Evaluatie van de opslag stabiliteit van extracellulaire blaasjes
Summary
Hier presenteren we een gemakkelijk toepasbare protocol om de opslag stabiliteit van de extracellulaire blaasjes te beoordelen, een groep van nature voorkomende nanodeeltjes geproduceerd door cellen. De blaasjes worden geladen met glucuronidase als model enzym en in verschillende omstandigheden opgeslagen. Na opslag worden de fysisch-chemische parameters en de activiteit van het ingekapseld enzym geëvalueerd.
Abstract
Extracellulaire blaasjes (EVs) zijn veelbelovende doelen in het huidige onderzoek, om te worden gebruikt als drugs, drug-carriers, en biomarkers. Voor hun klinische ontwikkeling, niet alleen hun farmaceutische activiteit is belangrijk, maar ook hun productie moet worden geëvalueerd. In dit verband richt het onderzoek zich op het isoleren van EVs, hun karakterisering en hun opslag. Het huidige manuscript beoogt een gemakkelijke procedure te bieden voor de beoordeling van het effect van verschillende opslagomstandigheden op EVs, zonder genetische manipulatie of specifieke functionele analyses. Dit maakt het mogelijk om snel een eerste indruk van de stabiliteit van EVs te krijgen onder een bepaalde opslag conditie, en EVs afgeleid van verschillende bronnen van de cel kan gemakkelijk worden vergeleken. De stabiliteits meting is gebaseerd op de fysisch-chemische parameters van de EVs (grootte, DEELTJESCONCENTRATIE en morfologie) en het behoud van de activiteit van hun lading. De laatste wordt beoordeeld door de saponine-gemedieerde inkapseling van het enzym Beta-glucuronidase in de EVs. Glucuronidase fungeert als een surrogaat en zorgt voor een eenvoudige kwantificering via de splitsing van een fluorescerende reporter molecuul. Het huidige protocol kan een hulpmiddel voor onderzoekers in het zoeken naar opslagomstandigheden die optimaal te behouden EV eigenschappen om EV onderzoek naar klinische toepassing vooraf.
Introduction
EVs zijn membraan gebonden nanodeeltjes geproduceerd door bijna alle soorten cellen. Voor zoogdiercellen kan EVS worden onderverdeeld in twee hoofdgroepen met verschillende productie trajecten1,2. Membraan blaasjes, met een grootte variëren van ongeveer 100-1000 nm, worden geproduceerd door directe ontluikende uit het celmembraan. Exosomes, sized 30-200 nm, zijn afgeleid van multivesiculaire lichamen gevormd door innerlijke ontluiken in endosomes die vervolgens fuseren met de celmembraan om meerdere Exosomes in een keer vrij te geven. De belangrijkste functie van deze blaasjes is het vervoer van informatie tussen cellen3. Voor dit doel, worden de ladingen zoals RNA, DNA, en proteïnen actief gesorteerd in hen. EVs kan brengen een verscheidenheid van effecten op hun doelstellingen, met implicaties voor zowel gezondheid en ziekte staat. Aan de ene kant, ze bemiddelen positieve effecten, zoals weefselregeneratie, antigeen presentatie, of antibiotica-effecten, waardoor ze veelbelovende doelen voor hun ontwikkeling als therapeutische4,5. Aan de andere kant, EVs kan bevorderen tumor vascularisatie6, omstanders effecten induceren in stressreacties7, en kan een rol spelen bij auto-immuunziekten8 en inflammatoire ziekten9. Aldus, zouden zij een zeer belangrijke component aan een beter begrip van vele pathologische gevolgen kunnen zijn. Echter, de aanwezigheid van veranderde EVS in diverse ziekten, zoals kanker10,11,12 en cardiovasculaire aandoeningen13, en hun gemakkelijke bereikbaarheid in bloed en urine maakt ze ideaal Biomarkers. Ten slotte, hun goede biocompatibiliteit14 en hun inherente targeting vermogen maken EVS ook interessant voor drug delivery15. In dit manuscript beschrijven we een protocol voor de evaluatie van de opslag stabiliteit van EVs afkomstig van zoogdiercellen, een belangrijke eigenschap die nog weinig wordt onderzocht.
Voor de klinische ontwikkeling van EVs, zijn er nog vele hindernissen om16te overwinnen, met inbegrip van de evaluatie van hun therapeutische gevolgen, productie, reiniging, en opslag17. Terwijl-80 °C op grote schaal wordt gezien als de gouden standaard voor EV opslag18, de vereiste diepvriezers zijn duur, en het handhaven van de vereiste koude keten van de productie naar de patiënt kan worden uitdagend. Bovendien, sommige rapporten geven aan dat de opslag bij-80 °c nog steeds niet optimaal EVS behoudt en induceert een verlies in EV functionaliteit19,20. Andere methoden, zoals vriesdrogen21,22 of spray-droging23, zijn voorgesteld als mogelijke alternatieven voor de bevroren opslag van EVS.
De optimale manier om de opslag stabiliteit te beoordelen zou zijn om de EVs te testen in functionele assays of door de evaluatie van een specifieke marker, bijvoorbeeld, hun antibacteriële activiteit19. Dit is mogelijk wanneer het gewenste effect van de blaasjes bekend is en wanneer een afzonderlijke groep van EVs moet worden bestudeerd. Als EVs uit verschillende cel bronnen moet worden vergeleken (bijv. voor drug inkapseling) of als er geen bekende functionele uitlezing is, is het niet langer mogelijk om wijzigingen als gevolg van opslag op een directe manier te beoordelen.
Aan de andere kant, gewoon de evaluatie van veranderingen in hun fysisch-chemische parameters, zoals grootte, deeltjes herstel, en eiwitconcentratie, niet altijd voorspellen veranderingen in EV activiteit, zoals is aangetoond in een recent patent20.
Hier bieden wij een gemakkelijk toepasbare protocol voor het meten van de opslag stabiliteit van EVs door de beoordeling van hun fysisch-chemische parameters in combinatie met de activiteit van een ingekapseld Beta-glucuronidase enzym als een surrogaat voor de lading van de EVs. De lading van het enzym wordt gedaan door saponine incubatie, een milde methode die met EVS van verschillende bronnen21,24,25wordt gevestigd. Saponine vormen voorbijgaande poriën in de EV membraan, die het mogelijk maakt enzym opname in de blaasje. Als enzymen zijn geneigd om hun activiteit te verliezen als onderworpen aan ongunstige opslagomstandigheden, ze zijn een ideale surrogaat voor de evaluatie van het behoud van functionele ladingen van de EVs.
We hebben aangetoond dat de toepassing van dit protocol op EVs afgeleid van menselijke mesenchymale stamcellen (MSCs), menselijke navelstreng endothelial cellen (HUVECs), en de menselijke adenocarcinoom alveolaire epitheelcellen (A549) inderdaad resulteren in grote verschillen in de stabiliteit van de opslag tussen verschillende cel lijnen, die in overweging zouden moeten worden genomen wanneer het kiezen van EV bron21.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit manuscript presenteren we een uitgebreid protocol om de stabiliteit van EVs onder verschillende opslagomstandigheden te bestuderen. Met de combinatie van ingekapseld glucuronidase als een functionele uitlezing en de evaluatie van de fysisch-chemische parameters van het EVs, het protocol zorgt voor een eenvoudige opslag stabiliteit evaluatie van EVs en de vergelijking van EVs uit verschillende cel Lijnen. SEM en TEM als complementaire methoden maken een inzicht in de veranderingen van de EVs op de single-particle n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het NanoMatFutur Junior research programma van het Federaal Ministerie van onderwijs en onderzoek, Duitsland (Grant Number 13XP5029A) steunde dit werk. Maximilian Richter werd gesteund door Studienstiftung des deutschen Volkes (Duitse academische beurs Stichting) door middel van een Ph.D. Fellowship.
Materials
| 1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 cm² cell culture flasks | Corning | 431082 | Used with 25 ml of medium |
| 30 kDa regenerated cellulose membrane | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 µm spacer | Wyatt Technology Europe | ||
| Automated fraction collector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Beta-glucuronidase | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
| Chloroform | Fisher scientific | C/4966/17 | |
| Column oven | Hitachi High-Technologies Europe | ||
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector | Wyatt Technology Europe | ||
| Durapore Membrane filter, PVDF, 0,1 µm, 47 mm | Merck | VVLP04700 | Used for the preparation of buffers for AF4 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells |
| ELISA Plate Sealers | R&D Systems | DY992 | used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay |
| Ethanol | Fisher scientific | E/0665DF/17 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| Filter support | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | used for liposome preparation |
| Fluorescein di-β-D-glucoronide | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS-tablets+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting cells at 300 g | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting larger debris at 3000 g | |
| HUVEC cells | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
| Kimble FlexColumn 1X30CM | Kimble | 420401-1030 | |
| Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC | Christ | ||
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR international | 525-0255 | the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery |
| Nanosight LM14 equipped with a green laser | Malvern Pananalytical | ||
| Nanosight-software version 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes | Whatman/GE Healthcare | 110406 | used for liposome preparation |
| PEEK Inline filter holder | Wyatt Technology Europe | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
| Polycarbonate bottles for ultracentrifugation | Beckman Coulter | 355622 | |
| QuantiPro BCA Assay Kit | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| SEM copper grids with carbon film | Plano | S160-4 | |
| Small AF4 channel | Wyatt Technology Europe | ||
| Sputter-coater Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Type 45 Ti ultracentrifugation rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
| Ultimate 3000 Dionex autosampler | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex isocratic pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K | Beckman Coulter | ||
| UV detector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC |
References
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, 167-183 (2016).
- Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges. Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).
- Goes, A., Fuhrmann, G. Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).
- György, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).
- Schulz, E., et al. Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity. Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).
- Feng, Q., et al. A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis. Nature Communications. 8, 14450 (2017).
- Bewicke-Copley, F., et al. Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746 (2017).
- Xu, Y., et al. Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses. Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).
- Buzas, E. I., György, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases. Nature Reviews Rheumatology. 10, 356 (2014).
- Rajappa, P., et al. Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).
- Umezu, T., et al. Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1. Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -. E., Amabile, N. Extracellular vesicles in coronary artery disease. Nature Reviews Cardiology. 14, 259 (2017).
- Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).
- Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. Extracellular vesicles for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 106, 148-156 (2016).
- Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
- Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190 (2017).
- Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).
- Lőrincz, &. #. 1. 9. 3. ;. M., et al. Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465 (2014).
- Kreke, M., Smith, R., Hanscome, P., Peck, K., Ibrahim, A. Processes for producing stable exosome formulations. US patent. , (2016).
- Frank, J., et al. Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying. Scientific Reports. 8 (1), 12377 (2018).
- Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization. International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).
- Kusuma, G. D., et al. To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles. Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson’s disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins. Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671 (2013).
- Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential – What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858 (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Patel, D. B., et al. Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Bioengineering & Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
- Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
