Summary
프로토카테츄아제 3,4-디옥시게나아제(PCD)는 기질 인 프로토카츄산(PCA)을 사용하여 수성 시스템에서 자유 분무기 산소를 효소적으로 제거할 수 있습니다. 이 프로토콜은 이러한 산소 제거 효소의 발현, 정제 및 활성 분석을 설명합니다.
Abstract
단 하나 분자 (SM) 현미경 검사법은 실시간으로 불소 표지된 생체 분자의 동적 분자 상호 작용의 연구 결과에서 이용됩니다. 그러나 형광단은 용존 산소에 의한 광표백을 통해 신호가 손실되는 경향이있다(O2). 광표백을 방지하고 형광공 수명을 연장하기 위해 산소 청소 시스템(OSS)을 사용하여O2를줄입니다. 시판되는 OSS는 핵산을 손상시키거나 분해하는 뉴클레아제에 의해 오염될 수 있으며, 실험 결과의 해석을 혼란스럽게 할 수 있다. 여기서 우리는 검출 가능한 뉴클레아제 오염이 없는 고활성 슈도모나스 푸티다 프로토카테추아제-3,4-디옥시게나아제(PCD)의 발현 및 정제를 위한 프로토콜을 상세히 설명한다. PCD는 기질 인 protocatechuic 산 (PCA)을 3-카르복시 -시스, 시스-무콘 산으로 변환하여 반응성 O2 종을 효율적으로 제거 할 수 있습니다. 이 메서드는 O2가 데이터 수집에 해로운 역할을 하는 모든 수성 시스템에서 사용할 수 있습니다. 이 방법은 시판되는 PCD와 비교하여 고활성, 뉴클레아제 프리 PCD를 제조하는데 효과적이다.
Introduction
단일 분자 (SM) 생물 물리학은 우리가 생물학적 현상을 보는 방식을 변화시키는 빠르게 성장하는 분야입니다. 이 분야는 생물학에 물리학 및 화학의 기본 법칙을 연결하는 독특한 능력을 가지고있다. 형광 현미경 검사법은 SM 감도를 달성할 수 있는 1개의 생물물리학적인 방법입니다. 형광은 작은 유기 형광체 또는 양자점1에연결하여 생체 분자를 검출하는 데 사용됩니다. 이 분자는 비가역적으로 광표백하기 전에 레이저에 의해 흥분될 때 광자를 방출할 수 있습니다2. 광표백은 형광 라벨이 원하는 파장에서 흥분하는 능력을 파괴하는 화학적 손상을 겪을 때 발생합니다2,3. 수성 완충제에 반응성 산소 종 (ROS)의 존재는광표백2,4의주요 원인입니다. 또한, ROS는 생체 분자를 손상시키고 SM 실험5,6에서잘못된 관찰로 이어질 수 있습니다. 산화 손상을 방지하기 위해 산소 청소 시스템 (OSS)을 사용할 수 있습니다3,7,8. 포도당 산화증 /카랄라제 (GODCAT) 시스템은 산소8을제거하는 데 효율적이지만 잠재적으로 손상될 수 있는 과산화물을 중간체로 생성합니다. 이들은 SM 연구 결과에 있는 관심의 생체 분자에 손상될 수 있습니다.
대안적으로, 프로토카테츄아테 3,4 디옥시게라아제(PCD)는 기질 프로토카테추산(PCA)7,9를이용하여 수성 용액으로부터O2를 효율적으로 제거한다. PCD는 논헴 철을 사용하여 PCA를 조정하고 용해O210을사용하여 카테콜 링 개방 반응을 촉매하는 금속 효소입니다. 이러한 한 단계 반응은 SM 실험에서 형광공 안정성을 향상시키기 위한 전체적으로 더 나은 OSS인 것으로 나타났다7. 불행히도, PCD를 포함하여 많은 시판되는 OSS 효소는 오염뉴클레아제를함유한다 11. 이러한 오염 물질은 SM 실험에 사용되는 핵산 계 기판의 손상으로 이어질 수 있습니다. 이 작품은 SM 시스템에서 재조합 PCD의 사용을 위한 크로마토그래피 기반 정제 프로토콜을 해명할 것이다. PCD는 ROS가 데이터 수집에 필요한 기판을 손상시키는 모든 실험에 광범위하게 적용할 수 있습니다.
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Protocol
1. 대장균에서 PCD 발현 유도
- 1 μL pVP91A-pcaHG 발현 플라스미드(20 ng/μL, 그림 1A)와20 μL의 E.coli BL21(20 μL 시판 되는 세포, > 2 x 106 cfu/μg 플라스미드)을 튜브에 결합합니다. 혼합 튜브를 가볍게. 튜브를 얼음 에 5 분 놓습니다.
- 30초에 42°C에서 변환을 배치합니다. 그런 다음 얼음 2 분.
- 80 μL SOC 매체 (카타볼라이트 억압이있는 슈퍼 최적의 국물 : 2.5 mM KCl, 10 mM NaCl, 2 % 트립톤, 0.5 % 효모 추출물, 10 mM MgSO4,10 mM MgCl2,20 mM 포도당). 분당 225 회전 (rpm) 37 °C에서 1 시간 동안 흔들어 주세요.
- LB Amp Agar (1L 루리아 국물 한천: 10g NaCl, 10g NaCl, 10g 바토 트립톤, 5 g 효모 추출물, 15 g 한천, 50 μg/mL 암피실린, 10cm 직경 의 페트리 접시 당 25 mL)에 변형 반응을 플레이트.
- 접시를 배양하고 뚜껑을 아래로 향하여 16-18 시간 동안 37 °C에서 배양합니다.
- 50 mL LB 앰프 (1L LB : 10g bacto-트립톤, 10g NaCl, 5 g 효모 추출물, 50 μg / mL 암페어)를 250 mL Erlenmeyer 플라스크에 1 개의 콜로니로 접종하십시오. 225 rpm에서 16-18 시간 동안 37 °C에서 배양하십시오.
- 20 mL 배양체를 1 L LB 암페어로 4L 플라스크로 옮니다. 37°C에서 225rpm에서 흔들어 주세요.
- 모든 h는 배양 OD600(600 nm에서 광학 밀도)을 측정한다. 배양 OD600이 0.5에 가까워지면 측정 빈도를 15분마다 증가시다. 배양물의 원하는 밀도는 0.5 OD600이다.
- 4L 플라스크를 얼음 통으로 옮김으로 옮김을 옮니다. 배양 온도를 줄이기 위해 얼음 욕조에서 플라스크를 소용돌이치십시오.
참고: 세포가 신진 대사 활성 상태로 유지되도록 얼음에 시간을 최소한으로 유지해야합니다. 이상적으로 세포는 10 분 미만얼음에있을 것입니다. - PCD의 성공적인 유도는 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 분석을 분해함으로써 관찰 될 수있다. 튜브에서 유도되지 않은 배양물의 1 mL을 수확한다. 주변 온도에서 마이크로 퍼지에서 14,000 x g에서 샘플을 1 분 회전시면 됩니다. 상급자.
- 150 μL PBS (인산완충 식염수)에서 펠릿 세포를 용해시.
- 2X 로딩 염료(1.2% SDS, 30% 글리세롤, 150 mM Tris-HCl, pH 6.8, 0.0018% 브로모페놀 블루, 15% β-메르카페에탄올)의 동일한 부피를 추가합니다. 샘플을 소용돌이로 철저히 섞어 줍니다.
- 샘플을 3분간 끓인 후 얼음으로 옮김을 옮김을 합니다. 샘플은 향후 분석을 위해 -20°C 냉동고에 보관할 수 있습니다.
참고: PBS는 CaCl2 및 MgCl2의유무에 관계없이 시판됩니다. 많은 실험실은 세포 배양 방법에 대한 CaCl2 및 MgCl2없이 PBS를 가질 것이다. 우리는 여부 CaCl2 및 MgCl2없이PBS와 차이를 발견하지 않았습니다 .
- 4 L 플라스크를 17°C에서 인큐베이터로 180 rpm 흔들어 서 전송합니다. 20분마다 OD600을 계속 모니터링합니다.
- 0.7 OD600에서 0.5 mM 최종 농도 (0.25 M 재고 용액) 및 10 mg /L 암모늄 철 (II) 황산염 헥사 하이드레이트 (Fe (NH4)2(SO4)2,10 mg / mL 스톡 솔루션에 이소 프로필 베타 -D-티오 갈라크 토피라 노사이드 (IPTG)를 추가합니다. PCD 유전자 pcaH 및 pcaG는 IPTG의 첨가에 의해 T5 프로모터로부터 유도된다(도1A). 황산철은 PCD에 의해 구속되며 카테콜 개구 시 산소를 조정하여 촉매 활성에 필요합니다.
- 18시간 동안 17°C에서 180 rpm에서 배양한다.
- 1.2에서와 같이 배양 플라스크를 얼음에 놓습니다. 1.3에서와 같이 SDS-PAGE에 대한 유도 된 세포의 1 mL을 수확합니다.
- 원심 분리에 적합한 병에 세균 배양을 붓습니다. A 1 L 배양은 4 250 mL 원엽 바닥 병에서 원심 분리될 수 있다. 펠렛 배양체를 4°C에서 3000 x g에서 20분 동안 경화하여 초자연적 인 것을 데산트한다. 세균성 액체 폐기물을 적절히 폐기하십시오.
- 1L 배양당 25 mL 콜드 PBS(CaCl2 및 MgCl2)에서 펠릿을 재중단시키는 피펫은 선택사항입니다.
- 재서스펜션을 50 mL 원점 튜브(1L 배양당 150 mL 튜브)로 옮김을 전달합니다. 4 °C에서 20 분 동안 3000 x g에서 세포를 펠렛. 상급체를 장식하고 적절하게 폐기하십시오.
- 10 mL의 리시즘 버퍼 (300 mM NaCl, 50 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 20 mM 이미다졸, 10% 글리세롤, 800 ng/mL 펩스타틴, 1 μg/mL Leupeptin, 및 87.1 μg/mL 페닐메틸설포닐 불소(PMSF)) Dewar 플라스크에서 액체 질소로 재서스펜션을 동결합니다. 시료 튜브를 -80°C 냉동고에 보관합니다. 우리는 활동의 명백한 손실없이 1 년 동안 -80 °C에 저장된 펠릿에서 PCD를 정제했습니다.
- SDS-PAGE에 의해 유도되지 않은 세포와 유도된 세포를 비교한다.
참고: 우리는 PCD 이종화의 유도에 어려움이 없었다. 그러나 시약이 예기치 않게 만료된 경우 정제를 계속하기 전에 유도를 테스트하는 것이 좋습니다.- SDS-PAGE용 플레이트 조립(치수: 7.3cm x 8.3cm x 두께 0.75mm). 스태킹 겔은 1.5 mL 6% 폴리아크릴아미드(6% 아크릴아미드, 125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 0.1% SDS, 0.1% 황황산 암모늄, 0.001% TEMED)이다. 해결 겔은 3.5 mL 12% 폴리아크릴아미드 (12% 아크릴아미드, 375 mM Tris-HCl, pH 8.8, 0.1% SDS, 0.1% 황산 암모늄, 0.001% TEMED)이다. 스태킹 레이어에 10개의 잘 빗을 삽입합니다.
- 유도되지 않은 및 유도된 세균 샘플의 10 μL을 로드합니다. 단백질에 대한 미리 염색된 분자량 마커의 4 μL을 로드합니다(그림1B).
- 16.5 V/cm에서 젤을 약 1 시간. 브로모페놀 블루는 젤의 바닥에 도달해야합니다.
- 젤을 플라스틱 욕조에 쿠마시 블루 얼룩(10% 아세트산, 메탄올 40%, 쿠마시 블루 염료 0.1%)에 놓습니다. 얼룩은 젤을 완전히 담가야합니다. 주위 온도에서 20 분 동안 얼룩. 염색 시 부드럽게 회전하는 것은 선택 사항입니다.
- 용액을 데스테인 (10 % 아세트산, 40 % 메탄올)으로 교체하십시오. 단백질 밴드가 쉽게 보일 때까지 옵션으로 부드러운 회전으로 주변 온도에서 배양하십시오.
- 탈스테인을 탈이온수로 교체하십시오. 세균성 단백질 중에서, 유도된 PCD 소단위는 유도된 세포에서 볼 수 있어야 한다. Hexahistidine 태그 PCD 소단위 pcaH는 28.3 kDa의 분자량을 가지며 pcaG 소부는 22.4 kDa입니다. PCD 하위 단위가 명백하지 않은 경우 새로운 콜로니에서 파생된 새로운 유도를 수행해야 합니다.
2. PCD의 니켈 친화성 크로마토그래피 정제
- 유도 된 세포의 얼음 하나 50 mL 튜브에 해동. 샘플을 완전히 해동하는 데 2-3 시간이 걸릴 수 있습니다.
- 튜브를 얼음 위에 두고 샘플을 1분 동안 30% 진폭으로 초음파 처리하고 1초를 켜고 끄십시오. 테이퍼 마이크로팁(직경 0.125인치) 초음파 처리를 사용합니다. 최대 전력은 400W이며 주파수는 20 kHz이며 1 L 배양 펠릿 당입니다.
- 초음파 처리 후 리소자임이 0.2 mg/mL 최종 농도(10 mg/ml 스톡 솔루션)에 추가하고 4°C에서 30분 동안 얼음을 유지합니다.
- 미리 차가운 폴리 카보네이트 병 (치수 : 25mm x 89mm)에 세균 용해물을 붓습니다. 병은 고정 각도 초원심분리로터와 호환되어야 합니다. 다른 튜브 및/또는 로터를 대체할 수 있지만 최종 중력은 유지되어야 합니다.
- 4 °C에서 120,000 x g에서 60 분 동안 원심 분리기. 세포 파편은 펠릿을 형성합니다. 상급자는 노란색으로 나타날 수 있습니다.
- 펠릿은 PCD의 용해도를 결정하기 위해 후속 SDS-PAGE 분석에 포함될 수있다(도 1B). 10 mL PBS에서 소용돌이로 펠릿을 용해시. 150 μL을 1.5 mL 튜브로 옮김. 1.3에서와 같이 SDS-PAGE에 대한 샘플을 준비합니다.
- 차가운 50mL 원추형 튜브에 상급물을 붓습니다. 볼륨을 기록합니다. 세균성 DNA를 가진 상농제의 오염은 점성 견본을 산출할 수 있습니다. 세균성 게놈 DNA는 컬럼 교류를 막을 수 있었습니다. 초원심분리 단계 2.2는 세균 DNA를 펠렛하기 위해 반복되어야 한다. 이 두 번째 스핀의 펠릿은 쉽게 보이지 않거나 투명할 수 있습니다.
- 500 mL Ni 버퍼 A (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 및 10 % 글리세롤, 800 ng / mL 펩스타틴, 1 μg / mL Leupeptin 및 87.1 μg / mL PMSF) 및 500 mL Ni 버퍼 B (300 mM NaCl, 300 mM NaCl, 300 mM NaCl) 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10% 글리세롤, 800 ng/mL 펩스타틴, 1 μg/mL Leupeptin, 및 87.1 μg/mL PMSF, 250 mM imidazole, pH 8.0). 0.2 μm 기공 필터를 통해 두 Ni 버퍼를 통과시다.
- 샘플, 완충제 및 FPLC(고속 단백질 액상 크로마토그래피) 시스템은 4°C의 냉장실에 있습니다. Ni 버퍼 A와 펌프 A를 세척하고 Ni 버퍼 B를 가진 펌프 B. UV및 전도도가 안정될 때까지 20 mM imidazole (8% Ni 버퍼 B, 92% Ni 버퍼 A)로 시스템을 세척합니다. 우리는 1.0 MPa 압력 한계로 5 mL / min에서 버퍼를 정기적으로 흐르고 있습니다. 유량 및 압력 한계는 사용되는 FPLC 계측기의 사양에 따라 결정되어야 합니다.
- 1.5 mL 니켈 충전 수지 (치수 : 110mm 길이 x 5mm)로 컬럼을 준비하십시오. 수지 결합 용량은 50 mg /mL이며 1 MPa 압력을 견딜 수 있습니다. 컬럼은 정제 전에 4°C에서 부어 보관할 수 있다.
참고: 컬럼의 크기는 더 많은 단백질이 요구되는 경우 유도된 세포의 하나 이상의 50 mL 튜브를 수용하기 위해 비례적으로 증가할 수 있다. 우리는 잔류 단백질이 원하는 단백질을 오염하지 않도록 각 준비에 대한 신선한 열을 선호합니다. 그러나 니켈 수지는 제조업체의 지침에 따라 재활용될 수 있습니다. - 니켈 충전 수지의 컬럼을 FPLC에 부착합니다. 0.5 mL/min에서 92% Ni 버퍼 A 및 8% Ni 버퍼 B(20 mM imidazole)의 20 mL를 열에 0.5 MPa 압력 한계를 실행하여 평형화합니다. 실시간으로 FPLC는 A280 (280 nm UV 흡광도)뿐만 아니라 전도도를 측정해야합니다. 20mL 볼륨이 열을 통과한 후에도 이러한 값이 안정화되지 않으면 버퍼가 안정화될 때까지 버퍼를 흐름합니다.
- 샘플을 0.15 mL/min에서 컬럼(~10mL)에 로드합니다. 압력 한계를 0.5MPa로 설정합니다. 통해 흐름을 수집합니다.
- 20 mM imidazole (92 % Ni 버퍼 A 및 8 % Ni 버퍼 B)에서 20 mL Ni 버퍼로 컬럼을 씻습니다. 분석을 위해 50 mL 튜브에 세척을 유지하십시오. 50% Ni 버퍼 A 및 50% Ni 버퍼 B(125 mM 이미다졸)의 15 mL로 컬럼을 세척합니다. 0.8 mL 부피의 19 분율로 용출을 수집합니다. 15 mL 100% Ni 버퍼 B. 0.2 mL의 추가 75 분획을 수집하여 컬럼을 세척합니다. 일부 PCD 헤테로디머는 50% Ni 버퍼 B 세척에서 용해되지만, 헤테로디머의 대다수는 100% Ni 버퍼 B 세척에서 용해될 것이다.
- 12% SDS-PAGE 젤에서 수집된 분획을 분석하여 PCD의 존재를 확인합니다. 2X 로딩 염료의 동일한 볼륨을 통과, 세척 및 피크 A280 분수에 추가합니다. 3분간 끓입니다. 12% SDS-PAGE 젤 2개를 붓습니다(1.7단계와 같이). 1.7에 기재된 바와 같이 겔 방법을 반복한다.
3. 뉴클레아제 활성 분석
- SDS-PAGE 분석을 기반으로 거의 순수한 PCD를 포함하는 니켈 선호도 분율을 식별합니다. 5 μL 크로마토그래피 분획및 500 ng 3 kb 수퍼코일 플라스미드 pXba+를 반응 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2,0.1 mM DTT)와 50 μL의 최종 부피로 결합합니다.
- 37°C에서 1시간 동안 배양한다.
- 음성 대조군(단백질 첨가 없음) 및 양성 대조군(시판PCD)을 포함한다. 10 μL 스톱 액 (150 mM EDTA, pH 8.0, 0.6 % SDS, 18 % 글리세롤, 0.15 % 오렌지 G)으로 반응을 멈춥니다.
- 시료는 나중에 분석될 수 있도록 -20°C 냉동고에 보관될 수 있다. 임의의 수퍼코일플라스미드는 수퍼코일및 이완된 원 반응 생성물이 아가로즈 겔 전기동동에 의해 해결될 수 있는 한 뉴클레아제 분석에 사용될 수 있다.
- 1X TAE 에티듐 완충액(40 mM Tris-acetate, 1 mMEDTA, 0.5 μg/mL 에티듐 브로마이드)에 120 mL 1% 아가로즈 겔을 겔 캐스트(치수: 15 x 10 cm)에 붓습니다. 15 웰 빗 (잘 크기 : 5mm x 1.5mm)을 사용합니다. 젤이 설정되면 1X TAE 에티듐 버퍼에 담그고.
- 아가로즈 겔에 의한 반응의 30 μL을 분석한다. 약 1 시간 동안 주변 온도에서 10V / cm에서 전기 조어. 오렌지 G 염료 전면은 젤의 끝에 있어야합니다.
- 형광 스캐너를 사용하여 겔의 에티듐 브로마이드 신호를 즉시 이미지화합니다. 3kb 플라스미드를 사용한 경우 가장 느린 밴드는 ~3.5kb에서 이완되고 선형 DNA는 3kb에서 실행되며, 수퍼코일 플라스미드는 ~2kb에서 가장 빠른 이동성을 갖습니다.
- 이미지 분석 소프트웨어로 각 레인의 총 픽셀 볼륨을 계산합니다.
- 수퍼코일, 선형 및 닉 원과 같은 다양한 DNA 종의 픽셀 볼륨을 결정합니다. 이러한 값을 사용하여 각 DNA 종의 백분율을 결정합니다. 예를 들어, 음의 대조군과 비교하여 분획과 연관된 닉크원들의 존재증가는 뉴클레아제의 존재를 나타낸다. 차선에 있는 닉된 원의 픽셀 볼륨은 총 DNA의 픽셀 값으로 나뉩니다. 이 숫자에 100을 곱하여 백분율을 결정합니다.
- SDS-PAGE 분석을 기반으로 거의 순수한 PCD 헤테로디머를 함유하고 감지할 수 없는 뉴클레아제 활성을 최소화하는 두 번째 용출 피크의 분획을 결합합니다. 우리의 전형적인 풀드볼륨은 ~2 mL입니다.
- 샘플을 10kA 분자량 차단으로 원심 필터 장치에 로드합니다. 4 °C에서 40 분 동안 4000 x g에서 스윙 버킷 원심 분리기. 대안적으로 35° 고정각 로터는 4°C에서 20분 동안 7500 x g에서 사용될 수 있다.
- 최종 리텐테이트 부피가 100-200 μL이 될 때까지 원심분리를 반복합니다.
- 필터 유닛을 반전시키고 4°C에서 2분 동안 1000 x g에서 원심분리에 의해 재원분리를 회수합니다.
4. PCD의 크기 배제 크로마토그래피 정제
- 250 mL 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 실행 버퍼 (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 % 글리세롤, 0.1 mM EDTA, 800 ng / mL 펩스타틴, 1 μg / mL Leupeptin, 및 87.1 μg / mL PMS)를 확인하십시오. 완충장치를 0.2 μm 기공 필터를 통과하고 4°C에서 보관한다.
참고: 4°C의 냉장실에서 모든 단계를 수행합니다. SEC 정제는 선택 사항이지만 단백질은 SEC 실행 버퍼에 저장되어야합니다. SEC 정제가 생략된 경우, 재연은 3.6.2로 수집된다. 10 kDa MWCO (분자량 차단) 투석 튜브에서 SEC 버퍼의 1 L에 대해 투석해야 4 °C 하룻밤. - SEC 러닝 버퍼를 0.5mL에서 SEC 러닝 버퍼로 가교된 아가로즈 SEC(크기 배제 크로마토그래피) 컬럼(동전: 10mm x 300 mm; 24 mL 침대 볼륨; 25 - 500 μL 샘플 볼륨; 1.5 MPa 압력 제한; 2 x 106 Da 배제 한계; 1 ~ 300 kDa 분리)을 평형화합니다.
참고: 원하는 대체 크기의 경우 SEC 열을 사용할 수 있습니다. - 농축된 분획을 200 μL 체적 주입 루프에 로드합니다. 샘플을 0.5mL/min로 열에 로드합니다. SEC 해상도는 더 작아짐에 따라 증가합니다. 23 mL SEC 실행 버퍼로 용출하고 250 μL의 94 분획을 수집합니다. SEC 크로마토그램은 PCD 이형형인 단일 A280 피크를 해결해야 합니다. 우리는 PCD가 8.9 mL을 용출하는 것을 발견합니다. 용출 타이밍은 다른 SEC 열에 따라 변경됩니다.
5. PCA 산화 및 뉴클레아제 활성 애서
- PCA 및 뉴클레아제 활성의 산화를 모두 분석하는 반응은 96 웰 플랫 바닥 플레이트에서 수행된다. 조기 촉매를 방지하기 위해 4 °C 냉장실에서 얼음 에 96 웰 플레이트에서 반응을 조립합니다. 50 μL의 최종 부피에 결합: 130 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl2,0.1 mM DTT, 5 mM PCA, 10 ng/mL 슈퍼코일드 pXba +, 및 개별 PCD SEC 분수의 10 μL.
참고: 단백질이 추가시에 촉매를 시작하기 때문에 PCD SEC 분획은 분석 직전에 마지막으로 추가되어야 합니다. - PCA의 PCD 산화는 290 nm (A290)에서PCA의 흡수를 감소시다. 96웰 플레이트를 플레이트 리더의 플레이트 홀더로 37°C의 내부 온도로 전송한다. 플레이트 홀더를 계측기안으로 후퇴시키고 20시간 간격으로 A290을 1시간 동안 측정합니다. 각 독서 전에 악기가 접시 5s를 흔들어 놓게하십시오.
- 1시간 후, 10 μL 스톱 액액(150 mM EDTA, pH 8.0, 0.6% SDS, 18% 글리세롤, 0.15% 오렌지 G)을 첨가하여 반응을 종료한다.
- 3.2단계에서와 같이 아가로즈 겔을 준비하고, 적재하고, 실행한다.
- 3.3단계에서와 같이 아가로즈 겔을 이미지 및 분석한다.
- -80°C에서 장기간 보관할 수 있도록 PCA 산화 활성이 가장 많은 분획을 선택하고 관찰된 뉴클레아제 오염이 없습니다. A280을측정합니다.
- 734,700M-1cm-1의A280 및 소멸 계수(θ280)를사용하여 총 PCD 농도를 계산한다.
- 액체 질소에서 개별 분획을 스냅합니다. -80°C 의 냉동고에 보관하십시오. 또는 활성, 뉴클레아제 없는 분획, 알리쿼트 및 동결을 동일한 방식으로 결합합니다. 우리의 일반적인 수율은 L 배양 당 1-2 mg PCD입니다. SM 실험에서 일반적인 사용은 3 μg PCD이다. 우리는 활동 감소없이 최대 1 년 동안 -80 °C에 저장된 PCD를 사용했습니다.
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Representative Results
시판되는 산소 스캐빈저 PCD는 DNA 뉴클레아제로 자주 오염된다. 뉴클레아제 활성을 오염시키는 것은 형광 연구, 특히 DNA 또는 DNA 상호 작용 단백질을 분석하는 연구에서 가짜 결과를 초래할 수 있습니다. 우리는 재조합 PCD, 헥사히스티딘태그 pcaH 및 pcaG의 이종, 대장균에서 표현될 수 있다는 것을 발견했습니다(도1). 이종은 먼저 니켈 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다(그림 2). PCD는 이미다졸 농도의 2 단계에서 용출됩니다. 크로마토그래피 분획은 SDS-PAGE에 의해 분석됩니다. 거의 순수한 PCD의 분획은 SEC에 의해 농축되고 더욱 정제됩니다(그림 3). SEC 분획은 PCA 산화 활성 및 뉴클레아제 활성 모두에 대해 개별적으로 분석됩니다(그림4). 높은 산화 활성 및 명백한 뉴클레아제 활성을 나타내는 분획은 단백질 농도를 위해 분석되고 실험용 -80°C 냉동고에 보관된다.
그림 1 : 대장균에서PCD의 유도 . (A) pVP91A-pcaHG는 pcaG(α) 및 헥사히스티딘 태그PCaH(β) PCD 소단위로 도시된다. (B) PCD 유도의 대표 SDS-PAGE 젤. 분자량은 왼쪽에 표시됩니다. 28.3 kDa 헥사히스티딘 태그 pcaH와 22.4 kDa pcaG의 동원은 오른쪽에 있습니다. 유도되지 않은 대장균(Un), 유도된 대장균(In), 대장균 용해 및 초원심분리(P), 니켈 컬럼(S)에 적재되는 초원심분리다음의 초원심분리에 따른 펠릿, 니켈 크로마토그래피(Ni) 및 SEC(SE)에 따른 대표적인 분획이다. 이 그림은 이전발행물 12에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: PCD의 니켈 친화성 크로마토그래피 정제. (A) PCD의 니켈 친화성 크로마토그래피의 크로마토그램. A280은 파란색으로 표시되고 Ni 버퍼 B의 백분율 농도는 빨간색으로 표시됩니다. 샘플을 낮은 20 mM imidazole 농도로 적재하였다. 플로우스루(Flw Thr)는 니켈 수지에 결합하지 않은 수용성 세균 단백질을 나타낸다. 컬럼을 20 mM 의 imidazole 완충제의 20 mL로 세척시켰다. 두 번째 15 mL 세척을 125 mM imidazole로 수행했습니다. PCD의 용출은 250 mM imidazole로 수행되었다. 일부 PCD는 125 mM imidazole의 존재에서 용출되었지만, 단백질의 대부분은 250 mM imidazole에서 용출되었다. (B) 니켈 선호도 분획의 대표적인 SDS-PAGE 분석. 부하, 플로우스루(Flw Thr) 및 제1 세척은 PCD의 성공적인 유도, 니켈 수지와 니켈 수지, 및 제1 세척 시 관찰된 최소한의 단백질을 각각 결합하지 않은 수용성 세균 단백질의 성공적인 유도를 보여주었다. 제2 세척 및 용출 단계에 걸쳐 여러 분획이 도시된다. 두 번째 세척의 분획은 PCD 단백질을 포함하지만 검출 가능한 더 높은 분자량 오염 물질을 표시했습니다. 용출 단계에서 분획은 오염 물질이 없는 것으로 나타났다. 분자량은 왼쪽에 표시됩니다. pcaH와 pcaG의 동원은 오른쪽에 표시됩니다. (C) 뉴클레아제 분석의 아가로즈 겔. 니켈 친화도 컬럼 하중, 유동, 세척 및 다중 분획을 뉴클레아제 활성에 대해 시험하였다. 음성 대조군(control)은 단백질을 첨가하지 않은 플라스미드이다. 양성 대조군(PCDa)은DNA 뉴클레아제에 오염된 것으로 알려진 시판되는 PCD이다. DNA 종은 작은 단편 (SF), 수퍼 코일 (SC), 선형 (LN), 닉 원 (NC) 및 닉 이머 (ND)로 오른쪽에 표시됩니다. (D) 아가로즈 겔 뉴클레아제 분석에서 관찰된 다양한 DNA 종의 정량화. 각 레인의 총 픽셀 부피를 측정했습니다. 각 DNA 종의 픽셀 부피는 차선내의 총 픽셀 부피의 백분율로 결정되고 표현되었다. 부정평가는 81.7%,14.4%로 나타났다. 긍부정평가는 46.0%의 유의성이 있는 것으로 나타났다. 하중 및 흐름통과에는 플라스미드를 변환하고 박테리아 DNA를 작은 조각으로 오염시키는 세균성 뉴클레아제가 포함되어 있습니다. 20 mM imidazole에서 첫번째 세척은 또한 선형 및 닉원 의 결과로 중요한 뉴클레아제 활성을 포함하는 것으로 나타났습니다. 분획 4-7은 125 mM에서 의 제2 세척으로부터 또한 상당한 뉴클레아제 활성을 나타냈다(특히, 관측된 선형화된 플라스미드를 생성한 분획 4 및 5). 용출 단계에서 분획(29-38)은 음의 대조군과 더 유사하게 나타났다. 이 예에서, 분수 29-38은 SEC에 의해 결합, 농축 및 추가 정제로 선택되었다. 이 그림은 이전발행물 12에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: PCD의 SEC 정제. (A) 니켈 친화성 크로마토그래피 다음 PCD 분획의 SEC의 크로마토그램. A(280)는 청색으로 표시되고 용출 분획이 표시된다. PCD는 단일 명백한 피크로 SEC에서 용출. (B) SEC 분수의 대표 SDS-PAGE 분석 33-48. 하중은 니켈 친화성 정제에 따른 농축 된 PCD입니다. 분수 33-48은 명백한 SEC 피크에 걸쳐 있습니다. 검출 가능한 오염 물질은 관찰되지 않았습니다. (C) 뉴클레아제 분석의 아가로즈 겔. SEC 부하 및 다중 분획은 뉴클레아제 활성을 시험하였다. 음성 대조군(control)은 단백질을 첨가하지 않은 플라스미드이다. 양성 대조군(PCDa)은DNA 뉴클레아제에 오염된 것으로 알려진 시판되는 PCD이다. DNA 종은 좌측에 수퍼코일(SC), 닉서클(NC), 닉이 있는 이광(ND)으로 표시된다. (D) 아가로즈 겔 뉴클레아제 분석에서 관찰된 다양한 DNA 종의 정량화. 각 레인의 총 픽셀 부피를 측정했습니다. 각 DNA 종의 픽셀 부피는 차선내의 총 픽셀 부피의 백분율로 결정되고 표현되었다. 부정적 대조는 82.1%로 13.7%에 불과했다. 긍부정평가는 64.8%로 크게 증가했다. SEC 하중은 니켈 친화도 정제로부터 분획의 현명한 선택으로 인해 명백한 뉴클레아제 활성을 나타내지 않았다. 유사하게, 분획(33-48)은 음성 대조군과 유사하게 나타났다. 예를 들어, 분수 36은 82.5% 수퍼코일및 13.2% 닉크원이었다. 이 예에서, 분획36 및 37은 향후 실험용 사용을 위해 -80°C 냉동고에 정량화, 동결 및 보관하도록 선택되었다. 이 그림은 이전발행물 12에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: PCD SEC 분획의 PCA 산화 및 뉴클레아제 활성. PCA 산화는 A290에의해 측정되었다. PCD가 PCA 분자를 산화함에 따라 A290이 감소했습니다. PCA 산화는 1시간 동안 매 20s마다 측정되었다. PCD 분획(blue line)을 첨가하지 않은 음성 대조군A는A290에서변화가 없었으며, 이는 PCA 분자가 안정되었음을 나타낸다. 세 가지 대표적인 SEC 분획(빨간색 36개, 주황색 33개, 노란색 39개)의 데이터는 정제된 PCD가 PcA의 산화를 나타내는 A290을감소시켰다는 것을 보여줍니다. 이 그림은 이전발행물 12에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
산소 청소 시스템은 일반적으로 광표백을줄이기 위해 단일 분자 형광 현미경 검사법에 포함3,7,8. 이러한 현미경 기술은 종종 핵산 또는 핵산과 단백질 상호 작용을 관찰하는 데 사용된다1,13,14. 뉴클레아제와 OSS의 오염은 가짜 결과로 이어질 수 있습니다.
GODCAT 및 PCD를 포함하는 시판되는 OSS는, 유의한 뉴클레아제오염(11)을포함하는 것으로 나타났다. PCD를 구입하고 SEC를 사용하여 뉴클레아제오염물질(11)을제거할 수 있다. 그러나, 한 공급 업체에서 상업적으로 사용할 수 있는 PCD의 가격 증가 5 배 그 방법의 출판 후. 이 방법은 고활성, 뉴클레아제 프리 PCD 헤테로디머를 생성하고 1주일 이내에 시행될 수 있다. 우리의 경험에서, 1 L 배양 (1-2 mg)에 의해 생성된 PCD의 양은 2개의 형광 화상 진찰 시스템을 가진 생산적인 실험실에서 실험 (3 μg/실험)의 1 년간을 위해 충분합니다.
유도 효율은 이 방법의 성공의 열쇠입니다. PCD 헤테로디머가 SDS-PAGE에 의해 효율적으로 유도되고 명백하지 않은 경우, 정제는 실패할 것이다. 두 가지 대체 전략을 시도할 수 있습니다. 먼저, 대장균 형질전환판상에 상이한 콜로니로부터 유도를 시도한다. 둘째, BL21로 이전에 성공을 거두었으나 BL21 pLysS와 같은 발현을 위한 대체 대장균 균주를 시도할 수 있다. PCA 산화 분석법의 성공은 분석기를 시작하기 전에 PCD에 기판의 최소한의 노출에 의존한다. 차가운 방에서 얼음에 96 웰 플레이트 반응을 조립하고 판독기에 플레이트를 로드하기 직전에 단백질 샘플을 추가하는 것이 좋습니다.
니켈 친화성 크로마토그래피는 오염된 뉴클레아제 활성없이 순수한 PCD의 분획을 식별하기에 충분할 수 있다. 이 경우 SEC 정제를 제거 할 수 있습니다. 그러나, 니켈 크로마토그래피 분획은 SEC 실행 버퍼에서 4°C에서 하룻밤 사이에 결합및 투석되어야 한다. SEC 실행 버퍼에 존재하는 글리세롤은 -80 °C에서 보관하는 데 중요합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작업은 NIH GM121284 및 AI126742에서 KEY로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | βME |
| 30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Acetic acid, Glacial Certified ACS | Fisherl Chemical | A38C-212 | |
| Agar, Granulated | BD Biosciences | DF0145-17-0 | |
| AKTA FPLC System | GE Healthcare Life Sciences | AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | UFC201024 | 10 kDa MWCO |
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma | F-2262 | |
| Ammonium Persulfate (APS) Tablets | Amresco | K833-100TABS | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract | VWR | 90004-092 | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue | Amresco | 0472-50G | |
| Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate | Bio-Rad | 2240096EDU | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | PBS |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Granulated LB Broth Miller | EMD Biosciences | 1.10285.0500 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250-250G | |
| IPTG | Goldbio | I2481C25 | |
| Leupeptin | Roche | 11017128001 | |
| Lysozyme from Chicken Egg White | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Amresco | 0288-1KG | |
| Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability | Thermo Fisher | ND-2000C | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| Ni-NTA Superflow (100 ml) | Qiagen | 30430 | |
| Novagen BL21 Competent Cells | EMD Millipore | 69-449-3 | SOC media included |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Pepstatin | Gold Biotechnology | P-020-25 | |
| PMSF | Amresco | 0754-25G | |
| Protocatechuic acid | Fisher Scientific | ICN15642110 | PCA |
| Sodium dodecyl sulfate | P212121 | CI-00270-1KG | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devises | ||
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-04 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-02 | |
| Superose 12 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517301 | |
| TEMED | Amresco | 0761-25ML | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager | GE Healthcare Life Sciences | ||
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
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