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Cancer Research

Flusso Analisi citometrica delle specie di ossigeno reattivo mitocondriale nelle cellule staminali e semigeniche Murine Hematopoietic e MLL-AF9 Driven Leucemia

Published: September 5, 2019 doi: 10.3791/59593
Automatic Translation
1, 1
1Blood Cell Development and Function Program, Fox Chase Cancer Center

Summary

Descriviamo un metodo per l'utilizzo di citometria a flusso multiparametrico per rilevare le specie di ossigeno reattivo mitocondriale (ROS) in cellule staminali e progenitrici (HSPC) e cellule leucemiche da un modello murino di leucemia mieloide acuta (AML) MLL-AF9.

Abstract

Vi presentiamo un approccio citometrico a flusso per analizzare il ROS mitocondriale in varie popolazioni di cellule staminali e progenitrici derivate da mandorone vivo (BM) da topi sani e topi con AML guidati da MLL-AF9. In particolare, descriviamo un processo di colorazione delle cellule in due fasi, in base al quale le cellule BM sane o leucemia vengono prima macchiate con un colorante fluorogenico che rileva i superossidi mitocondriali, seguito dalla colorazione con anticorpi monoclonali fluoromemici che vengono utilizzati per distinguere varie popolazioni di progenitori ematopoietici sani e maligni. Forniamo anche una strategia per l'acquisizione e l'analisi dei campioni per citometria di flusso. L'intero protocollo può essere eseguito in un lasso di tempo Mettiamo inoltre in evidenza le variabili chiave da considerare, nonché i vantaggi e i limiti del monitoraggio della produzione ROS nel compartimento mitocondriale delle sottopopolazioni di stelo e leucemia e progenie vive utilizzando coloranti fluogenici per citometria di flusso . Inoltre, presentiamo dati che l'abbondanza mitocondriale ROS varia tra distinti sottopopolazioni HSPC sani e progenitori di leucemia e discutiamo le possibili applicazioni di questa tecnica nella ricerca ematologica.

Introduction

Le specie REattive dell'ossigeno (ROS) sono molecole altamente reattive derivate dall'ossigeno molecolare. La posizione cellulare più ben definita della produzione di ROS è il mitocondria, dove gli elettroni che passano attraverso la catena di trasporto degli elettroni (ETC) durante il fosforoostoslazione ossidativa (OXPHOS) vengono assorbiti dall'ossigeno molecolare che porta alla formazione di uno specifico tipo di ROS chiamato superoossidi1. Attraverso le azioni di una serie di enzimi, chiamati disinmutasi di superossido o SOD, i superolisi vengono convertiti in perossidi di idrogeno, che vengono successivamente neutralizzati in acqua da enzimi come catalasi o perossioni glutathione (GPX). Le perturbazioni nei meccanismi di regolazione del ROS possono portare all'eccesso di produzione di ROS, spesso indicato come stress ossidativo, che hanno conseguenze cellulari dannose e potenzialmente letali come il danno da macromolecola (cioè DNA, proteine, lipidi). Inoltre, lo stress ossidativo è legato a diverse patologie, come il diabete, le malattie infiammatorie, l'invecchiamento e i tumori2,3,4. Per mantenere l'omeostasi redox e prevenire lo stress ossidativo, le cellule possiedono una varietà di meccanismi di regolazione ROS5.

I livelli fisiologici di alcuni ROS sono necessari per una corretta ematopoiesi embrionale e adulta6. Tuttavia, l'eccesso di ROS è associato al danno al DNA, alla differenziazione cellulare e all'esaurimento dello stelo ematopoietico e del pool progenitore. Ci sono anche prove che le alterazioni nella biologia redox possono differire tra leucemia e cellule sane. Ad esempio, i livelli di ROS tendono ad essere più elevati nelle cellule acute di leucemia mieloide (AML) rispetto alle loro controparti sane e altri studi hanno suggerito che le cellule staminali della leucemia mantengono un basso livello costante di ROS per la sopravvivenza7,8. È importante sottolineare che le strategie per capitalizzare terapeuticamente queste differenze redox hanno mostrato promessa in diverse impostazioni di cancro umano9,10. Pertanto, i saggi che consentono la valutazione dei livelli di ROS nei modelli murini possono migliorare la nostra comprensione di come queste specie contribuiscono alla fisiologia cellulare e alla patogenesi della malattia, nonché potenzialmente fornire una piattaforma per valutare l'efficacia nuove terapie anti-cancro di mira redox.

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Protocol

Tutte le procedure sugli animali descritte in questo protocollo sono state approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) del Fox Chase Cancer Center.

NOT: Il flusso di lavoro del protocollo è suddiviso in 4 parti, come illustrato nella Figura 1 e i reagenti necessari sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Isolamento del midollo osseo (BM)

NOT: I topi di leucemia MLL-AF9 sono stati generati come descritto in precedenza11.

  1. Recuperare le cellule del midollo osseo mononucleare, come descritto in precedenza12,13,14,15, da topi di tipo selvaggio C57.Bl6 (che esprimono il marcatore congenico CD45.2) e da C57. Topi Bl6-SJL (che esprimono il marcatore congenico CD45.1) che sono stati trapiantati con cellule leucemiche mLL-AF9 (CD45.2).
    NOT: BM può essere recuperato dai topi schiacciando12,13 o lavando le ossa14,15. Per gli esperimenti presentati qui, BM è stata recuperata da topi sani e leucemia attraverso il lavaggio.

2. Ros mitocondriale Colorazione colorante fluorogenico

  1. Una volta che le cellule del midollo osseo mononucleari sono state recuperate da topi sani e/o leucemici, macchiare un'aliquota di cellule con Trypan Blue e contare utilizzando un emocitometro per determinare il numero iniziale di cellule BM totali.
  2. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min. Aspirate il supernatante e risospendere il pellet in F-PBS (PBS integrato con 2% siero bovino fetale e un 1% Penicillin/ Streptomycin cocktail) ad una concentrazione di 2 x 106 cellule / mL.
  3. Aliquota 200 -L di sospensione cellulare per tubo in 9 tubi di controllo monocolore etichettati come segue:
    Nessuna macchia, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (solo per HSPC sani), CD45.2-APC (solo per le cellule leucemiche), CD34-FITC, Mitochondrial ROS dye e Live/dead cell colorin.
    NOT: (Facoltativo) Un controllo positivo per l'induzione del ROS mitocondriale può essere preparato trattando 2 x 105 cellule in 200 -L con 20 M di Menadione Sodium Bisulfite (MSB) per 1 h a 37 s In un 5% di incubatore di CO2. Un secondo controllo per invertire l'induzione mediata da MSB di ROS mitocondriale può essere preparato trattando 2 x 105 cellule in 200 -L con 20 M di MSB più 100 M N-acetyl-L-cysteine (NAC) per 1 h a 37 gradi centigradi in un incubatore di CO2 5%.
  4. Aliquota le cellule rimanenti in un tubo (tubo sperimentale) e centrifuga a 300 x g per 5 min.
  5. Risospendere le celle in F-PBS con una macchia di cellule vive / morte secondo le istruzioni del produttore. Incubare sul ghiaccio per 30 min. Assicurarsi di aggiungere una macchia viva /morta al tubo di controllo monocolore.
  6. Aggiungere 1,0 mL di temperatura ambiente (RT) F-PBS sia ai tubi monocolore che a quelli sperimentali macchiati con la tintura viva/morta. Centrifuga 5 min a 300 x g a RT.
  7. Risospendere 50 g di tintura ROS mitocondriale in 13 - L di solforo dimetile (DMSO) per ottenere una soluzione di stock 5 mM.
  8. Dilute mitocondrial ros colora ad una concentrazione finale di 5 M in RT F-PBS con o senza Verapamil (50 M).
  9. Aspirate fuori il lavaggio della macchia cella morta / morta. Aggiungere 200 l di colorante mitocondriale ROS che contenga Verapamil ad ogni tubo sperimentale, nonché il tubo di controllo mitocondriale ROS colorante monocolore.
  10. Vortice per mescolare e incubare per 10 min a 37 gradi centigradi al buio.
  11. Aggiungere 1,0 mL di RT F-PBS al controllo mitocondriale a colore singolo e ai tubi sperimentali. Centrifuga 5 min a 300 x g a RT.
  12. Aspirare il supernatante e lavare le cellule con un ulteriore 1.0 mL di RT F-PBS. Centrifuga 5 min a 300 x g a RT.

3. Colorazione anticorpo di lignaggio

  1. Preparare i cocktail anticorpali elencati nella tabella 1.
    NOT: Questi cocktail anticorpi sono stati ottimizzati in precedenza14,15,16.
  2. Aspirare il supervolontario dal lavaggio del ROS mitocondriale finale dei tubi sperimentali contenenti BM sani e aggiungere 200 l di cocktail anticorpale #1 ad ogni tubo. Vortice da mescolare. Preparare anche i tubi di controllo monocolore. Incubare per 60 min sul ghiaccio al buio.
  3. Aspirare il supernatante dal lavaggio del ROS mitocondriale finale dei tubi sperimentali contenenti leucemia BM e aggiungere 200 -L del cocktail anticorpo #2 ad ogni tubo. Vortice da mescolare. Incubare per 60 min sul ghiaccio al buio.
  4. Lavare con 1,0 mL di F-PBS freddo e centrifugare 5 min a 300 x g a RT.
  5. Risospendere le cellule in 500 - L di F-PBS freddo e filtrare le cellule in un tubo citometro di flusso utilizzando un filtro di 40 m per escludere gli aggregati.

4. Acquisizione e analisi della citometria di flusso

NOT: Diversi sottoinsiemi di gambo ematopoietico e progenitore sono rari, come le cellule staminali ematopoietiche a lungo termine. Pertanto, idealmente dovrebbero essere raccolti 3-5 milioni di eventi per ogni tubo sperimentale durante l'acquisizione della citometria di flusso per un'analisi sufficiente del ROS mitocondriale nei vari sottoinsiemi HSPC.

  1. Utilizzare il tubo di controllo no-colorin per impostare i grafici a dispersione in avanti (FSC-A) e laterali (SSC-A) in base alle dimensioni e alla complessità della popolazione cellulare analizzata.
  2. Utilizzare i tubi di controllo senza macchie e a colore singolo per compensare il citometro di flusso.
  3. Cancello i detriti estranei dal grafico a dispersione in avanti e laterale(Figura 2A, B, primo pannello da sinistra).
  4. Cancello doppietti utilizzando un doppio discriminatore come il discriminatore forward(Figura 2A,B, secondo pannello da sinistra).
  5. Seguire la strategia di gating proposta nella Figura 2A,B per selezionare le cellule vive, le cellule basse di lignaggio e i vari sottoinsiemi HSPC e leucemia.
  6. Per ogni popolazione di interesse, analizzare l'intensità mediana di fluorescenza (MFI) del canale TRPE (asse x) in un grafico istogramma per valutare le differenze nel segnale ROS mitocondriale (Figura 3A-C, pannelli a sinistra). I livelli di ROS mitocondriale possono essere valutati a livello di singola cellula confrontando la colorazione ROS mitocondriale con marcatori di lignaggio specifici in un grafico a dispersione.

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Representative Results

Presentato è un metodo per analizzare ROS nei mitocondri di più popolazioni progenie leucemia sane e MLL-AF9-esprimente. Figura 1 viene visualizzata una visualizzazione schematica del flusso di lavoro protocollo, che consiste di 4 passaggi principali: 1) isolamento BM dai mouse; 2) colorare le cellule BM con un colorante fluorogenico che riconosce ROS mitocondriale, in particolare superossidi; 3) Colorazione anticorpo marcatore di superficie per delineare varie popolazioni sane e leucemia ematopoietiche; e 4) Acquisizione e analisi della citometria di flusso.

Figura 2 A,B descrive una strategia rappresentativa di gating per l'analisi di varie popolazioni di staminali epatici e progenitori in sane e leucemia BM. Viene applicato un grafico FSC/SSC per eliminare i detriti e un grafico ADAd (FSC-A) rispetto all'altezza FSC (FSC-H) viene utilizzato per escludere doppiettoi e aggregati. Un pannello di marcatori di superficie di lignaggio (Tabella 1 e passo 3.1) sono combinati per escludere una varietà di popolazioni ematopoinetiche mature come linfociti, eritrociti, granulociti e monociti /macrofagi (cioè, Lignaggio basso oLin low). Il cocktail di lignaggio comprende anche un anticorpo CD48 e quindi tutti i sottoinsiemi di cellule basse di lignaggio sono anche CD48-. Sca-1 e c-Kit espressione di superficie cellulare viene utilizzato per distinguere una miscela eterogenea di HSPC chiamato CD48- LSKs (Linlow, Sca-1,c-Kit,CD48-) da progenitori mieloidi (Linlow, Sca-1- , c-Kit,CD48-. Per distinguere ulteriormente vari sottoinsiemi HSPC, vengono aggiunti anche il marcatore SLAM, CD150 e CD3417,18,19,20,21. Figura 2 B descrive anche una strategia di gating rappresentativa per i progenitori di leucemia ad alto esalto cKit (Linlow, c-Kithigh; Sca-1- ),che sono arricchiti per l'incudimentazione delle cellule (LIC)11 e le cellule leucemiche che esprimono l'espressione intermedia-bassa di cKit (cKitInt-low).

Un confronto di colorazione ROS mitocondriale tra CD48- LSK e progenitori mieloidi mostra che i progenitori mieloidi mostrano livelli significativamente più elevati di colorazione ROS mitocondriale (Figura 3A). Inoltre, i progenitori di leucemiaalta cKit mostrano livelli significativamente più elevati di colorazione ROS mitocondriale rispetto a CD48- LSK, progenitori mieloidi o cellule leucemiche cKitint-bassa (Figura 3A). cKit LeucemiaInt-basso mostravano anche una colorazione ROS mitocondriale significativamente più alta rispetto a CD48- cellule LSK ma non ai progenitori mieloidi (Figura 3A). Gli LSK ulteriormente suddivisi per l'espressione CD150 hanno mostrato che la colorazione ROS mitocondriale non ha variato in modo significativo in CD48- cellule LSK suddivise per CD150alto(CD150 High ), intermedio (CD150Int) o no (CD150Neg) espressione (Figura 3B). Tuttavia, la colorazione ROS mitocondriale allo stato costante delle cellule leucemiche cKitalte o cKitInt-basso è risultata significativamente superiore a CD48- LKs-CD150High, -CD150Int o -CD150Neg ( Figura 3B). Le cellule LSK che esprimono basso a nessun livello di CD34 sono arricchite per cellule staminali ematopoietiche di ricostituzione a lungo termine, in particolare le cellule CD48- LSK che sono CD34- e CD150alto20,21. Tuttavia, la suddivisione delle cellule CD48- LSK per espressione CD150 e CD34 non ha rivelato differenze significative nella colorazione ROS mitocondriale tra questi sei sottoinsiemi HSPC (Figura 3C).

Figure 1
Figura 1 : rappresentazione schematica del flusso di lavoro del protocollo. Fase 1) Isolamento BM da topi leucemici sani e MLL-AF9; Fase 2) colorazione cellulare con un colorante ROS mitocondriale (mROS); Fase 3) colorazione cellulare con anticorpi monoclonali collegati al fluorocroper per discriminare le cellule staminali e progenitrici (HPGC) in topi sani e leucemici; Fase 4) Flusso acquisizione della citometria e analisi del ROS mitocondriale in diverse popolazioni HSPC. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Strategie di attometria di flusso per cellule del midollo osseo sane e MLL-AF9. (A) Le cellule BM isolate da topi sani sono state macchiate con un colorante vivo/morto (QDot), colorante ROS mitocondriale (TRPE). BM da topi sani è stato successivamente colorato con anticorpi che riconoscono marcatori di lignaggio più CD48 (Cy5-PE), c-Kit (Cy7-APC), Sca1 (PacBlue), CD34 (FITC), CD150 (APC). (B) Oltre alle cellule vive/morte e alle macchie mitocondriali ROS, BM da topi leucemiasi sono stati macchiati anche con anticorpi che riconoscono marcatori di lignaggio più CD48 (Cy5-PE), c-Kit (Cy7-APC), Sca1 (PacBlue) e CD45.2 (APC), che viene applicato per discriminare tra leucemie MLL-AF9 provenienti da cellule BM sane (CD45.1). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Livelli mitocondriali di ROS in midollo osseo mitonico sano e MLL-AF9. I pannelli a sinistra sono istogrammi rappresentativi dei livelli mitocondriali di ROS delle popolazioni indicate e i rispettivi pannelli di destra rappresentano le analisi del grafico a barre delle IFM del ROS mitocondriale per le popolazioni indicate (n . 4). (A) Confronto dei livelli di ROS mitocondriale nelle cellule sane CD48- LSK, progenitori mieloidi, nonché MLL-AF9 Linlow c-KitHigh e MLL-AF9 Linlow c-KitInt-Low. (B) Confronto dei livelli di ROS mitocondriale nelle cellule CD48- LSK basate sulla loro espressione CD150 rispetto alle cellule MLL-AF9Lin low c-KitHigh e MLL-AF9 Linlow c-KitInt-Low. (C) Confronto dei livelli di ROS mitocondriale in CD48- Cellule LSK in base alla loro espressione CD150 e CD34. (p-0,05; p < 0,01, p < 0,001; Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Cambiamenti nei livelli di ROS mitocondriale utilizzando composti pro e antiossidanti. Istogrammi di livelli di ROS mitocondriali in cellule BM sane e mLL-AF9 trattate con 20 M di bisulfite di sodio menadino (MSB) per 1 h a 37 s C in un 5% di CO2 incubatore (controllo positivo) o con 20 M di MSB in combinazione con 100M N-acetyl-L-cysteine (NAC) per 1 h a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di CO2 del 5%. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : Ottimizzazione del ROS mitocondriale e delle macchie dell'anticorpo che riconoscono il lignaggio. (A) Confronto dei livelli di ROS mitocondriale (mROS) in MLL-AF9 che esprimono cellule leucemiche utilizzando 1 o 5 M per 10 o 30 min. (rosso: veicolo; Blu : MSB 20 M; Verde : NAC 100 M; Arancione , Msb 20 M , NAC 100 M. (B) Confronto delle IFM del canale CD34 (FITC) in LSK sani macchiati per 20, 60 o 90 min con il cocktail anticorpale #1 (n . 4, (C) Confronto degli anticorpi che macchiano prima o dopo l'incubazione per 30 min a 37 gradi centigradi in un incubatore di CO2 del 5%. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 : Ordine di colorazione dell'anticorpo mitocondriale e del marcatore di lignaggio. (A) Grafici a punti delle popolazioni di HSPC indicate ottenute utilizzando diversi ordini di colorazione. (B) I livelli di ROS mitocondriale valutati nei compartimenti LSK e Progenitori ottenuti hanno utilizzato un diverso ordine di colorazione (rosso : colorazione anticorpale per 1 h a 4 gradi centigradi seguito da colorazione ROS mitocondriale per 10 min a 37 gradi centigradi; Blu - colorazione ROS mitocondriale per 10 min a 37 gradi centigradi seguita da colorazione anticorpale 1h a 4 gradi centigradi). (C) Quantificazione delle IFM di colorazione ROS mitocondriale (mROS) utilizzando diversi ordini di colorazione nelle popolazioni indicate (n , 4, , p , 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7 : Impatto del trattamento in verapamile sulla colorazione del ROS mitocondriale nelle cellule BM sane e che esprimono MLL-AF9. (A) Grafici a punti delle popolazioni di HSPC indicate in campioni trattati con o senza 50 M Verapamil per 10 min a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di CO2 del 5%. (B) Istogrammi di ROS mitocondriale e mitoMASS Colorazione verde nelle popolazioni HSPC indicate in presenza (blu) o assenza (rosso) di 50 M Verapamil. (C-E) Quantificazione dei livelli di ROS mitocondriale nelle popolazioni di cellule sane (C & D) e leucemia (E) indicate nei campioni di BM trattati con o senza 50 - M Verapamil durante la colorazione ROS mitocondriale (n - 4, - p - 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Table 1
Tabella 1: Cocktail anticorpali. Elenco dei cocktail anticorpali preparati nel Passo 3.1. per identificare varie sottopopolazioni ematopoietiche all'interno di midollo osseo sano e leucemia.

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Discussion

I coloranti fluorogenici che sono stati sviluppati per la rilevazione di ROS sono spesso valutati in cellule fisse mediante microscopia o in cellule vive per citometria di flusso22. La valutazione citometrica del flusso del ROS mitocondriale nelle cellule BM che utilizza nodi fluorogeniche MItocondriali ROS ha due vantaggi principali: 1) Si tratta di una tecnica semplice e veloce adatta per l'analisi delle cellule vive e 2) consente di distinguere e analizzare raro a livello di singola cellula nel BM utilizzando la colorazione dei marcatori di superficie. Il protocollo passo-passo qui presentato è stato sviluppato per studiare lo stato di redox ex vivo delle popolazioni di staminali e semipoieti da topi sani e un modello murino di AML guidato da MLL-AF9 utilizzando la citometria a flusso. Ci sono diverse variabili tecniche chiave che devono essere considerate durante l'esecuzione di questo protocollo.

In primo luogo, l'uso di controlli pro e anti-ossidanti consente all'utente di stabilire una linea di base per gli aumenti nella colorazione ROS mitocondriale e la specificità della macchia. Per il protocollo qui presentato, il MSB pro-ossidante è stato utilizzato come un controllo positivo per un'induzione rilevabile di colorazione ROS mitocondriale in cellule BM sane e leucemia (Figura 4). L'anti-ossidante NAC può essere utilizzato come un controllo aggiuntivo, in quanto inverte in gran parte la colorazione ROS mitocondriale indotta da MSB (Figura 4).

In secondo luogo, il tinridireziona fluorogenico ROS mitocondriale impiegato in questo studio è raccomandato per essere utilizzato ad una concentrazione di 5 M per 10 min. Tuttavia, il produttore suggerisce anche che la concentrazione e il tempo di colorazione possono variare tra i tipi di cellule. In questo studio, la colorazione ROS mitocondriale è stata confrontata sia a 1 : M e 5 M per 10 o 30 min. L'analisi ha rivelato che una concentrazione di 5 M per 10-30 min è sufficiente per rilevare i cambiamenti mediati da MSB nel ROS mitocondriale, nonché quelli invertiti dal trattamento NAC (Figura 5A). Poiché non vi era alcuna differenza quantitativa tra 10 e 30 min, è stato selezionato un tempo di colorazione di 10 min per questo studio per ridurre al minimo la lunghezza del saggio.

In terzo luogo, i tempi di incubazione degli anticorpi CD34 variano all'interno della letteratura da 20 a 90 min23,24. Per ottimizzare il protocollo qui presentato, le cellule del midollo osseo murino sono state incubate con il cocktail anticorpale #1 (Passaggio 3.1) per 20, 60 o 90 min. Come mostrato nella Figura 5B, significativamente più forte colorazione CD34 è stato osservato su cellule macchiate per 60 o 90 min rispetto alla macchia 20 min. Tuttavia, una differenza significativa nella colorazione CD34 non è stata osservata tra i tempi di incubazione degli anticorpi di 60 e 90 min (Figura 5B) e quindi una macchia anticorpo 60 min è raccomandato per il protocollo presentato.

Quarto, nel protocollo presentato, sia le cellule sane che leucemiche vengono prima macchiate con il colorante fluorogenico ROS mitocondriale, lavato e poi macchiato con anticorpi di lignaggio fluorocro. Sebbene in questo studio non sia stata condotta una valutazione diretta della combinazione della macchia mitocondriale del ROS con anticorpi di lignaggio, in questo studio è stata condotta una valutazione della colorazione dell'anticorpo di lignaggio legata al fluorocro 30 min a 37 gradi centigradi. Questa analisi ha rivelato che 30 m0 di incubazione a 37 gradi centigradi alterano sostanzialmente la colorazione del marcatore di superficie di lignaggio (Figura 5C). Inoltre, la colorazione ROS mitocondriale è stata valutata per la prima volta, colorando cellule BM sane con anticorpi di lignaggio fluorocrometallici seguiti dalla colorazione fluorogenica ROS mitocondriale e dall'ordine delle operazioni viceversa. Le cellule di colorazione prima con anticorpi di lignaggio seguiti da colorazione ROS mitocondriale hanno prodotto segnali ROS mitocondriali più bassi rispetto al protocollo di colorazione viceversa (Figura 6A,B) - comprese differenze significative per CD48- LSK CD150alto, CD48- LSK CD150Int CD34 e popolazioni progenie mieloidi (Figura 6C).

Quinto, studi recenti dimostrano che diverse popolazioni di HSPC sani murini possiedono capacità distinte di efflux diverse sonde fluorogeniche mitocondriali come quelle utilizzate per valutare la massa mitocondriale (in seguito indicata come verde mitoMASS) o potenziale25,26. Pertanto, è stato valutato anche l'impatto del verapamil inibitore della pompa di efflusso sulla colorazione colorata di progenitori sani e leucemia con il colorante fluorogenico ROS mitocondriale. La colorazione simultanea degli HSPC con ROS mitocondriale non ha alterato la colorazione dell'anticorpo del marcatore di lignaggio (Figura 7A), tuttavia, il verapamil ha migliorato significativamente i segnali di colorazione ROS mitocondriali in una varietà di salute e leucemia popolazioni progenitorie (Figura 7B,C). In particolare, la grandezza di una migliore colorazione ROS mitocondriale da verapamil non era così grande come quella vista con il colorante fluorogenico verde mitoMASS (Figura 7B).

Sesto, nel protocollo qui presentato, le cellule BM sono state recuperate rimuovendo le punte ossee (epifisi) seguite dallo sciacquone delle ossa. Tuttavia, l'epifisi contiene cellule ematopoietiche che potrebbero potenzialmente essere perse dal lavaggio osseo. In alternativa, le cellule BM possono essere estratte schiacciando le ossa con un mortaio e pestello come descritto in precedenza12,13.

Il protocollo qui presentato fornisce una base per l'uso di coloranti fluorogenici per misurare la biologia redox intracellulare in cellule vive estratte da organismi viventi. Tuttavia, è importante notare che non si può presumere che nessun singolo tincolo fluorogenico sia definitivamente specifico e pertanto dovrebbero essere condotti ulteriori studi con metodi alternativi per verificare eventuali risultati. Inoltre, i risultati di questo studio suggeriscono che le popolazioni di cellule leucemiche arricchite per i LIC (cioè Linlow cKithigh) mostrano livelli più elevati di ROS mitocondriale rispetto ai progenitori di mieloidi sani o ad altre popolazioni di HSPC. Tuttavia, la popolazione di cellulead alta leucemia Linbassa cKit valutata qui ha dimostrato di essere eterogenea e può essere ulteriormente suddivisa da altri marcatori di lignaggio11,27. Inoltre, studi recenti dimostrano che i LIC possiedono un fenotipo metabolico distinto28. Pertanto, studi futuri che valutano il ROS mitocondriale in parallelo con saggi metabolici o sonde, nonché ulteriori anticorpi marcatore lignaggio saranno informativi.

Questo protocollo semplice consente la misurazione dei livelli di ROS mitocondriale nelle cellule ematopoietiche viventi e può fornire una base per studiare la biologia rifare delle cellule staminali e progenitrici sane e malate, nonché per valutare l'efficacia delle cellule staminali e progenitrici terapie di targeting redox.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dal Fox Chase Cancer Center Board of Directors (DDM), l'American Society of Hematology Scholar Award (SMS), American Cancer Society RSG (SMS) e dal Department of Defense (Award: W81XWH-18-1-0472).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heat inactivated FBS VWR Seradigm LIFE SCIENCE 97068-085 Media
Penicillin Streptomycin Corning 30-002-CI Media
PBS Fisher Scientific BP399-20 Buffer
15 mL conical tube BD falcon 352096 Tissue Culture Supplies
50 mL conical tube BD falcon 352098 Tissue Culture Supplies
40 μm cell strainers Fisher Scientific 22-363-547 Tissue Culture Supplies
RBC Lysis Buffer Fisher Scientific 50-112-9751 Tissue Culture Supplies
Menadione sodium Bisulfite Sigma aldrich M5750 Pro-oxidant
NAC Sigma aldrich A7250 Anti-oxidant
CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11 Biolegend 100310 Antibody
CD4 PE-Cy5 clone RM4-5 eBioscience 15-0041-81 Antibody
CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7 eBioscience 15-0081-81 Antibody
CD19 PE-Cy5 clone 6D5 Biolegend 115510 Antibody
B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2 Biolegend 103210 Antibody
Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5 Biolegend 108410 Antibody
Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119 Biolegend 116210 Antibody
CD48 PE-Cy5 clone HM48-1 Biolegend 103420 Antibody
CD117  APC-Cy7 clone 2B8 Biolegend 105825 Antibody
Sca1 peacific Blue clone D7 Biolegend 108120 Antibody
CD150 APC clone TC15-12F12.2 Biolegend 115909 Antibody
CD34 FITC clone RAM34 BD Bioscience 553733 Antibody
CD45.2 APC clone 104 Biolegend 1098313 Antibody
MitoSOX Red ThermoFisher Scientific M36008 Dye
Mitotracker Green ThermoFisher Scientific M7514 Dye
Live/dead Yellow Dye ThermoFisher Scientific L34967 Dye

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Ricerca sul cancro Numero 151 AML HSC ROS superoossidi mitocondri citometro di flusso
Flusso Analisi citometrica delle specie di ossigeno reattivo mitocondriale nelle cellule staminali e semigeniche Murine Hematopoietic e MLL-AF9 Driven Leucemia
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Di Marcantonio, D., Sykes, S. M. Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia. J. Vis. Exp. (151), e59593, doi:10.3791/59593 (2019).

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