5. Fare clic su  Riproduci, quindi sul pulsante Esegui per avviare il programma di erogazione: come richiesto, posizionare le lastre di origine (riempite con MISCELA TR) e la piastra di destinazione (diluente e riempita di DNA) nel nanodispenser.
    NOTA: Il tempo di erogazione è inferiore a 20 min per una piastra completa di 384 pozze durante l'erogazione di 500 nL di miscela TR.
  6. Incubare 15-30 min a temperatura ambiente dopo aver aggiunto il TR al DNA come indicato dal protocollo del produttore.

8. Dispensazione cellulare basata su gestore di liquidi peristaltici

  1. Preparare il gestore di liquidi peristaltico per l'erogazione delle cellule. Disinfettare la testa di una cassetta da 10 l spruzzandola con Aniospray Surf 29 Disinfectant e assorbendo il resto sulla carta. Montare la cassetta sul dispositivo di gestione dei liquidi peristalitici, modificare l'impostazione del tipo di cassetta su 10 , e assicurarsi che il formato della piastra sia impostato su 384 pozzi.
  2. Disinfettare il tubo di cassette da 10 L come descritto in precedenza al punto 4.2. Immergi l'organizzatore del tubo in un recipiente sterile e sciacqua il tubo con 5 mL di alcool del 70%, poi con 5 mL di acqua distillata, e infine, con 5 mL di mezzo senza siero, successivamente riempito nello stesso recipiente e fino a quando ogni tubo è vuoto.
  3. Preparare la sospensione cellulare a erogazione. Da un piatto confluente di cellule HeLa B10, lavare le cellule 1x con 1x soluzione salina con tamponamenti fosfati (PBS), quindi dissociare le cellule con la metapsina / EDTA per 5 min a 37 .
  4. Verificare la dissociazione cellulare al microscopio e arrestare l'azione trypsin/EDTA aggiungendo 10 mL di mezzo completo (DMEM integrato con 10% siero bovino fetale e 100 U/mL penicillina-streptomica; vedere la Tabella del Materiale) nella parabola di coltura. Raccogliere le cellule in un tubo da 50 mL e contare le cellule al microscopio, utilizzando una cellula di Malassez o un contatore cellulare automatico.
  5. Preparare almeno 25 mL di sospensione cellulare HeLa ad una concentrazione di 37.500 cellule/mL nel mezzo completo (ad es. 1.500 cellule/40 l) per una piastra completa di 384 pozzetti, per garantire l'innesco del tubo e la dispensazione di 40 l/po.
  6. Per erogare le cellule, riempire un nuovo vaso sterile con la sospensione cellulare preparata e mescolarlo per evitare sedimentazioni che portano a imprecisione nella densità cellulare della dispensazione. Inserire l'organizzatore del tubo in questa soluzione e premere il pulsante Prime fino a quando la sospensione cellulare inizia a lavare dalla testa di erogazione. Assicurarsi che nessuna punta sia intasata ispezionando visivamente il flusso di liquido da tutti e che ogni tubo sia caricato con sospensioni cellulari.
  7. Caricare il DNA e la piastra di destinazione riempita da TR da 384 pozzetti sul supporto peristaltico peristaltico per la piastra di gestione del liquido e rimuovere il coperchio. Eseguire il programma precalibrato per erogare 40 -L della sospensione cellulare sulla piastra completa 384 pozze (cioè 1.500 cellule/pozzo). Il tempo di erogazione è di circa 8 s. Sostituire il coperchio della piastra 384-bene.
    NOTA: In alternativa, la sospensione a celle da 40 once può essere erogata manualmente utilizzando una micropipetta multicanale.

9. Analisi biologica personalizzata (monitoraggio dell'efficienza della trasfezione cellulare)

NOTA: seguendo le impostazioni sperimentali e l'intento dell'esperimento, utilizzare i metodi necessari per la luminescenza, la fluorescenza, lo screening ad alto contenuto e la reazione a catena quantitativa di trascrizione inversa (RT-qPCR). In questa sezione del protocollo, l'efficienza della trasfezione cellulare viene valutata mediante microscopia a fluorescenza automatizzata e analisi delle immagini.

  1. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 in un'atmosfera satura d'acqua e fino a una corretta espressione proteica.
    NOTA: Qui, un tempo di incubazione di 48 h viene utilizzato per le cellule HeLa per monitorare l'efficienza della trasfezione, utilizzando plasmidi che esprimono tdTomato e mVenus.
  2. Rimuovere il mezzo di coltura 48 h post-trasfezione invertendo la piastra, aggiungere 30 l/pozzetto di 10% di formalina utilizzando il gestore liquido peristaltico (10 - cassetta l') e incubare per 15 min a temperatura ambiente.
  3. Rimuovere la formalina invertendo la piastra; quindi incubare le cellule per 15 min a temperatura ambiente con 0,1 ng/mL Hoechst diluito in soluzione 1x PBS.
  4. Lavare le cellule 3x per 15 min con 80 luna di 1x PBS regolate a pH - 8 al fine di recuperare il segnale ad alta fluorescenza perso dal 6,9 pH della fase di incubazione della soluzione di formalina.
  5. Utilizzando un microscopio fluorescente automatizzato, acquisire le immagini di due o tre canali fluorescenti (Hoechst, tdTomato e mVenus) in sequenza con obiettivi 10x e un set di filtri di emissione adeguato (4,6-diamidino-2-fenilitine [DAPI], dsRed e fluoresceina isothiocyanate [FITC], rispettivamente).
  6. Per valutare l'efficienza della trafezione, utilizzare il software di analisi delle immagini per determinare l'efficienza della trafezione utilizzando l'analisi dello script basata sulla colorazione dei nuclei.

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Representative Results

Al fine di determinare se la tecnologia ADE potrebbe essere utilizzata per un protocollo di trasfezione inversa automatizzato, abbiamo monitorato l'efficienza della trasfezione cellulare mediante microscopia a fluorescenza, utilizzando un plasmide fluorescente rosso fluorescente. In primo luogo puntando a determinare i migliori parametri di trasfezione, diversi volumi diluenti e quantità totali di DNA sono stati testati in modo incrociato. Il volume diluente è stato utilizzato per consentire alle goccioline di DNA, una volta erogate, di diffondersi in tutti i pozzi per aggirare la trasfezione inomogenea osservata negli esperimenti preliminari (cioè solo al centro dei pozzi). Come illustrato nella Figura 6A, la trasfezione delle cellule HeLa che utilizza il reagente lipopolyplex20 ha avuto esito positivo. È interessante notare che, utilizzando un volume diluente di 1 l, quantità di DNA che vanno da 5 a 30 ng hanno mostrato la stessa efficienza e fino al 90% di trasfezione cellulare rispetto a quantità più elevate, come 50 e 100 ng, per le quali è stata osservata una brusca diminuzione. Abbiamo provato vari volumi diluenti che vanno da 15 nL a 4 l e identificato 1 L per essere la condizione migliore, come significativamente esemplificato qui utilizzando 30 ng di DNA.

Figure 6
Figura 6 : Risultati rappresentativi. (A) Impatto della quantità di DNA e del volume diluente sull'efficienza della trasfezione. Le cellule HeLa sono state trafettate inverse utilizzando il dispositivo nanodispenser e il lipopolisopopo, utilizzando una concentrazione di 1x come raccomandato dal produttore. Del diluente raccomandato (mezzo senza siero), 15-4.000 nL è stato utilizzato con 10-100 ng quantità di plasmide rosso-fluorescente (tdTomato). L'efficienza della trafezione è stata determinata 48 h dopo la trasfezione utilizzando un software di analisi basato su immagini. I risultati sono espressi come percentuale di cellule trasfetate per l'aumento della quantità di DNA, e il volume diluente mostra le condizioni ottimali: 30 ng di DNA totale con un volume diluente crescente e 1 :L di diluente con quantità di DNA crescenti. Le barre di errore rappresentano il SEM con n . Per l'analisi statistica sono stati utilizzati post-test ANOVA e Bonferroni bidirezionali. p < 0,05 rispetto ad altri punti. (B) Stabilità delle piastre di DNA preparate. Il diluente (1 L) è stato dispensato utilizzando il gestore del liquido peristale, e 30 ng di DNA sono stati erogati e immediatamente transettati utilizzando il reagente lipopolpuso dispensato da ADE (controllo) o immagazzinati a temperatura ambiente una volta asciugati o congelati a -20 gradi centigradi. Ai giorni 0, 2 o 7, il DNA secco è stato reidratato con 1 llcid di diluente erogato utilizzando il gestore liquido peristale, e le placche congelate sono state scongelate a temperatura ambiente e centrifuse (a 1.500 x g per 2 min). Le cellule sono state poi semiate utilizzando il gestore liquido peristaltico secondo il protocollo descritto. Le barre di errore rappresentano il SEM con n - 3. Per l'analisi statistica sono stati utilizzati post-test ANOVA e Bonferroni bidirezionali. ns - non significativamente diverso. (C) Efficienza della cotraflessione del DNA plasmid. Le cellule di HeLa sono state trafettate con 30 ng di plasmid mVenus e tdTomato caricato in due pozzi sorgente separati (utilizzando un rapporto di 1,7 di mVenus su tdTomato al fine di livellare la loro produzione di fluorescenza relativa). L'efficiencie di trasfezione è stata confrontata 48 h dopo la trasfezione utilizzando un software di analisi basata su immagini e sono state espresse come percentuale di cellule trasfette e una percentuale di cellule cotransfected all'interno della popolazione trasstata. La percentuale di cellule cotrafetta è stata determinata calcolando il numero di cellule che esprime il verde-fluorescenza nelle cellule della popolazione fluorescente rossa. Le barre di errore rappresentano il SEM con n - 3. Per l'analisi statistica sono stati utilizzati post-test ANOVA e Bonferroni bidirezionali. ns - non significativamente diverso. (D) Campi rappresentativi della microscopia a fluorescenza dall'acquisizione dell'immagine mostrata nel pannello C utilizzando tre canali fluorescenti (Hoechst, tdTomato e mVenus) acquisiti in sequenza da una piattaforma di imaging ( Tabelladei materiali ), utilizzando obiettivi 10x e un set di filtri di emissione adeguato (DAPI, dsRed e FITC, rispettivamente). Questa cifra è stata modificata da Colin etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Al fine di migliorare ulteriormente la produttività di questo protocollo, abbiamo poi esaminato se un deposito di lastre di sorgente precompilato con DNA e soluzioni diluenti potrebbe essere memorizzato e utilizzato in una fase successiva. Sono stati testati due modi per conservare in modo efficiente il DNA, vale a dire la conservazione a secco della piastra lasciandola asciugare sul banco o lo stoccaggio congelato (a -20 gradi centigradi). Entrambi i metodi di conservazione non hanno portato a risultati significativamente diversi rispetto alla soluzione di DNA appena erogata immagazzinata per un massimo di 7 giorni (Figura6B),ed entrambi i metodi hanno reso possibile l'esecuzione della trasfezione da piastre precompilate di DNA immagazzinate, ad esempio una banca di Plasmidi.

Infine, poiché la trasfezione plasmide si verifica più spesso utilizzando almeno due plasmidi diversi, abbiamo poi esaminato la capacità di multiplexing del DNA del protocollo qui presentato utilizzando le migliori condizioni identificate (1 - L di diluente e 30 ng di DNA). Il plasmide tdTomato rosso-fluorescente-espressione delle proteine, usato in precedenza, è stato modificato per esprimere mVenus, una proteina fluorescente giallo brillante, ed entrambi sono stati poi utilizzati nei tentativi di co-traduzione. L'analisi delle cellule rosso-o verde-fluorescente-positiva (Figura 6C) ha mostrato che l'efficienza della trasfezione è di circa l'80%; tuttavia, nella popolazione rossa, quasi il 100% delle cellule sono state cotransigiate anche con il plasmide che esprime il mulO, come si può vedere nell'analisi rappresentativa delle immagini basate su software della Figura 6D.

Figura supplementare 1: Diagramma che mostra un'altezza di eroga adatta per la goccia di toccare la parte inferiore del pozzo per evitare la sua ritenzione sulla punta di erogazione. Sulla sinistra, le impostazioni appropriate consentono alla caduta di diffondersi sulla superficie del pozzo evitandone la ritenzione sulle punte di erogazione. Sulla destra, cattive impostazioni portano alla ritenzione di goccioline che può essere osservata durante il movimento della testa al prossimo crudo. Clicca qui per scaricare questa figura.

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Discussion

L'istituzione e l'ottimizzazione di un accurato metodo di trasflessazione ad alto throughput per una determinata linea cellulare richiedono agli scienziati di seguire alcuni parametri chiave descritti in questa sezione. Incoraggiamo vivamente a partire dai valori raccomandati in tutto il protocollo poiché queste impostazioni ottimizzate per le cellule HeLa si sono dimostrate efficienti anche per le cellule HEK. Tuttavia, poiché i parametri migliori possono dipendere dalle linee cellulari e dai reagenti di trasfezione, le condizioni ottimali possono essere definite variando il numero di cellule, il volume diluente, la quantità totale di DNA e la natura della reagente di trasfezione, la concentrazione o anche il volume utilizzato come caso durante l'ottimizzazione di questo protocollo per le celle HeLa1.

Il protocollo complessivo qui presentato è stato sviluppato e ulteriormente ottimizzato per consentire la trasfezione cellulare anche dai principianti sul campo. Per raggiungere questo obiettivo, sono stati sviluppati strumenti chiave per rendere il protocollo il più semplice possibile ed evitare errori umani: una macro di foglio di calcolo user-friendly per progettare facilmente l'esperimento e un'applicazione tablet per guidare l'utente a riempire correttamente la fonte numero/i.

Pertanto, per garantire l'affidabilità del protocollo, devono essere controllati solo pochi passaggi critici: i) un'adeguata progettazione sperimentale; ii) le adeguate dispensazioni peristalitiche dal classico gestore di liquidi peristalitici; iii) le adeguate dispensazioni acustiche per il reagente di DNA e trasfezione; iv) evitare la centrifugazione della piastra di origine prima della dispensazione del reagente di trasfezione come quella che sembrava compromettere la trasfezione. Seguendo queste poche raccomandazioni garantirebbe l'efficiente trasfezione delle cellule.

Progettazione sperimentale adeguata

La configurazione sperimentale è stata resa user-friendly dallo sviluppo del foglio di calcolo macro che deve solo essere riempito con il nome di plasmids DNA previsto, quantità desiderata, e alcuni valori chiave dei parametri. Una volta riempita, la macro analizza prima i parametri inseriti per rilevare potenziali errori, come i volumi minimi e massimi idonei inseriti per i pozzi di origine e il volume di dispensazione del reagente di trasfezione. Inoltre, in base alle concentrazioni di DNA inserite in ciascuna delle quattro possibili righe e alla quantità di plasmid inserita nei campi sottostanti, la macro verifica se i volumi attesi da erogare sono multipli di 2,5 nL (volume delle gocce erogate dal nanodispenser). Una volta eseguito un controllo per eventuali errori, la macro calcola la quantità totale di ogni campione di DNA che dovrà essere dispensato e, quindi, progetta il modello di piastra di origine (ordinando i nomi del DNA in ordine alfabetico). I volumi indicati nelle piastre di origine tengono conto dei volumi di lavoro attesi in un pozzo sorgente (calcolati in base ai valori di volume minimi e massimi riempiti nel foglio modello). Tutte le dispensazioni di DNA attese in ciascuno dei pozzi vengono poi scritte sul foglio di raccolta del DNA. L'elenco dei pozzi trasfettati dal DNA viene quindi utilizzato per scrivere il foglio TR-picklist utilizzando il volume del reagente di trasfezione indicato sul foglio modello. I volumi calcolati sul foglio di piastra di origine vengono quindi trasferiti al foglio di guida di tubazione a 384 pozzi. I dati del PROGRAMMA di selezione del DNA, del TR-picklist e della guida alla pipettatura a 384 pozzi vengono quindi utilizzati per generare i file corrispondenti nel formato .csv.

Corretta soppressione del DNA e del TR sulla lastra di origine

Poiché l'erogazione su una piastra di origine 384-pozzi e, più specificamente, individuare il pozzo di destinazione può promuovere errori e sono inoltre dispendiosi in termini di tempo, abbiamo sviluppato un'applicazione dedicata basata su tablet simile a iPipet21. A differenza di iPipet, quello qui descritto può essere utilizzato con Android (è supportata solo la versione Android 4.4 e versioni successive). Basato sul file 384-Wells-Pipetting-Guide.csv generato dal foglio di calcolo macro, aiuta l'utente nel processo di erogazione generale. Mentre il suo uso per alcuni dispensazioni non vale la pena, può essere interessante per risparmiare tempo ed evitare errori se un gran numero di DNA e TR dispensazioni sono attesi. Il file CSV deve contenere informazioni su ben, la piastra, il nome, la concentrazione e il volume. Questa applicazione potrebbe quindi essere utilizzata per altre applicazioni, come soluzioni di erogazione (reagenti, tintura, composto, ecc.) nel pozzo di destinazione, secondo un file csv dedicato dall'utente. Inoltre, consente all'utente di illuminare un'intera riga o riga inserendo le informazioni rilevanti nella colonna del pozzo di destinazione utilizzando il seguente formato previsto: Riga_1 (a 24) o Linea_A (a P).

Risoluzione dei problemi relativi alla scarsa efficienza di trasfezione cellulare

Diversi parametri descritti di seguito possono compromettere la trasfezione cellulare nel protocollo basato su ADE descritto e dovrebbero essere controllati e aggirati individualmente in caso di problemi di efficienza.

Uno dei primi parametri importanti per la trasfezione è la qualità delle cellule e la densità utilizzata durante la semina. Anche se ogni tipo di cella richiederà parametri diversi, alcuni di essi devono essere rispettati per garantire una trasfezione di successo. Prima di tutto, la sospensione cellulare deve essere preparata in modo estemporaneo da una piastra subconfluente per evitare lo stress cellulare prima della trasfezione, e non deve essere lasciata sdraiata sul banco per troppo tempo (2 h massimo). In secondo luogo, la densità di semina delle cellule deve essere abbastanza bassa per due motivi: per evitare i contatti cellulari e promuovere un'alta superficie cellulare una volta diffusa, ma anche perché la divisione attiva delle cellule meglio occupano acido nucleico estraneo22,23. Sfortunatamente, la densità cellulare ottimale per la trasfezione varia a seconda dei tipi di cellule e della tecnologia di trasfezione e deve essere determinata per ogni linea cellulare. Si tratta di parametri cruciali per garantire una trasfezione efficace.

Un altro parametro importante che può modulare l'efficienza della trasfezione è il numero di passaggio cellulare24. Infatti, le cellule in coltura sono continuamente soggette a evoluzione a causa della concorrenza e della selezione naturale. È risaputo che l'espressione genica differenziale tra i numeri di passaggio cellulare basso e quello alto è prevista nella maggior parte delle linee cellulari a causa della dedifferenziazione all'aumentare del numero di passaggio. A seguito di questo fenomeno, l'efficienza della trasfezione può anche essere influenzata. Tuttavia, gli effetti relativi al passaggio hanno dimostrato di essere fortemente dipendenti dalla linea cellulare e dalle condizioni di coltura. Per di più, ciò che è considerato un livello di passaggio "alto" varia da una linea cellulare all'altra. Ciò significa che l'intervallo di numeri di passaggio in cui è possibile eseguire in modo affidabile una serie di esperimenti deve essere determinato per ogni linea cellulare.

Un altro parametro che accresce la difficoltà nel determinare le migliori condizioni per la trasfezione è che la composizione media di coltura gioca anche un ruolo cruciale poiché la presenza di siero e/o antibiotici modulano l'efficienza della trasfezione. Infatti, la maggior parte dei protocolli commerciali raccomanda l'uso di un mezzo senza siero durante la fase di trasfezione per migliorare l'efficienza o aggirare i problemi di scarsa efficienza3,25,26,27. Tuttavia, questo parametro è davvero più complesso da comprendere in quanto è stato dimostrato che, per una determinata linea cellulare, i passaggi precoci rispetto a quelli tardivi possono migliorare o ridurre l'efficienza a seconda della presenza o dell'assenza del siero28. Altri ricercatori preconizzano l'uso di un mezzo privo di antibiotici per il passaggio prima della trasfezione durante la coltura delle cellule, al fine di ottenere cellule di alta qualità per la trasfezione29. Per concludere, quando si ottimizzano le condizioni di trasfezione per un determinato tipo di cellula, ciascuno di questi parametri deve essere testato: celle di passaggio precoce o tardivo e l'uso di un mezzo con o senza siero durante l'ultimo passaggio prima della raccolta delle cellule e/o durante il passo di trasfezione stesso.

Durante l'ottimizzazione del protocollo qui presentato, sono stati utilizzati due tipi di reagente: un reagente liposomico che forma complessi liposomici e reagente lipopoliplex, un composto polimerico non liposomal1. Mentre abbiamo avuto successo per anni traducendo manualmente le cellule HeLa con la prima, scarsa efficienza di trasfezione è stata osservata nell'attuale protocollo automatizzato. Ciò era probabilmente dovuto a una fase di vortice necessaria durante la miscelazione del DNA con il reagente di trasfezione che non può essere eseguito nel formato piastra 384-well. Il lipopolispopo non ha bisogno di un tale passo e, quindi, ha portato a maggiori efficienze di trasfezione in tutte le impostazioni testate. Anche se questo non è stato confermato nello studio attuale, evitare reagenti di trasfezione che richiedono un passaggio di miscelazione fisica tale ha pipettaggio o vortice probabilmente porterà a risultati migliori.

Consigliamo inoltre l'uso di un reagente di trasfezione compatibile con la trasfezione inversa poiché il protocollo presentato si basa su una trasfezione inversa. Alcune cellule sono noti per essere difficile da tradurre e alcuni composti chimici dedicati sono sviluppati per promuovere una maggiore efficienza di trasfezione30,31. Se si mira a tradurre cellule da difficile da trafetti, si consiglia di testare i reagenti di trasfezione dedicati a cellule o cellule, supponendo che la trasfezione inversa sia fattibile con queste.

Diversi parametri descritti nei paragrafi sottostanti possono avere un impatto e compromettere in qualche modo il processo di erogazione ADE, eventualmente rovinando l'esperimento finale.

Il nanodispenser è stato sviluppato per erogare goccioline da 2,5 nL da pozzi di sorgente riempiti con 3-12 - L di buffer acquoso (cioè 9 volume di lavoro). Il dispositivo nanodispenser utilizzato in questo studio integra una tecnologia dinamica di analisi dei fluidi per la determinazione della composizione dei fluidi e dell'altezza del liquido nella piastra di origine al fine di controllare la potenza necessaria per espellere goccioline da 2,5 nL19. Durante il riempimento manuale della piastra di origine o utilizzando un gestore liquido peristaltico classico, i volumi spesso non sono così accurati di quelli determinati dall'analisi dinamica dei fluidi. Questo è un punto cruciale da prendere in considerazione in quanto il dispositivo non è in grado di erogare dai pozzi di origine caricati con più di 12 l. Così, la loro presenza comprometterebbe l'esperimento. Naturalmente, un elenco dei dispensazioni eseguite può essere generato alla fine del programma, ma questo richiede all'utente di regolare i volumi ed eseguire un programma per recuperare solo i dispensazioni perse. Per evitare questi disaccordi, si consiglia di eseguire un "sondaggio" una volta che i plasmidi di DNA sono stati caricati per verificare il volume previsto in ogni bene interessato.

Un parametro cruciale per l'espulsione delle goccioline è la variazione della tensione della superficie liquida17,32. Le soluzioni del DNA d'acqua sono note per la loro viscosità; ciò potrebbe compromettere il processo di erogazione da parte di ADE. Mentre i parametri fisici non sonostati determinati nel nostro studio precedente 1, concentrazioni più elevate di soluzioni di DNA nella piastra di origine hanno portato a una minore efficienza di trasfezione, anche per la stessa quantità totale di DNA erogato, probabilmente a causa di questo fenomeno. Per ottenere i migliori risultati, si consiglia di utilizzare una diluizione plasmide di 100 ng/L per ottenere i migliori risultati, anche se altre concentrazioni potrebbero essere testate per comodità dell'utente. Per garantire una corretta ADE con la concentrazione di DNA necessaria per l'utente, è possibile aggiungere un coloranti alla soluzione per monitorare l'espulsione delle goccioline nei pozze o, ancora meglio, sul coperchio della piastra. Poiché il primo obiettivo del protocollo presentato era quello di ottenere un'elevata produttività, sono stati utilizzati kit di minipreparazione del DNA plasmide a basso costo basati su minicolonne compatibili con i protocolli di purificazione del plasmide a piastre. Mentre ha funzionato correttamente durante l'esecuzione dell'esperimento, in caso di bassa efficienza e scarsa vitalità cellulare dopo la trasfezione, si raccomanda di utilizzare metodi di purificazione del DNA di qualità superiore come midi- o maxi-preparati o anche endotossina-free kit disponibili in commercio che garantirebbero una migliore purezza del DNA e una minore tossicità per le cellule33.

Risoluzione dei problemi relativi alla trasfezione cellulare inomogenea sulla superficie del pozzo

I primi tentativi durante la configurazione del protocollo hanno portato alla trasfezione cellulare solo al centro dei pozzi, dove le gocce sono state inviate dall'ADE. Infatti, abbiamo notato che la miscela di DNA e trasfezione non si stava diffondendo su tutta la superficie del pozzo e si stava asciugando prima dell'aggiunta delle cellule a causa dei bassi volumi erogati (appena 500 nL). Per aggirare questo problema, è stata aggiunta una fase di erogazione diluente per consentire alla miscela DNA/TR di diffondersi su tutti i pozzi prima dell'aggiunta cellulare. Ciò ha provocato una trasfezione cellulare omogenea nel pozzo. Così, quando si riproduce l'esperimento e la miscela DNA/TR non si diffonde su tutti i pozzi, il volume diluente può essere regolato in base alle esigenze dell'utente.

Poiché il gestore del liquido acustico può distribuire volumi nella gamma nanolelicottere, il metodo descritto potenzialmente non ha limitazioni tecniche. Tuttavia, abbiamo notato che i pozzi acquosi e pieni di soluzioni sono soggetti a evaporazione, che potrebbe rappresentare una limitazione. Se i volumi esatti da erogare vengono abbassati da questa evaporazione, la nano-espensing non verrà eseguita fino alla fine prevista. In questo caso, viene generata una segnalazione errori dal nanodispenser. Per aggirare questo problema, utilizzare volumi più elevati del previsto rimanendo nell'intervallo superiore accettabile (in effetti, inferiore a 12 l). Tuttavia, se l'evaporazione porta alla compromissione di alcune dispensazioni, viene generata una segnalazione di errore dal nanodispenser. Questo file può essere utilizzato per riempire la piastra di origine con un nuovo reagente da erogare sui pozzi di destinazione interessati. Fare questo in un breve intervallo di tempo non sembra compromettere l'efficienza della trasfezione.

Il protocollo qui descritto è il primo ad ottenere tale produzione per le trasfetazioni indipendenti di DNA plasmid. Le migliori tariffe raggiunte prima erano per 288 diverse condizioni che richiedevano competenze altamente specializzate da eseguire contemporaneamente15. Questo, oltre alla sua elevata produttività, l'attuale protocollo ha altri vantaggi significativi in quanto il processo complessivo è stato ottimizzato per consentirne l'utilizzo da parte di non specialisti e strumenti sono stati sviluppati per evitare errori, vale a dire i) una macro di foglio di calcolo dedicato che consente la facile progettazione del modello sperimentale, ii) la generazione automatica del DNA corrispondente e del modello di lastre di origine reagente di trasfezione da questa macro, iii) la generazione di due file pronti all'uso per controllare i dispensazioni software-driven del DNA reagente di trasfezione dal dispositivo nanodispenser, e iv) l'esportazione di un file "384-well pipetting guide" corrispondente alle piastre di origine progettate, per essere utilizzato da un'applicazione dedicata basata su tablet anche sviluppato al fine di evitare errori umani mentre erogazione nelle lastre di origine 384-pozzi.

Miglioramenti futuri del protocollo

Al fine di migliorare la produttività e la riproducibilità, la piastra di origine riempita con plasmidi potrebbe essere conservata a 4 gradi centigradi o congelata come di consueto per le soluzioni di riserva di DNA. Inoltre, abbiamo dimostrato che la piastra di destinazione precaricata precompilata con DNA può anche essere conservata asciutta o congelata per almeno 7 giorni prima di aggiungere il reagente di trasfezione e le cellule, portando al miglioramento della produttività complessiva e alla facilità del protocollo. La conservazione del DNA da più di 4 anni è stata precedentemente segnalata utilizzando supporti ottimizzati34 e dovrebbe, pertanto, essere testata nel contesto di questo protocollo in quanto lo spingerà un ulteriore passo avanti, consentendo lo stoccaggio a lungo termine delle piastre precompilate con le banche di plasmidi e pronti all'uso negli esperimenti di trasfezione.

In precedenza abbiamo dimostrato che le condizioni di trasfusione ottimali identificate potevano esseretrasferite a esperimenti su scala superiore, da 96-po a 10 cm di coltura, calcolando la quantità di DNA, il volume della reagente di trasfezione e la densità cellulare che dovrebbe essere utilizzato in base al protocollo ottimizzato a 384 bengeti. Poiché la dispensazione a piastre 1536-well è gestibile anche dal nanodispenser, il protocollo può essere eseguito anche su una scala inferiore, migliorando così la sua produttività. Tuttavia, una delle principali limitazioni per raggiungere questo formato è la capacità di erogare le cellule e gestire la lettura finale in un formato così miniaturizzato. L'erogazione cellulare da parte di ADE è già stata eseguita con successo nel formato piastra 1536-well35 utilizzando una soluzione di densità neutra che impediva la semina delle cellule e garantiva la stessa densità di cellule nel tempo. Sulla base del numero di cella utilizzato qui e il rapporto di superficie di 384 (0,056 cm2) contro 1536 pozze (0,025 cm2),500-650 cellule verrebbero erogate in quest'ultimo formato. Tale intervallo di numeri di dispensazione cellulare ha dimostrato di essere altamente affidabile se viene utilizzata una soluzione concentrata 14%-18% di densità neutra. In queste impostazioni, 100 nL di sospensione cellulare sarebbero distribuiti su 1536 pozzi. Con una soluzione di lavoro di 5-8 l in tali pozzi, l'aggiunta di 5-8 L di mezzo di coltura utilizzando i classici gestori di liquidi peristalici diluirebbe la soluzione antiseeding a meno dello 0,3%, consentendo così una corretta semina cellulare. La traduzione di cellule su una scala così bassa sembra quindi tecnicamente possibile; tuttavia, l'effetto della concentrazione residua della soluzione a densità neutra sull'efficienza della trasfezione rimane da determinare da ulteriori lavori.

L'utilizzo di tipi di lamiere con volumi di lavoro più elevati per erogare le cellule, come le lastre di sorgente in polipropilene 384-well con un volume di lavoro di 45 gradi, consentirebbe dispensazioni di soluzione cellulare da 100 nL da soli quattro pozze per una piastra complessiva di 1536 pozze. Inoltre, i nuovi nanodispenser sono in grado di erogare gocce di 25 nL invece del 2,5 nL utilizzato in questo protocollo. Questa dimensione di goccia, quindi, divide 10 volte il tempo di erogazione, ma implica l'uso di multipli di 25 volumi nL che, tuttavia, rimangono compatibili con i diversi volumi erogati nel protocollo qui presentato.

Sulla base di questi ultimi lavori e miglioramenti tecnologici, un'ulteriore fase di erogazione delle cellule ADE per ottenere una trasfezione di piastra 1536-pozzo potrebbe essere facilmente aggiunto al protocollo attuale. Tuttavia, raggiungere tali miniaturizzazioni vale la pena solo se il bioassaggio è concomitante fattibile in un formato così miniaturizzato.

In conclusione, abbiamo sviluppato un metodo di trascostitura semplice, ad alta produttività e accurato, con diversi vantaggi grazie alla miniaturizzazione: (1) abbassando i costi di reagente della trasfezione; 2) ridurre lo spreco di preparati di DNA; (3) garantire che anche i principianti possano eseguire con successo la trasfezione cellulare. In effetti, richiede solo pochi semplici passaggi manuali, vale a dire diluire il DNA a 100 ng/ prima del seming. Il nanodispenser basato su ADE è responsabile della somministrazione di dose e del multiplexing dei plasmidi, che richiede tempo e di errore e del multiplexing dei plasmidi, secondo il modello fornito dell'esperimento.

Inoltre, mentre questo protocollo potrebbe garantire la maggior parte degli intenti biologici di base degli esperimenti classici di trasfezione, potrebbe anche aprire nuove strade per esperimenti basati su array. Ad esempio, esprimere o abbattere ogni gene di codifica delle proteine umane dalla raccolta umana ORFeome36 o dagli approcci basati sulla libreria CRISPR-Cas937, rispettivamente, richiederebbe meno di 24 h su una piattaforma automatizzata dedicata (53 x 384- piastre di bene), piuttosto che 2-3 giorni di lavoro umano, assumendo l'uso di una banca di piastre precaricate di DNA. Grazie alla sua elevata efficienza e alle prestazioni ad alta produttività, il protocollo qui presentato potrebbe anche essere in grado di ottenere nuovi approcci non di poolper per gli studi basati su CRISPR-Cas9 con librerie gRNA/plasmidi espressi da CRISPR-Cas9. In effetti, i cambiamenti lievi del fenotipo cellulare, che attualmente non possono consentire la fase di smistamento delle cellule richiesta, sarebbero finalmente gestibili, come un pozzo rappresenterebbe un gene bussato.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori hanno rivelato una ricevuta del seguente sostegno finanziario per la ricerca, la paternità e/o la pubblicazione di questo articolo: Inserm, Lille University, Lille Pasteur Institute, Conseil Régional du Nord, e PRIM-HCV1 e 2 (P Interdisciplinaire sur le Médicament), Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-EQPX-04-01), la Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) e la Comunità Europea (ERC-STG INTRACELL nTB 260901). Gli autori desiderano ringraziare il Dr. S. Moureu, il Dr. B. Villemagne, il Dr. R. Ferru-Clément e il Dr. H. Groult per la loro revisione critica e le correzioni del manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384LDV Microplate Labcyte LP-0200
384-well Microplate μClear Black Greiner 781906
Ampicilin Sigma A9393-5G Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector
Android Tablet Samsung Galaxy Note 8 used to guide the user while the source plate manual dispense
Aniospray Surf 29 Anios 2421073 disinfectant to clean the MicroFlo head
Columbus software Perkin Elmer image analysis software
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10566032 cell culture medium
Echo Cherry Pick 1.5.3 software Labcyte Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software
Echo550 Labcyte ADE-based dispenser
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 to add in cell culture medium
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L to fix cell
HeLa cells ATCC HeLa (ATCC® CCL-2™)
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570 10 mg/mL Solution in Water
INCell Analyzer 6000 GE Healthcare 29043323 automated laser-based confocal imaging platform
LB medium Thermoischer Scientific
LB Broth Base (Lennox L Broth Base)®, powder		 12780052 culture medium for bacteria growth
Lysis Buffer (A2)  Macherey-Nagel 740912.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
MicroFlo 10µL cassette Biotek Instruments Inc 7170013 to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo 1μL cassette Biotek Instruments Inc 7170012 to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo Dispenser Biotek Instruments Inc 7171000 peristaltic pump-based liquid handler device
Microvolume spectrophotometer Denovix DS-11 Spectrophotometer Measure the DNA concentration of samples
mVenus plasmid mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus
Neutralization Buffer (A3)  Macherey-Nagel 740913.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
NucleoSpin Plasmid kit Macherey-Nagel 740588.50 used to prepare plasmid from bacterial culture
Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
optional Wash bufferWash Buffer (A4) Macherey-Nagel 740914.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
orbital shaker  incubated large capacity shaker 444-7084 Used to grow bacteria under gentle agitation and 37°C
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 10,000 U/mL
Phosphate-Buffered Saline Thermo Fisher Scientific 10010001
Plasmid mini-columns Macherey-Nagel 740499.250 Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture
Resuspension Buffer (A1)  Macherey-Nagel 740911.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
RNAse A Macherey-Nagel 740505 Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
tdTomato-N1 plasmid Addgene Plasmid #54642 Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato 
TransIT-X2 Dynamic Delivery System Mirus Bio MIR 6000
Wash Buffer (AW) Macherey-Nagel 740916.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
3D printer Creality CR10S used to print the plate adapter
Blender Software   https://www.blender.org/
Free software under GNU General Public License (GPL).		 version 2.79b used to design the plate adapter

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References

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Retrazione numero 150 espulsione acustica delle goccioline alta produttività trasfezione plasmide di DNA cellule di mammiferi manipolazione del liquido proteina fluorescente
Plasmid di DNA ad alto throughput e trasfezione utilizzando la tecnologia di nanoedispensing acustico
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Colin, B., Rocq, N., Deprez, B., Couturier, C. High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology. J. Vis. Exp. (150), e59570, doi:10.3791/59570 (2019).

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