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Genetics

Multiplexação e transfecção de plasmídeo de DNA de alta produtividade usando tecnologia de Nanodosagem acústica

Published: August 8, 2019 doi: 10.3791/59570
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Institut Pasteur de Lille, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) U1177, Drugs and Molecules for Living Systems, Université de Lille, 2L'atelier du Développeur, Marquette lez Lille

Summary

Este protocolo descreve o transfection do plasmídeo da elevado-produção de pilhas de mamíferos em uma placa 384-well usando a tecnologia acústica da ejeção da gota. O tempo-demorado, erro-propenso a dispensar e Multiplexing do ADN, mas igualmente a dispensação do reagente do transfection, são software-driven e executado por um dispositivo do nanodispenser. As células são então semeadas nestes poços pré-preenchidos.

Abstract

O transfection da pilha, indispensável para muitos estudos biológicos, exige controlar muitos parâmetros para uma realização exata e bem sucedida. Na maioria das vezes realizada em baixa taxa de transferência, é, além disso demorado e propenso a erros, ainda mais quando multiplexar vários plasmídos. Nós desenvolvemos um método fácil, rápido, e exato executar o transfection da pilha em um layout da placa de 384 poços usando a tecnologia acústica da ejeção da gota (ADE). O dispositivo do nanodispenser usado neste estudo é baseado nesta tecnologia e permite a entrega precisa do nanovolume na alta velocidade de uma placa do poço da fonte a um destino um. Pode dispensar e Multiplex o ADN e o reagente do transfection de acordo com uma folha de cálculo pré-definidos. Aqui nós apresentamos um protocolo óptimo para executar o transfection do plasmídeo da elevado-produção baseada em ADE que faz possível alcangar uma eficiência de até 90% e um Cotransfection de quase 100% em experimentos do Cotransfection. Estendemos o trabalho inicial propondo uma macro baseada em planilhas de fácil utilização, capaz de gerenciar até quatro plasmímetros/poços de uma biblioteca contendo até 1.536 plasmímetros diferentes e uma aplicação de guia de pipetagem baseada em Tablets. A macro projeta os modelos necessários da placa de origem (s) e gera os arquivos prontos para uso para o aplicativo baseado em Tablet e nanodispenser. O protocolo da transfecção de quatro etapas envolve i) um diluente dispensar com um manipulador líquido clássico, II) distribuição e multiplexação do plasmídeo, III) um reagente do transfection dispense pelo nanodispenser, e IV) chapeamento de pilha nos poços pré-preenchidos. O controle software-baseado descrito da multiplexação e do transfection do plasmídeo do Ade permite mesmo especialistas no campo de executar um transfection de pilha de confiança em uma maneira rápida e segura. Esse método permite a rápida identificação de configurações ideais para um determinado tipo de célula e pode ser transposta para abordagens de maior escala e manual. O protocolo facilita aplicações, como a proteína ORFeome humana (conjunto de quadros de leitura abertos [ORFs] em um genoma) ou a validação da função gênica baseada em CRISPR-Cas9, em estratégias de triagem não agrupadas.

Introduction

O método aqui apresentado descreve detalhadamente como realizar a multiplexação e transfecção de plasmídeo de DNA em células de mamíferos com alta taxa de transferência usando um nanodispensador líquido acústico em uma placa de 384 poços, mesmo para não especialistas no campo. Este método publicado recentemente1 permite executar tanto quanto 384 condições independentes da multiplexação e do transfection do ADN do plasmídeo em um experimento, em menos de 1 h. os únicos ou os experimentos do Cotransfection eram bem sucedidos, alcançando uns 100% próximos Cotransfection dentro da população transfected das pilhas. Esse protocolo facilita a transfecção porque a maioria dos passos tediosos, demorados e propensos a erros agora são acionados por software (consulte a Figura 1 para obter uma visão geral). Mais esforços foram feitos para desenvolver ferramentas dedicadas para melhorar a facilidade de uso, evitando erros humanos durante o processo geral e para promover a transfecção bem-sucedida, mesmo para os não-especialistas no campo. O protocolo descrito inclui uma planilha de macro "fácil de usar" que desenvolvemos a fim de gerenciar 384 condições de transfecção independentes com possibilidades de multiplexação de até quatro plasmídos em cada poço. A macro gera automaticamente modelos de placas de origem para carregar o volume de plasmídeo de DNA esperado de iniciar soluções de estoque e os arquivos necessários para conduzir o software nanodispenser sobre o experimento que foi introduzido. Como a dispensação manual do DNA em uma placa de fonte 384-well é tedioso e propenso a erros, também desenvolvemos um aplicativo baseado em Tablet dedicado para orientar o usuário ao dispensar a solução de DNA de acordo com o modelo.

Figure 1
Figura 1: fluxo de trabalho experimental. Representação esquemática do protocolo de transfecção reversa de alta taxa de transferência automatizada ideal (do experimento experimental para o ensaio biológico personalizado). As etapas manuais são indicadas pelo símbolo da mão e o tempo aproximado para cada etapa é escrito em uma caixa vermelha. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Muitas experiências Cell-Based começam com o transfection do ADN do plasmídeo, e mesmo se muitos reagentes dedicados foram e estão sendo desenvolvidos ainda para realçar a eficiência do transfection e/ou facilitar o procedimento, muito resta ser feito2,3 , 4. o transfection da pilha do plasmídeo do ADN envolve diversas etapas para alcangar a eficiência elevada, tal como uma tomada complexa inicial, um escape endosomal, e um transporte cytoplasmic ao núcleo5,6. Além de precipitação de cálcio ou técnicas físicas, como eletroporação ou microinjeção usando dispositivos dedicados7, métodos químicos modernos têm focado em melhorar a entrega de células de DNA, reduzindo a citoxicidade celular8, a 9. O uso de lipídios ou polímeros catiônicos formando complexos liposemelhantes e, mais recentemente, os sistemas de química polimérico não-Liposomal tornaram a transfecção mais fácil e eficiente10. Apesar destes desenvolvimentos, o transfection da pilha ainda exige habilidades específicas ser executado exatamente como a maioria destes protocolos físicos ou químicos do transfection exigem cientistas de preparar manualmente cada condição da reação do transfection do ADN, assim prejudicar a taxa de transferência. Para contornar esse problema, os protocolos de transfecção reversa foram desenvolvidos usando reagentes de transfecçãoquímica 11,12,13, permitindoao usuário testar ou combinar vários plasmídos de forma mais rápida. Nestes protocolos, os complexos de ácidos nucleicos com reagentes de transfecção são formados antes da semeadura das células nos complexos. No entanto, esses protocolos inversos ainda são limitados pelo manuseio manual de soluções de DNA e pela combinação de cada uma das condições independentes. Embora seja viável para realizá-los em um formato de placa 96-well, a preparação de DNA e dispensa será tedioso, e provavelmente haverá erros. Quando as quantidades diferentes de diversos plasmídeos do ADN são exigidas e multiplexados com se, o transfection da pilha se torna ainda mais duro de conseguir e mais demorado, e os erros humanos tornam-se completamente inevitáveis. Escalar até o formato da placa 384-well em uma aproximação reversa do transfection, apesar de poucas condições multiplexados do transfection do ADN, transforma-se um desafio impossível devido às seguintes razões. i) as quantidades de ADN, o reagente de transfecção ou os volumes de mistura de reacção a gerir são inferiores a 1 μL para cada poço. II) a multiplexação de plasmídeos para 384 condições independentes torna-se extremamente complicada. A entrega em cada um dos 384 poços também é III) altamente demorado e IV) propenso a erros. De fato, dispensar a solução certa nos poços esperados é difícil de administrar, pois os volumes baixos já dispensados não permitem o monitoramento visual entre os poços vazios e já preenchidos. v) finalmente, há um alto risco de secagem da mistura por evaporação antes que as células sejam adicionadas devido ao tempo necessário para realizar as etapas de dispensação necessárias. Em resumo, o fator limitante para configurar ensaios de transfecção de plasmídeo de DNA de alta taxa de transferência parece ser a miniaturização do ensaio, o que implica a multiplexação e o gerenciamento de baixo volume que não podem ser manuseados manualmente, mas também dificilmente alcançáveis em um maneira de confiança por manipuladores líquidos Peristatic clássicos.

Como prova de dificuldade para automatizar tais ensaios e obter alta taxa de transferência, apenas algumas tentativas de automatização da transfecção foram publicadas até agora: um formato de placa de 96 poços usando um dispositivo comercial de manuseio de líquidos e uma precipitação de fosfato de cálcio14 e, mais recentemente, um reagente lipoplex, e um chip microfluídico permitindo 280 Transfections independentes15 , mas exigindo habilidades especializadas neste campo. Outro método, acoustophoresis, permitindo a levitação líquida e conduzindo à manipulação e à mistura fluidas, foi usado para executar o transfection do ADN em 24-aos formatos da placa de 96-well16. Embora viável, esta aproximação sofre de uma taxa de transferência extremamente baixa como a mistura das pilhas com a mistura do transfection do ADN exige uma incubação de 60 s para cada único ponto antes de semear. Isso implica uma duração de pelo menos 96 min para uma placa completa de 96 poços. Além disso, este protocolo está longe de ser passíveis ao público geral dos biólogos como este trabalho foi feito com um dispositivo interno projetado e manufacturado que não esteja atualmente disponível no mercado. Pelo contrário, nos últimos anos, uma tecnologia de dispensação acústica baseada em software fácil de usar surgiu com dispositivos de dispensador de nanovolume. Usando a energia acústica focalizada, estes dispositivos permitem a ejeção firmemente controlada de volumes líquidos pequenos de 2,5 nL a 500 nL de uma placa da fonte a um destino um17. Esta tecnologia, chamada de ejeção de gotas acústicas (ADE), tem inúmeras vantagens: é totalmente automatizada, sem contato, tipless, precisa, precisa e altamente reprodutível, e tem uma alta taxa de transferência18. Primeiro dedicado à entrega de soluções de dimetil sulfóxido (DMSO), as configurações foram aprimoradas para dispensar buffers aquosos19. Os nanodispensadores acústicos, então, parecem adequados para protocolos de transfecção de células reversas e podem contornar a maioria das limitações manuais acima mencionadas. Como nenhuma tentativa do transfection do plasmídeo foi descrita previamente usando esta tecnologia, nós avaliamos recentemente a adequação de um sistema de distribuição acústico-baseado para executar o transfection reverso da pilha.

Aproveitando-se da taxa de transferência do nanodispenser e da facilidade de utilização, nós otimizamos um protocolo reverso do transfection para pilhas de HeLa por testes cruzados diversos parâmetros que podem influenciar o transfection do ADN em uma placa 384-well, única, a saber, a quantidade total do ADN e concentração inicial do ADN da fonte, volume do diluente, reagente do transfection, e número de pilhas da propagação. O protocolo desenvolvido contorna as limitações manuais acima descritas do Transfection da pilha e apresenta diversas vantagens sobre outras tentativas automatizadas do transfection. Em primeiro lugar, é miniaturizado, permitindo assim o reagente de transfecção rentável, salvando as preparações de plasmídeo de DNA e o reagente de transfecção. Em segundo lugar, é muito mais elevado-throughput e reprodutível do que o protocolo manual (mesmo para novatos), porque o transfection de uma placa inteira de 384-well pode ser conseguido em menos de 1 h. Finalmente, é orientado por software, permitindo o controle da quantidade de DNA dispensado e a multiplexação de vários plasmídos. Certamente, agradecimentos ao software do nanodispenser (tabela dos materiais), o usuário pode elaborar uma planta do estudo para controlar os volumes a ser dispensados de uma placa bem definida da fonte a um destino um.

O protocolo aqui apresentado destina-se principalmente àqueles que têm acesso a um nanodispenser e gostaria de configurar experimentos de transfecção em alta taxa de transferência, mas também para aqueles que desejam otimizar rapidamente seus parâmetros de transfecção para um determinado tipo de célula por Aplicando este protocolo para Cross-Test vários parâmetros em alta taxa de transferência. Na verdade, mostramos que os parâmetros otimizados identificados com este protocolo de nanoescala podem ser transpostos para experimentos de transfecção de maior escala e manuais. Finalmente, como o reagente do transfection usado no protocolo atual permite o transfection do ADN ou do siRNA de acordo com o fabricante, o protocolo é igualmente do interesse àqueles que visam executar aproximações da disposição para o superexpressão ou o knockdown do gene. As placas do destino pré-enchidas com o ADN podem ser conservadas até 7 dias antes do uso em um ensaio do transfection sem perda de eficácia, que é uma outra vantagem do seguinte protocolo para este tipo da aplicação.

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Protocol

1. preparações antecipadas

  1. Preparação dos programas de tratamento de líquidos peristálticos
    Nota: para o diluente e as etapas de dispensação da célula do protocolo, um programa dedicado deve ser preparado, tendo em conta a altura da cabeça dispensadora para a placa utilizada e a intenção da etapa.
    1. Para o passo de dosagem de diluente de 1 μL, monte uma gaveta de 1 μL e prepare um programa com as definições descritas nas etapas 1.1.1.1 e 1.1.1.2.
      1. Ajuste o parâmetro de vazão para alto para obter a melhor taxa de transferência, pois não é esperado nenhum dano de material biológico nesta etapa. Ajuste a altura de dosagem para 9,6 mm (de acordo com a placa de cultura de células utilizada, suplementar Figura 1) para permitir que a gota de 1 μl toque na parte inferior dos poços durante a dispensação.
        Nota: esta etapa é crucial para evitar a retenção das gotas na cabeça dispensadora até atingir um volume suficiente para soltar.
      2. Ajuste a altura desobstruída da placa a 14,4 milímetros para permitir um deslocamento livre da cabeça de dispensação sobre a placa após dispensar cada fileira. Controle visualmente as configurações apropriadas da altura da cabeça do manipulador líquido peristáltico: Certifique-se de que nenhuma gota seja mantida nas pontas de dosagem enquanto dispensa e verifique se a cabeça é suficientemente alta para permitir o deslocamento da cabeça após dispensar cada linha.
        Observação: evitar a retenção de queda é um parâmetro crucial, pois prejudicará a precisão do volume da dispensação.
    2. Para dispensar a suspensão da célula 40 μL, monte uma gaveta de 10 μL e prepare um programa com as definições descritas nas etapas 1.1.2.1-1.1.2.2.
      1. Ajuste o parâmetro de vazão para baixo para dispensar células com uma velocidade baixa para evitar a promoção de danos potenciais para as células por tensão de cisalhamento e alto impacto na parte inferior dos poços. Ajuste a altura de dispensação para 11,43 mm (de acordo com a placa de cultura de células utilizada, suplementar Figura 1), suficientemente alta para diminuir o impacto da célula na parte inferior dos poços durante o processo de dosagem, mas suficientemente baixo para evitar a retenção das gotas no cabeça de dosagem. Ajuste a altura desobstruída da placa a 16 milímetros para permitir o deslocamento livre da cabeça de dispensação sobre a placa após dispensar cada fileira.
      2. Controle visualmente as configurações apropriadas da altura da cabeça do manipulador líquido peristáltico: Certifique-se de que nenhuma gota seja mantida nas pontas de dosagem enquanto dispensa e verifique se a cabeça é suficientemente alta para permitir o deslocamento da cabeça após dispensar cada linha.
        Observação: evitar a retenção de queda é um parâmetro crucial, pois levará a dispensar um número de célula não confiável.
  2. Preparação do plasmídeo do ADN (protocolo clássico da extração do protocolo)
    1. Cresça uma cepa de bactérias DH5α transformada em meio LB suplementado com 125 μg/mL de antibiótico de seleção de ampicilina (tabela de materiais) durante a noite a 37 ° c e agitação suave (200 rpm) em um agitador orbital (tabela de materiais).
    2. Colher 2 mL da cultura, pellet as células por centrifugação por 5 min em 6.000 x g, e descartar o sobrenadante.
    3. Ressuscitem o pellet celular com 250 μL de tampão de ressuscipensão contendo RNase A (tabela de materiais). Adicionar 250 μL de tampão de Lise e incubar durante 5 min à temperatura ambiente, de acordo com as instruções do fabricante.
    4. Pare a reação de Lise adicionando 300 μL de tampão de neutralização (tabela de materiais) e vortexting em breve. Centrifugar os tubos durante 5 min a 11.000 x g.
    5. Coloque uma nova minicoluna de plasmídeo (tabela de materiais) em um tubo de coleta de 2 ml e decantar o sobrenadante na coluna por centrifugação por 1 min a 11.000 x g.
    6. Descarte o fluxo e coloque a minicoluna de volta no tubo de coleta.
    7. Lave a minicoluna de plasmídeo com 500 μL de tampão de lavagem opcional (tabela de materiais) e centrifugue durante 1 min a 11.000 x g, de acordo com as instruções do fabricante.
    8. Descarte o fluxo e coloque a minicoluna de plasmídeo de volta no tubo de coleta.
    9. Adicionar 700 μL de tampão de lavagem (tabela de materiais) suplementado com etanol e centrifugador por 1 min a 11.000 x g, de acordo com as instruções do fabricante.
    10. Descarte o fluxo e centrifugue a minicoluna de plasmídeo e seu tubo de coleta 1x mais por 2 min a 11.000 x g para secar a membrana de sílica.
    11. Coloque a minicoluna de plasmídeo seco num novo tubo de 1,5 mL e adicione 30 μL de água destilada pré-aquecido a 60 ° c, incubar-o durante 2 min à temperatura ambiente e, em seguida, centrifugue-o durante 1 min a 11.000 x g.
    12. Descarte a minicoluna de plasmídeo e mantenha o eluato contendo o plasmídeo de DNA purificado.
    13. Meça a concentração do ADN do ADN eluída usando um espectrofotômetro do microespectrômetro (tabela dos materiais).
      1. Ligue o espectrofotômetro e escolha as configurações de medição de DNA .
      2. Levante o braço de amostragem do espectrofotômetro e Pipete 1 μL de água para o pedestal de medição para realizar uma calibração em branco.
      3. Abaixe o braço de amostragem, inicie a medição em branco e aguarde a conclusão.
      4. Levante o braço de amostragem e limpe a amostra dos pedestais superiores e inferiores.
      5. Pipetar 1 μL da solução de ADN para o pedestal inferior para medi-lo.
      6. Abaixe o braço da amostragem, comece a medida da concentração do ADN, e espere a conclusão.
      7. Levante o braço de amostragem e limpe a amostra dos pedestais superiores e inferiores.
      8. Para medidas mais adicionais da concentração do ADN, repita etapas 1.2.13.5-1.2.13.7.
    14. Uma vez que as medidas são terminadas, armazene as soluções do ADN em 4 ° c até o uso.

2. projeto experimental e geração das listas de opções para impulsionar as dispensas baseadas em ADE

Nota: uma macro de planilha dedicada "amigável" foi desenvolvida para gerenciar quantidades de DNA e misturar até quatro plasmídos em um formato de placa de 384 poços. Baseado no projeto experimental entrado, esta macro gera os arquivos necessários para conduzir o protocolo ADE-based do transfection do ADN pelo nanodispenser. A fim gerar estes arquivos, diversos campos têm que ser preenchidos na folha do molde como mostrado em Figura 2.

Figure 2
Figura 2 : Geração das listas de opções para conduzir a dispensação Ade usando a macro de planilha. Vários parâmetros devem ser preenchidos, ou seja, (1) o reagente de TRANSFECÇÃO (TR) e os volumes mínimos/máximos a serem utilizados na chapa de origem, (2) as concentrações iniciais de plasmídeo a serem dispensadas na chapa de origem e (3) a projeto da inteiro-placa, incluindo as quantidades esperadas do plasmídeo e multiplexação em cada um dos 384-Wells. (4) gerar listas de seleção ativação permite que os diferentes campos a serem verificados e, uma vez devidamente preenchido, listas de opções para a dispensação de DNA e Tr e o modelo de placa de fonte necessária são gerados automaticamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Insira os parâmetros do protocolo nanodispenser nos campos rosa. Defina o valor da mistura de reagente de transfecção (TR) para 500 nL. Defina o valor mínimo de volume nos poços da chapa de origem para 4 μL. defina o volume máximo nos poços da chapa de origem para 11,25 μL.
    Nota: o nanodispenser utilizado aqui só pode transferir um máximo de 500 nL em uma corrida de ADE. Esses campos rosa são preenchidos com os valores recomendados, mas podem ser modificados de acordo com as necessidades do usuário.
  2. Insira 100 ng/μL de concentrações iniciais de DNA nos campos azuis correspondentes ao DNA subjacente.
    Observação: esse valor é a concentração ideal definida anteriormente, mas pode, no entanto, ser modificada para diferentes necessidades do usuário.
  3. Introduza a quantidade de ADN desejada nos campos cinzento/Verde. Insira os valores e os nomes de plasmídeo para os 384 poços, assegurando a mesma ortografia se o mesmo plasmídeo for usado em vários poços.
  4. Gere o design da placa de origem, os arquivos de listas de opções e o arquivo de guia de pipetagem. Clique em gerar listas de opções para permitir que a macro gere o DNA-picklist. csv, o T. R.-picklist. csv e os arquivos 384-Wells-pipetting-Guide. csv dos dados coletados na planilha correspondente. Se solicitado, corrija os valores de célula com preenchimento de laranja, pois indica erros ou volumes que não podem ser manipulados pelo nanodispenser.
  5. Imprima o modelo (s) da folha de placa de origem . Nomes de plasmídeo e volume mínimo para preencher os poços são indicados. Da mesma forma, os volumes de mistura de reagentes de transfecção que, em seguida, terão de ser preenchidos nos seguintes poços são indicados como TR e destacados em verde.

3. preparação da placa da fonte do ADN usando a aplicação de guia de pipetagem 384-well

  1. Diluir o plasmídeo de DNA armazenado do passo 1.2.14 para 100 ng/μL usando água destilada.
  2. Calibre a grelha 384-well nas dimensões da chapa: Abra a aplicação de guia de pipetagem 384-well num comprimido (Figura 3). Coloque a placa de origem na grade na tela inferior e, no menu de calibração superior esquerdo, clique em + ou - (ou use o cursor vermelho) para aumentar ou reduzir o tamanho da grade e poços para ajustar os poços verdes aos quatro poços de canto da placa .

Figure 3
Figura 3 : Utilização da aplicação de guia de pipetagem 384-well. (1) calibração da grade 384-well ao tamanho da placa; (2)) montagem de um adaptador de placa 3D universal impresso para o Tablet usando fita dupla face; (3) colocação da placa no adaptador; (4) deslocamento da grelha para CentrÃ-lo na placa montada. (5) bloqueio da etapa de calibração. (6) abertura do arquivo Guide. csv de pipetagem de 384 poços. (7) dada a lista de arquivos, o aplicativo indicará o nome da placa fonte esperada, reagente (DNA ou reagente de transfecção), a concentração e o volume para dispensar os poços alvo, que serão iluminados um por um. (8) as teclas de seta esquerda e direita permitem que o usuário siga o guia de pipetagem para dispensar facilmente os reagentes de acordo com o modelo (s) da placa de fonte macro da planilha. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Usando fita dupla face, monte o adaptador de placa impressa em 3D na tela para evitar movimentos de placa de origem durante a dispensação. Se necessário, mova a grade calibrada usando as setas de rotação e botões para cima/para baixo/direita/esquerda para ajustar a grade na tela para a posição da placa. Uma vez que a grade e os tamanhos de poço são calibrados corretamente e situados, assinale a caixa da calibração do fechamento .
  2. Clique em arquivo e abra o arquivo 384 Wells pipetagem Guide. csv . Siga as instruções do ecrã para dispensar manualmente o volume indicado do plasmídeo indicado na concentração indicada no poço branco realçado correspondente ao destino adequado da chapa esperada. Use - ou + setas para voltar ou mais no processo de dispensação de DNA. Pare de dispensar ao alcançar a primeira solução do reagente do transfection para carregar.
  3. Uma vez que as dispensações do ADN são terminadas, remova a placa da fonte do adaptador. Se várias placas de origem tiverem que ser preenchidas, coloque uma nova placa de fonte no adaptador e siga as instruções de dispensação. Uma vez que a dispensação do ADN terminou, centrifugue a placa (s) da fonte DNA-enchida (em 1.500 x g por 2 minutos) para assegurar o nivelamento líquido apropriado e para remover as bolhas que conduzem à imprecisão nas transferências Ade-baseadas.

4. dispensação de diluente com base em manipulador líquido peristáltico 1 μL na placa de destino

Nota: execute as etapas 4.1-4.5 em um armário de segurança biológico.

  1. Desinfete a cabeça da gaveta de 1 μL pulverizando-a com um desinfetante de pulverização (tabela de materiais) e permita que esta solução entre no suporte da ponta. Absorva o desinfetante remanescente em papel absorvente. Monte a gaveta de 1 μL no dispositivo de tratamento de líquidos peristáltico. Ligue o dispositivo e certifique-se de que a definição do tipo de gaveta está correcta (1 μL), bem como o formato da chapa (384 poços).
  2. Desinfete todo o lúmen da tubagem: Insira o organizador do tubo (segurando os oito tubos juntos) numa embarcação estéril e encha-o com 5 mL de álcool a 70%. Usando a função de escorva do manipulador líquido peristáltico, primeiro lave o álcool na tubulação e depois enxague-o passando 5 mL de água destilada e 5 mL de meio livre de soro (o meio de Eagle modificado de Dulbecco [DMEM] suplementado com 100 U/mL penicilina-estreptomicina; Tabela de material), sucessivamente preenchendo o mesmo navio. Certifique-se de que nenhuma das pontas está obstruído visualmente inspecionando o fluxo de líquido de todos eles.
  3. Prime a tubagem com meio livre de soro preenchendo uma nova embarcação estéril com 10 mL de meio livre de soro pré-aquecido e mergulhando no organizador do tubo. Pressione o botão Prime do manipulador líquido peristáltico por cerca de 10 s. Mais uma vez, assegure-se de que nenhuma ponta esteja obstruído inspecionando visualmente o fluxo líquido de todos eles.
  4. Encha a placa com 1 μL de diluente. Coloque uma placa de cultura 384-well estéril (destino) no portador de placa de manipulador líquido peristáltico e retire a tampa.
  5. Execute o programa pré-calibrado para dispensar 1 μL em cada poço da placa 384-well. O tempo de dispensação é de aproximadamente 8 s. Em seguida, substitua a tampa da placa 384-well.
    Nota: Alternativamente, esta etapa pode ser tratada manualmente, em um gabinete de segurança, usando uma micropipeta multicanal.

5. desempenho de uma pesquisa para controlar os volumes manualmente dispensados

Observação: para obter detalhes, consulte a Figura 4.

  1. Execute o programa nanodispenser, vá para a guia de diagnóstico, marque a placa de origem para fora da caixa, coloque a placa de origem no suporte da placa, e marque in para entrar na placa. Quando solicitado, selecione 384Ldv_aq_b2 para definir o nanodispenser para o modo de distribuição de buffer aquoso e pressione OK.
  2. Selecione pesquisa no menu Miscelânea e clique em Launch. Selecione os poços pré-preenchidos para analisar e clique no botão ir . Verifique se os volumes medidos correspondem aos esperados e assegure-se de que nenhum poço tenha sido carregado com volumes de mais de 12 μL, pois isso evitará transferências.

Figure 4
Figura 4 : Definindo os parâmetros do software de pesquisa. (1) inicie o programa nanodispenser. (2) Abra a guia diagnósticos . (3) Insira a placa de origem marcando a placa de origem e, em seguida, em. (4) defina o tipo de placa de origem no menu quando solicitado. (5) na caixa diversos, selecione pesquisa no menu suspenso. (6) inicie o programa de pesquisa clicando no lançamento. (7) Selecione os poços pré-preenchidos para medir. (8) inicie a análise clicando em ir. (9) uma vez realizada a pesquisa, os volumes medidos são escritos nos poços selecionados correspondentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. dispensação ADE-driven do ADN na placa do destino

  1. Execute o software de lista de opções, defina os tipos de placa de origem e destino 384-well para 384_LDV e Greiner 384PS_781096, respectivamente (Figura 5). Defina o dispositivo para o modo de distribuição de buffer aquoso selecionando 384ldv_aq_b2 e desmarque "otimizar o throughput de transferência".

Figure 5
Figura 5 : Desempenho das dispensações baseadas em picklist. (1) inicie o software nanodispenser. Na guia Protocolo, selecione (2) o formato da placa de amostra, (3) o tipo de placa de destino e (4) unticks "otimizar o throughput de transferência". (5) Selecione a guia lista de seleção . (6) clique em importar e selecione o arquivo *. csv adequado (DNA-picklist ou-lista de opções). (7) uma vez selecionado, clique em Import. (8) clique em Play e salve o protocolo. (9) realize uma simulação de dispensação clicando em simular, ou (10) inicie a dispensação programada clicando em executar. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Selecione a guia "lista de seleção", clique em importar, selecione o arquivo DNA-picklist. csv. Clique em Play e salve o protocolo. Clique em simular para realizar uma simulação das dispensações programadas para garantir que a lista de opções corresponda ao experimento experimental esperado. Depois de concluído, clique em fechar.
  2. Clique em Playe, em seguida, executar, para iniciar o programa de dispensação: quando solicitado, insira a placa de origem solicitada (soluções de DNA preenchidas manualmente) e a placa de destino (diluente-preenchido) no nanodispenser.
    Nota: o tempo de dispensação é de aproximadamente 5-20 min para uma placa completa de 384 poços, dependendo dos volumes selecionados e do número total de dispensações no experimento.
  3. Alternativamente, pause o protocolo aqui como as placas Diluent-e ADN-enchidas podem segurar o armazenamento seco ou congelado por até 7 dias. Para o armazenamento seco, deixe as placas secar no banco em temperatura ambiente e, em seguida, armazená-los da mesma maneira. Descongelar e centrifugar (a 1.500 x g por 2 min) placas armazenadas congeladas antes da utilização numa etapa de transfecção (secção 7).
     

7. dispensação do reagente do transfection ADE-driven

  1. Em um armário do biossegurança, extemporaneamente dilui o reagente do transfection do lipopolyplex no meio soro-livre a uma concentração final 1x. Vortex e imediatamente dispensar esta mistura de reagente de transfecção de acordo com a placa (s) de origem predefinida concebida pela macro e utilizando a aplicação de guia de pipetagem pré-calibrada 384-well, conforme descrito no passo 3,4.
    Nota: Não centrifugue a placa de fonte uma vez que é carregada com o reagente como nenhuma transfecção é observada após a centrifugação.
  2. Execute o programa nanodispenser para realizar uma "pesquisa" conforme descrito na seção 5, a fim de controlar os volumes de todos os poços de TR preenchidos manualmente da (s) chapa (ões) de origem para evitar erros de dispensação devido a volumes superiores a 12 μl.
  3. Clique em Redefinir para limpar a lista de amostras da lista de opções de DNA no software de lista de opções e verifique se os parâmetros do dispositivo ainda estão configurados para buffers aquosos e para os tipos de placa de origem e destino usados, como na etapa 6,1.
  4. Clique em importar e escolha o arquivo TR-picklist. csv. Clique em Play e salve o protocolo, se solicitado, e (isto é, opcionalmente, mas fortemente recomendado) realizar uma simulação das dispensações de mistura de reagente de transfecção programada para garantir o design adequado das dispensações, clicando no Botão simular . Depois de concluído, clique em fechar.
  5. Clique em Playe , em seguida, executar o botão para iniciar o programa de dispensação: conforme solicitado, coloque a placa (s) de origem (TR-mistura-preenchido) e a placa de destino (diluente-e cheia de DNA) no nanodispenser.
    Nota: o tempo de dispensação é inferior a 20 min para uma placa completa de 384 poços ao dispensar 500 nL da mistura TR.
  6. Incubar 15-30 min à temperatura ambiente após a adição do TR ao DNA, conforme indicado pelo protocolo do fabricante.

8. dispensação de célula baseada em manipulador líquido peristáltico

  1. Prepare o manipulador líquido peristáltico para a distribuição de células. Desinfete uma cabeça de gaveta de 10 μL pulverizando-a com Aniospray surf 29 desinfetante e absorvendo o remanescente no papel. Monte a gaveta no dispositivo de manipulador líquido peristalótico, mude a configuração do tipo de gaveta para 10 μL e certifique-se de que o formato da chapa esteja definido para 384 poços.
  2. Desinfete o tubo de gaveta de 10 μL como descrito anteriormente no passo 4,2. Mergulhe o organizador do tubo em uma embarcação estéril e lave a tubagem com 5 mL de álcool 70%, depois com 5 mL de água destilada e, finalmente, com 5 mL de meio livre de soro, sucessivamente preenchido na mesma embarcação e até que cada tubo esteja vazio.
  3. Prepare a suspensão da célula para dispensar. A partir de uma célula HeLa confluentes B10-cultura prato, lave as células 1x com 1x fosfato-tampão solução salina (PBS) e, em seguida, dissociar as células com Trypsin/EDTA para 5 min a 37 ° c.
  4. Verificar a dissociação celular um microscópio e interromper a ação de Trypsin/EDTA adicionando 10 mL de meio completo (DMEM suplementado com soro bovino fetal a 10% e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina; ver a tabela de material) no prato de cultura. Colha pilhas em um tubo de 50 mL e conte as pilhas o microscópio, usando uma pilha de Malassez ou um contador de pilha automático.
  5. Prepare pelo menos 25 mL da suspensão da pilha de HeLa em uma concentração de 37.500 Cells/mL no meio completo (isto é, 1.500 Cells/40 μL) para uma placa completa de 384 poços, para assegurar a escorva do tubo e a dispensação de 40 μL/well.
  6. Para dispensar as pilhas, encha uma embarcação estéril nova com a suspensão preparada da pilha e mexa-a para evitar o sedimentação que conduz à inexatidão na densidade da pilha da dispensação. Insira o organizador do tubo nesta solução e pressione o botão Prime até que a suspensão da célula esteja começando a se liberar da cabeça dispensadora. Certifique-se que nenhum da ponta está obstruído inspecionando visualmente o fluxo líquido de todos eles, e assegure-se de que cada tubo esteja carregado com suspensão da pilha.
  7. Carregue o DNA e a placa de destino 384-well preenchida no transportador líquido peristalótico da placa do alimentador e remova sua tampa. Execute o programa pré-calibrado para dispensar 40 μL da suspensão da célula na placa completa de 384 poços (i.e., 1.500 células/poço). O tempo de dispensação é de cerca de 8 s. Substitua a tampa da placa 384-well.
    Nota: Alternativamente, a suspensão da célula 40 μL pode ser manualmente dispensada utilizando uma micropipeta multicanal.

9. teste biológico feito encomenda (monitoração da eficiência do Transfection da pilha)

Nota: seguindo as configurações experimentais e a intenção do experimento, use os métodos necessários para luminescência, fluorescência, triagem de alto conteúdo e transcrição reversa da reacção em cadeia quantitativa da polimerase (RT-qPCR). Nesta seção do protocolo, a eficiência da transfecção celular é avaliada por microscopia de fluorescência automatizada e análise de imagem.

  1. Incubar a placa a 37 ° c com 5% de CO2 em uma atmosfera saturada de água e até expressão protéica adequada.
    Nota: aqui, um tempo de incubação de 48 h é usado para células HeLa para monitorar a eficiência de transfecção, usando plasmíos de expressão de tdTomato e mVenus.
  2. Retire o meio de cultura 48 h pós-transfecção invertendo a placa, adicione 30 μL/poço de formalina a 10% utilizando o manipulador líquido peristáltico (gaveta de 10 μL) e incubar durante 15 min à temperatura ambiente.
  3. Retire a formalina invertendo a placa; em seguida, incubar as células durante 15 min à temperatura ambiente com 0,1 ng/mL de Hoechst diluído em solução de PBS 1x.
  4. Lave as células 3x por 15 min com 80 μL de 1X PBS ajustado para pH = 8 a fim de recuperar o sinal de alta fluorescência perdido pelo pH 6,9 da etapa de incubação da solução de formalina.
  5. Usando um microscópio fluorescente automatizado, adquira imagens de duas ou três canaletas fluorescentes (Hoechst, tdtomato, e mvenus) sequencialmente com os objetivos 10x e um jogo apropriado do filtro da emissão (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI], dsred, e fluoresceína isotiocianato [FITC], respetivamente).
  6. Para avaliar eficiências de transfecção, use o software de análise de imagem para determinar as eficiências de transfecção usando a análise de script baseada na coloração dos núcleos.

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Representative Results

fIn para determinar se a tecnologia ADE poderia ser usada para um protocolo de transfecção reversa automatizada, monitoramos a eficiência da transfecção celular por microscopia de fluorescência, usando um tdTomato fluorescente vermelho expressando plasmídeo. Primeiramente visando determinar os melhores parâmetros de transfecção, diferentes volumes de diluentes e quantidades totais de DNA foram testados em cruz. O volume de diluente foi utilizado para permitir que as gotas de DNA, uma vez dispensadas, espalhem-se por todos os poços para contornar a transfecção inhomogênea observada em experimentos preliminares (ou seja, apenas no centro dos poços). Como mostrado na Figura 6a, o transfection de pilhas de Hela que usam o reagente lipopolyplex20 era bem sucedido. Curiosamente, usando um volume de diluente de 1 μL, as quantidades de DNA variando de 5 a 30 NG mostraram a mesma eficiência e até 90% de transfecção de células em comparação com quantidades mais elevadas, como 50 e 100 ng, para as quais foi observada uma diminuição abrupta. Nós tentamos vários volumes diluentes variando de 15 nL a 4 μL e identificou 1 μL para ser a melhor condição, como exemplificado significativamente aqui usando 30 NG de DNA.

Figure 6
Figura 6 : Resultados representativos. (A) impacto da quantidade de DNA e do volume de diluente na eficiência da transfecção. As pilhas de HeLa eram transfected reverso usando o dispositivo do nanodispenser e o lipopolyplex, usando uma concentração 1x como recomendado pelo fabricante. Do diluente recomendado (meio livre de soro), 15-4000 nL foi usado com 10-100 ng quantidades de plasmídeo vermelho-fluorescente-expressando (tdTomato). Eficiências de transfecção foram determinadas 48 h pós-transfecção usando software de análise baseada em imagem. Os resultados são expressos em percentagem de células transfectadas para a quantidade crescente de DNA, e o volume diluente mostra as condições ideais: 30 NG de DNA total com um volume de diluente crescente e 1 μL de diluente com aumento de quantidades de DNA. As barras de erro representam o SEM com n ≥ 4. Para análise estatística, utilizou-se ANOVA bidirecional e pós-teste de Bonferroni. *p < 0, 5 em comparação com outros pontos. (B) estabilidade das placas de ADN preparadas. Diluente (1 μL) foi dispensado usando o manipulador líquido peristáltico, e 30 NG de DNA foi dispensado e imediatamente transfected usando reagente lipopolyplex dispensado pelo ADE (controle) ou armazenado à temperatura ambiente uma vez seco ou congelado a-20 ° c. Nos dias 0, 2, ou 7, o DNA seco foi rehidratado com 1 μL de diluente dispensado utilizando o manipulador líquido peristáltico, e as placas congeladas foram descongelados à temperatura ambiente e centrifugadas (a 1.500 x g por 2 min). As pilhas foram semeadas então usando o alimentador líquido peristáltica de acordo com o protocolo descrito. As barras de erro representam o SEM com n ≥ 3. Para análise estatística, utilizou-se ANOVA bidirecional e pós-teste de Bonferroni. NS = nonsignificantemente diferente. (C) eficiência do Cotransfection do ADN do plasmid. As pilhas de Hela foram transfected com 30 NG de mvenus-e tdtomato-expressando o plasmídeo carregado em dois poços separados da fonte (usando uma relação 1,7 de mvenus sobre tdtomato a fim nivelar sua saída relativa da fluorescência). As eficiências do transfection foram comparadas 48 h borne-transfection usando o software imagem-baseado da análise e foram expressos como uma porcentagem de pilhas transfected e de uma porcentagem de pilhas cotransfected dentro da população transfected. A porcentagem de pilhas cotransfected foi determinada calculando o número de pilha verde-fluorescência-expressando nas pilhas fluorescentes vermelhas da população. As barras de erro representam o SEM com n ≥ 3. Para análise estatística, utilizou-se ANOVA bidirecional e pós-teste de Bonferroni. NS = nonsignificantemente diferente. D) campos representativos da microscopia de fluorescência a partir da aquisição de imagem mostrada no painel C usando três canais fluorescentes (Hoechst, Tdtomato e mvenus) adquiridos sequencialmente por uma plataforma de imagem (tabela de materiais ), usando objetivos de 10x e um conjunto adequado de filtros de emissão (DAPI, dsRed e FITC, respectivamente). Este número foi modificado de Colin et al.1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A fim de aumentar ainda mais a taxa de transferência deste protocolo, examinamos em seguida se um armazenamento de placa de origem pré-preenchido com DNA e soluções diluentes poderia ser armazenado e usado em uma fase posterior. Duas maneiras de armazenar eficientemente o ADN foram testadas, a saber o armazenamento seco a placa deixando a secar no banco ou no armazenamento congelado (em-20 ° c). Ambos os métodos de armazenamento não levam a resultados significativamente diferentes do que a solução de DNA recém-dispensada armazenada por até 7 dias (Figura 6B), e ambos os métodos tornaram possível realizar a transfecção de placas pré-cheias de DNA armazenadas, como um banco de Plasmídeo.

Finalmente, como o transfection do plasmídeo ocorre o mais frequentemente usando pelo menos dois Plasmids diferentes, nós examinamos em seguida a habilidade da multiplexação do ADN do protocolo apresentado aqui usando as melhores condições identificadas (1 μl do diluente e 30 NG do ADN). O plasmídeo da vermelho-fluorescente-proteína-expressando previamente usado do tdTomato foi modificado para expressar mVenus, uma proteína fluorescente amarela brilhante, e ambos foram usados então em tentativas do Cotransfection. A análise de células vermelho-ou verde-fluorescente-positiva (Figura 6C) mostrou que a eficiência de transfecção é de cerca de 80%; Entretanto, na população vermelha, quase 100% das células também foram cotransfectadas com o plasmídeo expressando mVenus como pode ser observado na análise de imagem representativa baseada em software da Figura 6D.

Figura suplementar 1: diagrama que mostra uma altura de dosagem adequada para que a gota toque na parte inferior do poço para evitar a sua retenção na ponta de dosagem. À esquerda, as configurações apropriadas permitem que a gota se espalhe na superfície do poço evitando sua retenção nas pontas de dispensação. À direita, as configurações ruins levam à retenção de gotas que pode ser observada durante o movimento da cabeça para o próximo RAW. Por favor clique aqui para baixar esta figura.

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Discussion

O estabelecimento e a otimização de um método de transfecção de alta taxa de transferência precisa para uma determinada linha de célula exigem que os cientistas sigam alguns dos principais parâmetros descritos nesta seção. Nós encorajamos a começar com os valores recomendados em todo o protocolo como essas configurações otimizadas para células HeLa também provou ser eficiente para células HEK. No entanto, como os melhores parâmetros podem depender das linhas celulares e reagentes de transfecção, as condições ideais podem ser definidas variando-se o número da célula, o volume do diluente, a quantidade total de DNA e a natureza do reagente de transfecção, a concentração ou mesmo o volume usado como foi o caso durante a otimização deste protocolo para as células HeLa1.

O protocolo geral apresentado aqui foi desenvolvido e otimizado para permitir o transfection da pilha mesmo por noviços no campo. A fim alcançar esta meta, as ferramentas chaves para tornar o protocolo tão simples como possível e para evitar erros humanos foram desenvolvidas: uma macro user-friendly da folha de cálculo para projetar fàcilmente a experimentação e uma aplicação do comprimido para guiar o usuário para encher corretamente a fonte placa (s).

Assim, para garantir a confiabilidade do protocolo, apenas algumas etapas críticas devem ser controladas: i) um projeto experimental adequado; II) as dispensações peristálticas apropriadas do manipulador líquido peristalótico clássico; III) o DNA adequado e as dispensações à base de reagente de transfecção; IV) evitando a centrifugação da placa fonte antes da dispensação do reagente do transfection como aquela pareceu prejudicar o transfection. Seguir estas poucas recomendações asseguraria o transfection eficiente das pilhas.

Projeto experimental apropriado

A configuração experimental foi renderizada pelo usuário pelo desenvolvimento da planilha de macros que só precisa ser preenchida com o nome esperado de plasmíos de DNA, quantidade desejada e alguns valores de parâmetro chave. Uma vez preenchido, a macro primeiro analisa os parâmetros inseridos para detectar possíveis erros, tais como volumes mínimos e máximos adequados inseridos para os poços de origem e o volume de dispensação de reagente de transfecção. Além disso, com base nas concentrações de DNA inseridas em cada uma das quatro linhas possíveis e na quantidade de plasmídeo inserida nos campos subjacentes, a macro verifica se os volumes esperados para dispensar são múltiplos de 2,5 nL (volume das gotas dispensadas pelo nanodispenser). Uma vez que uma verificação para todos os erros foi executada, a macro calcula a quantidade total de cada amostra do ADN que terá que ser dispensada e, a seguir, projeta o molde da placa da fonte (classificando os nomes do ADN na ordem alfabética). Os volumes indicados na placa (s) de origem levam em conta os volumes de trabalho esperados em um poço de origem (calculado a partir dos valores mínimos e máximos de volume preenchidos na folha de modelo). Todas as dispensações esperadas do ADN em cada um dos poços são escritas então na folha do DNA-picklist. A lista de poços DNA-transfected é usada então para escrever a folha do TR-picklist usando o volume do reagente do transfection indicado na folha do molde. Os volumes calculados na folha da chapa de origem são então transferidos para a folha de guia de pipetagem de 384 poços. Os dados do guia de pipetagem de DNA-picklist, TR-picklist e 384-well são usados para gerar os arquivos correspondentes no formato *. csv.

Adequada de DNA e TR dispensação na placa de origem

Como dispensar em uma placa de fonte 384-well e, mais especificamente, localizando o poço do alvo pode promover erros e são além disso demorado, nós desenvolvemos uma aplicação tabuleta-baseada dedicada similar a iPipet21. Ao contrário do iPipet, o descrito aqui pode ser usado com Android (apenas Android versão 4,4 e até é suportado). Com base no arquivo 384-Wells-pipetting-Guide. csv gerado pela planilha de macro, ele ajuda o usuário no processo de dispensação geral. Considerando que seu uso para algumas dispensações não vale a pena, pode ser interessante economizar tempo e evitar erros se um grande número de DNA e dispensações TR são esperados. O arquivo. csv deve conter informações de bem, placa, nome, concentração e volume. Esta aplicação poderia então ser usada para outras aplicações, tais como soluções de dispensação (reagentes, corante, composto, etc.) no poço de destino, de acordo com um arquivo CSV dedicado ao usuário. Além disso, ele permite que o usuário para iluminar toda uma linha ou linha, inserindo as informações relevantes para a coluna de poço de destino usando este formato esperado: Row_1 (para 24) ou Line_A (para P).

Solucionando problemas de eficiência de transfecção de células pobres

Vários parâmetros descritos abaixo podem prejudicar o transfection da pilha no protocolo ADE-baseado descrito e teriam que individualmente ser verific e contornado em caso dos problemas da eficiência.

Um dos primeiros parâmetros importantes para a transfecção é a qualidade das células e a densidade utilizada durante a semeadura. Embora cada tipo de célula exigirá parâmetros diferentes, alguns deles devem ser respeitados para garantir uma transfecção bem-sucedida. Em primeiro lugar, a suspensão celular deve ser preparada extemporaneamente a partir de uma placa subconfluente para evitar o stress celular antes da transfecção, e eles não devem ser deixados deitado no banco por muito tempo (2 h no máximo). Em segundo lugar, a densidade de semeadura das células deve ser baixa o suficiente por duas razões: para evitar contatos celulares e promover uma superfície celular de alta uma vez espalhados, mas também porque dividir ativamente as células melhor pegar o ácido nucleico estrangeiro22,23. Infelizmente, a densidade óptima da pilha para o transfection varia dependendo dos tipos da pilha e da tecnologia do transfection e tem que ser determinada para cada linha de pilha. Estes são parâmetros cruciais para assegurar o transfection eficaz.

Outro parâmetro importante que pode modular a eficiência de transfecção é a passagem celular número24. De fato, as células na cultura são continuamente submetidas à evolução devido à concorrência e à seleção natural. É sabido que a expressão genética diferencial entre os números de passagem de células baixas e altas é esperada na maioria das linhas celulares devido à desdiferenciação à medida que o número de passagem aumenta. Seguindo este fenômeno, a eficiência do transfection pode igualmente ser afetada. Entretanto, os efeitos passagem-relacionados foram demonstrados para ser fortemente dependentes da linha celular e das condições da cultura. Além disso, o que é considerado um nível de passagem "alto" varia de uma linha celular para outra. Isso significa que o intervalo de número de passagem o qual um conjunto de experimentos pode ser executado de forma confiável deve ser determinado para cada linha de célula determinada.

Outro parâmetro que reforça a dificuldade em determinar as melhores condições para a transfecção é que a composição do meio de cultura também desempenha um papel crucial, uma vez que a presença de soro e/ou antibióticos modulam a eficiência da transfecção. Na verdade, a maioria dos protocolos comerciais recomendam o uso de meio livre de soro durante a etapa de transfecção para aumentar a eficiência ou contornar problemas de má eficiência3,25,26,27. No entanto, esse parâmetro é de fato mais complexo para apreender, pois tem sido demonstrado que, para uma determinada linha celular, passagens precoces versus tardias podem aumentar ou diminuir a eficiência dependendo da presença ou ausência do soro no meio de cultura28. Outros pesquisadores preconizam o uso de meio livre de antibióticos para a passagem antes da transfecção ao cultivar células, a fim de obter células de alta qualidade para a transfecção29. Para concluir, ao otimizar as condições de transfecção para um determinado tipo de célula, cada um desses parâmetros deve ser testado: células de passagem precoce ou tardia e o uso de meio com ou sem soro durante a última passagem antes da colheita das células e/ou durante a própria etapa de transfecção.

Durante a optimização do protocolo apresentado aqui, dois tipos do reagente foram usados: um reagente lipossomal que dá forma a liposome-como complexos e reagente do lipopolyplex, um composto poliméricos não1. Considerando que nós tivemos o sucesso por anos que transfecting manualmente pilhas de HeLa com o primeiro, a eficiência pobre do transfection foi observada no protocolo automatizado atual. Isto foi provavelmente devido a uma etapa vortexing exigida ao misturar o ADN com o reagente do transfection que não pode ser executado no formato da placa do 384-well. O lipopolyplex não precisa tal etapa e, conseqüentemente, conduziu às eficiências mais elevadas do transfection em todas as configurações testadas. Embora isso não tenha sido confirmado no estudo atual, evitando reagentes de transfecção que exijam uma etapa de mistura física, tal tem pipetagem ou vortexing provavelmente levará a melhores resultados.

Também recomendamos o uso de um reagente de transfecção compatível com transfecção reversa, pois o protocolo apresentado é baseado em uma transfecção reversa. Algumas células são conhecidas por serem difíceis de transfecção e alguns compostos químicos dedicados são desenvolvidos para promover maior eficiência de transfecção30,31. Se visar transfecting pilhas hard-to-transfect, nós recomendamos testar os reagentes dados tipo dado do transfection do Cell-Type ou da pilha-linha-, supor que o transfection reverso é praticável com estes.

Vários parâmetros detalhados nos parágrafos subjacentes podem ter um impacto e um pouco prejudicar o processo de dispensação ADE, possivelmente arruinando o experimento final.

O nanodispenser foi desenvolvido para dispensar 2,5 gotas nL de poços de origem preenchidos com 3-12 μL de tampão aquoso (i.e., 9 μL de volume de trabalho). O dispositivo do nanodispenser usado neste estudo integra uma tecnologia dinâmica da análise fluida para a determinação da composição fluida e da altura líquida na placa da fonte a fim controlar a potência necessária para ejetar 2,5 gotas de nL19. Ao encher a placa da fonte manualmente ou usando um manipulador líquido peristáltica Classical, os volumes são o mais frequentemente não tão exatos do que aqueles determinados pela análise dinâmica do líquido. Este é um ponto crucial a ter em conta, uma vez que o dispositivo não é capaz de dispensar de poços de origem carregados com mais de 12 μL. Assim, sua presença comprometeria o experimento. É claro que uma lista das dispensações executadas pode ser gerada no final do programa, mas isso requer que o usuário ajuste os volumes e execute um programa para recuperar apenas as dispensações perdidas. Para evitar essas discordâncias, recomenda-se realizar uma "pesquisa" uma vez que os plasmínios de DNA tenham sido carregados para verificar o volume esperado em cada poço em questão.

Um parâmetro crucial para a ejeção da gota é a variação na tensão de superfície líquida17,32. As soluções de DNA de água são conhecidas por sua viscosidade; Isso pode prejudicar o processo de dispensação por ADE. Considerando que os parâmetros físicos não foram determinados em nosso estudo anterior1, as concentrações mais elevadas da solução do ADN na placa da fonte conduziram à eficiência mais baixa do transfection, mesmo para a mesma quantidade total de ADN dispensada, provavelmente por causa desta Fenômeno. Assim, recomendamos o uso de uma diluição de plasmídeo de 100 ng/μL para melhores resultados, embora outras concentrações possam ser testadas para conveniência do usuário. Para garantir a ADE adequada com a concentração de DNA necessária ao usuário, um corante pode ser adicionado à solução para monitorar a ejeção de gotas nos poços ou, ainda melhor, na tampa da placa. Porque o primeiro objetivo do protocolo apresentado era ganhar a taxa de transferência elevada, os jogos minicolumn-baseados baratos do Minipreparation do ADN do plasmídeo compatíveis com protocolos high-throughput placa-baseados da purificação do plasmídeo foram usados. Considerando que funcionou corretamente durante o desempenho do experimento, em caso de baixa eficiência e má viabilidade celular após o transfection, recomenda-se usar métodos de purificação de DNA de maior grau, como Midi-ou Maxi-preparações ou mesmo endotoxina-livre kits comercialmente disponíveis que garantirão uma melhor pureza do DNA e menor toxicidade para as células33.

Solucionando problemas de transfecção de células inhomogêneas sobre a superfície do poço

As primeiras tentativas ao estabelecer o protocolo conduziram ao transfection da pilha somente no centro dos poços, onde as gotas foram emitidas por ADE. Na verdade, percebemos que a mistura de DNA e transfecção não estava se espalhando por toda a superfície do poço e estava secando antes da adição de células devido aos baixos volumes dispensados (mal 500 nL). Para contornar este problema, um passo de dosagem diluente foi adicionado para permitir que a mistura de DNA/TR para espalhar todos os poços antes da adição de células. Isto conduziu a um transfection homogêneo da pilha no poço. Assim, ao reproduzir o experimento e a mistura DNA/TR não se espalha por todo o poço, o volume de diluente pode ser ajustado de acordo com as necessidades do usuário.

Como o manipulador de líquido acústico pode distribuir volumes na faixa de nanolitros, o método descrito potencialmente não tem quaisquer limitações técnicas. No entanto, percebemos que os poços cheios de solução aquosa estão sujeitos a evaporação, o que pode representar uma limitação. Se os volumes exatos a serem dispensados forem reduzidos por esta evaporação, a nanodosagem não será realizada até o final esperado. Nesse caso, um relatório de erro é gerado pelo nanodispenser. Para contornar esse problema, use volumes mais altos do que o esperado ao permanecer no intervalo superior aceitável (na verdade, inferior a 12 μL). Entretanto, se a evaporação conduz ao prejuízo de algumas dispensações, um relatório de erro é gerado pelo nanodispenser. Este arquivo pode ser usado para encher a placa da fonte com o reagente novo a ser dispensado nos poços em causa do destino. Fazer isto em um intervalo de tempo curto não pareceu prejudicar a eficiência do transfection.

O protocolo descrito aqui é o primeiro a obter tal débito para Transfections independentes do plasmídeo do ADN. As melhores taxas alcançadas antes eram para 288 circunstâncias diferentes que exigiram habilidades altamente especializadas a ser executadas simultaneamente15. Isso, além de sua alta taxa de transferência, o protocolo atual tem outras vantagens significativas como o processo global foi otimizado para permitir o seu uso por não especialistas e ferramentas foram desenvolvidas para evitar erros, ou seja, i) uma macro de planilha dedicada permitindo o projeto fácil do modelo experimental, II) a geração automática do correspondente DNA e transfection reagente fonte placa (s) modelo por esta macro, III) a geração de dois Ready-to-use arquivos para controlar as dispensações software-driven de DNA e o reagente do transfection pelo dispositivo do nanodispenser, e IV) a exportação de um "384-poço que pipting o arquivo do guia" que corresponde à placa da fonte (s) projetada, a ser usada por uma aplicação tabuleta-baseada dedicada igualmente desenvolvida a fim evitar erros humanos quando distribuição na placa (s) de fonte 384-well.

Melhorias futuras do protocolo

A fim de aumentar a produtividade e a reprodutibilidade, a placa de origem preenchida com plasmíos pode ser armazenada a 4 ° c ou congelada como habitualmente para soluções de DNA. Além disso, nós mostramos que a placa pré-carregado do destino pré-enchida com o ADN pode igualmente ser armazenada seca ou congelada por pelo menos 7 dias antes de adicionar o reagente e as pilhas do transfection, conduzindo ao realce da taxa de transferência total e da facilidade do protocolo. A conservação do ADN por mais de 4 anos foi relatada previamente usando meios aperfeiçoados34 e deve, conseqüentemente, ser testada no contexto deste protocolo porque o empurrará uma etapa mais adicional, permitindo o armazenamento a longo prazo das placas pré-enchidas com os bancos de plasmís e pronto para uso em experimentos de transfecção.

Nós mostramos previamente que as condições óptimas identificadas do transfection poderiam ser transferidas aos experimentos de maior escala, de 96-bem a 10 pratos da cultura do cm1, calculando a quantidade do ADN, o volume do reagente do transfection, e a densidade da pilha que devem ser usado com base no protocolo de placa otimizada 384-well. Como a dispensação da placa 1536-well é gerenciável pelo nanodispenser demasiado, o protocolo pode igualmente ser executado em uma escala mais baixa, assim realçando sua taxa de transferência. No entanto, uma grande limitação para atingir esse formato é a capacidade de dispensar células e gerenciar a leitura final em um formato miniaturizado. A distribuição de células por ADE já foi realizada com sucesso no formato de placa 1536-well35 usando uma solução de densidade neutra que impediu a semeadura de células e garantiu a densidade de células iguais no tempo. Com base no número de células aqui utilizados e na relação de superfície de 384 (0, 56 cm2) versus 1536 poços (0, 25 cm2), 500-650 células seriam dispensadas neste último formato. Tal uma escala do número da dispensação da pilha foi mostrada para ser altamente-confiável se a solução concentrada de 14%-18% da densidade neutra é usada. Nestas configurações, 100 nL de suspensão celular seria distribuído sobre 1536 poços. Com uma solução de trabalho de 5-8 μL em tais poços, a adição de 5-8 μL de meio de cultura usando manipuladores de líquidos peristalóticos clássicos diluiria a solução de antisemeadura para menos de 0,3%, permitindo assim a semeadura adequada da célula. As pilhas transfecting em uma escala tão baixa parecem assim tecnicamente possível; Entretanto, o efeito da concentração residual da solução da densidade neutra na eficiência do transfection permanece ser determinado pelo trabalho mais adicional.

Usando tipos de placas de origem com volumes de trabalho mais altos para dispensar células, como as placas de fonte de polipropileno 384-well com um volume de trabalho de 45 μL, permitiriam 100 dispensações de solução de célula nL de apenas quatro poços de fonte para uma placa de 1536-poço geral. Além disso, os nanodispensers novos são capazes de dispensar gotas de 25 nL em vez do 2,5 nL que foi utilizado neste protocolo. Esse tamanho de queda, então, divide 10 vezes o tempo de dispensação, mas implica o uso múltiplo de 25 volumes nL que, no entanto, permanecer compatível com os diferentes volumes dispensados no protocolo apresentado aqui.

Com base nestas últimas obras e melhorias tecnológicas, um passo adicional de dispensação de células ADE para alcançar um transfection placa 1536-bem poderia ser facilmente adicionado ao protocolo atual. No entanto, atingir tais miniaturizações só vale a pena se o bioensaio é concomitantemente viável em tal formato miniaturizado.

Em conclusão, desenvolvemos um método de transfecção fácil, de alta taxa de transferência e preciso, tendo várias vantagens devido à miniaturização: (1) reduzindo os custos do reagente de transfecção; (2) reduzir o desperdício de preparações de DNA; (3) assegurando-se de que mesmo os novatos possam com sucesso executar o transfection da pilha. Na verdade, ele requer apenas algumas etapas manuais fáceis, ou seja, diluindo o DNA para 100 ng/μL, dispensando-o em uma placa de origem (um plasmídeo/poço) de acordo com o modelo gerado pela planilha e usando o guia de pipetagem baseado em Tablet, e preparando a suspensão celular antes da semeadura. O nanodispenser baseado em ADE é responsável pelo tempo de entrega da dose e pela multiplexação dos plasmímids, de acordo com o modelo do experimento.

Além disso, Considerando que este protocolo poderia assegurar a maioria das intenções biológicas básicas de experimentos de transfecção clássica, ele também poderia abrir novas maneiras para experimentos baseados em array. Por exemplo, expressar ou derrubar cada gene de codificação de proteínas humanas da coleção de ORFeome humana36 ou abordagens baseadas em biblioteca Crispr-Cas937, respectivamente, exigiriam menos de 24 h em uma plataforma automatizada dedicada (53 x 384- placas de poço), em vez de 2-3 dias de trabalho humano, assumindo o uso de um banco de placas de DNA-preloaded. Devido à sua alta eficiência e desempenho de alta produtividade, o protocolo aqui apresentado pode até ser capaz de alcançar novas abordagens não agrupadas para estudos baseados em CRISPR-Cas9 com bibliotecas gRNA/plasmíos expressando CRISPR-Cas9. Certamente, as mudanças celulares suaves do phenotype, que atualmente não podem permitir a etapa exigida da pilha-ordenação, seriam finalmente gerenciáveis, porque um poço representaria um gene batido.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores divulgaram um recebimento do seguinte apoio financeiro para a pesquisa, autoria e/ou publicação deste artigo: INSERM, Lille University, Lille Pasteur Institute, Conseil Régional du Nord, e PRIM-HCV1 e 2 (Pôle de Recherche Interdisciplinaire sur le Médicament), Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-EQPX-04-01), o FEDER (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) e a Comunidade Européia (ERC-STG INTRACELLTB n ° 260901). Os autores desejam agradecer ao Dr. S. Moureu, Dr. B. Villemagne, Dr. R. ferru-Clément, e Dr. H. Groult por sua revisão crítica e correções do manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384LDV Microplate Labcyte LP-0200
384-well Microplate μClear Black Greiner 781906
Ampicilin Sigma A9393-5G Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector
Android Tablet Samsung Galaxy Note 8 used to guide the user while the source plate manual dispense
Aniospray Surf 29 Anios 2421073 disinfectant to clean the MicroFlo head
Columbus software Perkin Elmer image analysis software
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10566032 cell culture medium
Echo Cherry Pick 1.5.3 software Labcyte Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software
Echo550 Labcyte ADE-based dispenser
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000044 to add in cell culture medium
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128-4L to fix cell
HeLa cells ATCC HeLa (ATCC® CCL-2™)
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570 10 mg/mL Solution in Water
INCell Analyzer 6000 GE Healthcare 29043323 automated laser-based confocal imaging platform
LB medium Thermoischer Scientific
LB Broth Base (Lennox L Broth Base)®, powder		 12780052 culture medium for bacteria growth
Lysis Buffer (A2)  Macherey-Nagel 740912.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
MicroFlo 10µL cassette Biotek Instruments Inc 7170013 to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo 1μL cassette Biotek Instruments Inc 7170012 to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo Dispenser Biotek Instruments Inc 7171000 peristaltic pump-based liquid handler device
Microvolume spectrophotometer Denovix DS-11 Spectrophotometer Measure the DNA concentration of samples
mVenus plasmid mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus
Neutralization Buffer (A3)  Macherey-Nagel 740913.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
NucleoSpin Plasmid kit Macherey-Nagel 740588.50 used to prepare plasmid from bacterial culture
Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
optional Wash bufferWash Buffer (A4) Macherey-Nagel 740914.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
orbital shaker  incubated large capacity shaker 444-7084 Used to grow bacteria under gentle agitation and 37°C
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 10,000 U/mL
Phosphate-Buffered Saline Thermo Fisher Scientific 10010001
Plasmid mini-columns Macherey-Nagel 740499.250 Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture
Resuspension Buffer (A1)  Macherey-Nagel 740911.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
RNAse A Macherey-Nagel 740505 Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
tdTomato-N1 plasmid Addgene Plasmid #54642 Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato 
TransIT-X2 Dynamic Delivery System Mirus Bio MIR 6000
Wash Buffer (AW) Macherey-Nagel 740916.1 Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
3D printer Creality CR10S used to print the plate adapter
Blender Software   https://www.blender.org/
Free software under GNU General Public License (GPL).		 version 2.79b used to design the plate adapter

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References

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Retração edição 150 ejeção de gotas acústicas alta taxa de transferência transfecção plasmídeo de DNA células de mamíferos manuseio de líquidos proteína fluorescente
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