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Cancer Research

Análisis citométrico de flujo de especies de oxígeno reactivo mitocondrial en células hematopoyéticas de la muriña y células progenitoras y leucemia impulsada por MLL-AF9

Published: September 5, 2019 doi: 10.3791/59593
Automatic Translation
1, 1
1Blood Cell Development and Function Program, Fox Chase Cancer Center

Summary

Describimos un método para utilizar citometría de flujo multiparámetro para detectar especies de oxígeno reactivo mitocondrial (ROS) en células hematopoyéticas sanas murinas (HSCCP) y células de leucemia a partir de un modelo de ratón de leucemia mieloide aguda (LMA) impulsada por MLL-AF9.

Abstract

Presentamos un enfoque citométrico de flujo para analizar la ROS mitocondrial en varias poblaciones de células madre y progenitoras derivadas de médula ósea viva (BM) de ratones sanos, así como ratones con LMA impulsados por MLL-AF9. Específicamente, describimos un proceso de tinción celular de dos pasos, por el que las células BM sanas o leucemias se tiñen primero con un tinte fluorogénico que detecta superóxidos mitocondriales, seguido de la tinción con anticuerpos monoclonales vinculados al fluorocromo que se utilizan para distinguir varias poblaciones de progenitores hematopoyéticos sanos y malignos. También proporcionamos una estrategia para adquirir y analizar las muestras por citometría de flujo. Todo el protocolo se puede llevar a cabo en un período de tiempo tan corto como 3-4 h. También destacamos las variables clave a tener en cuenta, así como las ventajas y limitaciones de la monitorización de la producción de ROS en el compartimiento mitocondrial de las subpoblaciones de tallo y progenitores hematopoyéticos vivos y de leucemia utilizando colorantes fluorogénicos por citometría de flujo . Además, presentamos datos de que la abundancia de ROS mitocondrial varía entre subpoblaciones de HSPC sanas distintas y progenitores de leucemia y analizamos las posibles aplicaciones de esta técnica en la investigación hematológica.

Introduction

Las Especies Reactivas de Oxígeno (ROS) son moléculas altamente reactivas derivadas del oxígeno molecular. La ubicación celular más bien definida de la producción de ROS es las mitocondrias, donde los electrones que pasan a través de la cadena de transporte de electrones (ETC) durante la fosforilación oxidativa (OXPHOS) son absorbidos por el oxígeno molecular que conduce a la formación de un específico tipo de ROS llamado superóxidos1. A través de las acciones de una serie de enzimas, llamadas dismutas de superóxido o SOD, los superóxidos se convierten en peróxidos de hidrógeno, que posteriormente son neutralizados en agua por enzimas como la catalasa o glutatión peroxidasas (GPX). Las perturbaciones en los mecanismos reguladores de ROS pueden conducir al exceso de producción de ROS, a menudo conocido como estrés oxidativo, que tienen consecuencias celulares dañinas y potencialmente letales como daño a macromoléculas (es decir, ADN, proteínas, lípidos). Además, el estrés oxidativo está relacionado con varias patologías, como diabetes, enfermedades inflamatorias, envejecimiento y tumores2,3,4. Para mantener la homeostasis redox y prevenir el estrés oxidativo, las células poseen una variedad de mecanismos reguladores de ROS5.

Los niveles fisiológicos de ciertos ROS son necesarios para la hematopoyesis embrionica y adulta adecuada6. Sin embargo, el exceso de ROS se asocia con daño al ADN, diferenciación celular y agotamiento del tallo hematopoyético y la piscina de progenitoras. También hay evidencia de que las alteraciones en la biología redox pueden diferir entre la leucemia y las células sanas. Por ejemplo, los niveles de ROS tienden a ser más altos en las células de leucemia mieloide aguda (LMA) en relación con sus contrapartes sanas y otros estudios han sugerido que las células madre de la leucemia mantienen un bajo nivel de estado estacionario de ROS para la supervivencia7,8. Es importante destacar que las estrategias para capitalizar terapéuticamente estas diferencias redox han demostrado ser prometedoras en varios entornos de cáncer humano9,10. Por lo tanto, los ensayos que permiten la evaluación de los niveles de ROS en los modelos de ratón pueden mejorar nuestra comprensión de cómo estas especies contribuyen a la fisiología celular y la patogénesis de la enfermedad, así como potencialmente proporcionar una plataforma para evaluar la eficacia de nuevas terapias contra el cáncer dirigidas al redox.

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Protocol

Todos los procedimientos animales descritos en este protocolo han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC) en Fox Chase Cancer Center.

NOTA: El flujo de trabajo del protocolo se divide en 4 partes como se presenta en la Figura 1 y los reactivos necesarios se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Aislamiento de médula ósea (BM)

NOTA: Se generaron ratones de leucemia MLL-AF9 como se describió anteriormente11.

  1. Recuperar células de médula ósea mononuclear, como se describió anteriormente12,13,14,15, de ratones salvajes tipo C57.Bl6 (que expresan el marcador congénico CD45.2) así como de C57. Ratones Bl6-SJL (que expresan el marcador congénico CD45.1) que han sido trasplantados con células de leucemia mLL-AF9 que expresan (CD45.2+).
    NOTA: BM se puede recuperar de ratones ya sea triturando12,13 o mediante el lavado de huesos14,15. Para los experimentos presentados aquí, BM se recuperó de ratones sanos y de leucemia a través del lavado.

2. Estaño de tinte fluorogénico ROS mitocondrial

  1. Una vez que las células de médula ósea mononuclear es recuperadas de ratones sanos y/o leucemia, manchan una alícuota de células con Trypan Blue y cuentan usando un hemocitómetro para determinar el número inicial de células BM totales.
  2. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en F-PBS (PBS complementado con 2% de suero bovino fetal y un cóctel de penicilina/estreptomicina al 1%) a una concentración de 2 x 106 células/ml.
  3. Aliquot 200 l de suspensión celular por tubo en 9 tubos de control monocolor etiquetados de la siguiente manera:
    Sin manchas, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (solo para HSCCP sanos), CD45.2-APC (solo para células de leucemia), CD34-FITC, tinte ROS mitocondrial y mancha de células vivas/muertas.
    NOTA: (Opcional) Se puede preparar un control positivo para la inducción de ROS mitocondrial mediante el tratamiento de 2 x 105 células en 200 ol con 20 m de bisulfito de sodio de menadiona (MSB) durante 1 h a 37 oC en una incubadora de CO2 al 5%. Se puede preparar un segundo control para revertir la inducción mediada por MSB de ROS mitocondrial mediante el tratamiento de 2 x 105 células en 200 oL con 20 m de MSB más 100 m de N-acetil-L-cisteína (NAC) durante 1 h a 37 oC en una incubadora de CO2 al 5%.
  4. Alícuota las células restantes en un tubo (tubo experimental) y centrífuga a 300 x g durante 5 min.
  5. Resuspenda las células en F-PBS con una mancha de células vivas/muertas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Incubar sobre hielo durante 30 minutos. Asegúrese de añadir una mancha viva/muerta al tubo de control de un solo color.
  6. Añadir 1,0 ml de temperatura ambiente (RT) F-PBS a tubos de un solo color y experimentales teñidos con el tinte vivo/muerto. Centrífuga 5 min a 300 x g en RT.
  7. Resuspenda 50 g del tinte ROS mitocondrial en 13 sulfóxido de dimetil (DMSO) para obtener una solución de stock de 5 mM.
  8. Diluir el tinte ROS mitocondrial a una concentración final de 5 m en RT F-PBS con o sin Verapamil (50 oM).
  9. Aspirar el lavado de la mancha de células vivas/muertas. Añadir 200 l de mancha de tinte ROS mitocondrial que contiene Verapamil a cada tubo experimental, así como el tubo de control mitocondrial ROS de un solo color.
  10. Vórtice para mezclar e incubar durante 10 min a 37oC en la oscuridad.
  11. Añadir 1,0 ml de RT F-PBS al control mitocondrial de un solo color teñido de ROS y tubos experimentales. Centrífuga 5 min a 300 x g en RT.
  12. Aspirar el sobrenadante y lavar las células con 1,0 ml adicionales de RT F-PBS. Centrífuga 5 min a 300 x g en RT.

3. Lineage Anticuerpo Staining

  1. Preparar los cócteles de anticuerpos enumerados en la Tabla 1.
    NOTA: Estos cócteles antianticuerpos han sido optimizados anteriormente14,15,16.
  2. Aspirar el sobrenadante del lavado final de tinte ROS mitocondrial de los tubos experimentales que contienen BM saludable y añadir 200 l de cóctel de anticuerpos #1 a cada tubo. Vórtice para mezclar. También prepare los tubos de control de un solo color. Incubar durante 60 minutos sobre hielo en la oscuridad.
  3. Aspirar el sobrenadante del lavado final de tinte ROS mitocondrial de los tubos experimentales que contienen leucemia BM y añadir 200 l del cóctel de anticuerpos #2 a cada tubo. Vórtice para mezclar. Incubar durante 60 minutos sobre hielo en la oscuridad.
  4. Lavar con 1,0 ml de F-PBS frío y centrífuga 5 min a 300 x g a RT.
  5. Resuspenda las células en 500 ml de F-PBS frío y filtre las células en un tubo de citómetro de flujo utilizando un filtro de 40 m para excluir agregados.

4. Adquisición y Análisis de Citometría de Flujo

NOTA: Varios subconjuntos hematopoyéticos del tallo y del progenitor son raros, como las células madre hematopoyéticas a largo plazo. Por lo tanto, idealmente se deben recolectar 3-5 millones de eventos para cada tubo experimental durante la adquisición de citometría de flujo para un análisis suficiente de ROS mitocondrial en los diversos subconjuntos de HSPC.

  1. Utilice el tubo de control sin manchas para establecer las gráficas de dispersión hacia adelante (FSC-A) y lateral (SSC-A) en función del tamaño y la complejidad de la población celular analizada.
  2. Utilice los tubos de control sin manchas y de un solo color para compensar el citómetro de flujo.
  3. Salida de escombros extraños de la gráfica de dispersión hacia adelante y lateral(Figura 2A,B,primer panel desde la izquierda).
  4. Salida de dobletes utilizando un doble discriminador como el discriminador hacia adelante(Figura 2A,B, segundo panel de la izquierda).
  5. Siga la estrategia de gating propuesta en la Figura 2A,B para seleccionar células vivas, linaje de células bajas y los diversos subconjuntos de HSPC y leucemia.
  6. Para cada población de interés, analice la intensidad media de fluorescencia (IMF) del canal TRPE (eje X) en una gráfica de histograma para evaluar las diferencias en la señal ROS mitocondrial(Figura 3A-C,paneles izquierdos). Los niveles de ROS mitocondrial se pueden evaluar a nivel de una sola célula comparando la tinción de ROS mitocondrial frente a marcadores de linaje específicos en una gráfica de dispersión.

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Representative Results

Presentado es un método para analizar la ROS en las mitocondrias de múltiples poblaciones de progenitores de leucemia sanas y mLL-AF9. La Figura 1 muestra una vista esquemática del flujo de trabajo del protocolo, que consta de 4 pasos principales: 1) aislamiento BM de ratones; 2) Manchación de células BM con un tinte fluorogénico que reconoce ROS mitocondrial, particularmente superóxidos; 3) Tinción de anticuerpos de marcador de superficie para delinear varias poblaciones hematopoyéticas sanas y leucemias; y 4) Adquisición y análisis de citometría de flujo.

Figura 2 A,B representa una estrategia de gating representativa para analizar varias poblaciones de tallo hematopoyético y progenitor en BM sana y leucemia. Se aplica una gráfica FSC/SSC para eliminar los desechos y se utiliza una gráfica FSC-area (FSC-A) versus FSC-height (FSC-H) para excluir dobletes y agregados. Un panel de marcadores de superficie de linaje(Tabla 1 y paso 3.1) se combinan para excluir una variedad de poblaciones hematopoyéticas maduras como linfocitos, eritrocitos, granulocitos y monocitos/macrofages (es decir, linaje bajo o Linbajo). El cóctel de linaje también incluye un anticuerpo CD48 y por lo tanto todos los subconjuntos de células bajas de linaje también son CD48-. La expresión de superficie celular Sca-1 y c-Kit se utiliza para distinguir una mezcla heterogénea de HSCCP llamada CD48- LSK (Linlow, Sca-1+, c-Kit+, CD48-) de los progenitores mieloides (Linlow, Sca-1- , c-Kit+, CD48-). Para distinguir aún más varios subconjuntos de HSPC, el marcador SLAM, CD150 y CD34 también se añaden17,18,19,20,21. Figura 2 B también representa una estrategia de gating representativa para los progenitores de leucemia de alta expresión de cKit (Linbajo,c-Kitalto; Sca-1-), que están enriquecidos para las células que inician la leucemia (LIC)11, así como las células de la leucemia que expresan la expresión intermedia-baja de cKit (cKitInt-low).

Una comparación de la tinción mitocondrial ROS entre los progenitores sanos CD48- LSK y mieloide muestra que los progenitores mieloides muestran niveles significativamente más altos de tinción de ROS mitocondrial(Figura 3A). Por otra parte, los progenitores deleucemia alta de cKit muestran niveles significativamente más altos de tinción de ROS mitocondrial en comparación con CD48- LSK, progenitores mieloides o células de leucemiabaja de cKit(Figura 3A). Las células de leucemia baja de cKitInt también mostraron una tinción de ROS mitocondrial significativamente mayor en comparación con las células CD48- LSK, pero no con los progenitores mieloides(Figura 3A). Los LSK subdivididos por la expresión CD150 mostraron que la tinción de ROS mitocondrial no varió significativamente en CD48- Células LSK subdivididas por CD150 alto (CD150High), intermedia (CD150Int) o no (CD150Neg) expresión(Figura 3B). Sin embargo, se encontró que la tinción DE ROS mitocondrial en estado estacionario de células de leucemiacKit alta o cKitInt-low era significativamente mayor que las células CD48- LSKs-CD150High, -CD150Int o -CD150Neg ( Figura 3B). Las células LSK que expresan niveles bajos a nulos de CD34 están enriquecidas para células madre hematopoyéticas reconstituyentes a largo plazo, particularmente células CD48- LSK que son CD34- y CD150de alto20,21. Sin embargo, la subdivisión de células CD48- LSK por expresión CD150 y CD34 no reveló diferencias significativas en la tinción mitocondrial ROS entre estos seis subconjuntos de HSPC(Figura 3C).

Figure 1
Figura 1 : Representación esquemática del flujo de trabajo del protocolo. Paso 1) Aislamiento BM de ratones leucémicos sanos y MLL-AF9; Paso 2) tinción celular usando un tinte ROS mitocondrial (mROS); Paso 3) tinción celular con anticuerpos monoclonales ligados al fluorocromo para discriminar la población de células madre hematopoyéticas y células progenitoras (HSCCP) en ratones sanos y leucémicos; Paso 4) Adquisición y análisis de la citometría de flujo de ROS mitocondrial en varias poblaciones de HSPC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Estrategias de medición de citometría de flujo para células de médula ósea sanas y con mll-AF9. (A) Las células BM aisladas de ratones sanos se teñieron con un tinte vivo/muerto (QDot), tinte ROS mitocondrial (TRPE). La BM de ratones sanos se teñió posteriormente con anticuerpos que reconocen marcadores de linaje más CD48 (Cy5-PE), c-Kit (Cy7-APC), Sca1 (PacBlue), CD34 (FITC), CD150 (APC). (B) Además de las manchas de ROS vivas/muertas y mitocondriales, BM de ratones de leucemia también se vieron manchados con anticuerpos que reconocen marcadores de linaje más CD48 (Cy5-PE), c-Kit (Cy7-APC), Sca1 (PacBlue) y CD45.2 (APC), que se aplica para discriminar entre las células de leucemia MLL-AF9 de células BM receptoras sanas (CD45.1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Niveles de ROS mitocondrial en médula ósea sana y MLL-AF9. Los paneles izquierdos son histogramas representativos de los niveles de ROS mitocondriales de las poblaciones indicadas y los paneles derecho respectivos representan análisis gráficos de barras de la IMF de ROS mitocondrial para las poblaciones indicadas (n.o 4). (A) Comparación de los niveles de ROS mitocondrial en CD48 sano- LSK, progenitores mieloides, así como MLL-AF9 Linbajo c-KitHigh y MLL-AF9 Lincélulas bajas c-KitInt-Low. (B) Comparación de los niveles de ROS mitocondrial en células CD48sanas - Células LSK basadas en su expresión CD150 frente a células MLL-AF9 Linbaja c-KitHigh y MLL-AF9 Linbaja c-KitInt-Low. (C) Comparación de los niveles de ROS mitocondrial en células CD48- LSK sanas basadas en su expresión CD150 y CD34. (* p-0.05; ** p < 0.01*** p < 0.001; **** p < 0.0001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Cambios en los niveles mitocondriales de ROS utilizando compuestos pro y antioxidantes. Histogramas de los niveles de ROS mitocondrial en células DE MBM sanas y mLL-AF9 que expresan tratadas con 20 m de bisulfito sódico de menadiona (MSB) durante 1 h a 37 oC en una incubadora de CO2 al 5% (control positivo) o con 20 m de MSB en combinación con 100 oC N-acetil-L-cisteína (NAC) durante 1 h a 37oC en una incubadora de CO2 al 5%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Optimización del ROS mitocondrial y manchas de anticuerpos que reconocen el linaje. (A) Comparación de los niveles de ROS mitocondrial (mROS) en MLL-AF9 expresando células de leucemia utilizando 1 o 5 m durante 10 o 30 minutos (vehículo rojo; Azul á MSB 20 m; Verde - NAC 100 M; Naranja: Msb 20 m + NAC 100 m). (B) Comparación de la IMF del canal CD34 (FITC) en LSK sanos manchados durante 20, 60 o 90 min con el cóctel de anticuerpos #1 (n a 4, * p a 0,05; ** p < 0,01). (C) Comparación de la tinción de anticuerpos antes o después de la incubación durante 30 min a 37 oC en una incubadora de CO2 al 5%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Orden de ROS mitocondrial y tinción de anticuerpos con marcadores de linaje. (A) Gráficas de puntos de las poblaciones de HSCCP indicadas obtenidas mediante diferentes órdenes de tinción. (B) Los niveles de ROS mitocondriales evaluados en los compartimentos de progenitores LSK y Mieloid obtenidos utilizaron un orden diferente de tinción (Rojo - tinción de anticuerpos durante 1 h a 4 oC seguido de tinción mitocondrial ROS durante 10 min a 37 oC; Azul - tinción de ROS mitocondrial durante 10 min a 37 oC seguida de tinción de anticuerpos 1h a 4 oC). (C) Cuantificación de la IMF de la tinción mitocondrial ROS (mROS) utilizando diferentes órdenes de tinción en las poblaciones indicadas (n x 4, * p a 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7 : Impacto del tratamiento con verapamilo en la tinción de tinte ROS mitocondrial en células BM sanas y exprésas MLL-AF9. (A) Parcelas de puntos de las poblaciones de HSPC indicadas en muestras tratadas con o sin Verapami de 50 m durante 10 min a 37 oC en una incubadora de CO2 al 5%. (B) Histogramas de ROS mitocondrial y tiñera de tinte verde mitoMASS en las poblaciones de HSPC indicadas en presencia (azul) o ausencia (rojo) de 50 M De Verapamil. (C-E) Cuantificación de los niveles de ROS mitocondriales en las poblaciones de células sanas (C & D) y leucemia (E) indicadas en muestras de BM tratadas con o sin 50 m de Verapamil durante la tinción mitocondrial ROS (n .4, * p a 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Table 1
Tabla 1: Cócteles de anticuerpos. Lista de cócteles de anticuerpos preparados en el Paso 3.1. para identificar varias subpoblaciones hematopoyéticas dentro de la médula ósea sana y leucemia.

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Discussion

Los colorantes fluorogénicos que se han desarrollado para la detección de ROS se evalúan con frecuencia en células fijas mediante microscopía o en células vivas mediante citometría de flujo22. La evaluación citométrica de flujo de ROS mitocondrial en células BM utilizando colorantes fluorogénicos MItocondrial es ROS tiene dos ventajas principales: 1) Es una técnica rápida y sencilla que es adecuada para el análisis de células vivas y 2) permite distinguir y analizar raras poblaciones a nivel de una sola célula en el BM utilizando la tinción de marcadores de superficie. El protocolo paso a paso presentado aquí se ha desarrollado para estudiar el estado ex vivo redox de las poblaciones de tallo hematopoyético y progenitor tanto de ratones sanos como de un modelo de ratón de LMA impulsado por MLL-AF9 utilizando citometría de flujo. Hay varias variables técnicas clave que deben tenerse en cuenta durante la ejecución de este protocolo.

En primer lugar, el uso de controles pro y antioxidantes permite al usuario establecer una línea de base para los aumentos en la tinción de ROS mitocondrial, así como la especificidad de la mancha. Para el protocolo presentado aquí, el pro-oxidante MSB fue utilizado como un control positivo para una inducción detectable de la tinción MItocondrial ROS en células BM sanas y leucemia(Figura 4). El ANTIOXIDANTE NAC se puede utilizar como un control adicional, ya que en gran medida invierte la tinción ROS mitocondrial inducida por MSB(Figura 4).

En segundo lugar, se recomienda utilizar el tinte fluorogénico ROS mitocondrial empleado en este estudio a una concentración de 5 m durante 10 minutos. Sin embargo, el fabricante también sugiere que la concentración y el tiempo de tinción pueden variar entre los tipos de células. En este estudio, se comparó la tinción de ROS mitocondrial a 1 m y 5 m durante 10 o 30 minutos. El análisis reveló que una concentración de 5 m para cualquiera de 10 a 30 minutos es suficiente para detectar cambios mediados por MSB en ROS mitocondrial, así como los invertidos por el tratamiento con NAC(Figura 5A). Dado que no hubo diferencia cuantitativa entre 10 y 30 min, se seleccionó un tiempo de tinción de 10 min para este estudio para minimizar la longitud del ensayo.

En tercer lugar, los tiempos de incubación de anticuerpos CD34 varían en la literatura de 20 a 90 min23,24. Para optimizar el protocolo presentado aquí, las células de la médula ósea murina se incubaron con el cóctel de anticuerpos #1 (Paso 3.1) durante 20, 60 o 90 min. Como se muestra en la Figura 5B,se observó una tinción CD34 significativamente más fuerte en células teñidas durante 60 o 90 minutos en comparación con la mancha de 20 minutos. Sin embargo, no se observó una diferencia significativa en la tinción CD34 entre los tiempos de incubación de anticuerpos de 60 y 90 min(Figura 5B)y, por lo tanto, se recomienda una mancha de anticuerpos de 60 minutos para el protocolo presentado.

En cuarto lugar, en el protocolo presentado, las células sanas y de leucemia se tiñen primero con el tinte fluorogénico ROS mitocondrial, se lavan y luego se tiñen con anticuerpos de linaje ligados al fluorocromo. Aunque en este estudio no se realizó una evaluación directa de la combinación de la mancha de ROS mitocondrial con anticuerpos de linaje, se realizó una evaluación de la tinción de anticuerpos de linaje ligada al fluorocromo en condiciones de tinción de ROS mitocondrial durante 10, 20 y 30 min a 37oC. Este análisis reveló que 30 minutos de incubación a 37 oC altera sustancialmente la tinción del marcador de superficie de linaje(Figura 5C). Además, la tinción mitocondrial ROS se evaluó mediante la primera vez, mantando células BM sanas con anticuerpos de linaje ligados al fluorocromo seguidos de tinción con el tinte fluorogénico ROS mitocondrial, así como el orden de las operaciones viceversa. Las células de tinción primero con anticuerpos de linaje seguidos de la tinción MItocondrial ROS dieron lugar a señales ROS mitocondriales inferiores en comparación con el protocolo de tinción viceversa (Figura 6A,B) - incluyendo diferencias significativas para CD48- LSK CD150alto, CD48- LSK CD150Int CD34 y poblaciones de progenitores mieloides(Figura 6C).

Quinto, estudios recientes muestran que diferentes poblaciones de HSPC sanas murinas poseen habilidades distintas para eflujo varias sondas fluorogénicas de tinción mitocondrial como las utilizadas para evaluar la masa mitocondrial (en adelante, mitoMASS verde) o potencial25,26. Por lo tanto, también se evaluó el impacto del inhibidor de la bomba de eflujo verapamil en la tinción de progenitores sanos y de leucemia con el tinte fluorogénico ROS mitocondrial. La tinción simultánea de HSCCP con ROS mitocondrial no alteró la tinción de anticuerpos con marcadores de linaje(Figura 7A),sin embargo, el verapamilo mejoró significativamente las señales de tinción DE ROS mitocondrial en una variedad de señales sanas y leucemia progenitores(Figura 7B,C). En particular, la magnitud de la tinción MItocondrial ROS mejorada por verapamilo no fue tan grande como la vista con el tinte fluorogénico verde mitoMASS(Figura 7B).

Sexto, en el protocolo presentado aquí, las células BM se recuperaron mediante la eliminación de las puntas óseas (epifísica) seguidas de enrojecimiento de los huesos. Sin embargo, la epifísica contiene células hematopoyéticas que potencialmente podrían perderse por enrojecimiento óseo. Como alternativa, las células BM se pueden extraer triturando huesos con un mortero y un pestillo como se describió anteriormente12,13.

El protocolo presentado aquí proporciona una base para el uso de colorantes fluorogénicos para medir la biología de redox intracelular en células vivas extraídas de organismos vivos. Sin embargo, es importante señalar que no se puede suponer que ningún tinte fluorogénico único sea definitivamente específico y, por lo tanto, deben realizarse estudios adicionales con métodos alternativos para verificar cualquier hallazgo. Además, los resultados de este estudio sugieren que las poblaciones de células de leucemia enriquecidas para los LIC (es decir, Linlow cKithigh)muestran niveles más altos de ROS mitocondrial que los progenitores mieloides sanos u otras poblaciones de HSPC. Sin embargo, se ha demostrado que la población de células deleucemia baja de Lin cKit evaluada aquí es heterogénea y puede subdividirse aún más por otros marcadores de linaje11,27. Además, estudios recientes muestran que los LIC poseen un fenotipo metabólico distinto28. Por lo tanto, los estudios futuros que evalúen la ROS mitocondrial en paralelo con ensayos metabólicos o sondas, así como anticuerpos adicionales con marcadores de linaje serán informativos.

Este protocolo sencillo permite la medición de los niveles de ROS mitocondrial en células hematopoyéticas vivas y puede proporcionar una base para el estudio de la biología redox de células madre y progenitoras sanas y enfermas, así como para evaluar la eficacia de terapias de redox-targeting.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Junta Directiva del Centro Oncológico Fox Chase (DDM), el American Society of Hematology Scholar Award (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) y el Department of Defense (Premio: W81XWH-18-1-0472).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heat inactivated FBS VWR Seradigm LIFE SCIENCE 97068-085 Media
Penicillin Streptomycin Corning 30-002-CI Media
PBS Fisher Scientific BP399-20 Buffer
15 mL conical tube BD falcon 352096 Tissue Culture Supplies
50 mL conical tube BD falcon 352098 Tissue Culture Supplies
40 μm cell strainers Fisher Scientific 22-363-547 Tissue Culture Supplies
RBC Lysis Buffer Fisher Scientific 50-112-9751 Tissue Culture Supplies
Menadione sodium Bisulfite Sigma aldrich M5750 Pro-oxidant
NAC Sigma aldrich A7250 Anti-oxidant
CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 Biolegend 100310 Antibody
CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 eBioscience 15-0041-81 Antibody
CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 eBioscience 15-0081-81 Antibody
CD19 PE-Cy5 clone 6D5 Biolegend 115510 Antibody
B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 Biolegend 103210 Antibody
Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 Biolegend 108410 Antibody
Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 Biolegend 116210 Antibody
CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 Biolegend 103420 Antibody
CD117  APC-Cy7 clone 2B8 Biolegend 105825 Antibody
Sca1 peacific Blue clone D7 Biolegend 108120 Antibody
CD150 APC clone TC15-12F12.2 Biolegend 115909 Antibody
CD34 FITC clone RAM34 BD Bioscience 553733 Antibody
CD45.2 APC clone 104 Biolegend 1098313 Antibody
MitoSOX Red ThermoFisher Scientific M36008 Dye
Mitotracker Green ThermoFisher Scientific M7514 Dye
Live/dead Yellow Dye ThermoFisher Scientific L34967 Dye

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Cancer Research Número 151 LMA HSCs ROS superóxidos mitocondrias citómetro de flujo
Análisis citométrico de flujo de especies de oxígeno reactivo mitocondrial en células hematopoyéticas de la muriña y células progenitoras y leucemia impulsada por MLL-AF9
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Di Marcantonio, D., Sykes, S. M.… More

Di Marcantonio, D., Sykes, S. M. Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia. J. Vis. Exp. (151), e59593, doi:10.3791/59593 (2019).

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