Summary
Wir beschreiben eine Methode zur Verwendung von Multiparameter-Durchflusszytometrie zum Nachweis von mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in murinen gesunden hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und Leukämiezellen aus einem Mausmodell akuter myeloischer Leukämie (AML), das von MLL-AF9.
Abstract
Wir präsentieren einen flow cytometrischen Ansatz zur Analyse von mitochondrialem ROS in verschiedenen lebenden Knochenmark (BM)-abgeleiteten Stamm- und Vorläuferzellpopulationen von gesunden Mäusen sowie Mäusen mit AML, die von MLL-AF9 angetrieben werden. Insbesondere beschreiben wir einen zweistufigen Zellfärbeprozess, bei dem gesunde oder Leukämie-BM-Zellen zuerst mit einem fluorogenen Farbstoff gefärbt werden, der mitochondriale Superoxide erkennt, gefolgt von der Färbung mit fluorchromegebundenen monoklonalen Antikörpern, die verwendet werden. verschiedene gesunde und bösartige hämatopoetische Vorläuferpopulationen zu unterscheiden. Wir bieten auch eine Strategie für den Erwerb und die Analyse der Proben durch Durchflusszytometrie. Das gesamte Protokoll kann in einem Zeitrahmen von nur 3-4 h durchgeführt werden. Wir heben auch die wichtigsten zu berücksichtigenden Variablen sowie die Vorteile und Grenzen der Überwachung der ROS-Produktion im mitochondrialen Teil von lebenden hämatopoetischen und Leukämiestamm- und Vorläufersubpopulationen mit fluorogenen Farbstoffen durch Durchflusszytometrie hervor. . Darüber hinaus präsentieren wir Daten, dass die mitochondriale ROS-Fülle zwischen verschiedenen gesunden HSPC-Subpopulationen und Leukämie-Vorläufern variiert, und diskutieren die möglichen Anwendungen dieser Technik in der hämatologischen Forschung.
Introduction
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind hochreaktive Moleküle, die aus molekularem Sauerstoff gewonnen werden. Der am besten definierte zelluläre Standort der ROS-Produktion ist die Mitochondrien, wo Elektronen, die während der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) durch die Elektronentransportkette (ETC) gehen, von molekularem Sauerstoff absorbiert werden, was zur Bildung einer spezifischen Art von ROS genannt Superoxide1. Durch die Aktionen einer Reihe von Enzymen, sogenannten Superoxid-Dismutasen oder SODs, werden Superoxide in Wasserstoffperoxide umgewandelt, die anschließend durch Enzyme wie Kataalase oder Glutathionperoxidasen (GPX) in Wasser neutralisiert werden. Störungen in ROS-Regulierungsmechanismen können zu einer übermäßigen Produktion von ROS führen, der oft als oxidativer Stress bezeichnet wird und schädliche und potenziell tödliche zelluläre Folgen wie Makromolekülschäden (z. B. DNA, Protein, Lipide) hat. Darüber hinaus ist oxidativer Stress mit mehreren Pathologien verbunden, wie Diabetes, entzündliche Erkrankungen, Alterung und Tumoren2,3,4. Um Die Homöostase von Redox aufrecht zu erhalten und oxidativen Stress zu verhindern, besitzen die Zellen eine Vielzahl von ROS-regulierenden Mechanismen5.
Physiologische Konzentrationen bestimmter ROS sind für eine ordnungsgemäße embryonale und erwachsene Hämatopoese6notwendig. Überschüssiges ROS ist jedoch mit DNA-Schäden, zellulärer Differenzierung und Erschöpfung des hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferpools verbunden. Es gibt auch Hinweise darauf, dass Veränderungen in der Redoxbiologie zwischen Leukämie und gesunden Zellen unterscheiden können. Zum Beispiel, ROS-Spiegel neigen dazu, höher in akuten myeloischen Leukämie (AML) Zellen im Vergleich zu ihren gesunden Gegenstücken und andere Studien haben vorgeschlagen, dass Leukämie-Stammzellen halten einen niedrigen stationären Zustand ROS für das Überleben7,8. Wichtig ist, Strategien zur therapeutischen Kapitalisierung dieser Redoxunterschiede haben in mehreren menschlichen Krebsumgebungen versprechend gezeigt9,10. Daher können Assays, die die Bewertung der ROS-Spiegel in Mausmodellen ermöglichen, unser Verständnis darüber verbessern, wie diese Arten zur zellulären Physiologie und Krankheitspathogenese beitragen, und potenziell eine Plattform für die Bewertung der Wirksamkeit von neuartige Nobox-targeting-Anti-Krebs-Therapien.
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Protocol
Alle in diesem Protokoll beschriebenen tierexperimentellen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Fox Chase Cancer Center genehmigt.
HINWEIS: Der Protokollworkflow ist in 4 Teile unterteilt, wie in Abbildung 1 dargestellt, und die erforderlichen Reagenzien sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt.
1. Knochenmark (BM) Isolierung
HINWEIS: MLL-AF9 Leukämiemäuse wurden wie zuvor beschrieben11erzeugt.
- Rückgewinnung mononuklearer Knochenmarkzellen, wie zuvor beschrieben12,13,14,15, von wilden Typ C57.Bl6-Mäusen (die den cd45.2-Kongenenmarker ausdrücken) sowie von C57. Bl6-SJL-Mäuse (die den cd45.1-Kongenenmarker ausdrücken), die mit MLL-AF9-exprimierenden Leukämiezellen transplantiert wurden (CD45.2+).
HINWEIS: BM kann von Mäusen entweder durch Zerkleinernvon 12,13 oder durch Spülen von Knochen14,15zurückgewonnen werden. Für die hier vorgestellten Experimente wurde BM sowohl von gesunden als auch von Leukämiemäusen durch Spülung geborgen.
2. Mitochondriale ROS FluorogenfarbstoffFärbung
- Sobald mono-nukleare Knochenmarkzellen von gesunden und/oder Leukämiemäusen geborgen wurden, färben Sie eine Aliquot von Zellen mit Trypan Blue und zählen mit einem Hämozytometer, um die Startzahl der gesamten BM-Zellen zu bestimmen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min. Den Überstand ansaugen und das Pellet in F-PBS (PBS ergänzt mit 2% fetalem Rinderserum und einem 1% Penicillin/Streptomycin-Cocktail) auf eine Konzentration von 2 x 106 Zellen/ml wieder aufsetzen.
- Aliquot 200 l Zellsuspension pro Rohr in 9 einfarbige Kontrollröhrchen, die wie folgt gekennzeichnet sind:
Kein Fleck, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (nur für gesunde HSPCs), CD45.2-APC (nur für Leukämiezellen), CD34-FITC, Mitochondrial ROS Farbstoff und Live/Dead Cell Stain.
HINWEIS: (Optional) Eine positive Kontrolle für die Induktion von mitochondrialem ROS kann durch Behandlung von 2 x 105 Zellen in 200 l mit 20 M Menadion-Natriumbisulfit (MSB) für 1 h bei 37 °C in einem 5%CO2-Inkubator hergestellt werden. Eine zweite Steuerung zur Umkehrung der MSB-vermittelten Induktion von mitochondrialem ROS kann durch Behandlung von 2 x 105 Zellen in 200 l mit 20 M MSB plus 100 M N-Acetyl-L-Cystein (NAC) für 1 h bei 37 °C in einem 5%CO2-Inkubator hergestellt werden. - Aliquot die verbleibenden Zellen in einem Rohr (experimentelles Rohr) und Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.
- Setzen Sie die Zellen in F-PBS mit einem lebenden/toten Zellfleck gemäß den Anweisungen des Herstellers aus. Inkubieren Sie auf Eis für 30 min. Achten Sie darauf, lebend / tote Fleck auf dem einfarbigen Kontrollrohr hinzufügen.
- Fügen Sie 1,0 ml Raumtemperatur (RT) F-PBS sowohl in einfarbigen als auch in experimentellen Röhrchen hinzu, die mit dem lebenden/toten Farbstoff gefärbt sind. Zentrifuge 5 min bei 300 x g bei RT.
- Resuspendieren Sie 50 g des mitochondrialen ROS-Farbstoffs in 13 l Dimethylsulfoxid (DMSO), um eine 5 mM-Stammlösung zu erhalten.
- Mitochondrialen ROS-Farbstoff in RT F-PBS mit oder ohne Verapamil (50 m) auf eine Endkonzentration von 5 m verdünnen.
- Aspirieren Sie die Wäsche des lebenden/toten Zellflecks. Fügen Sie jedem Versuchsröhrchen 200 L mitochondrialen ROS-Farbstoff mit Verapamil sowie dem mitochondrialen ROS-Farbstoff-Einfarben-Kontrollrohr hinzu.
- Wirbel zu mischen und für 10 min bei 37 °C im Dunkeln zu mischen.
- Fügen Sie 1,0 ml RT F-PBS zu den mitochondrialen ROS-gebeizten einfarbigen Kontroll- und Versuchsröhrchen hinzu. Zentrifuge 5 min bei 300 x g bei RT.
- Den Überstand absaugen und die Zellen mit zusätzlichen 1,0 ml RT F-PBS waschen. Zentrifuge 5 min bei 300 x g bei RT.
3. Lineage Antikörper Färbung
- Bereiten Sie die in Tabelle 1aufgeführten Antikörpercocktails vor.
HINWEIS: Diese Antikörper Cocktails wurden zuvor optimiert14,15,16. - Aspirieren Sie den Überstand aus der letzten mitochondrialen ROS-Farbstoffwäsche der Versuchsröhrchen, die gesunde BM enthalten, und fügen Sie jedem Röhrchen 200 l Antikörpercocktail #1 hinzu. Wirbel zu mischen. Bereiten Sie auch die einfarbigen Steuerrohre vor. Inkubieren Sie für 60 min auf Eis in der Dunkelheit.
- Aspirieren Sie den Überstand aus der letzten mitochondrialen ROS-Farbstoffwäsche der leukämiehaltigen Versuchsröhrchen BM und fügen Sie jedem Röhrchen 200 l des Antikörpercocktails #2 hinzu. Wirbel zu mischen. Inkubieren Sie für 60 min auf Eis in der Dunkelheit.
- Mit 1,0 ml kaltem F-PBS und Zentrifuge 5 min bei 300 x g bei RT waschen.
- Resuspend Zellen in 500 l kalteF-PBS und Filtern der Zellen in einem Durchflusszytometerrohr mit einem 40-mm-Filter, um Aggregate auszuschließen.
4. Durchflusszytometrie Erfassung und Analyse
HINWEIS: Mehrere hämatopoetische Stamm- und Vorläufer-Untergruppen sind selten, wie z. B. langfristige hämatopoetische Stammzellen. Daher sollten idealerweise 3-5 Millionen Ereignisse für jede Versuchsröhre während der Durchflusszytometrieerfassung gesammelt werden, um eine ausreichende Analyse von mitochondrialem ROS in den verschiedenen HSPC-Teilmengen zu ermöglichen.
- Verwenden Sie das Fleckenkontrollrohr, um die nach vorne (FSC-A) und seitlichen (SSC-A) Streudiagramme basierend auf der Größe und Komplexität der analysierten Zellpopulation einzustellen.
- Verwenden Sie die fleckenfreien und einfarbigen Steuerröhrchen, um das Durchflusszytometer zu kompensieren.
- Tor ieren Sie fremde Trümmer aus dem vorderen und seitlichen Streudiagramm heraus (Abbildung 2A,B, erstes Panel von links).
- Gate out Doublets mit einem doppelten Diskriminator wie dem vorderen Diskriminator(Abbildung 2A,B, zweites Panel von links).
- Befolgen Sie die in Abbildung 2A,B vorgeschlagene Gating-Strategie zur Auswahl von lebenden Zellen, Linienniedriger Zellen und den verschiedenen HSPC- und Leukämie-Untergruppen.
- Analysieren Sie für jede von Interesse bedachte Grundgesamtheit die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) des TRPE-Kanals (x-Achse) in einem Histogrammdiagramm, um Unterschiede im mitochondrialen ROS-Signal zu bewerten(Abbildung 3A-C, linke Panels). Ebenen von mitochondrialem ROS können auf einzelzelliger Ebene ausgewertet werden, indem mitochondriale ROS-Färbung mit bestimmten Linienmarkierungen in einem Streudiagramm verglichen wird.
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Representative Results
Präsentiert wird eine Methode zur Analyse von ROS in den Mitochondrien mehrerer gesunder und MLL-AF9-exemittierender Leukämie-Vorläuferpopulationen. Abbildung 1 zeigt eine schematische Ansicht des Protokollworkflows, die aus 4 Hauptschritten besteht: 1) BM-Isolierung von Mäusen; 2) Färbung von BM-Zellen mit einem fluorogenen Farbstoff, der mitochondriale ROS, insbesondere Superoxide erkennt; 3) Oberflächenmarker-Antikörperfärbung zur Abgrenzung verschiedener gesunder und Leukämie hämatopoetischer Populationen; und 4) Durchflusszytometrie Erfassung und Analyse.
Abbildung 2 A,B stellt eine repräsentative Gating-Strategie zur Analyse verschiedener hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferpopulationen bei gesunden und Leukämie BM dar. Ein FSC/SSC-Diagramm wird angewendet, um Schutt zu beseitigen, und ein FSC-Flächendiagramm (FSC-A) im Vergleich zu FSC-Höhe (FSC-H) wird verwendet, um Doublets und Aggregate auszuschließen. Eine Gruppe von Linienoberflächenmarkern(Tabelle 1 und Schritt 3.1) werden kombiniert, um eine Vielzahl von reifen hämatopoetischen Populationen wie Lymphozyten, Erythrozyten, Granulozyten und Monozyten/Makrophagen (d. h. Lineage low oder Linlow)auszuschließen. Der Lineage-Cocktail enthält auch einen CD48-Antikörper und daher sind alle Teilmengen von Lineage Low-Zellen auch CD48-. Sca-1 und c-Kit Zelloberflächenexpression wird verwendet, um eine heterogene Mischung von HSPCs namens CD48- LSKs (Linlow, Sca-1+, c-Kit+, CD48-) von myeloischen Vorläufern (Linlow, Sca-1- , c-Kit+, CD48-). Zur weiteren Unterscheidung verschiedener HSPC-Teilmengen werden auch der SLAM-Marker, CD150 sowie CD34hinzugefügt 17,18,19,20,21. Abbildung 2 B stellt auch eine repräsentative Gating-Strategie für cKit hochexstende Leukämie-Vorläufer (Linlow,c-Kithoch; Sca-1-), die für Leukämie-initiierende Zellen (LICs)11 sowie Leukämiezellen angereichert sind, die eine zwischenniedrige Expression von cKit (cKitInt-low)exdrücken.
Ein Vergleich der mitochondrialen ROS-Färbung zwischen gesunden CD48- LSK und myeloischen Vorläufern zeigt, dass myeloische Vorläufer deutlich höhere Konzentrationen von mitochondrialer ROS-Färbung aufweisen (Abbildung 3A). Darüber hinaus zeigencKit-Vorläufer mit hoher Leukämie signifikant höhere Konzentrationen von mitochondrialer ROS-Färbung im Vergleich zu CD48- LSK, myeloischen Vorläufern odercKit-int-niedrigen Leukämiezellen (Abbildung 3A). cKitInt-low Leukämie-Zellen zeigten auch eine signifikant höhere mitochondriale ROS-Färbung im Vergleich zu CD48- LSK-Zellen, aber nicht zu myeloischen Vorläufern (Abbildung 3A). LSKs weiter unterteilt durch CD150-Expression zeigte, dass mitochondriale ROS Färbung nicht signifikant in CD48- LSK-Zellen unterteilt durch CD150 hoch (CD150High), Intermediate (CD150Int) oder nein (CD150Neg) Ausdruck (Abbildung 3B). Es wurde jedoch festgestellt, dass die stationäre mitochondriale ROS-Färbung von cKit-Hoch- oder cKit-niedrigen Leukämiezellen signifikant höher ist als CD48-LSKs-CD150High, -CD150Int oder -CD150 Neg-Zellen ( Abbildung 3B). LSK-Zellen, die niedrige bis gar keine CD34-Werte exdrücken, werden für langfristige rekonstituierende hämatopoetische Stammzellen angereichert, insbesondere CD48- LSK-Zellen, die CD34- und CD150hoch20,21sind. Die Unterteilung von CD48- LSK-Zellen durch CD150 und CD34-Expression ergab jedoch keine signifikanten Unterschiede in der mitochondrialen ROS-Färbung zwischen diesen sechs HSPC-Teilmengen (Abbildung 3C).
Abbildung 1 : Schematische Darstellung des Protokollarbeitsablaufs. Schritt 1) BM-Isolierung von gesunden und MLL-AF9-Leukämischen Mäusen; Schritt 2) zelluläre Färbung mit einem mitochondrialen ROS Farbstoff (mROS); Schritt 3) zelluläre Färbung mit fluorchromen verbundenen monoklonalen Antikörpern zur Diskriminierung hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) bei gesunden und leukämischen Mäusen; Schritt 4) Durchflusszytometrie Erfassung und Analyse von mitochondrialem ROS in mehreren HSPC-Populationen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Flusszytometrie-Gating-Strategien für gesunde und MLL-AF9-extierende Knochenmarkzellen. (A) BM-Zellen, die von gesunden Mäusen isoliert wurden, wurden mit einem lebenden/toten Farbstoff (QDot), einem mitochondrialen ROS-Farbstoff (TRPE) gefärbt. BM von gesunden Mäusen wurde anschließend mit Antikörpern gefärbt, die Linienmarker sowie CD48 (Cy5-PE), c-Kit (Cy7-APC), Sca1 (PacBlue), CD34 (FITC), CD150 (APC) erkennen. (B) Neben lebenden/toten Zellen und mitochondrialen ROS-Flecken wurden BM von Leukämiemäusen auch mit Antikörpern gefärbt, die Linienmarker plus CD48 (Cy5-PE), c-Kit (Cy7-APC), Sca1 (PacBlue) und CD45.2 (APC) erkennen, die zur Diskriminierung zwischen MLL-AF9-Leukämiezellen aus gesunden Empfänger-BM-Zellen (CD45.1). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Mitochondriale ROS-Spiegel in gesunden und MLL-AF9 Knochenmark. Linke Tafeln sind repräsentative Histogramme der mitochondrialen ROS-Spiegel der angegebenen Populationen und die jeweiligen rechten Tafeln stellen Stabdiagrammanalysen des MFI der mitochondrialen ROS für die angegebenen Populationen dar (n = 4). (A) Vergleich der mitochondrialen ROS-Spiegel in gesunden CD48- LSK, myeloischen Vorläufern sowie MLL-AF9 Linlow c-KitHigh und MLL-AF9 Linlow c-KitInt-Low Zellen. (B) Vergleich der mitochondrialen ROS-Spiegel in gesunden CD48- LSK-Zellen basierend auf ihrer CD150-Expression mit MLL-AF9 Linlow c-KitHigh und MLL-AF9 Linlow c-KitInt-Low Zellen. (C) Vergleich der mitochondrialen ROS-Spiegel in gesunden CD48- LSK-Zellen basierend auf ihrer CD150- und CD34-Expression. (* p 0,05; ** p < 0,01*** p < 0,001; **** p < 0,0001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Veränderungen der mitochondrialen ROS-Spiegel mit pro- und antioxidativen Verbindungen. Histogramme mitochondrialer ROS-Spiegel in gesunden und MLL-AF9-exemittierenden BM-Zellen, die mit 20 M Menadion-Natriumbisulfit (MSB) für 1 h bei 37 °C in einem 5%-CO2-Inkubator (positive Kontrolle) oder mit 20 m MSB in Kombination mit 100 m behandelt wurden N-Acetyl-L-Cystein (NAC) für 1 h bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5 : Optimierung der mitochondrialen ROS- und Linienerkennungs-Antikörperflecken. (A) Vergleich der mitochondrialen ROS-Spiegel (mROS) in MLL-AF9, die Leukämiezellen mit 1 oder 5 m m für 10 oder 30 Min. (Rot = Fahrzeug; Blau = MSB 20 m; Grün = NAC 100 m; Orange = Msb 20 m + NAC 100 m). (B) Vergleich des MFI des CD34-Kanals (FITC) in gesunden LSKs, die für 20, 60 oder 90 min gebeizt werden, mit dem Antikörpercocktail #1 (n = 4, * p bei 0,05; ** p < 0,01). (C) Vergleich von Antikörpern, die vor oder nach der Inkubation 30 min bei 37 °C in einem 5%CO2-Inkubator färben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6 : Reihenfolge der mitochondrialen ROS- und Linienmarker-Antikörperfärbung. (A) Punktdiagramme der angegebenen HSPCs-Populationen, die unter Verwendung unterschiedlicher Färbungsreihenfolgen erhalten wurden. (B) Mitochondriale ROS-Spiegel, die in den in den LSK- und Myeloid-Vorläuferfächern bewerteten Mitochondrien-Fächern in unterschiedlicher Reihenfolge der Färbung (Rot = Antikörperfärbung für 1 h bei 4 °C gefolgt von mitochondrialer ROS-Färbung für 10 min bei 37 °C) bewertet wurden; Blau = mitochondriale ROS-Färbung für 10 min bei 37 °C, gefolgt von Antikörperfärbung 1h bei 4 °C). (C) Quantifizierung des MFI der mitochondrialen ROS (mROS) Färbung unter Verwendung verschiedener Gebeizungsreihenfolgeen in den angegebenen Populationen (n = 4, * p - 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7 : Auswirkungen der Verapamil-Behandlung auf mitochondriale ROS-Farbstofffärbung in gesunden und MLL-AF9-exezierenden BM-Zellen. (A) Punktdiagramme der angegebenen HSPC-Populationen in Proben, die mit oder ohne 50 m Verapamil 10 min bei 37 °C in einem 5%CO2-Inkubator behandelt wurden. (B) Histogramme der mitochondrialen ROS- und MitoMASS-Grünfarbstofffärbung in den angegebenen HSPC-Populationen in Gegenwart (blau) oder Abwesenheit (rot) von 50 M Verapamil. (C-E) Quantifizierung der mitochondrialen ROS-Spiegel in den angegebenen gesunden (C & D) und Leukämie (E) Zellpopulationen in BM-Proben, die mit oder ohne 50 M Verapamil während der mitochondrialen ROS-Färbung behandelt wurden (n = 4, * p - 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1: Antikörpercocktails. Liste von Antikörper-Cocktails in Schritt 3.1. verschiedene hämatopoetische Unterpopulationen innerhalb des gesunden und Leukämieknochenmarks zu identifizieren.
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Discussion
Fluorogene Farbstoffe, die für den Nachweis von ROS entwickelt wurden, werden häufig in festen Zellen durch Mikroskopie oder in lebenden Zellen durch Durchflusszytometrie22ausgewertet. Die zytometrische Fließbewertung von mitochondrialem ROS in BM-Zellen mit mitochondrialen ROS-Fluorenfarbstoffen hat zwei wesentliche Vorteile: 1) Es ist eine schnelle und einfache Technik, die für die Analyse von lebenden Zellen geeignet ist und 2) es ermöglicht, seltene Populationen auf einzelzeller Ebene im BM mit Oberflächenmarkerfärbung. Das hier vorgestellte Schritt-für-Schritt-Protokoll wurde entwickelt, um den ex vivo Redoxstatus von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferpopulationen sowohl von gesunden Mäusen als auch ein Mausmodell von AML zu untersuchen, das durch MLL-AF9 mit Flusszytometrie angetrieben wird. Es gibt mehrere wichtige technische Variablen, die während der Ausführung dieses Protokolls berücksichtigt werden müssen.
Erstens ermöglicht die Verwendung von Pro- und Antioxidans-Kontrollen dem Benutzer, eine Ausgangsbasis für die Erhöhung der mitochondrialen ROS-Färbung sowie die Spezifität des Flecks zu etablieren. Für das hier vorgestellte Protokoll wurde das prooxidative MSB als positiv für eine nachweisbare Induktion der mitochondrialen ROS-Färbung sowohl in gesunden als auch in Leukämie-BM-Zellen eingesetzt (Abbildung 4). Das antioxidative NAC kann als zusätzliche Kontrolle verwendet werden, da es die durch MSB induzierte mitochondriale ROS-Färbung weitgehend umkehrt (Abbildung 4).
Zweitens wird empfohlen, den in dieser Studie verwendeten mitochondrialen ROS-Fluorfarbstoff in einer Konzentration von 5 m für 10 min zu verwenden. Der Hersteller schlägt jedoch auch vor, dass die Konzentration und die Zeit der Färbung von Zelltypen variieren können. In dieser Studie wurde die mitochondriale ROS-Färbung sowohl bei 1 m als auch bei 5 m für 10 oder 30 min verglichen. Die Analyse ergab, dass eine Konzentration von 5 m für entweder 10 bis 30 min ausreicht, um MSB-vermittelte Veränderungen in mitochondrialem ROS sowie solche, die durch NAC-Behandlung rückgängig gemacht wurden , zu erkennen (Abbildung 5A). Da es keinen quantitativen Unterschied zwischen 10 und 30 min gab, wurde für diese Studie eine Färbezeit von 10 min gewählt, um die Länge des Assays zu minimieren.
Drittens variieren die Inkubationszeiten von CD34-Antikörpern innerhalb der Literatur von 20 bis 90 min23,24. Zur Optimierung des hier vorgestellten Protokolls wurden murine Knochenmarkzellen mit dem Antikörpercocktail #1 (Schritt 3.1) für 20, 60 oder 90 min inkubiert. Wie in Abbildung 5Bdargestellt, wurde eine signifikant stärkere CD34-Färbung an Zellen beobachtet, die 60 oder 90 min im Vergleich zum 20 min Fleck gefärbt wurden. Ein signifikanter Unterschied in der CD34-Färbung wurde jedoch nicht zwischen Denameninkubationszeiten von 60 und 90 min(Abbildung 5B) beobachtet, so dass für das vorgestellte Protokoll ein 60 min Antikörperfleck empfohlen wird.
Viertens werden im vorgestellten Protokoll sowohl gesunde als auch Leukämiezellen zuerst mit dem mitochondrialen ROS-Fluorenfarbstoff gefärbt, gewaschen und dann mit fluorchromgebundenen Lineage-Antikörpern gefärbt. Obwohl in dieser Studie keine direkte Bewertung der Kombination des mitochondrialen ROS-Fleckens mit Leinenantikörpern durchgeführt wurde, wurde eine Bewertung der fluorchromen-gebundenen Lineage-Antikörperfärbung unter mitochondrialen ROS-Färbungsbedingungen für 10, 20 und 30 min bei 37 °C. Diese Analyse ergab, dass 30 min Inkubation bei 37 °C die Linienoberflächen-Markerfärbung wesentlich verändert(Abbildung 5C). Zusätzlich wurde die mitochondriale ROS-Färbung zunächst durch die Färbung gesunder BM-Zellen mit fluorchromegebundenen Linienantikörpern bewertet, gefolgt von der Färbung mit dem mitochondrialen ROS-Fluorenfarbstoff sowie umgekehrt. Färbzellen zuerst mit Lineage-Antikörpern gefolgt von mitochondrialer ROS-Färbung führten zu niedrigeren mitochondrialen ROS-Signalen im Vergleich zum umgekehrten Färbeprotokoll (Abbildung 6A,B) - einschließlich signifikanter Unterschiede für CD48- LSK CD150hoch, CD48- LSK CD150Int CD34 und myeloische Vorläuferpopulationen (Abbildung 6C).
Fünftens zeigen neuere Studien, dass verschiedene murine gesunde HSPC-Populationen unterschiedliche Fähigkeiten besitzen, mehrere mitochondriale Fluorogen-Sonden auszueffizient zu machen, wie sie zur Beurteilung der mitochondrialen Masse verwendet werden (im Folgenden als MitoMASS grün bezeichnet) oder Potenzial25,26. Daher wurde auch der Einfluss des Efflux-Pumpeninhibitors Verapamil auf die Färbung von gesunden und Leukämie-Vorläufern mit dem mitochondrialen ROS-Fluorenfarbstoff bewertet. Die gleichzeitige Färbung von HSPCs mit mitochondrialem ROS änderte die Lineage Marker-Antikörperfärbung nicht (Abbildung 7A), verapamil verbesserte jedoch signifikant die mitochondrialen ROS-Färbungssignale in einer Vielzahl von gesunden und Leukämien. Vorläuferpopulationen (Abbildung 7B,C). Bemerkenswert ist, dass die Größe der verbesserten mitochondrialen ROS-Färbung durch Verapamil nicht so groß war wie bei dem mitoMASS grünen fluorogenen Farbstoff (Abbildung 7B).
Sechstens wurden in dem hier vorgestellten Protokoll BM-Zellen durch Entfernen der Knochenspitzen (Epiphyse) wiederhergestellt, gefolgt von einer Spülung der Knochen. Die Epiphyse enthält jedoch hämatopoetische Zellen, die möglicherweise durch Knochenspülung verloren gehen könnten. Alternativ können BM-Zellen durch Maischen von Knochen mit Mörtel und Stößel extrahiert werden, wie zuvor beschrieben12,13.
Das hier vorgestellte Protokoll bildet die Grundlage für die Verwendung fluorogener Farbstoffe zur Messung der intrazellulären Redoxbiologie in lebenden Zellen, die aus lebenden Organismen extrahiert werden. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass kein einziger fluorogener Farbstoff als endgültig spezifisch angenommen werden kann, und daher sollten zusätzliche Studien mit alternativen Methoden durchgeführt werden, um etwaige Ergebnisse zu überprüfen. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse dieser Studie darauf hin, dass Leukämie-Zellpopulationen, die für LICs angereichert sind (d. h. Linlow cKithigh), höhere Konzentrationen von mitochondrialem ROS aufweisen als gesunde myeloide Vorläufer oder andere HSPC-Populationen. Die hier ausgewerteteLin-Niedrige cKit-Hochleukämie-Zellpopulation hat sich jedoch als heterogen erwiesen und kann weiter durch andere Linienmarkierungen11 ,27unterteilt werden. Darüber hinaus zeigen neuere Studien, dass LICs einen ausgeprägten metabolischen Phänotyp28besitzen. Daher werden zukünftige Studien zur Bewertung von mitochondrialem ROS parallel zu metabolischen Assays oder Sonden sowie zusätzlichen Lineage Marker-Antikörpern informativ sein.
Dieses einfache Protokoll ermöglicht die Messung des mitochondrialen ROS-Spiegels in lebenden hämatopoetischen Zellen und kann eine Grundlage für die Untersuchung der Redoxbiologie gesunder und kranker Stamm- und Vorläuferzellen sowie für die Bewertung der Wirksamkeit von Redox-Targeting-Therapien.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Fox Chase Cancer Center Board of Directors (DDM), dem American Society of Hematology Scholar Award (SMS), der American Cancer Society RSG (SMS) und dem Department of Defense (Auszeichnung: W81XWH-18-1-0472) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat inactivated FBS | VWR Seradigm LIFE SCIENCE | 97068-085 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific | BP399-20 | Buffer |
| 15 mL conical tube | BD falcon | 352096 | Tissue Culture Supplies |
| 50 mL conical tube | BD falcon | 352098 | Tissue Culture Supplies |
| 40 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Tissue Culture Supplies |
| RBC Lysis Buffer | Fisher Scientific | 50-112-9751 | Tissue Culture Supplies |
| Menadione sodium Bisulfite | Sigma aldrich | M5750 | Pro-oxidant |
| NAC | Sigma aldrich | A7250 | Anti-oxidant |
| CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 | Biolegend | 100310 | Antibody |
| CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | Antibody |
| CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | Antibody |
| CD19 PE-Cy5 clone 6D5 | Biolegend | 115510 | Antibody |
| B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | Antibody |
| Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | Antibody |
| Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 | Biolegend | 116210 | Antibody |
| CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 | Biolegend | 103420 | Antibody |
| CD117 APC-Cy7 clone 2B8 | Biolegend | 105825 | Antibody |
| Sca1 peacific Blue clone D7 | Biolegend | 108120 | Antibody |
| CD150 APC clone TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | Antibody |
| CD34 FITC clone RAM34 | BD Bioscience | 553733 | Antibody |
| CD45.2 APC clone 104 | Biolegend | 1098313 | Antibody |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | Dye |
| Mitotracker Green | ThermoFisher Scientific | M7514 | Dye |
| Live/dead Yellow Dye | ThermoFisher Scientific | L34967 | Dye |
References
- Dröse, S., Brandt, U. Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).
- Gerber, P. A., Rutter, G. A. The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus. Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).
- Höhn, A., et al. Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence. Redox Biology. 11, 482-501 (2017).
- Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked. Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).
- Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. Redox regulation of cell state and fate. Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).
- Harris, J. M., et al. Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo. Blood. 121, 2483-2493 (2013).
- Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias. Blood. 117, 5816-5826 (2011).
- Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
- Di Marcantonio, D., et al. Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia. Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).
- Glasauer, A., Chandel, N. S. Targeting antioxidants for cancer therapy. Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).
- Kalaitzidis, D., et al. mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis. Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).
- Sykes, S. M., et al. AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias. Cell. 146 (5), 697-708 (2011).
- Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment. International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).
- Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).
- Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
- Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow. Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Somervaille, T. C., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
- Hao, X., et al. Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche. Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).
