Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo prontamente aplicável para avaliar a estabilidade do armazenamento de vesicles extracelular, um grupo de nanopartículas naturais produzidas pelas pilhas. As vesículas são carregadas com glucuronidase como uma enzima modelo e armazenadas diferentes condições. Após o armazenamento, os seus parâmetros físico-químicos e a atividade da enzima encapsulada são avaliados.
Abstract
As vesículas extracelulares (EVs) são alvos promissores na pesquisa atual, usadas como drogas, portadores de drogas e biomarcadores. Para seu desenvolvimento clínico, não somente sua atividade farmacêutica é importante mas também sua produção precisa de ser avaliada. Neste contexto, a pesquisa concentra-se no isolamento de EVs, sua caracterização e seu armazenamento. O presente manuscrito tem como objetivo fornecer um procedimento facile para a avaliação do efeito de diferentes condições de armazenamento em EVs, sem manipulação genética ou ensaios funcionais específicos. Isto torna possível obter rapidamente uma primeira impressão da estabilidade de EVs uma condição de armazenamento dada, e os EVs derivados das fontes diferentes da pilha podem ser comparados facilmente. A medida de estabilidade baseia-se nos parâmetros físico-químicos dos EVs (tamanho, concentração de partículas e morfologia) e na preservação da atividade de sua carga. O último é avaliado pelo encapsulamento saponina-negociado do beta-glucuronidase da enzima nos EVs. Glucuronidase atua como um substituto e permite uma quantificação fácil através da clivagem de uma molécula de repórter fluorescente. O presente protocolo poderia ser uma ferramenta para os pesquisadores na busca de condições de armazenamento que otimamente reter Propriedades EV para avançar a pesquisa EV para aplicação clínica.
Introduction
Os EVs são nanopartículas ligadas à membrana produzidas por quase todos os tipos de células. Para as células de mamíferos, os EVS podem ser subdivididos em dois grupos principais com distintas viasdeprodução1,2. As vesículas da membrana, com uma escala do tamanho de aproximadamente 100-1000 nanômetro, são produzidas pelo brotamento direto da membrana de pilha. Os exosomas, de tamanho 30-200 nm, são derivados de corpos multivesiculares formados por brotamento interno em endosomas que posteriormente se fundem com a membrana celular para liberar vários exosomas de uma só vez. A principal função dessas vesículas é o transporte de informações entre as células3. Para esta finalidade, as cargas tais como o RNA, o ADN, e as proteínas são classificadas ativamente neles. Os EVs podem transmitir uma variedade de efeitos sobre seus alvos, com implicações tanto para a saúde quanto para o estado da doença. De um lado, eles mediam efeitos positivos como regeneração tecidual, apresentação de antígenos ou efeitos de antibióticos, o que os torna alvos auspiciosos para seu desenvolvimento como terapêutica4,5. Por outro lado, os EVs podem promover a vascularização tumoral6, induzir efeitos de espectador nas respostas de estresse7, podendo desempenhar um papel nas doenças auto-imunes8 e doenças inflamatórias9. Assim, eles podem ser um componente-chave para uma melhor compreensão de muitos efeitos patológicos. No entanto, a presença de EVS alterados em doenças múltiplas, como câncer10,11,12 e distúrbios cardiovasculares13, e sua fácil acessibilidade no sangue e na urina os torna ideais Biomarcadores. Finalmente, a sua boa biocompatibilidade14 e sua capacidade de segmentação inerente fazer EVS também interessante para a entrega de drogas15. Neste manuscrito, descrevemos um protocolo para a avaliação da estabilidade de armazenamento de EVs derivados de células de mamíferos, uma importante propriedade que ainda é pouco investigada.
Para o desenvolvimento clínico de EVS, ainda existem muitos obstáculos para superar16, incluindo a avaliação de seus efeitos terapêuticos, produção, purificação e armazenamento17. Enquanto-80 ° c é amplamente visto como o padrão de ouro para o armazenamento de EV18, os congeladores necessários são caros, e manter a cadeia de frio necessária a partir da produção para o paciente pode ser desafiador. Além disso, alguns relatórios indicam que o armazenamento em-80 ° c ainda não preserva otimamente EVS e induz uma perda na funcionalidade de EV19,20. Outros métodos, como liofilização21,22 ou spray-secagem23, têm sido propostos como alternativas potenciais para o armazenamento congelado de EVS.
A maneira ideal de avaliar a estabilidade do armazenamento seria testar os EVs em ensaios funcionais ou pela avaliação de um marcador específico, por exemplo, sua atividade antibacteriana19. Isso é possível quando o efeito desejado das vesículas é conhecido e quando um grupo distinto de EVs deve ser estudado. Se os EVs de diferentes fontes de células forem comparados (por exemplo, para encapsulamento de drogas) ou se não houver leitura funcional conhecida, não será mais possível avaliar as alterações devidas ao armazenamento de forma direta.
Por outro lado, a simples avaliação de alterações em seus parâmetros físico-químicos, como tamanho, recuperação de partículas e concentração proteica, nem sempre prediz mudanças na atividade de EV, como foi demonstrado em uma patente recente20.
Aqui, nós fornecemos um protocolo prontamente aplicável para medir a estabilidade do armazenamento de EVS avaliando seus parâmetros físico-químicas combinados com a atividade de uma enzima encapsulada da beta-glucuronidase como um substituto para a carga dos EVS. O carregamento da enzima é feito por incubação de saponina, um método leve estabelecido com EVS de diferentes fontes21,24,25. A saponina forma poros transitórios na membrana EV, o que permite a absorção enzimática na vesícula. Como as enzimas são propensas a perder sua atividade se submetido a condições de armazenamento desfavorável, eles são um substituto ideal para a avaliação da preservação das cargas funcionais dos EVs.
Nós demonstramos que a aplicação deste protocolo aos EVS derivados das pilhas de haste mesenquimais humanas (MSCS), das pilhas endothelial humanas da veia de cordão umbilical (HUVECs), e das pilhas epithelial alveolares humanas do adenocarcinoma (A549) resulta certamente em grandes diferenças na estabilidade de armazenamento entre diferentes linhas celulares, que devem ser levados em consideração ao escolher a fonte EV21.
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Protocol
1. cultura celular e produção de meio celular-condicionado
- Geralmente, cultivar as células as condições individuais necessárias para a respectiva linha celular.
- Cultivar as células para 24-72 h em condições livres de soro ou em meio contendo soro bovino fetal empobrecido EV (FBS).
Nota: se for utilizado FBS empobrecido EV, empregar um método comprovado para esgotar eficientemente o soro, para evitar a contaminação com soro-derivado de bovinos EVs26. - Colete o meio dos frascos. Centrifugador em 300 x g por 10 min para pellet as células. Colete com cuidado o meio celular-condicionado (CCM), sem perturbar as células peletizadas. De preferência, use o CCM diretamente, ou armazene-o durante a noite a 4 ° c.
Nota: é sempre preferível usar o CCM recentemente produzido. Se o armazenamento por períodos de tempo mais longos não puder ser contornado, todos os parâmetros relevantes devem ser gravados de acordo com as diretrizes do MISEV201826, e os potenciais vieses dos resultados adquiridos precisam ser levados em consideração. - Exemplo de protocolo para HUVECs
- Cultivar células HUVEC para 120 h em meio EGM-2 contendo FBS e outros suplementos.
- Cultivar células HUVEC para 48 h no meio basal EBM-2 livre de quaisquer suplementos adicionais.
- Recolher o meio dos frascos e executar a etapa de centrifugação como indicado acima (passo 1,3). Normalmente, use 100 mL de meio para um isolamento de EV.
2. ultracentlee de CCM
- Imediatamente antes de ultracentlee (UC), centrifugue o CCM por 15 min a 3.000 x g e 4 ° c para remover detritos celulares e grandes aglomerados.
- Transfira cuidadosamente o sobrenadante para os tubos UC. Se estiver usando um rotor de ângulo fixo, marque a orientação dos tubos na centrífuga para facilitar a recuperação do pellet EV após a UC. Centrifugador para 2 h em 120.000 x g, com um k-factor de 259,4.
- Após UC, elimine com cuidado o sobrenadante usando um Pipet sorológicos, para evitar o distúrbio dos EVS peletizada.
Nota: o pellet pode ser invisível. - Adicionar 200 μL de soro fisiológico tamponado com fosfato de 0,2 μm (PBS) ao primeiro tubo e utilizar PBS e o sobrenadante residual para ressuscitar o pellet através de pipetagem para cima e para baixo. Transfira a suspensão EV resultante para o tubo seguinte da respectiva amostra e utilize-a para a repensão. Proceda desta forma para suspender todos os EVs da amostra num volume final de aproximadamente 300-350 μL.
- Após a ressuspensão, confirme a presença de partículas por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). Use as configurações otimizadas para o tipo de EV determinado, como as configurações abaixo (etapa 2.5.1).
Nota: os artigos de Gardiner et al.27 e vestad et al.28 contêm informações valiosas sobre como otimizar os parâmetros de medição de EVS.- Para reproduzir os resultados descritos abaixo, utilize instrumentos (por exemplo, NanoSight LM14) equipados com um laser verde. Gravar três vídeos de 30 s com um ganho de tela de 1,0 e um nível de câmera de 13. Para análise, use um ganho de tela de 1,0 e um limiar de detecção de 5.
- Use o pellet imediatamente, se possível; caso contrário, guarde-o a 4 ° c durante a noite.
3. encapsulamento de glucuronidase em EVs
- Ao pellet ressoado, adicionar beta-glucuronidase (10 mg/mL em PBS) a uma concentração final de 1,5 mg/mL e saponina (10 mg/mL em H2o) a uma concentração final de 0,1 mg/ml. Misture bem por vortexing para 3 s.
- Incubar durante 10 min à temperatura ambiente com a mistura intermitida, sacudendo suavemente o tubo. Após a incubação, purificar diretamente por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) (ver secção 5).
Nota: não recongelar amostras de glucuronidase uma vez descongeladas, para evitar a degradação da enzima devido ao congelamento.
4. liposome produção
- Para preparar os lipossomas para comparação com EVs, dissolva 1,2-dimyristoyl-SN-glycero-3-fosfocolina (dmpc) e 1,2-dipalmitoyl-SN-glicero-3-FOSFOCOLINA (DPPC) em uma ração molar 2:3 em clorofórmio a uma concentração final de 5 mm. Prepare alíquotas de 1 mL em frascos de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e deixe-os secar durante a noite para formar um filme lipídico.
Cuidado: o clorofórmio é tóxico e suspeita de ser cancerogênico. Tome as devidas precauções ao manusear. - Rehidrate o filme lipídico com 1 mL de PBS contendo 1,5 mg/mL de glucuronidase. Aqueça-o a 42 ° c e Vortex por 1 min. Aqueça o conjunto da extrusora a 42 ° c e extrusão a suspensão lipídica 11X através de uma membrana de policarbonato de 200 nm. Purificar diretamente pela SEC (ver secção 5).
5. purificação por SEC
- Prepare a coluna SEC usando o seguinte protocolo.
- Use apenas água purificada fresca e tampões preparados na hora. Filtrar todos os buffers através de um filtro de membrana de 0,2 μm e Degas-los para evitar a formação de bolhas de ar na coluna.
- Para a preparação de uma coluna SEC, use a matriz baseada em filtração em gel de agarose (por exemplo, Sepharose CL-2B) ou outro meio SEC adequado para separar EVs e lipossomas de impurezas proteicas e excesso de enzima. Primeiro, retire a solução de 20% EtOH que o meio é armazenado, para evitar a formação de bolhas de ar na coluna. Para este fim, centrifugue o meio SEC em 3.000 x g por 10 min, retire o EtOH e substitua-o por água desgaseificada.
- Encha uma coluna de vidro (com um diâmetro interno de 10 mm) com o meio SEC para a marca de 15 mL.
Observação: os volumes serão diferentes para colunas com dimensões diferentes. Certifique-se de deixar o gel resolver completamente. - Antes de uma corrida, equilibram a coluna com pelo menos dois volumes de coluna de PBS. Para armazenar a coluna, primeiro lave-a com um volume de coluna de água, seguido de pelo menos dois volumes de coluna de 20% de EtOH. Após o armazenamento, lave a coluna primeiro com um volume de coluna de água antes de equilibrar com PBS.
- Use até 400 μL de EV ou suspensão lipossomas em uma separação. Colete frações de 1 mL. Após a SEC, armazene os EVs purificados (ver secção 7) ou sujei-os a um ensaio de glucuronidase (ver secção 6).
- Confirme a separação de EVs e lipossomas de proteínas contaminantes e glucuronidase livre. Para tanto, correlacionar as concentrações de partículas das frações coletadas com a concentração proteica e a atividade da glucuronidase.
- Avaliar a concentração de partículas por NTA (ver 2,5)
- Avaliar o teor de proteínas por ensaio de ácido bicinchonínico (BCA) ou outro ensaio adequado de quantificação de proteínas. Realize o ensaio de acordo com o protocolo do fabricante.
- Avaliar a atividade da glucuronidase pelo ensaio de glucuronidase (ver secção 6).
- Opcionalmente, avalie a morfologia do EV por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e microscopia eletrônica de varredura (MEV).
- Para a preparação de amostras de TEM, adicione 10 μL de suspensão EV a uma grelha TEM, incubar durante 10 min e, em seguida, limpe qualquer excesso de líquido utilizando um papel de filtro. Realize a fixação por 10 min com 10 μL de paraformaldeído a 4% e afaste qualquer excesso. Lave 3x com água. Manchar as vesículas em 20 s de incubação com 30 μL de 1% de ácido fosfórico-tungstic hidrato. Depois de blotting afastado o excesso, seque as vesículas durante a noite. Visualize por TEM.
Cuidado: o ácido fosfórico é altamente cáustico; assim, proteger a pele e os olhos. - Para o SEM, fixe as amostras previamente preparadas do TEM em discos de carbono e Sputter-as com uma camada grossa do ouro de 50 nanômetro. Visualize por SEM.
- Para a preparação de amostras de TEM, adicione 10 μL de suspensão EV a uma grelha TEM, incubar durante 10 min e, em seguida, limpe qualquer excesso de líquido utilizando um papel de filtro. Realize a fixação por 10 min com 10 μL de paraformaldeído a 4% e afaste qualquer excesso. Lave 3x com água. Manchar as vesículas em 20 s de incubação com 30 μL de 1% de ácido fosfórico-tungstic hidrato. Depois de blotting afastado o excesso, seque as vesículas durante a noite. Visualize por TEM.
6. ensaio de glucuronidase
- Para permitir uma comparação entre diferentes amostras e condições de armazenamento, correlacionando o número de partículas e a atividade enzimática, primeiro meça a concentração de partículas da amostra por NTA (ver etapa 2,5).
- Prepare uma solução de trabalho de fluoresceina di-β-D-glucuronida adicionando 1 μL do composto (10 mg/mL em H2o) a 199 ΜL de PBS. Adicionar 25 μL desta solução a 125 μL de EVs purificados para obter uma concentração final de 8,3 μg/mL. Pipet a amostra em uma placa 96-well preta. Medir o ponto de tempo 0 h com um leitor de chapa, usando 480 nm como excitação e 516 nm como comprimento de onda de emissão.
- Cubra a placa firmemente (por exemplo, com a folha plástica transparente usada para placas do PCR) para minimizar a evaporação e incubar no escuro por 18 h em 37 ° c. Meça a produção da fluoresceina usando os parâmetros do leitor da placa alistados na etapa 6,2.
7. armazenamento de EVs e lipossomas
Nota: para todas as finalidades do armazenamento, é aconselhável usar os tubos Low-Binding para reduzir a perda do EV devido à adsorção.
- Siga os parâmetros nesta seção para reproduzir os resultados representativos abaixo. Utilize amostras compostas por 400 μL de suspensão de EV.
- Armazene a 4 ° c ou-80 ° c ou prossiga para as etapas listadas abaixo.
- Liofililize os EVs.
- Adicionar trealose (40 mg/ml em H2o) até uma concentração final de 4 mg/ml para os EVS purificados. Congelar as amostras a-80 ° c durante pelo menos 1 h.
- Liofililize as amostras usando os seguintes parâmetros. Para a secagem principal, ajuste a temperatura da prateleira a 15 ° c e a pressão a 0,180 mbar e deixe as amostras para secar por 46 h. Para a secagem final, ajuste a temperatura da prateleira a 25 ° c e a pressão a 0, 35 mbar e deixe as amostras para secar por 2 h. Guarde as amostras liofilizadas a 4 ° c.
- Para Rehidratar as amostras, adicionar H2o, igual à quantidade de EV suspensão presente no início (tipicamente, 400 μL). Não utilize nenhum tampão para reidratação.
8. análise após o armazenamento
- Para avaliar a atividade enzimática, primeiro remova a glucuronidase livre, que pode ter vazado dos EVs durante o armazenamento. Consiga isto por uma etapa adicional da purificação que seja realizada pelo SEC (veja a etapa 5) ou pelo fraccionamento do fluxo de campo assimétrico do fluxo (AF4) (veja a etapa 8.1.2).
Nota: Informamos que ambos os métodos levam a uma diluição da amostra EV; assim, use concentrações suficientes de EV antes do armazenamento para evitar mover-se abaixo do limite de quantificação de NTA. Espere uma diluição 1:10 das partículas devido ao SEC ou ao AF4.- Para a purificação da SEC, siga o protocolo descrito acima (ver secção 5).
- Realize a purificação AF4.
- Configure o instrumento usando um pequeno canal com um espaçador de 350 μm e uma membrana de celulose de corte de peso molecular de 30 kD. Coloque um filtro de tamanho de poros de 0,1 μm entre a bomba HPLC e o canal AF4. Use a PBS filtrada recentemente preparada 0,1 μm como a fase móvel para reduzir a carga e o ruído da partícula nos detectores da luz-espalhamento.
- Detecte proteínas utilizando um detector UV definido para 280 nm. Para detectar partículas, use espalhamento de luz multiangular com o laser definido para 658 nm.
- Use o seguinte método de execução. Pre-Focus para 1 minuto com um fluxo do foco de 1 mL/min; em seguida, injete 300 μL da amostra a uma taxa de 0,2 mL/min e mantenha o fluxo de focagem durante 10 min. Após a injeção, eluir a amostra em 1 ml/min ao aplicar um fluxo transversal que diminua de 2 ml/min a 0,1 ml/min ao longo de 8 min. eluir por outro 10 min sem fluxo cruzado. Colete frações de 1 mL, começando após 12,5 min e continuando até 27 min.
- Realize o ensaio de glucuronidase como descrito acima (ver secção 6).
- Para avaliar o tamanho e a concentração, use o NTA como descrito acima (ver passo 2,5).
- Opcionalmente, execute TEM e SEM para avaliar a morfologia dos EVs após o armazenamento (ver 5,3).
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Representative Results
A Figura 1 exibe as características de armazenamento de EVS isoladas de HUVECs. Os EVs foram isolados por UC, a glucuronidase foi encapsulada e, após a SEC, os EVs purificados foram avaliados por suas propriedades físico-químicas por NTA. Uma amostra dos vesículas foi submetida subseqüentemente à purificação AF4 e a atividade do glucuronidase foi medida.
As vesículas foram então armazenadas por 7 d a 4 ° c ou-80 ° c e a 4 ° c em forma liofilizada, no último caso com a adição de trealose a 4%. Após o armazenamento, as vesículas foram novamente mensuradas pela NTA e, após a AF4, a atividade remanescente de glucuronidase por partícula foi avaliada.
O princípio de funcionamento do AF4 é baseado na combinação de fluxo laminar e um cruzamento ortogonal através da membrana porosa na parte inferior do canal AF4, que afeta diferencialmente as partículas de acordo com seu tamanho (Figura 2). As partículas maiores tendem a ser localizadas mais perto da membrana, enquanto as partículas menores estão localizadas mais acima no canal. Devido ao perfil de fluxo parabólico do fluxo laminar, partículas mais distantes da membrana viajam mais rápido em direção ao detector, levando a uma separação de partículas por tamanho. Em um experimento AF4 típico, as partículas injetadas são primeiramente focalizadas na membrana, aplicando um fluxo cruzado sem um fluxo longitudinal através do canal (Figura 2a). Após a injeção e o foco, a eluição começa aplicando simultaneamente um fluxo cruzado e um fluxo longitudinal para fraccionar e eluir os diferentes subconjuntos de partículas (Figura 2B), que, no nosso caso, foram EVS e glucuronidase livre.
A Figura 3 ilustra a separação de nanopartículas (EVS ou lipossomas) de proteínas contaminantes e glucuronidase não encapsulada. O perfil de eluição da SEC de lipossomas (Figura 3a) purificada após a sua preparação (ver secção 4 do protocolo) demonstrou a separação das partículas com glucuronidase encapsulada da enzima livre, detectada tanto através do ensaio BCA como atividade enzimática. No presente exemplo, a fração 6 e 7 seria escolhida para experimentos adicionais, pois continham as maiores concentrações de partículas e evitaria possíveis contaminações com glucuronidase livre. AF4 foi também bem sucedido em separar EVs da glucuronidase livre como demonstrado na Figura 3B, com um grau mais elevado de separação do que o SEC, fazendo a contaminação das frações que contêm as vesículas menos prováveis.
Na Figura 4, foi realizado um experimento de controle para garantir que a atividade enzimática medida para as vesículas estivesse de fato ligada à encapsulação de glucuronidase em EVS e não causada por agregados enzimáticos. Estes agregados puderam ter sido dados forma devido à incubação do glucuronidase com saponina e conduzem aos resultados positivos falsos. Para verificar as frações em que as vesículas elute, as EVs purificadas sem glucuronidase encapsulada foram submetidas à SEC na mesma coluna que a amostra contendo apenas saponina e a enzima.
Quando a glucuronidase foi incubada com saponina e subsequentemente purificada pela SEC, nenhuma atividade enzimática foi encontrada nas frações tipicamente contendo EVs. Quando as pequenas quantidades de partículas foram encontradas ao eluir ao mesmo tempo que EVS (que fazem acima < 0.1% das partículas recuperadas de um pellet típico do EV), não havia nenhum correlacionando a atividade de enzima. Esses resultados indicam que a enzima ativa recuperada nas frações contendo vesículas foi encapsulada neles.
A Figura 5 compara a recuperação da enzima ativa após o armazenamento com ou sem purificação AF4 adicional para remover o corante não encapsulado. Com a purificação AF4, geralmente há uma menor recuperação da enzima por partícula, com o maior efeito para o armazenamento a 4 ° c, onde a recuperação cai por dois terços. Assim, omitindo esta etapa adicional da purificação pode conduzir às suposições erradas sobre a estabilidade da enzima.
A Figura 6 mostra o efeito da liofilização sem um crioprotectante em vesículas derivadas de MSCS, células A549 e lipossomas, em comparação com o congelamento a-80 ° c. As partículas foram imaged por TEM e SEM como descrito acima (veja a etapa 5,3 do protocolo). Os MSCs e A549 EVs não apresentaram grandes diferenças na forma nas imagens de TEM, comparando as duas condições de armazenamento. No entanto, nas imagens de SEM, as amostras liofilizadas exibiam agregados não encontrados nas amostras-80 ° c. Os liposomas igualmente exibiu agregados na imagem de sem, quando em tem, o liofilização pareceu induzir um aumento do tamanho dos lipossomas. A liofilização sem criprotectantes também reduziu a recuperação da glucuronidase intacta após o armazenamento (Figura 7). A adição de trealose como um crioprotectante aumentou a recuperação da enzima ativa de forma dose-dependente.
A Figura 8 demonstra a conversão da fluoresceina di-β-D-glucuronida na fluoresceina livre, ocorrendo no ensaio de glucuronidase. Quando o reagente era nonfluorescente em 516 nanômetro, a fluoresceina é altamente fluorescente neste comprimento de onda. Isso permitiu um ensaio de atividade enzimática direta com alta sensibilidade.
Figura 1 : Estabilidade do armazenamento de HUVEC EVs. (A) recuperação da partícula comparada a antes do armazenamento, (B) tamanho médio, e (C) a atividade normalizada do glucuronidase por a partícula dos EVS isolados de HUVECs. As vesículas foram armazenadas para 7 d a 4 ° c e-80 ° c e a 4 ° c após liofilização com 4% de trealose. O tamanho médio e a recuperação das partículas foram medidos por NTA; a atividade de glucuronidase por partícula foi calculada combinando dados de NTA e os resultados do ensaio de glucuronidase e normalizado antes do armazenamento. Média ± DP, n = 3, *p < 0, 5 (ANOVA One-Way seguida pelo teste post hoc de Tukey). Modificado de Frank et al.21. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Princípio de funcionamento do AF4. (A) EVS e glucuronidase livre são focalizados após a injeção aplicando um fluxo transversal. (B) depois, os EVS e a enzima livre são eluída separadamente combinando o fluxo através do canal com um fluxo transversal. Modificado de Frank et al.21. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Separação de EVs e lipossomas da glucuronidase livre. (A) separação representativa da SEC de lipossomas carregados de glucuronidase, glucuronidase livre e contaminantes proteicos. O gráfico exibe a concentração de partículas (vermelho), a concentração de proteínas (azul) e a atividade da glucuronidase (verde). (B) demonstração da separação de EVS da glucuronidase livre. EVs não tratados, EVs cravado com 0, 5 mg/mL de glucuronidase, glucuronidase livre (0,5 mg/mL), e EVs carregados com glucuronidase e purificados pela SEC (EV glucuronidase) foram injetados e analisados por UV a 280 nm e 90 ° espalhamento de luz. Enzima livre eluída separadamente de EVS. Modificado de Frank et al.21. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Experimentos de controle para a purificação de EVs de glucuronidase livre. 400 μL de EVs nativos ou 400 μL de 1,5 mg/mL de glucuronidase em PBS incubados durante 10 min com 0,1 mg/mL de saponina foram purificados por SEC. (a) concentrações de partículas das frações coletadas de vesículas e glucuronidase, respectivamente, e a atividade enzimática de a glucuronidase purificada. (B) absorção de UV a 280 nm medida no mesmo experimento. O primeiro pico pequeno para glucuronidase corresponde com a linha cinzenta no painel A. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : O efeito de etapas adicionais da purificação após o armazenamento do EV. Atividade restante da glucuronidase por partícula comparada a D0 com ou sem uma etapa adicional da purificação de AF4 após o armazenamento. Os EVs de HUVEC foram armazenados para 7 d em 4 ° c ou-80 ° c e liofilizado com 4% Trehalose. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Tem e sem imagens de EVs. Imagens de Met e SEM de EVs de (a) MSCS e (B) A549 células e (C) lipossomas. As amostras foram armazenadas por 14 d a-80 ° c ou liofilizadas sem a adição de trealose. As setas indicam a presença de partículas morfològica alteradas nas imagens e nos agregados de TEM nas imagens de SEM. Modificado de Frank et al.21. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 : O efeito da trealose na recuperação enzimática após liofilização. Comparação da atividade enzimática após liofilização por 14 dias, com 0%, 1% e 4% de trealose com a amostra antes do armazenamento (0 dias). Modificado de Frank et al.21. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8 : A clivagem enzimática de fluoresceina di-β-D-glucuronida por glucuronidase. No esquema, a reação subjacente à detecção de glucuronidase é explicada. A fluoresceina di-β-D-glucuronida não fluorescente é clivada por glucuronidase. Através da remoção dos resíduos de açúcar, a fluoresceína recupera suas propriedades fluorescentes. A fluorescência medida após o período de incubação correlaciona-se com a quantidade de enzima ativa presente e é o leitura do ensaio da glucuronidase. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste manuscrito, apresentamos um protocolo abrangente para estudar a estabilidade dos EVs diferentes condições de armazenagem. Com a combinação de glucuronidase encapsulado como um leitura funcional e a avaliação dos parâmetros físico-químicas dos EVS, o protocolo permite uma avaliação de estabilidade de armazenamento direta de EVS e a comparação de EVS da pilha diferente Linhas. SEM e TEM como métodos complementares permitem uma introspecção em mudanças dos EVs no nível da único-partícula. Os resultados aqui apresentados mostraram uma tendência dos EVs e dos lipossomas de agregar devido à liofilização sem um crioprotectante (Figura 6). No entanto, isso só foi observado nos experimentos de SEM. Quando a imagem latente do em não foi conduzida com as amostras que foram preservadas com Trehalose, a literatura sugere que este crioprotetor possa certamente reduzir a agregação de EVS29. Também é possível avaliar, se uma determinada condição de armazenamento afeta diferencialmente o tamanho do EV, a taxa de recuperação e as moléculas encapsuladas. Tal efeito é exemplificado pelos resultados obtidos para o HUVEC EVs (Figura 1). Enquanto a recuperação de partículas para 4 ° c e-80 ° c foi melhor do que para as amostras liofilizadas, a recuperação da glucuronidase encapsulada ativa foi melhor para as amostras liofilizadas. A liofilização de EVs poderia ser a condição de armazenamento mais favorável, por exemplo, ao analisar biomarcadores EV, onde o foco é mais na obtenção e preservação da carga intacta, em vez de em vesículas intactas.
Em seu recente artigo sobre a liofilização de EVs22, charoenviriyakul et al. seguiram uma abordagem comparável. Em relação aos parâmetros físico-químicos, concentraram-se no índice de polidispersão (PDI) e no potencial zeta, pois as alterações no potencial zeta podem se correlacionar com a redução da estabilidade coloidal. No entanto, o potencial zeta não pode apenas explicar as mudanças observadas na estabilidade30, o que também se refletiu em seus resultados. Igualmente compararam a proteína e o índice do RNA de EVS armazenados pela electroforese do gel do poliacrilamida. Esta técnica pode muito bem indicar mudanças substanciais na proteína ou no índice do RNA das vesículas. No entanto, ele requer quantidades muito maiores de material do que o método apresentado aqui. Para avaliar o efeito do armazenamento na carga de EV, charoenviriyakul et al. expressaram heterologamente uma enzima e uma espécie de DNA cada uma em sua linha de células produtoras de EV e monitoraram sua atividade e integridade nos EVS. Entretanto, tal expressão heterólogo não é apropriada se os EVS das fontes diferentes devem ser comparados, porque exige uma quantidade de tempo substancial para cada linha de pilha nova, quando o encapsulamento saponin-negociado simples puder prontamente ser aplicado.
É crucial remover qualquer enzima não encapsulada, como mostrado na Figura 3. A glucuronidase encapsulada por EV reage muito mais lentamente com seu substrato do que a enzima livre em solução, levando a uma superestimativa da eficiência da encapsulação. A separação limpa é especial importante para a análise após o armazenamento, porque as condições de armazenamento puderam afetar a atividade do glucuronidase livre na amostra diferentemente e puderam conduzir ao escapamento dos EVs danificados. Isso foi aparente em nossos experimentos (Figura 5), pois a aplicação de AF4 antes do ensaio de glucuronidase conseguiu remover o corante não encapsulado nas vesículas. Assim, tornou possível obter resultados claros sobre o efeito dos métodos de armazenamento discutidos aqui, enquanto sem AF4, a perda de atividade devido ao armazenamento teria sido subestimada.
Outra consideração importante é o isolamento e caracterização dos EVs a serem testados para sua estabilidade. Embora a técnica descrita permita a comparação de EVS de diferentes fontes, isso só é possível se todos eles forem preparados pelo mesmo método de isolamento para que os resultados não sejam distorcidos18,31,32. Neste contexto, as condições de cultura celular precisam ser levadas em consideração também, pois podem impactar a quantidade e a bioatividade dos EVs isolados33. Para obter resultados que podem ser comparados a outros resultados publicados, é aconselhável consultar o recém-atualizado "informações mínimas para estudos de vesículas extracelulares" que contém diretrizes para a harmonização da pesquisa EV26.
No protocolo apresentado aqui, nós usamos SEC ou AF4 para remover a enzima livre após o armazenamento. Outros métodos podiam ser aplicados, tais como o ultracentlee do inclinação, o UC, ou o ultrafiltração34. Comparado aos métodos centrífugos, SEC e AF4 são menos demorados (por exemplo, aproximadamente 1,5 h para SEC, incluindo a equilibração da coluna versus até 16 h ou mais para gradiente UC) e eles podem separar completamente as proteínas livres dos EVs em comparação com a UC normal, onde sempre permanece sobrenadante residual com o pellet. Além disso, SEC15 e AF435 são métodos leves, que induzem menos tensão de cisalhamento nos EVS. Em comparação, as forças impostas em EVS durante UC puderam conduzir às alterações das partículas, tais como a agregação e as alterações no tamanho34,36.
Uma desvantagem da SEC e AF4 é a diluição das amostras. Assim, é exigido isolar quantidades suficientes de EVs para manter as concentrações exigidas para medidas de NTA após etapas múltiplas da purificação. As frações EV podem ser concentradas usando filtros centrífugos, mas, dependendo do material filtrante e do protocolo, pode haver uma perda de vesículas37.
A limitação do protocolo discutido aqui é que monitora somente a atividade de enzima do glucuronidase exogenamente encapsulado, não tendo em conta o RNA encapsulado e o ADN nem as proteínas de superfície do EV que puderam ser importantes para a funcionalidade18 . Para a pesquisa da nova terapêutica EV, esta técnica não pode substituir os ensaios na funcionalidade, mas elogiá-los e dar uma indicação sobre a estabilidade da vesícula. Poderia ser de grande uso se, por exemplo, EVS derivados de biofluídos devem ser armazenados para posterior análise de seu conteúdo vesícula.
No futuro, o escopo deste protocolo poderia ser expandido para incluir também EVs derivados de outros organismos, por exemplo, vesículas de membrana externa bacteriana. Outro próximo passo interessante seria testar o encapsulamento de ácidos nucleicos por incubação de saponina e também olhar para a estabilidade de cargas de DNA ou RNA.
Em conclusão, este procedimento oferece um método simples para a avaliação da estabilidade do armazenamento de EVS das várias fontes de pilha mamíferos integrando um readout físico-químicas e funcional. Este protocolo detalhado permitirá a investigadores do EV uma determinação direta de condições de armazenamento apropriadas para suas vesículas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O programa de pesquisa Júnior NanoMatFutur do Ministério Federal da educação e pesquisa, Alemanha (Grant Number 13XP5029A) apoiou este trabalho. Maximilian Richter foi apoiado por Studienstiftung des Deutschen Volkes (Fundação alemã de bolsas acadêmicas) através de uma bolsa de doutorado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 cm² cell culture flasks | Corning | 431082 | Used with 25 ml of medium |
| 30 kDa regenerated cellulose membrane | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 µm spacer | Wyatt Technology Europe | ||
| Automated fraction collector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Beta-glucuronidase | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
| Chloroform | Fisher scientific | C/4966/17 | |
| Column oven | Hitachi High-Technologies Europe | ||
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector | Wyatt Technology Europe | ||
| Durapore Membrane filter, PVDF, 0,1 µm, 47 mm | Merck | VVLP04700 | Used for the preparation of buffers for AF4 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells |
| ELISA Plate Sealers | R&D Systems | DY992 | used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay |
| Ethanol | Fisher scientific | E/0665DF/17 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| Filter support | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | used for liposome preparation |
| Fluorescein di-β-D-glucoronide | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS-tablets+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting cells at 300 g | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting larger debris at 3000 g | |
| HUVEC cells | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
| Kimble FlexColumn 1X30CM | Kimble | 420401-1030 | |
| Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC | Christ | ||
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR international | 525-0255 | the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery |
| Nanosight LM14 equipped with a green laser | Malvern Pananalytical | ||
| Nanosight-software version 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes | Whatman/GE Healthcare | 110406 | used for liposome preparation |
| PEEK Inline filter holder | Wyatt Technology Europe | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
| Polycarbonate bottles for ultracentrifugation | Beckman Coulter | 355622 | |
| QuantiPro BCA Assay Kit | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| SEM copper grids with carbon film | Plano | S160-4 | |
| Small AF4 channel | Wyatt Technology Europe | ||
| Sputter-coater Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Type 45 Ti ultracentrifugation rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
| Ultimate 3000 Dionex autosampler | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex isocratic pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K | Beckman Coulter | ||
| UV detector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC |
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