Summary
Ici, un modèle expérimental critique d'ischémie de membre postérieur est présenté suivi d'une batterie de tests fonctionnels, histologiques et moléculaires pour évaluer l'efficacité des thérapies angiogéniques.
Abstract
L'ischémie critique des membres (ICL) est une affection grave qui entraîne un risque élevé d'amputation des membres inférieurs. En dépit de la revascularisation étant la thérapie d'or-standard, un nombre considérable de patients de CLI ne sont pas adaptés pour la revascularisation chirurgicale ou endovasculaire. Les thérapies angiogéniques émergent comme option pour ces patients mais sont actuellement encore à l'étude. Avant l'application chez l'homme, ces thérapies doivent être testées dans des modèles animaux et ses mécanismes doivent être clairement compris. Un modèle animal de l'ischémie postérieure (HLI) a été développé par la ligature et l'excision des artères et veines iliaques et fémorales externes distales chez les souris. Un panel complet d'essais a été assemblé pour évaluer les effets de l'ischémie et des thérapies angiogéniques putatives aux niveaux fonctionnel, histologique et moléculaire. Laser Doppler a été utilisé pour la mesure du débit et l'évaluation fonctionnelle de la perfusion. La réponse de tissu a été évaluée par l'analyse de la densité capillaire après coloration avec l'anticorps anti-CD31 sur des sections histologiques du muscle gastrocnemius et par la mesure de la densité collatérale de navire après diaphonization. L'expression des gènes angiogéniques a été quantifiée par RT-PCR ciblant des facteurs angiogéniques choisis exclusivement dans les cellules endothéliales (EC) après microdissection de capture de laser des muscles gastrocnemius de souris. Ces méthodes étaient sensibles en identifiant les différences entre les membres ischémiques et non ischémiques et entre les membres traités et non traités. Ce protocole fournit un modèle reproductible de CLI et un cadre pour tester les thérapies angiogéniques.
Introduction
La maladie artérielle périphérique (PAD) affecte principalement les membres inférieurs. La DAP est causée par l'athérosclérose, une obstruction artérielle qui peut causer une restriction grave du flux sanguin dans les membres inférieurs1. La claudication intermittente est la première manifestation de PAD et se réfère à la douleur musculaire lors de la marche. CLI est le stade le plus grave de PAD, étant diagnostiqué chez les patients qui montrent des douleurs de repos ischémiques, des ulcères ou de la gangrène2. Les patients atteints d'ICL ont un risque élevé d'amputation, surtout s'ils ne sont pas traités3. La revascularisation des membres inférieurs (soit par chirurgie ouverte, soit par une procédure endovasculaire) est actuellement le seul moyen d'obtenir le sauvetage des membres. Cependant, environ 30% des patients de CLI ne sont pas adaptés à ces procédures, pour des raisons qui incluent l'emplacement des lésions, le modèle de l'occlusion artérielle et la comorbidité étendue4,5. Par conséquent, de nouvelles thérapies sont nécessaires pour ces patients autrement intraitables, avec la promotion de l'angiogenèse étant la stratégie sous l'enquête plus intense.
Avant d'effectuer des essais chez l'homme, l'efficacité et l'innocuité de nouvelles thérapies in vivo doivent être prises en compte dans les modèles animaux. Plusieurs modèles ont été développés pour l'étude de CLI, principalement en induisant l'ischémie postérieure (HLI) chez les souris6,7,8,9,10. Cependant, ces modèles diffèrent dans plusieurs aspects, y compris la nature des artères qui sont ligated et / ou excisée et si les veines et les nerfs environnants sont disséqués ainsi6,7,8, 9,10. Pris ensemble, ces aspects affecteront la sévérité de la lésion ischémique-reperfusion chez chaque animal, ce qui rend les résultats difficiles à comparer. Par conséquent, il est essentiel de développer un protocole efficace dans lequel la procédure d'induire l'ischémie et l'évaluation de différentes cibles devraient être normalisées pour évaluer si une thérapie angiogénique donnée sera efficace. Un protocole expérimental conçu pour couvrir tous ces aspects fournirait une compréhension complète des mécanismes par lesquels les thérapies angiogéniques exercent leurs effets et une mesure de leur efficacité à chacun de leurs résultats. Deux ouvrages distincts récemment publiés par notre équipe sont un bon exemple11,12, dans lequel différentes approches pour induire l'angiogenèse thérapeutique ont été évaluées en utilisant le même protocole qui sera décrit avec plus de détails dans ce protocole.
L'objectif global de ce protocole est de décrire un modèle expérimental reproductible qui peut imiter les effets de CLI et jeter les bases expérimentales pour une évaluation complète des effets fonctionnels, histologiques et moléculaires de l'angiogénique putatif Agents.
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Protocol
Toutes les procédures relatives aux animaux sont conformes à la directive 2010/63/UE et ont été approuvées par l'Organe institutionnel de protection des animaux et autorisées par la DGAV, l'autorité compétente portugaise en matière de protection des animaux (numéro de licence 023861/2013)
CAUTION: Plusieurs des produits chimiques utilisés dans les protocoles sont toxiques et nocifs. Veuillez utiliser toutes les pratiques de sécurité appropriées et l'équipement de protection individuelle (gants, blouse de laboratoire, pantalons longs et chaussures à bout fermé)
1. Le modèle murine de l'ischémie de membre postérieur
REMARQUE : Toutes les expériences sont effectuées sur des souris femelles C57BL/6 de 22 semaines.
- Préparation des solutions
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Préparation de la solution anesthésique
Note: Cette combinaison anesthésique (médetomidine et kétamine) fournit jusqu'à 30 min d'immobilisation et une fenêtre chirurgicale de 15 min. L'effet peut être retourné par l'administration de l'atipamezole.- À l'aide d'une seringue propre de 1cc, retirez 1 ml de médetomidine (1 mg/kg de poids corporel), éliminez les bulles d'air pour des mesures précises et ajoutez-la à un tube de faucon de 15 ml.
- Avec une seringue propre de 1 cc, retirer 0,75 ml de kétamine (75 mg/kg de poids corporel), éliminer les bulles d'air pour des mesures précises et l'ajouter à un tube de faucon de 15 ml contenant la médetomidine.
- Ajouter 8,25 ml de salin stérile (0,9% NaCl), afin d'obtenir 10 ml de solution anesthésique.
- Identifiez le tube avec le nom des composés, la date mélangée et la date d'expiration.
- Conserver dans l'obscurité à 4 oC.
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Préparation de la solution antisédative
- Avec une seringue propre de 1 cc, retirez 1 ml d'atipamezole (5 mg/Kg de poids corporel), éliminez les bulles d'air pour des mesures précises et ajoutez-la à un tube de faucon de 15 ml.
- Ajouter 9 ml de salin stérile (0,9% NaCl), afin d'obtenir 10 ml de solution de réversion.
- Identifiez le tube avec le nom des composés, la date mélangée et la date d'expiration.
- Conserver dans l'obscurité à 4 oC.
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Préparation de la solution d'analgésie postopératoire
- À l'aide d'une seringue propre de 1 cc, retirez 0,5 ml de buprénorphine (100 l/15-30 g de poids corporel), éliminez les bulles d'air pour des mesures précises et ajoutez-la à un tube de faucon de 15 ml.
- Ajouter 9,5 ml de salin stérile (0,9% NaCl), afin d'obtenir 10 ml de solution d'analgésie.
- Identifiez le tube avec le nom des composés, la date mélangée et la date d'expiration.
- Conserver dans l'obscurité à 4 oC.
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Préparation de la solution anesthésique
- Induction chirurgicale de l'ischémie postérieure
- Outils chirurgicaux nécessaires à cette intervention : forceps pointus, ciseaux de ressort, porte-aiguilleophamique, ciseaux chirurgicaux et porte-aiguille. Stériliser tous les outils chirurgicaux dans un autoclave avant utilisation. Utilisez des cotons-tiges pour la dissection de graisse sous-cutanée.
- Chargez la seringue avec la solution d'anesthésie avant de tenir la souris.
- Retenez l'animal en appliquant de la force derrière ses oreilles contre la grille de la cage, en maintenant autant de peau que possible pour garder la souris immobile.
- Maintenez l'animal incliné avec sa tête abaissée et effectuez une injection intrapéritonéale de la solution d'anesthésie, en gardant la seringue à un angle de 45 degrés avec le corps de la souris.
- Vérifier l'absence de réflexes de sevrage de la pédale, pour évaluer la profondeur de l'anesthésie.
- Retirer les cheveux du membre postérieur droit à l'aide d'un rasage électrique. Utilisez un gommage de savon désinfectant à la chlorhexidine pour la préparation de la peau. Utilisez un essuie-tout propre pour enlever la mousse. Appliquer un gommage chirurgical à la chlorhexidine et protéger la zone de la peau avec un drapé stérile avant de transporter les souris à la suite stérile chirurgicale.
- Placez l'animal dans le decubitus dorsal et retenez-le avec les quatre membres écartés et fixés avec du ruban adhésif.
CAUTION: Effectuer la procédure sur un coussinet chauffé pour maintenir la température corporelle de l'animal stable; la procédure chirurgicale est exécutée utilisant un microscope de dissection au grossissement 10x ou 20x. - Appliquer une solution antiseptique à la chlorhexidine à l'aide de gaze stérile pour finaliser la préparation de la peau. À l'aide d'une lame de scalpel chirurgicale numéro 11 effectuer une incision de la peau de 1 cm au-dessus de la cuisse de l'arrière droit.
- La graisse sous-cutanée émoussée de disséquer exposant le faisceau neurovasculaire. À l'aide des forceps pointus, des ciseaux à ressort et du porte-aiguille ophtalmique, ouvrez la gaine ilio-fémorale membranaire pour exposer les vaisseaux iliaques et fémoraux externes distal.
- Disséquer et séparer les vaisseaux (artère et veine) du nerf. Utilisant une suture de polypropylène non absorbable de 7.0 ligate ligate l'artère et la veine iliaque externe distales et l'artère et la veine fémorales distales.
- Transect le segment de l'artère ilio-fémorale et les veines entre les noeuds distal et proximal avec les ciseaux de ressort.
- Fermer l'incision avec une suture absorbable (p. ex., 5,0 suture vicryl).
- Chargez la seringue avec la solution antisédative et utilisez la même méthode détaillée en 1.2.3 et 1.2.4 pour effectuer une injection intrapéritonéale de la solution antisédative.
- Surveillance postopératoire
REMARQUE : Les animaux sont soigneusement observés toutes les 15-20 min pour s'assurer que tous les animaux récupèrent bien de l'anti-sédatif ; les animaux anesthésiés ne sont jamais laissés sans surveillance.- Évaluer le rétablissement de l'anesthésie : 1) surveiller le taux et la profondeur de la respiration; 2) évaluer les réflexes animaux (position de la pédale et des yeux)
- Effectuer une injection sous-cutanée de l'analgésie postopératoire tous les 8-12 h.
- Surveillez les animaux tous les jours après la chirurgie en registrant une brève description de l'état de santé de l'animal et de l'apparence du site de chirurgie, s'assurer que toutes les sutures sont fermées.
- Resuture l'incision, si la déhiscence se produit. En cas d'échec, appliquer un film de barrière cutanée sur l'incision pour protéger de l'urine, les excréments fécaux, la friction et le cisaillement de la peau et pour aider le processus de guérison.
2. Évaluation de l'effet angiogénique
REMARQUE : Après l'induction d'ischémie, appliquez l'agent thérapeutique dans l'étude et réalisez les procédures suivantes. Les étapes entreprises à d'autres moments sont détaillées dans la section correspondante.
- Imagerie par perfusion Laser Doppler
- Retirez les cheveux des deux membres postérieurs un jour avant l'analyse à l'aide d'un rasage électrique suivi d'une crème dépilatoire.
- Anesthésiez les souris à l'aide de la solution anesthésique.
- Placer l'animal sur un coussin chauffant de 37 oC pendant 5 min pour s'assurer que la température ne changera pas pendant l'intervention.
- Placez l'animal en position de supine avec les jambes fixées dans une position étendue. Mesurer la distance entre les jambes et les pieds droits et gauches pour chaque animal puisque le positionnement de l'animal doit être similaire chaque fois que la procédure doit être répétée afin de suivre les changements de perfusion de l'arrière-membre au fil du temps.
- Commencez à acquérir des données à l'aide d'un imageur de perfusion Doppler laser.
- Une fois l'acquisition terminée, retournez l'anesthésie avec la solution antisédative.
- Ouvrez le logiciel d'analyse d'image et dessinez la région d'intérêt (ROI) autour de l'arrière-membre arrière ischémique et d'un retour sur investissement comparable autour de l'arrière-pays non ischémique.
- Observez les valeurs de flux et déterminez la perfusion comme rapport de la perfusion dans le membre ischémique à celui dans le membre non ischémique. Les changements dans le ratio de perfusion sont mesurés au fil du temps.
- Analyse de l'immunohistochimie et de la densité capillaire
- Après anesthésie, sacrifiez les souris par luxation cervicale.
- Pour récolter les muscles gastrocnemius des deux jambes, d'abord, enlever la peau des deux membres postérieurs.
- Identifiez le tendon d'Achille et séparez le tendon de l'os à l'aide d'un scalpel à 11 lames.
- Tenez le tendon d'Achille et séparez le muscle du tibia et du péroné jusqu'à l'articulation du genou avec des ciseaux de printemps.
- Séparer le biceps femoris du muscle gastrocnemius.
- Utilisez des ciseaux de printemps pour couper les insertions des muscles gastrocnemius au niveau de l'articulation du genou.
- Placez les muscles gastrocnemius récoltés dans une orientation transversale sur un petit disque de liège à l'aide de 10% de tragacanth.
- Congeler les échantillons dans de l'isopentane refroidi à l'azote liquide et les stocker à -80 oC jusqu'à ce qu'ils soient sectionnés.
- Couper des sections de 7 m des spécimens musculaires sur un cryostat et monter sur des lames de verre.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. - Fixer les lames de verre dans une bouteille contenant de l'acétone pure refroidie (environ 50 ml) pendant 10 min, à -20 oC.
- Ajouter l'hydrogène peroxidase 0,3 % dilué dans le méthanol (50 ml) pendant 30 min à température ambiante.
- Laver deux fois dans de la saline tamponnée par le phosphate (PBS) (50 ml) pour un total de 10 min.
- Utilisez un stylo hydrophobe autour des sections.
REMARQUE : L'utilisation d'un stylo hydrophobe permet de réduire la quantité de solutions dépensées pendant le protocole. Pour toutes les incubations, utilisez 100 l de toutes les solutions, par section. - Appliquer une solution de blocage de 5% de sérum de lapin dans PBS pendant 30 min à température ambiante.
- Incuber les spécimens pendant 1 h à température ambiante avec un anticorps monoclonal anti-CD31 dilué à 1:500 dans 1 % d'albumine de sérum bovin (BSA) en PBS.
- Laver trois fois en PBS pour un total de 30 min.
- Ajouter un anticorps antirat igG de lapin biotinylated secondaire à 1:200 dans 1% BSA dans PBS et 5% sérum de lapin pendant 30 min à température ambiante.
- Laver dans le PBS comme avant et ajouter le complexe de peroxidase avide-conjugué étiqueté pendant 30 min à température ambiante.
- Rincer 3 fois en PBS pendant 5 min et ajouter le kit de substrat peroxidiase de diaminobenzidine (DAB) pendant 5 min.
- Counterstain les sections avec de l'hématoxylin pendant 10 s avant de monter.
- Mesurer les densités capillaires à l'aide d'un microscope à champ lumineux droit (c.-à-d. nombre de capillaires par nombre de myocytes) dans 2 sections différentes de 4 zones anatomiques distinctes dans chaque spécimen.
- Perfusion d'agent de contraste
- Anesthésiez les souris à l'aide de la solution anesthésique.
- Effectuer une laparotomie médiane à l'aide d'une lame de scalpel numéro 15.
- Exposer l'aorte abdominale et le cava véna caudale, après s'être rétracté latéralement les petites entrailles et avoir utilisé des ciseaux de printemps.
- Insérer un cathéter de calibre 26 cranially dans l'aorte abdominale et un autre dans le cava de veine caudale dans la même direction.
- Fixer les cathéters en place à l'aide d'une suture en soie 5/0 pour effectuer une suture de séjour.
- Laver le système vasculaire à l'aide d'une solution saline de 37 oC contenant de l'héparine (500 unités/100 ml) poussée dans l'aorte abdominale à l'aide d'une seringue de 10 ml. Continuer la perfusion douce jusqu'à ce qu'une solution claire soit vue sortant du cathéter placé à l'intérieur du cava de veine caudale.
REMARQUE : Habituellement 30 à 40 ml d'une solution saline héparinisée sont nécessaires pour rincer le système vasculaire d'un rat adulte. - Administrer un mélange d'adénosine (1 mg/L) et de papaverine (4 mg/L) pendant 2 min.
- Injecter dans le cathéter aortique 10 ml d'un mélange de 50% de sulfate de baryum et 5% de gélatine.
REMARQUE : La solution doit être maintenue à 60 oC pour éviter l'épaississement. - Laisser les souris à - 4 oC pendant au moins 4 h, afin de permettre à la fonte vasculaire de se solidifier.
- Enlever la peau du bas du corps de chaque souris.
- Diaphonisation - Technique Spalteholz
- Fixez les souris par immersion dans une solution de formaldéhyde de 10 % pendant au moins 72 h.
- Blanchir les souris par immersion dans une solution de peroxyde d'hydrogène de 30% pendant 24 h.
- Déshydrater les souris en utilisant la technique de substitution du gel. Cette méthodologie consiste à soumettre les souris à des passages successifs (en moyenne quatre) d'acétone pure à - 20 oC pour 24 h chacun.
- Clarifier les souris en l'immergeant dans une solution contenant un mélange de benzyl benzoate 100% et 100% de salicylate méthyle dans une proportion de 3:5 (ce mélange est également connu sous le nom de solution Spalteholz) 13.
- Laissez les souris immergées dans la solution Spalteholz à l'intérieur dans une chambre à vide jusqu'à ce qu'elle devienne diaphane, ce qui prend généralement 5 à 7 jours.
- Remplacez la solution, s'il fait nuit avant que le spécimen ne devienne clair.
- Quantification des navires collatéraux
- Observez les souris suspendues dans la solution Spalteholz sous transillumination à l'aide d'un microscope stéréotaxique. Utilisez des forceps de microchirurgie pour le saisir et le déplacer doucement.
- Photographiez les membres entiers à l'aide d'un appareil photo numérique relié au microscope.
- Obtenir des photographies de membres entiers à l'aide du logiciel approprié.
- Effectuer une segmentation manuelle des navires collatéraux en les mettant en évidence à l'aide du logiciel approprié.
REMARQUE : Les navires collatéraux sont définis selon la définition de Longland, une tige définie, une zone médiane et une ré-entrée, d'un diamètre compris entre 20 et 300 m, à l'exclusion des artères fémorales, sapilères et popliteal et de toutes les structures veineuses. - Définir les ROIs dans chaque souris dans la même région anatomique dans l'adducteur, entourant et au-dessous de l'occlusion chirurgicale.
- Quantifier la densité des navires collatéraux (MCV) en IO équivalents correspondant à 20 % de la superficie totale des membres. La MCV est calculée comme le rapport entre la zone vasculaire et les zones DE ROIs. Toutes les mesures de densité sont effectuées à l'aide du logiciel ImageJ.
REMARQUE : La valeur de CVD du membre non ischémique pour chaque souris est supposée correspondre à 100% pour exclure des variations dans l'anatomie, la perfusion ou les procédures de diaphonisation. Le pourcentage de MCV dans le membre ischémique a été, par conséquent, calculé par rapport à celui non ischémique. - Déterminer le pourcentage d'augmentation des maladies cardiovasculaires comme la différence entre le pourcentage de MCV entre les membres ischémiques et nonischmiques.
- Microdissection de capture laser des capillaires
- Après anesthésie, sacrifiez les souris par luxation cervicale.
- Pour récolter les muscles gastrocnemius des deux jambes, enlever la peau des souris des deux membres postérieurs.
- Identifiez le tendon d'Achille et séparez le tendon de l'os à l'aide d'un scalpel à 11 lames.
- Tenez le tendon d'Achille et séparez le muscle du tibia et du péroné jusqu'à l'articulation du genou avec des ciseaux de printemps.
- Séparer le biceps femoris du muscle gastrocnemius.
- Utilisez des ciseaux de printemps pour couper les insertions des muscles gastrocnemius au niveau de l'articulation du genou.
- Placez les muscles gastrocnemius récoltés dans une orientation transversale sur un petit disque de liège à l'aide de 10 % de tragacanth.
- Congeler les échantillons dans de l'isopentane refroidi à l'azote liquide et les stocker à -80 oC jusqu'à ce qu'ils soient sectionnés.
- Couper sur un cryostat de 12 m sections des spécimens musculaires et monter sur des lames de verre.
REMARQUE : Pour la protection de l'ARN, prenez une glissière prérefroidie et touchez le dos de la glissière avec votre doigt (gants) pour réchauffer uniquement la région pour placer la section. Transférer la section du couteau cryostat en touchant avec la zone réchauffée et sécher à -20 oC dans le cryostat pendant 2-3 min. Le protocole peut être mis en pause ici.- Fixez les lames de verre dans une bouteille contenant de l'acétone pure refroidie (environ 50 ml) pendant 5 min à -20 oC et séchez-les à l'air.
- Utilisez un stylo hydrophobe autour des sections.
REMARQUE : L'utilisation du stylo hydrophobe contribue à réduire la quantité de solutions dépensées pendant le protocole. Pour toutes les incubations, utilisez 100 l de toutes les solutions, par section. - Réhydratez-vous avec 2 M NaCl/PBS à 4 oC et incubez les spécimens pendant la nuit à 4 oC avec un anticorps monoclonal anti-CD31 rat à 1:500 dans 2M NaCl/PBS.
- Laver deux fois en 2M NaCl/PBS pour un total de 6 min.
- Ajouter un anticorps antirat igG de lapin biotinylated secondaire à 1:200 dans 2M NaCl/PBS et 5% de sérum de lapin pendant 30 min à 4 oC.
- Laver dans 2 M NaCl/PBS comme avant et ajouter le complexe de peroxidase avide-conjugué étiqueté pendant 30 min à 4 oC.
- Rincer et ajouter le kit de substrat peroxidase DAB pendant 5 min.
- Déshydrater les sections dans de l'éthanol glacé à 90 % suivi de 100 % d'éthanol et les laisser sécher.
- Disséquez 10 000 capillaires par souris à l'aide d'un système de microdissection laser équipé d'un laser pulsé à l'état solide de 355 nm et catapultez les capillaires disséqués dans un tube de microfuge adhésif-cap.
- Extraction d'ARN, synthèse de cDNA, pré-amplification, et RT-PCR
- Isoler l'ARN total des capillaires microdissés à l'aide d'un kit approprié, l'ARN total obtenu se situe entre 1,5-3 ng/L.
- Utilisez un kit de synthèse de l'ADNc pour la synthèse et deux séries de pré-amplification, à l'aide des amorces décrites dans le tableau 1.
- Effectuer RT-PCR pour les mêmes cibles décrites dans l'étape précédente. Utilisez un programme composé d'une première étape de dénaturation à 95 oC pendant 10 min, suivie de 50 cycles à 95 oC pour 15 s et de 60 oC pendant 1 min.
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Representative Results
Utilisant le protocole décrit, les cellules souches mésenchymales de cordon ombilical et le rayonnement ionisant de bas-dose (LDIR) ont été examinés en tant que thérapies angiogéniques putatives 11,12. Des lectures de perfusion de Doppler de laser ont été obtenues avant l'induction d'ischémie et aux points de temps pré-spécifiés s'étendant immédiatement après l'induction d'ischémie à 45 jours post-ischémie. Les lectures de perfusion de tissu par Doppler de laser ont été enregistrées en tant qu'images couleur-codées, sans perfusion affichée en bleu foncé et le niveau de perfusion le plus élevé affiché en rouge. Comme le montrent les figures 2A et 3A et quantifiées dans les figures 2B et 3B, une perte complète de perfusion des membres postérieurs a été observée chez toutes les souris immédiatement après l'induction de l'ischémie postérieure, assurant reproductibilité de la technique pour induire l'ischémie postérieure. Fait important, la gravité de l'ischémie est similaire chez tous les animaux. Un roi-ci a été dessiné autour du membre arrière ischémique et un roi d'érodit comparable a été dessiné autour du postérieur non ischémique pour effectuer la quantification de la perfusion. La perfusion est exprimée comme rapport de la perfusion dans le membre ischémique à celle dans le membre non ischémique. Les changements dans le ratio de perfusion sont mesurés au fil du temps.
L'immunohistochimie a été exécutée entre 15 et 90 jours post-ischémie. La diaphonisation a été entreprise entre 19- et 90 jours post-ischémie et microdissection capillaire entre 45- et 70 jours d'induction de poteau-ischémie de s'assurer que les différentes thérapies pro-angiogenic ont induit un effet proangiogenic soutenu et prolongé.
La quantification des capillaires CD31-positifs dans les sections histologiques du muscle gastrocnemius a évalué la densité capillaire et ceci a été exprimé comme nombre de capillaires par nombre de fibres de muscle. Comme le montre la figure4, la densité capillaire était plus élevée dans le membre ischémique par rapport au membre non ischémique.
Afin d'évaluer la densité collatérale des navires, des souris ont été diaphonisées et un retour sur investissement équivalent, correspondant à 20 % de la superficie des membres, a été sélectionné pour la quantification. La densité collatérale des navires a augmenté de façon constante dans le membre ischémique, de sorte que les données relatives aux membres traités et témoins ont été exprimées comme le pourcentage d'augmentation de la densité des navires collatéraux dans le membre ischémique relativement à celui non ischémique (figure5 ).
L'expression des gènes pro-angiogéniques par les EC a été analysée par RT-PCR quantitatif des cellules CD31-positives. Les transcriptions pour Vegfr2, Vegfr1, Fgf2, Angpt2, Pdgfc, Tgfb2, Hgf, et Met ont montré une variation claire de l'expression entre les membres ischémiques et non ischémiques, exclusivement chez les souris exposées au stimulus pro-angiogénique (Figure 6).
Figure 1 : Illustration schématique de l'anatomie de la vascularisation de l'arrière-pays de souris montrant les sites de ligature. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : LDIR augmente la récupération de perfusion. Après induction chirurgicale de HLI unilatéral, les deux membres postérieurs des souris de C57BL/6 ont été simulés irradiés ou irradiés avec quatre fractions quotidiennes de 0.3Gy, dans les jours consécutifs et ont permis de récupérer. (A) Représentant laser Doppler flux images pré-HLI, et aux jours 0 (d0) et 15 (d15) post-HLI induction. (B) L'évaluation quantitative du flux sanguin exprimée en tant que rapport de membre d'ISC à membre de NISC a démontré la perfusion significativement augmentée de sang de membre dans les souris irradiées contre sham-irradiées les jours 15 (d15) et 45 (d45) post-HLI. Les changements entre les groupes ont été évalués par des mesures répétées bidirectionnelles ANOVA suivies d'un test post-hoc Bonferroni (n - 12 souris par groupe). Moyens - SEM sont affichés. P et lt; 0,001; ns, non significatif. HLI, ischémie de membre postérieur ; ISC, ischémique; NISC, non ischémique; Pré-HLI, avant l'ischémie de membre arrière. Adapté de 11. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Cellules souches mésenchymales du cordon ombilical (UCX) augmenter la récupération de perfusion. UCX ou leur véhicule (comme un contrôle) ont été administrés dans le muscle gastrocnemius ischémique 5 heures après l'induction de HLI. (A) Images représentatives d'écoulement laser doppler avant (PRE-HLI), immédiatement après (d0 POST-HLI) et à 7, 14 et 21 jours après l'induction de l'ILH (d7 POST-HLI, d14 POST-HLI, d21 POST-HLI). (B) L'évaluation quantitative du flux sanguin exprimée en tant que rapport de membre d'ISC à membre de NISC a démontré la perfusion significativement augmentée de sang de membre dans les cellules souches mésenchymales de moelle ombilical -souris traitées à 7, 14 et 21 jours après HLI. (n-16 pour chaque groupe expérimental; D7: t (22.69) 4.26; P 0,001; la taille de l'effet était de 1,51 et la puissance 0,98; D14: t (30) 4,7; P 0,001; la taille de l'effet était de 1,66 et la puissance 0,99; D21: t (30) - 7,22; P 0,001; la taille de l'effet était de 2,56 et la puissance 0,99). HLI, ischémie de membre postérieur ; ISC, ischémique; NISC, non ischémique. Adapté de11. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : LDIR augmente la densité capillaire. (A) Sections représentatives des muscles gastrocnemius ischémiques simulés et irradiés au jour 45 post-HLI. Les capillaires et les myocytes ont été identifiés par l'immunohistochimie CD31 et l'hématoxylin, respectivement. Barre d'échelle, 150 mm. (B) L'analyse quantitative a indiqué la densité capillaire accrue (capillaires/myocytes) dans les muscles ischémiques irradiés de gastrocnemius comparés aux ischémiques faux-irradiés aux jours 15 et 45 post-HLI. L'ANOVA mixte suivi de l'essai post-hoc bonferroni a été effectué avec un facteur à l'intérieur du sujet de l'ISC et des facteurs entre-sujets du jour et de l'irradiation (n -6 souris par groupe). Les données et les moyens individuels - SEM sont affichés. P-lt;0,001; ns, non significatif. ISC, ischémique; NISC, non ischémique. Adapté de11. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : LDIR augmente la densité collatérale. (A) Images illustratives de ROIs sélectionnés pour des souris simulées et irradiées. Les membres de l'ISC et du NISC au jour 90 post-HLI sont montrés. Barre d'échelle, 300 mm. (B) Les données sont représentées comme le pourcentage d'augmentation des maladies cardiovasculaires du membre ISC relativement à celui du NISC. Aux jours 15 et 90 post-HLI, les souris irradiées ont présenté une augmentation significativement plus élevée de CVD (%) contre les souris irradiées par faux. L'ANOVA bidirectionnel a été menée suivie d'un test post-hoc Bonferroni avec un entre les facteurs sujets du jour et l'irradiation (n -6 souris par groupe). Les données et les moyens individuels - SEM sont affichés. le 0,05; P-lt;0,001; ns, non significatif. HLI, ischémie de membre postérieur ; ISC, ischémique; NISC, non ischémique. Adapté de11. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : LDIR régule l'expression des gènes angiogéniques dans les E Isolées des muscles ischémiques irradiés de gastrocnemius. Après induction chirurgicale de HLI unilatéral, les deux membres postérieurs des souris de C57BL/6 ont été simulés-irradiés ou irradiés avec quatre fractions quotidiennes de 0.3Gy, dans les jours consécutifs et ont permis de récupérer. Au jour 45 post-HLI, l'expression des facteurs pro-angiogéniques et de leurs récepteurs a été évaluée par qRT-PCR exclusivement sur des ECs. Les sections de muscle de Gastrocnemius ont été souillées pour CD31. Les cellules endothéliales individuelles de CD31 ont été visualisées, disséquées, et isolées utilisant un système de microdissection de laser. Chaque barre représente l'expression génétique relative chez un animal. Les barres blanches et grises représentent des souris simulées irradiées et irradiées, respectivement. Les valeurs ont été normalisées à 18S pour obtenir des niveaux d'expression relatifs. Les résultats exprimés comme des changements de pli de journal2 entre les échantillons ischémiques et non ischémiques ont démontré l'abondance relative des transcriptions chez les souris irradiées ; en revanche, une régulation vers le bas est observée chez les souris simulées irradiées. Adapté de11. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Vegfr1F (5'-TTGAGGAGCTTCACCGAACTCCA-3'); |
| Vegfr1R (5'-TATCTTCATGGAGGCCTGGGCTT-3'); |
| Vegfr2F (5'-AGGCCCATTGAGTCCAACTACACA-3'); |
| Vegfr2'R (5'-AGACCATGTGGCTTTTTTTCTCCA-3'); |
| Pdgf-c'F (5'-ATGCCACAAGTCACAGAAACCACG-3'); |
| Pdgf-c'R (5'-AAGGCAGTCACAGCATTGTTGAGC-3'); |
| Met(5'-ACGTTGAAATGCACAGTTGGTCCC-3'); |
| Met'R (5'-TTGCGTCGTCTCTCGACTGTTTGA-3'); |
| Fgf2F (5'-ACTCCAGTTGGTATGTGGCACTGA-3'); |
| Fgf2'R (5'-AACAGTATGGCCTCTTGTCCAGGT-3'); |
| Tgfb2(5'-GCTTTGGATGCGGCCTTGCTGCTTTTT-3'); |
| Tgfb2'R (5'-CTCCAGCACAGAAGTTGGCATTGT-3'); |
| Ang2F (5'-ATCCAACACCGAGAAGATGGCAGT-3'); |
| Ang2R (5'-AACTCATTGCCCAGCCAGTACTCT-3'); |
| HgfF (5'-GCATTCAAGGCCAAGGAGAAGGTT-3'); |
| Hgf-R (5'-TCATGCTTGTGAGGGTACTGCGAA-3'); |
| 18sF (5'-GCCCTATCAACTTTCGATTGGTAGT-3'); |
| 18sR (5'-CCGGAATCGAACCCTGATT-3'). |
Tableau 1 : Amorces utilisées pour l'étude.
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Discussion
Modèles Murine de CLI ont principalement consisté en ligature de l'artère fémorale juste distal à l'origine de la femoris profunda 4,6,6,7,8,9. Cela a montré de laisser la plupart de la circulation collatérale intacte, ce qui restaure le flux sanguin vers le membre dans les 7 jours 9. L'enlèvement du lit collatéral peut être réalisé par l'excision de l'artère fémorale. Cependant, jusqu'à un tiers du flux sanguin d'origine peut être rétabli dès 7 jours après la procédure, étant donné que la plupart des navires collatéraux proviennent de l'artère iliaque interne 7. Lejay et coll. ont proposé des ligatures séquentielles avec une deuxième ligature effectuée sur l'artère iliaque commune, réduisant efficacement la perfusion collatérale fournie par l'artère iliaque interne 4. Les étapes critiques de ce protocole comprennent non seulement l'identification de l'artère iliaque externe juste au-dessus du ligament inguinal, mais aussi la ligature et l'excision des artères et veines iliaques et fémorales externes distales, qui servent un double but : à augmenter la sévérité de l'ischémie ainsi que d'améliorer la reproductibilité technique du modèle, comme l'exposition de l'artère fémorale seule entraîne souvent la déchirure de la veine.
Une limitation de cette technique est l'interruption aigue du flux sanguin au membre, qui diffère du processus prolongé lié à l'accumulation de plaque athérosclérotique menant à la sténose artérielle et à l'occlusion. Pourtant, la réduction du flux sanguin était présente bien après 2 semaines, le point de temps établi pour le diagnostic de l'ischémie chronique. En outre, la collatéralisation a été augmentée avec l'insulte ischémique seule, qui imite le processus de formation collatérale observé dans les membres chroniquement ischémiques.
La néovascularisation des membres ischémiques implique une interaction complexe des événements biologiques, à savoir, l'angiogenèse et l'artériogenèse. Ce protocole comprend une variété d'essais qui ont évalué l'interférence des thérapies angiogéniques putatives sur la germination angiogénique (densité de vaisseau capillaire) et le développement collatéral de navire (arteriogenesis), le mécanisme le plus important dans la tolérance humaine ischémie des membres inférieurs. Simultanément, le laser Doppler est utilisé pour dévoiler la fonction de ces vaisseaux nouveaux ou agrandis, et pour la microdissection laser pour la première fois des capillaires est utilisé pour recueillir des ECs révélant les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la récupération fonctionnelle. Ce protocole donne un modèle animal reproductible qui peut imiter les effets de CLI une norme d'essai quand les animaux sont traités avec les thérapies angiogéniques possibles qui pourraient être appliquées dans un contexte clinique à l'avenir.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions José Rino et Tânia Carvalho, respectivement responsables de l'installation de bioimagerie et d'histologie et de pathologie comparée de l'Instituto de Medicina Molecular Joo Lobo Antunes, respectivement. Nous remercions également Vyacheslav Sushchyk du Département d'Anatomie de la Nova Medical School/Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa.
Référence de financement : projet financé par UID/IC/0306/2016 Fundaçao para a Ciência e a Tecnologia. Paula de Oliveira est soutenue par une bourse (SFRH/BD/80483/2011) de Fundaçao para a Ciência e Tecnologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution - nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution - toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution - toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
References
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