Summary
Biz murine sağlıklı hematopoetik kök ve döl hücreleri (HSPCs) ve akut miyeloid lösemi bir fare modeli lösemi hücreleri (ROS) tarafından tahrik mitokondriyal reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için multiparametre akış sitometri sitometri kullanmak için bir yöntem tanımlamak MLL-AF9.
Abstract
Sağlıklı farelerin yanı sıra MLL-AF9 tarafından yönlendirilen AML'li farelerden elde edilen çeşitli canlı kemik iliği (BM) kaynaklı kök ve ata hücre popülasyonlarında mitokondriyal ROS'u analiz etmek için akış sitometrik bir yaklaşım sitometrik bir yaklaşım sintometrik olarak sintometrik olarak sifonal bir yaklaşım sintometrik olarak sifonal bir yaklaşım sinat ıyoruz. Özellikle, sağlıklı veya lösemi BM hücrelerinin ilk olarak mitokondriyal süperoksitleri tespit eden florojenik boya ile boyandığı ve ardından florokrom bağlantılı monoklonal antikorlarla boyandığı iki aşamalı bir hücre boyama işlemini tanımlıyoruz. çeşitli sağlıklı ve malign hematopoetik döl popülasyonlarını ayırt etmek. Ayrıca, akış sitometrisi ile numunelerin elde edilip analiz edilebisbir strateji sitometrisi sağlarız. Tüm protokol 3-4 saat gibi kısa bir zaman diliminde gerçekleştirilebilir. Ayrıca, akış sitometrisi ile florojenik boyalar kullanan canlı hematopoetik ve lösemi sapı ve progenitor alt popülasyonlarının mitokondriyal bölmesinde ROS üretiminin izlenmesinin avantajları ve sınırlamaları gibi önemli değişkenleri de vurguluyoruz. . Ayrıca, mitokondriyal ROS bolluğunun farklı sağlıklı HSPC alt popülasyonları ve lösemi ataları arasında değiştiğine dair veriler sunmakta ve hematolojik araştırmalarda bu tekniğin olası uygulamalarını tartışılmaktadır.
Introduction
Reaktif Oksijen Türleri (ROS) moleküler oksijenden elde edilen yüksek reaktif moleküllerdir. ROS üretiminin en iyi tanımlanmış hücresel konumu, oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) sırasında elektron taşıma zincirinden (ETC) geçen elektronların belirli bir oluşumuna yol açan moleküler oksijen tarafından emildiği mitokondridir. süperoksit ler1olarak adlandırılan ROS türü. Süperoksit dismutazveya SOD siyonları olarak adlandırılan bir dizi enzimin eylemleri sayesinde, süperoksitler hidrojen peroksitlere dönüştürülür ve bunlar daha sonra katalaz veya glutatyon peroksidaz (GPX) gibi enzimler tarafından suya nötralize edilir. ROS düzenleyici mekanizmalardaki pertürbasyonlar, makromolekül hasarı (DNA, protein, lipidler) gibi zararlı ve potansiyel olarak ölümcül hücresel sonuçlara sahip oksidatif stres olarak adlandırılan ROS'un aşırı üretimine yol açabilir. Ayrıca, oksidatif stres diyabet, inflamatuar hastalıklar, yaşlanma ve tümörler2,3,4gibi çeşitli patolojiler ile ilgilidir. Redoks homeostazını korumak ve oksidatif stresi önlemek için, hücreler çeşitli ROS düzenleyici mekanizmalara sahip5.
Uygun embriyonik ve erişkin hematopoyon için bazı ROS fizyolojik düzeyleri gereklidir6. Ancak, aşırı ROS DNA hasarı ile ilişkilidir, hücresel farklılaşma ve hematopoetik kök ve ata havuzu yorgunluk. Redoks biyolojisindeki değişikliklerin lösemi ve sağlıklı hücreler arasında farklılık gösterdiğine dair kanıtlar da vardır. Örneğin, ROS düzeyleri akut miyeloid lösemi (AML) hücrelerinde sağlıklı muadillerine göre daha yüksek olma eğilimindedir ve diğer çalışmalar lösemi kök hücrelerinin hayatta kalmak için ROS düşük sabit devlet düzeyini korumak olduğunu ileri sürmüşlerdir7,8. Daha da önemlisi, terapötik bu redoks farklılıkları yararlanmak için stratejiler çeşitli insan kanseri ortamlarında umut göstermiştir9,10. Bu nedenle, fare modellerinde ROS düzeylerinin değerlendirilmesine olanak sağlayan tahliller, bu türlerin hücresel fizyoloji ve hastalık patogenene nasıl katkıda bulunduklarına dair anlayışımızı geliştirebilir ve potansiyel olarak yeni redoks hedefleyen anti-kanser tedavileri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde açıklanan tüm hayvan prosedürleri Fox Chase Kanser Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Protokol iş akışı Şekil 1'de sunulduğu gibi 4 bölüme ayrılmıştır ve gerekli reaktifler Malzeme Tablosu'ndalistelenmiştir.
1. Kemik İliği (BM) İzolasyon
NOT: MLL-AF9 lösemi fareler daha önce açıklandığı gibi oluşturuldu11.
- Mono-nükleer kemik iliği hücreleri kurtarmak, daha önce açıklandığı gibi12,13,14,15, yabani tip C57.Bl6 fareler (CD45.2 konjenik marker ifade) yanı sıra C57. MLL-AF9 ifade eden lösemi hücreleri (CD45.2+) ile nakledilen Bl6-SJL fareler (CD45.1 konjenial belirteç ifade)
NOT: BM farelerden 12,13 veya kemikleri 14,15yıkarak kurtarılabilir. Burada sunulan deneyler için, BM hem sağlıklı hem de lösemili farelerden kızarma yoluyla kurtarıldı.
2. Mitokondriyal ROS Florojenik Boya Boyama
- Mono-nükleer kemik iliği hücreleri sağlıklı ve / veya lösemi fareler kurtarıldı sonra, Trypan Mavi ile hücrelerin bir aliquot leke ve toplam BM hücrelerinin başlangıç sayısını belirlemek için bir hemositometre kullanarak saymak.
- Hücreleri 5 dk. 300 x g.'da santrifüj edin ve F-PBS'deki peleti (PBS %2 fetal sığır serumu ve %1 Penisilin/Streptomisin kokteyli ile desteklenmiş) 2 x 106 hücre/mL konsantrasyona geri alın.
- Aliquot 200 μL hücre süspansiyonu tüp başına 9 tek renkli kontrol tüpü ne kadar etiketli olarak etiketlenmiştir:
Leke yok, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (sadece sağlıklı HSPC'ler için), CD45.2-APC (sadece lösemi hücreleri için), CD34-FITC, Mitokondriyal ROS boya ve Canlı/ölü hücre lekesi.
NOT: (İsteğe bağlı) Mitokondriyal ROS indüksiyonu için pozitif kontrol, 200 μL'de 200 μL'lik 2 x 10 5 hücre ile %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de 1 saat boyunca 200°L'de 2 x 105 hücrenin tedavi edilmesiyle hazırlanabilir. Mitokondriyal ROS'un MSB aracılı indüksiyonuna ters çevirmek için ikinci bir kontrol, 200 μL'de 200 μL'lik 2 x 105 hücre nin 200 μM MSB artı 100 μM N-asetil-L-sistein (NAC) %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de 1 saat için tedavi edilerek hazırlanabilir. - Aliquot bir tüp (deneysel tüp) ve santrifüj içinde kalan hücreleri 300 x g 5 dk için.
- Üreticinin talimatlarına göre canlı/ölü hücre lekesi ile F-PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın. 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka.
- Canlı/ölü boya ile boyanmış tek renkli ve deneysel tüplere oda sıcaklığında 1,0 mL (RT) F-PBS ekleyin. Sentrifuge 5 dk 300 x g RT de.
- 5 mM stok çözeltisi elde etmek için 13 μL dimetil sülfoksitte (DMSO) 50 μg mitokondriyal ROS boyasını yeniden askıya alın.
- Verapamil (50 μM) içeren RT F-PBS'de mitokondriyal ROS boyasını 5 μM'lik son konsantrasyona seyreltin.
- Canlı/ölü hücre lekesinin yıkandığını aspire edin. Her deney tüpüne ve mitokondriyal ROS boyatek renkli kontrol tüpüne Verapamil içeren 200 μL mitokondriyal ROS boya lekesi ekleyin.
- Girdap karıştırmak ve karanlıkta 37 °C'de 10 dakika kuluçka.
- Mitokondriyal ROS lekeli tek renkli kontrol ve deneysel tüplere 1,0 mL RT F-PBS ekleyin. Sentrifuge 5 dk 300 x g RT de.
- Supernatant kapalı Aspire ve RT F-PBS ek bir 1.0 mL ile hücreleri yıkayın. Sentrifuge 5 dk 300 x g RT de.
3. Soy Antikor Boyama
- Tablo 1'delistelenen antikor kokteylleri hazırlayın.
NOT: Bu antikor kokteyller daha önce optimize edilmiştir14,15,16. - Sağlıklı BM içeren deneysel tüplerin son mitokondriyal ROS boya yıkamasından süpernatant aspire ve her tüp #1 antikor kokteyl 200 μL ekleyin. Girdap karıştırmak için. Ayrıca tek renkli kontrol tüpleri hazırlayın. Karanlıkta buz üzerinde 60 dakika kuluçka.
- Lösemi BM içeren deneysel tüplerin son mitokondriyal ROS boya yıkama supernatant aspire ve antikor kokteyl #2 her tüp #2 200 l ekleyin. Girdap karıştırmak için. Karanlıkta buz üzerinde 60 dakika kuluçka.
- RT'de 1,0 mL soğuk F-PBS ve santrifüj 5 dk 300 x g ile yıkayın.
- Hücreleri 500 μL soğuk F-PBS'de yeniden askıya alın ve agregaları dışlamak için 40 μm'lik bir filtre kullanarak akış sitometre tüpündeki hücreleri filtreleyin.
4. Akış Sitometri Kazanım ve Analizi
NOT: Uzun süreli hematopoetik kök hücreler gibi çeşitli hematopoetik kök ve atasetor alt kümeleri nadirdir. Bu nedenle, çeşitli HSPC alt kümelerinde mitokondriyal ROS yeterli analizi için akış sitometri edinimi sırasında her deneysel tüp için ideal 3-5 milyon olay toplanmalıdır.
- Analiz edilen hücre popülasyonunun boyutuna ve karmaşıklığına göre ileri (FSC-A) ve yan (SSC-A) dağılım çizimlerini ayarlamak için lekesiz kontrol tüpünü kullanın.
- Akış sitometresini dengelemek için lekesiz ve tek renkli kontrol tüplerini kullanın.
- Ön ve yan dağılım çiziminden dışa doğru enkaz kapısı(Şekil 2A,B, soldan ilk panel).
- İleri ayırıcı(Şekil 2A,B, soldan ikinci panel) gibi çift ayırıcı kullanarak kapı dışarı çiftler.
- Canlı hücreleri, soy düşük hücreleri ve çeşitli HSPC ve lösemi alt kümelerini seçmek için Şekil 2A,B'de önerilen gating stratejisini uygulayın.
- Her ilgi çeken popülasyon için, mitokondriyal ROS sinyalindeki farklılıkları değerlendirmek için TRPE kanalının (x-ekseni) ortanca floresan yoğunluğunu (MFI) analiz edin (Şekil 3A-C, sol paneller). Mitokondriyal ROS düzeyleri, bir dağılım çiziminde mitokondriyal ROS boyama ile belirli soy belirteçleri karşılaştırılarak tek hücre düzeyinde değerlendirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sunulan birden fazla sağlıklı ve MLL-AF9 ifade eden lösemi atası popülasyonlarının mitokondrisinde ROS'u analiz etmek için kullanılan bir yöntemdir. Şekil 1, 4 ana adımdan oluşan protokol iş akışının şematik görünümünü görüntüler: 1) Farelerden BM yalıtımı; 2) Bm hücrelerinin mitokondriyal ROS'u, özellikle de süperoksitleri tanıyan florojenik boyaile boyanması; 3) Çeşitli sağlıklı ve lösemi hematopoetik popülasyonları belineatetmek için yüzey marker antikor boyama; ve 4) Akış sitometri alımı ve analizi.
Şekil 2 A,B sağlıklı ve lösemi BM çeşitli hematopoetik kök ve ata popülasyonları analiz etmek için temsili bir gating stratejisi tasvir. Bir FSC / SSC arsa enkaz ortadan kaldırmak için uygulanır ve bir FSC-alan (FSC-A) karşı FSC yüksekliği (FSC-H) çizim doublets ve agregaları dışlamak için kullanılır. Bir panel soy yüzey belirteçleri(Tablo 1 ve adım 3.1) lenfositler, eritrositler, granülositler ve monositler/makrofajlar (yani, Soy düşük veya Lindüşük)gibi olgun hematopoetik popülasyonların çeşitli dışlamak için birleştirilir. Soy kokteyl de bir CD48 antikor içerir ve bu nedenle soy düşük hücrelerin tüm alt setleri de CD48 vardır-. Sca-1 ve c-Kit hücre yüzeyi ekspresyonu CD48 denilen HSPCs heterojen bir karışımı ayırt etmek için kullanılır- LSKs (Lindüşük, Sca-1+, c-Kit+, CD48- )myeloid progenitors (Lindüşük, Sca-1- , c-Kit+, CD48-). Daha fazla çeşitli HSPC alt kümeleri ayırt etmek için, SLAM marker, CD150 yanı sıra CD34 deeklenir 17,18,19,20,21. Şekil 2 B ayrıca cKit yüksek ifade lösemi ataları için temsili bir gating stratejisi tasvir (Lindüşük, c-Kityüksek; Sca-1-), lösemi başlatan hücreler için zenginleştirilmiş (LICs)11 yanı sıra cKit orta-düşük ifade ifade lösemi hücreleri (cKitInt-low).
Sağlıklı CD48- LSK ve miyeloid atalar arasında mitokondriyal ROS boyama karşılaştırması miyeloid atalarının önemli ölçüde daha yüksek düzeyde mitokondriyal ROS boyama gösterdiğini göstermektedir (Şekil 3A). Ayrıca, cKityüksek lösemi ataları CD48 ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha yüksek düzeyde mitokondriyal ROS boyama görüntüler- LSK, miyeloid ataları veya cKitint-düşük lösemi hücreleri(Şekil 3A). cKitInt-düşük lösemi hücreleri de CD48 ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha yüksek mitokondriyal ROS boyama gösterdi- LSK hücreleri ama miyeloid ataları değil(Şekil 3A). CD150 ifadesine göre daha fazla alt bölünmüş LSKs mitokondriyal ROS boyama önemli ölçüde CD48 değişmez gösterdi- LSK hücreleri CD150 yüksek (CD150Yüksek),orta (CD150Int)veya hayır (CD150Neg)tarafından alt bölünmüş ifade (Şekil 3B). Ancak, cKityüksek veya cKitInt-düşük lösemi hücrelerinin sabit durum lu mitokondriyal ROS boyama cd48- LSKs-CD150Yüksek, -CD150Int veya -CD150Neg hücrelerinden anlamlı olarak daha yüksek olduğu saptandı ( Şekil 3B). CD34 düzeyleri düşük ifade LSK hücreleri uzun vadeli reconstituting hematopoetik kök hücreler için zenginleştirilmiştir, özellikle CD48- CD34 olan LSK hücreleri- ve CD150yüksek20,21. Ancak, CD48- LSK hücrelerinin CD150 ve CD34 ekspresyonu ile bölünmesi, bu altı HSPC alt kümesi(Şekil 3C)arasında mitokondriyal ROS boyamada önemli bir fark göstermedi .
Şekil 1 : Protokol iş akışının şematik gösterimi. Adım 1) sağlıklı ve MLL-AF9 lösemik farelerden BM izolasyonu; Adım 2) mitokondriyal ROS boyası (mROS) kullanılarak hücresel boyama; Adım 3) sağlıklı ve lösemik farelerde hematopoetik kök ve progenitor hücreleri (HSPCs) popülasyonunu ayırt etmek için florokrom bağlantılı monoklonal antikorlarla hücresel boyama; Adım 4) Akış Sitometri edinimi ve çeşitli HSPC popülasyonlarında mitokondriyal ROS analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2 : Sağlıklı ve MLL-AF9 ifade eden kemik iliği hücreleri için akış sitometri gating stratejileri. (A) Sağlıklı farelerden izole edilen BM hücreleri canlı/ölü boya (QDot), mitokondriyal ROS boyası (TRPE) ile boyandı. Sağlıklı farelerden BM daha sonra soy belirteçleri artı CD48 (Cy5-PE), c-Kit (Cy7-APC), Sca1 (PacBlue), CD34 (FITC), CD150 (APC) tanıyan antikorlarla boyandı. (B) Canlı/ölü hücre ve mitokondriyal ROS lekelerine ek olarak, lösemili farelerden BM de soy belirteçlerini tanıyan antikorlarla ve CD48 (Cy5-PE), c-Kit (Cy7-APC), Sca1 (PacBlue) ve CD45.2 (APC) ile boyandı. sağlıklı alıcı BM hücrelerinden MLL-AF9 lösemi hücreleri arasında (CD45.1). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3 : Sağlıklı ve MLL-AF9 Kemik İliğinde Mitokondriyal ROS düzeyleri. Sol paneller, belirtilen popülasyonların mitokondriyal ROS düzeylerinin temsili histogramlarıdır ve ilgili sağ paneller belirtilen popülasyonlar için mitokondriyal ROS'un MFI bar grafik analizlerini temsil eder (n = 4). (A) Sağlıklı CD48 mitokondriyal ROS düzeylerinin karşılaştırılması- LSK, miyeloid atalarının yanı sıra MLL-AF9 Lindüşük c-KitYüksek ve MLL-AF9 Lindüşük c-KitInt-Low hücreleri. (B) Sağlıklı CD48- LSK hücrelerinde mitokondriyal ROS düzeylerinin MLL-AF9 Lindüşük c-KitYüksek ve MLL-AF9 Lindüşük c-KitInt-Low hücreleri ile CD150 ekspresyonuna göre karşılaştırılması. (C) Sağlıklı CD48- LSK hücrelerinde CD150 ve CD34 ekspresyonuna göre mitokondriyal ROS düzeylerinin karşılaştırılması. (* p≤0.05; ** p < 0.01*** p < 0.001; **** p < 0.0001). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4 : Pro- ve anti-oksidan bileşikler kullanarak mitokondriyal ROS düzeylerinde değişiklikler. Sağlıklı ve MLL-AF9 ifade eden BM hücrelerinde mitokondriyal ROS düzeylerinin histogramları 20 μM menadion sodyum bülsülfit (MSB) ile tedavi edilen histogramlar 1 saat 37 °C'de %5 CO2 kuvözde (pozitif Kontrol) veya 20 μM MSB ile birlikte 100 μM N-asetil-L-sistein (NAC) için 1 saat 37 °C'de %5 CO2 kuluçka makinesinde. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5 : Mitokondriyal ROS ve soy tanıyan antikor lekelerinin optimizasyonu. (A) MLL-AF9'da 10 veya 30 dakika boyunca 1 veya 5 μM kullanarak lösemi hücrelerini ifade eden mitokondriyal ROS (mROS) düzeylerinin karşılaştırılması (Kırmızı = araç; Mavi = MSB 20 μM; Yeşil = NAC 100 μM; Turuncu = Msb 20 μM + NAC 100 μM). (B) 20, 60 veya 90 dk'lık sağlıklı LSK'larda CD34 kanalının (FITC) MFI'sinin antikor kokteyli #1 (n = 4, * p ≤ 0.05; ** p < 0.01) karşılaştırılması. (C) Kuluçkadan önce veya sonra 30 dakika boyunca 37 °C'de %5 CO2 kuluçka makinesinde antikor boyamasının karşılaştırılması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6 : Mitokondriyal ROS ve soy marker antikor boyama sırası. (A) Farklı boyama emirleri kullanılarak elde edilen belirtilen HSPC popülasyonlarının nokta çizimleri. (B) LSK ve Miyeloid Progenitors bölmelerinde değerlendirilen mitokondriyal ROS düzeyleri farklı boyama sırası kullanılmıştır (Kırmızı = 4 °C'de 1 saat antikor boyama ve 37 °C'de 10 dakika boyunca mitokondriyal ROS boyama; Mavi = 37 °C'de 10 dk için mitokondriyal ROS boyama ve ardından 4 °C'de 1h antikor boyama). (C) Belirtilen popülasyonlarda farklı boyama emirleri kullanılarak mitokondriyal ROS (mROS) boyamamın MFI'sinin sayısallaştırılması (n = 4, * p ≤ 0.05). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7 : Verapamil tedavisinin sağlıklı ve MLL-AF9 ifade eden BM hücrelerinde mitokondriyal ROS boya boyama üzerine etkisi. (A) %5 CO2 kuluçka makinesinde 37 °C'de 10 dk'da 50 μM Verapamil ile veya olmadan tedavi edilen numunelerde belirtilen HSPC popülasyonlarının nokta çizimleri. (B) 50 μM Verapamil varlığında (mavi) veya yokluğu (kırmızı) belirtilen HSPC popülasyonlarında mitokondriyal ROS ve mitoMASS Yeşil boya boyama histogramları. (C-E) Mitokondriyal ROS boyama sırasında 50 μM Verapamil ile veya olmadan tedavi edilen BM örneklerinde belirtilen sağlıklı (C & D) ve lösemi (E) hücre popülasyonlarında mitokondriyal ROS düzeylerinin ölçülmesi (n = 4, * p ≤ 0.05). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Antikor kokteyller. Adım 3.1'de hazırlanan antikor kokteylleri listesi. sağlıklı ve lösemi kemik iliği içinde çeşitli hematopoetik alt popülasyonları belirlemek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ROS tespiti için geliştirilen florojenik boyalar sabit hücrelerde sıklıkla mikroskopi veya canlı hücrelerde akış sitometrisi22ile değerlendirilir. Mitokondriyal ROS florojenik boyalar kullanılarak BM hücrelerinde mitokondriyal ROS akış sitometrik değerlendirilmesi iki önemli avantajı vardır: 1) Canlı hücre analizi için uygun hızlı ve basit bir tekniktir ve 2) nadir ayırt ve analiz sağlar yüzey marker boyama kullanarak BM'de tek hücredüzeyinde popülasyonlar. Burada sunulan adım adım protokol hem sağlıklı farelerden hem atopoetik kök ve ata popülasyonlarının ex vivo redox durumunu incelemek için geliştirilmiştir hem sağlıklı farelerin hem de akış sitometrisi kullanılarak MLL-AF9 tarafından yönlendirilen AML'nin fare modeli. Bu protokolün yürütülmesi sırasında göz önünde bulundurulması gereken birkaç önemli teknik değişken vardır.
İlk olarak, pro- ve anti-oksidan kontrollerin kullanımı, kullanıcının mitokondriyal ROS boyamadaki artışlar ve lekenin özgüllüğü için bir temel oluşturmasını sağlar. Burada sunulan protokol için, pro-oksidan MSB hem sağlıklı hem de lösemi BM hücrelerinde mitokondriyal ROS boyama saptanabilir bir indüksiyon için pozitif kontrol olarak kullanılmıştır(Şekil 4). Anti-oksidan NAC ek bir kontrol olarak kullanılabilir, büyük ölçüde MSB tarafından indüklenen mitokondriyal ROS boyama ters gibi(Şekil 4).
İkinci olarak, bu çalışmada kullanılan mitokondriyal ROS florojenik boyanın 10 dakika boyunca 5 μM konsantrasyonda kullanılması tavsiye edilir. Ancak, üretici de konsantrasyon ve boyama zamanı hücre tipleri arasında değişebilir düşündürmektedir. Bu çalışmada mitokondriyal ROS boyama 10 veya 30 dk boyunca hem 1 μM hem de 5 μM olarak karşılaştırıldı. Analiz, mitokondriyal ROS'taki MSB aracılı değişikliklerin yanı sıra NAC tedavisi ile tersine çevrilen değişiklikleri tespit etmek için 10 ila 30 dakika için 5 μM konsantrasyonunun yeterli olduğunu ortaya koymuştur(Şekil 5A). 10 ile 30 dk arasında nicel bir fark olmadığından, bu çalışma için 10 dk boyama süresi, tayın uzunluğunu en aza indirmek için seçilmiştir.
Üçüncü olarak, CD34 antikor kuluçka süreleri literatür içinde 20 ila 90 dk23,24arasında değişir. Burada sunulan protokolü optimize etmek için, murin kemik iliği hücreleri 20, 60 veya 90 dakika boyunca antikor kokteyl#1 (Adım 3.1) ile inkübe edildi. Şekil 5B'degösterildiği gibi, 20 dk lekeile karşılaştırıldığında 60 veya 90 dk'lık hücrelerde önemli ölçüde daha güçlü CD34 boyama gözlendi. Ancak, 60 ve 90 dk(Şekil 5B)antikor kuluçka süreleri arasında CD34 boyamada anlamlı bir fark gözlenmemiş ve bu nedenle sunulan protokol için 60 dk antikor lekesi önerildi.
Dördüncü olarak, sunulan protokolde, hem sağlıklı hem de lösemi hücreleri önce mitokondriyal ROS florojenik boya ile boyanır, yıkanır ve daha sonra florokrom bağlantılı soy antikorları ile lekelenir. Bu çalışmada mitokondriyal ROS lekesinin soy antikorları ile birleştirilmesinin doğrudan değerlendirilmesi yapılmamış olsa da, 10, 20 ve 20 ve 20 ve 20 ve 20 ve 37 °C'de 30 dk. Bu analiz, 37 °C'de 30 dk kuluçka nın soy yüzey iması(Şekil 5C)önemli ölçüde değiştirdiğini ortaya koymuştur. Ayrıca ilk olarak mitokondriyal ROS boyama, sağlıklı BM hücrelerinin florokrom bağlantılı soy antikorları ile boyanması ve ardından mitokondriyal ROS florojenik boya ile boyanması ve tam tersi işlemler yapıldı. Hücreleri önce soy antikorları ve ardından mitokondriyal ROS boyama ile boyama, tam tersi boyama protokolüne göre daha düşük mitokondriyal ROS sinyalleri ile sonuçlandı (Şekil 6A,B) - CD48 için önemli farklılıklar da dahil olmak üzere- LSK CD150yüksek, CD48- LSK CD150Int CD34 ve miyeloid progenitor popülasyonları (Şekil 6C).
Beşinci, son çalışmalar farklı murine sağlıklı HSPC popülasyonları efflux çeşitli mitokondriyal boyama florojenik problar bu mitokondriyal kitle değerlendirmek için kullanılan gibi farklı yeteneklere sahip olduğunu göstermektedir (bundan böyle mitomass yeşil olarak anılacaktır) veya potansiyel25,26. Bu nedenle efflux pompa inhibitörü verapamilin mitokondriyal ROS florojenik boya ile sağlıklı ve lösemi atalarının boyanması üzerindeki etkisi de değerlendirildi. Mitokondriyal ROS ile HSPCs eşzamanlı boyama soy marker antikor boyama değişmedi(Şekil 7A),Ancak, verapamil önemli ölçüde sağlıklı ve lösemi çeşitli mitokondriyal ROS boyama sinyalleri geliştirmek yaptı ata popülasyonları (Şekil 7B,C). Özellikle, verapamil tarafından geliştirilmiş mitokondriyal ROS boyama büyüklüğü mitoMASS yeşil florojenik boya ile görülen kadar büyük değildi (Şekil 7B).
Altıncıolarak, burada sunulan protokolde, BM hücreleri kemik uçları (epifiz) kaldırılarak ve ardından kemiklerin kızarması ile kurtarıldı. Ancak, epifiz potansiyel kemik kızarma tarafından kaybolabilir hematopoetik hücreler içerir. Alternatif olarak, BM hücreleri daha önce açıklandığı gibi bir harç ve havaneli ile kemikleri püre tarafından ayıklanabilir12,13.
Burada sunulan protokol, canlı organizmalardan elde edilen canlı hücrelerde hücre içi redoks biyolojisini ölçmek için florojenik boyaların kullanımı için bir temel sağlamaktadır. Ancak, tek bir florojenik boya kesin olarak spesifik olarak kabul edilebilir ve bu nedenle alternatif yöntemlerle ek çalışmalar herhangi bir bulgu doğrulamak için yapılmalıdır dikkat etmek önemlidir. Ayrıca, bu çalışmanın sonuçları lösemi hücre popülasyonları LICs için zenginleştirilmiş öneririz (yani, Lindüşük cKityüksek) sağlıklı miyeloid ataları veya diğer HSPC popülasyonları daha mitokondriyal ROS daha yüksek düzeyde görüntülemek. Ancak, Burada değerlendirilen Lindüşük cKityüksek lösemi hücre popülasyonu heterojen olduğu gösterilmiştir ve diğer soy belirteçleri11,27ile daha da alt bölünebilir. Ayrıca, son çalışmalar LICs farklı bir metabolik fenotip sahip olduğunu göstermektedir28. Bu nedenle, metabolik tahlil ler veya problar ile paralel olarak mitokondriyal ROS'u değerlendiren gelecekteki çalışmalar ve ek soy belirteç antikorları bilgilendirici olacaktır.
Bu basit protokol, yaşayan hematopoetik hücrelerde mitokondriyal ROS düzeylerinin ölçülmesine olanak sağlar ve sağlıklı ve hastalıklı kök ve progenitor hücrelerin redoks biyolojisinin incelenmesinin yanı sıra, redoks hedefleme tedavileri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Fox Chase Kanser Merkezi Yönetim Kurulu (DDM), Amerikan Hematoloji Bilginleri Derneği Ödülü (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) ve Savunma Bakanlığı (Ödül#: W81XWH-18-1-0472) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heat inactivated FBS | VWR Seradigm LIFE SCIENCE | 97068-085 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Corning | 30-002-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific | BP399-20 | Buffer |
| 15 mL conical tube | BD falcon | 352096 | Tissue Culture Supplies |
| 50 mL conical tube | BD falcon | 352098 | Tissue Culture Supplies |
| 40 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Tissue Culture Supplies |
| RBC Lysis Buffer | Fisher Scientific | 50-112-9751 | Tissue Culture Supplies |
| Menadione sodium Bisulfite | Sigma aldrich | M5750 | Pro-oxidant |
| NAC | Sigma aldrich | A7250 | Anti-oxidant |
| CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 | Biolegend | 100310 | Antibody |
| CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 | eBioscience | 15-0041-81 | Antibody |
| CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 | eBioscience | 15-0081-81 | Antibody |
| CD19 PE-Cy5 clone 6D5 | Biolegend | 115510 | Antibody |
| B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 | Biolegend | 103210 | Antibody |
| Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 | Biolegend | 108410 | Antibody |
| Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 | Biolegend | 116210 | Antibody |
| CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 | Biolegend | 103420 | Antibody |
| CD117 APC-Cy7 clone 2B8 | Biolegend | 105825 | Antibody |
| Sca1 peacific Blue clone D7 | Biolegend | 108120 | Antibody |
| CD150 APC clone TC15-12F12.2 | Biolegend | 115909 | Antibody |
| CD34 FITC clone RAM34 | BD Bioscience | 553733 | Antibody |
| CD45.2 APC clone 104 | Biolegend | 1098313 | Antibody |
| MitoSOX Red | ThermoFisher Scientific | M36008 | Dye |
| Mitotracker Green | ThermoFisher Scientific | M7514 | Dye |
| Live/dead Yellow Dye | ThermoFisher Scientific | L34967 | Dye |
References
- Dröse, S., Brandt, U. Molecular mechanisms of superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Advances in experimental medicine and biology. 748, 145-169 (2012).
- Gerber, P. A., Rutter, G. A. The Role of Oxidative Stress and Hypoxia in Pancreatic Beta-Cell Dysfunction in Diabetes Mellitus. Antioxidant & Redox Signaling. 26 (10), 501-518 (2017).
- Höhn, A., et al. Happily (n)ever after: Aging in the context of oxidative stress, proteostasis loss and cellular senescence. Redox Biology. 11, 482-501 (2017).
- Reuter, S., Gupta, S. C., Chaturvedi, M. M., Aggarwal, B. B. Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked. Free Radical Biology & Medicine. 49 (11), 1603-1616 (2010).
- Lee, B. W. L., Ghode, P., Ong, D. S. T. Redox regulation of cell state and fate. Redox Biology. 2213-2317 (18), 30899 (2018).
- Harris, J. M., et al. Glucose metabolism impacts the spatiotemporal onset and magnitude of HSC induction in vivo. Blood. 121, 2483-2493 (2013).
- Hole, P. S., Darley, R. L., Tonks, A. Do reactive oxygen species play a role in myeloid leukemias. Blood. 117, 5816-5826 (2011).
- Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
- Di Marcantonio, D., et al. Protein Kinase C Epsilon Is a Key Regulator of Mitochondrial Redox Homeostasis in Acute Myeloid Leukemia. Clinical Cancer Research. 24 (3), 608-618 (2018).
- Glasauer, A., Chandel, N. S. Targeting antioxidants for cancer therapy. Biochemical Pharmacology. 92 (1), 90-101 (2014).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiments. (157), (2007).
- Kalaitzidis, D., et al. mTOR complex 1 plays critical roles in hematopoiesis and Pten-loss-evoked leukemogenesis. Cell Stem Cell. 11 (3), 429-439 (2012).
- Sykes, S. M., et al. AKT/FOXO signaling enforces reversible differentiation blockade in myeloid leukemias. Cell. 146 (5), 697-708 (2011).
- Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), 3776 (2008).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Yilmaz, O. H., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Mooney, C. J., Cunningham, A., Tsapogas, P., Toellner, K. M., Brown, G. Selective expression of flt3 within the mouse hematopoietic stem cell compartment. International Journal Molecular Sciences. 18 (5), (2017).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. I. SLAM family markers resolve functional distinct sub-populations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1178 (2010).
- Mukhopadhyay, P., Rajesh, M., Haskó, G., Hawkins, B. J., Madesh, M., Pacher, P. Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy. Nature Protocols. 2 (9), 2295-2301 (2007).
- Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
- Morita, Y., Ema, H., Yamazaki, S., Nakauchi, H. Non-side-population hematopoietic stem cells in mouse bone marrow. Blood. 108 (8), 2850-2856 (2006).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Somervaille, T. C., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
- Hao, X., et al. Metabolic Imaging Reveals a Unique Preference of Symmetric Cell Division and Homing of Leukemia-Initiating Cells in an Endosteal Niche. Cell Metabolism. 29 (4), 950-965 (2019).
