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Biochemistry

न्यूक्लीज-फ्री ऑक्सीजन स्कैवेंडर प्रोटोकैकेट 3,4-डिऑक्सिकाज़ की अभिव्यक्ति और शुद्धि

Published: November 8, 2019 doi: 10.3791/59599
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Cancer Biology and Genetics, College of Medicine, The Ohio State University

Summary

प्रोटोकेटचुएट 3,4-डाइऑक्सिजन (पीसीडी) अपने सब्सट्रेट प्रोटोकाक्यूटिक एसिड (पीसीए) का उपयोग करके एक जलीय प्रणाली से मुक्त डाइएटॉमिक ऑक्सीजन को एंजाइमेट रूप से हटा सकता है। यह प्रोटोकॉल इस ऑक्सीजन मैला ढोने वाले एंजाइम की अभिव्यक्ति, शुद्धि और गतिविधि विश्लेषण का वर्णन करता है।

Abstract

वास्तविक समय में फ्लोरोफोर लेबल वाले बायोमॉलिक्यूल्स के गतिशील आणविक इंटरैक्शन के अध्ययन में एकल अणु (एसएम) माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जाता है। हालांकि, फ्लोरोफोरस को भंग ऑक्सीजन (ओ2)द्वारा फोटोब्लीचिंग के माध्यम से सिग्नल के नुकसान का खतरा होता है। फोटोब्लीचिंग को रोकने और फ्लोरोफोर जीवनकाल का विस्तार करने के लिए, ओ2को कम करने के लिए ऑक्सीजन सफाई प्रणाली (ओएसएस) कार्यरत हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ओएसएस न्यूक्लीज द्वारा दूषित हो सकता है जो न्यूक्लिक एसिड को नुकसान या नीचा दिखाता है, प्रायोगिक परिणामों की व्याख्या करता है। यहां हम कोई पता लगाने योग्य न्यूक्लीज संदूषण के साथ अत्यधिक सक्रिय स्यूडोमोनास पुटिडा प्रोटोकेटचुएट-3,4-डाइऑक्सिकाज़ (पीसीडी) की अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए एक प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं। पीसीडी सब्सट्रेट प्रोटोकाटेचुइक एसिड (पीसीए) को 3-कार्बोक्सी-सिस, सिस-म्यूकोनिक एसिड में बदलने से प्रतिक्रियाशील ओ2 प्रजातियों को कुशलतापूर्वक हटा सकता है। इस विधि का उपयोग किसी भी जलीय प्रणाली में किया जा सकता है जहां ओ2 डेटा अधिग्रहण में हानिकारक भूमिका निभाता है। यह विधि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीसीडी की तुलना में अत्यधिक सक्रिय, न्यूलीज फ्री पीसीडी के उत्पादन में प्रभावी है।

Introduction

एकल अणु (एसएम) बायोफिजिक्स एक तेजी से बढ़ते क्षेत्र है जिस तरह से हम जैविक घटना को देखो बदल रहा है । इस क्षेत्र में भौतिकी और रसायन विज्ञान के मौलिक कानूनों को जीव विज्ञान से जोड़ने की अनूठी क्षमता है। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी एक बायोफिजिकल मेथड है जो एसएम संवेदनशीलता को हासिल कर सकती है। फ्लोरेसेंस का उपयोग जैव अणुओं का पता लगाने के लिए छोटे कार्बनिक फ्लोरोफोरस या क्वांटम डॉट्स1से जोड़कर किया जाता है । ये अणु फोटोब्लीचिंग अपरिवर्तनीय रूप से2से पहले लेजर से उत्साहित होने पर फोटॉन उत्सर्जित कर सकते हैं । फोटोब्लीचिंग तब होती है जब फ्लोरोसेंट लेबल रासायनिक क्षति से गुजरते हैं जो वांछित तरंगदैर्ध्य2,3पर उत्तेजित करने की उनकी क्षमता को नष्ट कर देता है । जलीय बफर में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओस) की उपस्थिति फोटोब्लीचिंग2,4का प्राथमिक कारण है। इसके अतिरिक्त, आरओएस जैव अणुओं को नुकसान पहुंचा सकता है और एसएम प्रयोगों5,6 में गलत टिप्पणियोंकाकारण बन सकता है। ऑक्सीडेटिव क्षति को रोकने के लिए, ऑक्सीजन सफाई प्रणाली (OSS)काउपयोग3,7,8किया जा सकता है। ग्लूकोज ऑक्सीडेस/कैटालास (GODCAT) प्रणाली ऑक्सीजन8को हटाने में कुशल है, लेकिन यह मध्यवर्ती के रूप में संभावित हानिकारक पेरोक्साइड पैदा करता है । ये एसएम अध्ययनों में रुचि के जैव अणुओं के लिए हानिकारक हो सकते हैं।

वैकल्पिक रूप से, प्रोटोकेटचुएट 3,4 डाइऑक्सिजन (पीसीडी) अपने सब्सट्रेट प्रोटोकाक्यूटिक एसिड (पीसीए)7,9का उपयोग करके एक जलीय समाधान से ओ2 को कुशलतापूर्वक हटा देगा। पीसीडी एक मेटलोएंजाइम है जो पीसीए के समन्वय के लिए नोहेम आयरन का उपयोग करता है और भंग ओ210का उपयोग करके कैटेकोकल रिंग ओपनिंग रिएक्शन को उत्प्रेरक करता है। यह एक कदम प्रतिक्रिया एसएमप्रयोगों 7में फ्लोरोफोर स्थिरता में सुधार के लिए एक समग्र बेहतर OSS दिखाया गया है । दुर्भाग्य से, पीसीडी सहित कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ओएसएस एंजाइमों में11को दूषित किया जाता है। ये संदूषक एसएम प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले न्यूक्लिक एसिड-आधारित सब्सट्रेट्स को नुकसान पहुंचा सकते हैं। यह काम एसएम सिस्टम में रीकॉम्बिनेंट पीसीडी के उपयोग के लिए एक क्रोमेटोग्राफी आधारित शुद्धिकरण प्रोटोकॉल को स्पष्ट करेगा। पीसीडी मोटे तौर पर किसी भी प्रयोग पर लागू किया जा सकता है जहां आरओस डेटा अधिग्रहण के लिए आवश्यक सब्सट्रेट्स को नुकसान पहुंचा रहा है।

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Protocol

1. ई. कोलाई में पीसीडी अभिव्यक्ति प्रेरित

  1. एक ट्यूब में 1 μL pVP91A-pcaHG PCD अभिव्यक्ति प्लाज्मिड (20 एनजी/μL, चित्रा 1A)और 20 μL E.coli BL21 (20 μL व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोशिकाओं, > 2 x 106 cfu/μg प्लाज्मिड) को मिलाएं । ट्यूब को मिलाने के लिए झटका दें। ट्यूब को बर्फ 5 मिन पर रखें।
  2. 30 एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर परिवर्तन रखें। फिर बर्फ 2 मिन।
  3. 80 माइक्रोनएल एसओसी मीडिया जोड़ें (कैटाबोलाइट दमन के साथ सुपर इष्टतम शोरबा: 2.5 एमएम केसीएल, 10 एमएम एनएसीएल, 2% ट्राइप्टोन, 0.5% खमीर निकालने, 10 एमएम एमजीएसओ4,10 एमएम एमजीसीएल2,20 एम एम ग्लूकोज)। 1 घंटे के लिए प्रति मिन (आरपीएम) 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 225 क्रांतियों पर हिलाएं।
  4. एलबी एम्प एगर (1एल लुरिया शोरबा आगर: 10 ग्राम नासीएल, 10 ग्राम बैक्टो-ट्राइप्टोन, 5 ग्राम खमीर निकालने, 15 ग्राम आगर, 50 μg/mL ampicillin; 25 मिलीग्राम प्रति 10 सेमी व्यास पेट्री डिश) पर परिवर्तन प्रतिक्रिया प्लेट करें।
  5. प्लेट को इनक्यूबेट करें, ढक्कन नीचे का सामना करना पड़ रहा है, 16-18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  6. एक कॉलोनी के साथ 250 मीटर एल एर्लेनमेयर फ्लास्क में 50 एमएल एल एएमपी (1एल एल एल: 10 ग्राम बैक्टो-ट्राइप्टोन, 10 ग्राम नैल, 5 ग्राम खमीर निकालने, 50 μg/mL ampicillin) का टीका लगाया गया है। 225 आरपीएम पर 16-18 घंटे झटकों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  7. 1 एल एल पौंड Amp के साथ एक 4 एल फ्लास्क करने के लिए 20 mL संस्कृति हस्तांतरण। 37 डिग्री सेल्सियस पर 225 आरपीएम पर हिला।
  8. हर एच संस्कृति OD600 (600 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व) को मापने। संस्कृति ओडी600 के रूप में 0.5 के पास, हर 15 न्यूनतम करने के लिए माप की आवृत्ति में वृद्धि हुई है। संस्कृति का वांछित घनत्व 0.5 ओडी600है।
  9. बर्फ के एक बिन के लिए 4L फ्लास्क स्थानांतरण। संस्कृति के तापमान को कम करने के लिए बर्फ स्नान में फ्लास्क को भंवर करें।
    नोट: बर्फ पर समय को न्यूनतम रखा जाना चाहिए ताकि कोशिकाएं चयापचय रूप से सक्रिय रहें। आदर्श रूप से कोशिकाएं 10 मिन से कम बर्फ पर होंगी।
  10. पीसीडी के सफल प्रेरण सोडियम डोडेसिल सल्फेट पॉलीएक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) विश्लेषण को डेन्टकरद्वारा देखा जा सकता है। एक ट्यूब में अप्रेरित संस्कृति की फसल 1 मिलीकर। परिवेश के तापमान पर एक माइक्रोफ्यूज में 14,000 x ग्राम पर नमूना 1 न्यूनतम स्पिन। अधिस्थान को डिडेंट कर दिया।
    1. 150 माइक्रोन पीबीएस (फॉस्फेट बफर लवलाइन) में पैलेट्ड कोशिकाओं को घुलना-देना।
    2. 2X लोडिंग डाइ (1.2% एसडी, 30% ग्लाइरोल, 150 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 6.8, 0.0018% ब्रोमोफेनॉल ब्लू, 15%-मर्काप्टोथेनॉल) की बराबर मात्रा जोड़ें। नमूना भंवर अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए।
    3. 3 मिन के लिए नमूना उबालें और बर्फ में स्थानांतरित करें। नमूना भविष्य के विश्लेषण के लिए एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत किया जा सकता है।
      नोट: पीबीएस सीएसीएल2 और एमजीसीएल2के साथ या उसके बिना व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है । कई प्रयोगशालाओं में सेल संस्कृति विधियों के लिए सीएसीएल2 और एमजीसीएल2 के बिना पीबीएस होगा। हमें सीएसीएल2 और एमजीसीएल2के साथ या उसके बिना पीबीएस के साथ कोई अंतर नहीं मिला है ।
  11. 180 आरपीएम मिलाते हुए 17 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर के लिए 4 एल फ्लास्क स्थानांतरित करें। हर 20 मिन में ओडी600 की निगरानी जारी रखें।
  12. 0.7 ओडी600 में आइसोप्रोपाइल-बीटा-डी-थिओगलकटोपिरानोसाइड (आईपीटीजी) में 0.5 एम अंतिम एकाग्रता (0.25 मीटर स्टॉक समाधान) और 10 मिलीग्राम/एल अमोनियम आयरन (II) सल्फेट हेक्साहाइड्रेट (फे (एनएच4)2(एसओ4)2,10 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक सॉल्यूशन) जोड़ें। पीसीडी जीन पीसीएएच और पीसीएजी को आईपीटीजी(चित्रा 1ए)के अलावा टी5 प्रमोटर से प्रेरित किया जाता है। आयरन सल्फेट पीसीडी से बंधा हुआ है और कैटइकोल खोलने के दौरान ऑक्सीजन का समन्वय करके उत्प्रेरक गतिविधि के लिए आवश्यक है।
  13. 18 घंटे के लिए 17 डिग्री सेल्सियस पर 180 आरपीएम पर संस्कृति हिला।
  14. 1.2 में बर्फ में संस्कृति फ्लास्क रखें। 1.3 में एसडी-पेज के लिए प्रेरित कोशिकाओं की फसल 1 mL।
  15. केंद्रीकरण के लिए उपयुक्त बोतलों के लिए जीवाणु संस्कृति डालो। एक 1 एल संस्कृति 4 250 mL शंकुनीचे बोतलों में केंद्रीकृत किया जा सकता है। 3000 x जी डेडेंट द सुपरनेटेंट पर 20 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति को गोली। बैक्टीरियल लिक्विड वेस्ट को उचित ढंग से निपटाएं।
  16. 25 मिलीग्राम ठंड पीबीएस (सीएसीएल2 और एमजीसीएल2 वैकल्पिक हैं) प्रति 1 एल संस्कृति में छर्रों को फिर से निलंबित करने के लिए पिपेट।
  17. पुनर्सस्पेंशन को 50 मिलीएल शंकुट्यूब (प्रति 1 एल संस्कृति 1 50 मिलीएल ट्यूब) में स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए 3000 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली। अधिस्थान को डिडेंट करें और उचित रूप से निपटाएं।
  18. लिसिस बफर (300 एमएम नैल) के 10 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, पाइपिंग द्वारा 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.5, 20 एमएम इमिडाजोल, 10% ग्लाइसेरोल, 800 एनजी/एमएल पेप्स्टेटिन, 1 μg/mL Leupeptin, और 87.1 μg/mL फिनाइलथाइलसुल्फोनिल फ्लोराइड (पीएमएसएफ)) पाइपिंग द्वारा। एक देवर फ्लास्क में तरल नाइट्रोजन के साथ पुनर्सस्पेंशन फ्रीज। सैंपल ट्यूब को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें। हमने गतिविधि का कोई स्पष्ट नुकसान नहीं होने के साथ एक वर्ष के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत छर्रों से पीसीडी को शुद्ध किया है।
  19. एसडीएस-पेज द्वारा अप्रेरित और प्रेरित कोशिकाओं की तुलना करें।
    नोट: हमें पीसीडी हेटेरोमर को शामिल करने में कोई दिक्कत नहीं हुई है । हालांकि, हम किसी भी अभिकर्ता की अप्रत्याशित रूप से समाप्त होने की स्थिति में शुद्धिकरण जारी रखने से पहले प्रेरण का परीक्षण करने की सलाह देते हैं।
    1. एसडीएस-पेज (आयाम: 7.3 सेमी x 8.3 सेमी x 0.75 मिमी मोटी) के लिए प्लेटें इकट्ठा करें। स्टैकिंग जेल 1.5 एमएल 6% पॉलीएक्रिलैमाइड (6% एक्रिलैमाइड, 125 एम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 6.8, 0.1% एसडीएस, 0.1% अमोनियम परसल्फेट, 0.001% टेमएड) है। हल करने वाला जेल 3.5 एमएल 12% पॉलीएक्रिलैमाइड (12% एक्रिलैमाइड, 375 एम एम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.8, 0.1% एसडीएस, 0.1% अमोनियम परसल्फेट, 0.001% टेमएड) है। स्टैकिंग परत में 10 अच्छी तरह से कंघी डालें।
    2. अप्रेरित और प्रेरित बैक्टीरियल नमूनों के 10 μL लोड। प्रोटीन के लिए प्रीदाग्ड आणविक वजन मार्कर के 4 μL लोड(चित्रा 1बी)।
    3. इलेक्ट्रोफोरीज़ 16.5 V/सेमी पर लगभग 1 घंटे जेल। ब्रोसोफेनोल ब्लू को जेल के नीचे तक पहुंचना चाहिए।
    4. प्लास्टिक के टब में जेल को कूमासी ब्लू दाग (10% एसिटिक एसिड, 40% मेथनॉल, 0.1% कूमासी ब्लू डाये) में रखें। दाग पूरी तरह से जेल विसर्जित कर देना चाहिए। 20 न्यूनतम के लिए परिवेश के तापमान पर दाग। धुंधला के दौरान कोमल रोटेशन वैकल्पिक है।
    5. समाधान को डिस्टेन (10% एसिटिक एसिड, 40% मेथनॉल) से बदलें। वैकल्पिक कोमल रोटेशन के साथ परिवेश के तापमान पर इनक्यूबेट जब तक प्रोटीन बैंड आसानी से दिखाई दे रहे हैं ।
    6. डिस्टेनाइज्ड पानी से डिस्टेनको बदलें। बैक्टीरियल प्रोटीन के बीच, प्रेरित पीसीडी उपइकाइयों को प्रेरित कोशिकाओं में दिखाई देना चाहिए। हेक्साहिस्टिडीन टैग पीसीडी सबयूनिट पीसीएएच का आणविक वजन 28.3 केडीए और पीसीएजी सबयूनिट 22.4 केडीए है। यदि पीसीडी उपइकाइयां स्पष्ट नहीं हैं, तो उपन्यास कॉलोनी से प्राप्त एक नया प्रेरण किया जाना चाहिए।

2. पीसीडी की निकल एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी शुद्धि

  1. बर्फ पर गल प्रेरित कोशिकाओं की एक 50 mL ट्यूब। सैंपल को पूरी तरह गल जाने में 2-3 घंटे का समय लग सकता है।
  2. बर्फ पर ट्यूब रखते हुए, 1 मिनट के लिए 30% आयाम पर नमूना सोनीकेट, साइकिल चालन 1 एस पर और बंद । एक पतला माइक्रोटिप (व्यास 0.125 इंच) सोनिकेटर का उपयोग करें। अधिकतम शक्ति 400 डब्ल्यू है और आवृत्ति 20 किलोवाट और प्रति 1 एल संस्कृति गोली है।
  3. सोनिकेशन के बाद, 0.2 मिलीग्राम/एमएल अंतिम एकाग्रता (10 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक सॉल्यूशन) में लिसोज़िम जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए बर्फ पर रखें।
  4. बैक्टीरियल लिसैट को प्री-चिल्ड पॉलीकार्बोनेट बोतल (आयाम: 25 मिमी x 89 मिमी) में डालें। बोतल एक निश्चित कोण अल्ट्रासेंट्रोफ्यूज रोटर के साथ संगत होनी चाहिए। अन्य ट्यूबों और/या रोटरको को प्रतिस्थापित किया जा सकता है, लेकिन अंतिम गुरुत्वाकर्षण बल को बनाए रखा जाना चाहिए ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 120,000 x ग्राम पर 60 मिन के लिए सेंट्रलाइज। सेलुलर मलबा एक गोली बनेगी। अधिस्थान पीला दिखाई दे सकता है।
    1. पीसीडी(चित्रा 1बी)की घुलनशीलता निर्धारित करने के लिए पैलेट को बाद के एसडी-पेज विश्लेषण में शामिल किया जा सकता है। 10 एमएल पीबीएस में भंवर द्वारा गोली को घुलना। 150 माइक्रोन को 1.5 मीटर ट्यूब पर स्थानांतरित करें। 1.3 के रूप में SDS-पेज के लिए नमूना तैयार करें।
  6. एक ठंडा 50 mL शंकुट्यूब के लिए अधिष्ठाता डालो। वॉल्यूम पर ध्यान दें। बैक्टीरियल डीएनए के साथ अधिनेत का संदूषण एक चिपचिपा नमूना निकल सकता है। बैक्टीरियल जीनोमिक डीएनए कॉलम प्रवाह को अवरुद्ध कर सकता है । अल्ट्रासेंट्रोयूजेशन स्टेप 2.2 को बैक्टीरियल डीएनए को पैलेट करने के लिए दोहराया जाना चाहिए। इस दूसरी स्पिन से एक गोली आसानी से दिखाई नहीं दे सकती है या पारदर्शी हो सकती है।
  7. 500 मीटर नी बफर ए (300 एमएम एनसीएल, 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.5, और 10% ग्लाइरोल, 800 एनजी/एमएल पेप्स्टेटिन, 1 μg/mL Leupeptin, और 87.1 μg/mL PMSF) और 500 mL नी बफर बी (300 मीटर एनओएम एलओएल, 50 एम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.5, 10% ग्लाइसेरोल, 800 एनजी/एमएल पेप्स्टेटिन, 1 μg/mL ल्यूपेप्टिन, और 87.1 μg/mL PMSF, 250 mM इमिडाजोल, पीएच 8.0)। 0.2 माइक्रोन पोर फिल्टर के माध्यम से दोनों नी बफ़र्स पास करें।
  8. नमूना, बफ़र्स, और एफपीएलसी (फास्ट प्रोटीन लिक्विड क्रोमेटोग्राफी) सिस्टम 4 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटेड कमरे में हैं। नी बफर ए के साथ पंप ए और नी बफर बी के साथ पंप बी को धोएं। यूवी और चालकता स्थिर होने तक सिस्टम को 20 एमएम इमिडाजोल (8% नी बफर बी, 92% नी बफर ए) के साथ धोएं। हम नियमित रूप से 1.0 एमपीए दबाव सीमा के साथ 5 mL/min पर बफ़र्स प्रवाहित करते हैं। प्रवाह दर और दबाव सीमा का उपयोग किए गए एफएलसी उपकरण के विनिर्देशों द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए।
  9. 1.5 mL निकल-चार्ज किए गए रेसिन (आयाम: 110 मिमी लंबा x 5 मिमी) के साथ एक कॉलम तैयार करें। रेसिन बाइंडिंग कैपेसिटी 50 एमजी/एमजी है और 1 एमपीए प्रेशर बर्दाश्त कर सकती है। शुद्धिकरण से पहले एक कॉलम डालकर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
    नोट: यदि अधिक प्रोटीन की आवश्यकता हो तो प्रेरित कोशिकाओं की एक से अधिक 50 एमएआर ट्यूब को समायोजित करने के लिए कॉलम का आकार आनुपातिक रूप से बढ़ाया जा सकता है। हम यह सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक तैयारी के लिए एक ताजा कॉलम पसंद करते हैं कि कोई अवशिष्ट प्रोटीन हमारे वांछित प्रोटीन को दूषित न करे। हालांकि, निकेल रेजिन निर्माता के निर्देशों के अनुसार पुनर्नवीनीकरण किया जा सकता है।
  10. एफएलसी में निकेल चार्ज किए गए रेसिन का कॉलम अटैच करें। 92% नी बफर ए और 8% नी बफर बी (20 एमएम इमिडाजोल) के 20 मीटर को कॉलम के माध्यम से 0.5 एमपीए दबाव सीमा के साथ 0.5 एमपीए दबाव सीमा के साथ समान रूप से चलाएं। वास्तविक समय में एफएलसी को280 (280 एनएम यूवी अवशोषण) के साथ-साथ चालकता को भी मापना चाहिए। यदि ये मान 20 मिलीआर मात्रा के बाद स्थिर नहीं हुए हैं, तो कॉलम के माध्यम से पारित हो गए हैं, तब तक बफ़र्स प्रवाहित करें जब तक कि वे स्थिर न हो जाएं।
  11. 0.15 mL/min पर कॉलम (~ 10 mL) के लिए नमूना लोड करें। 0.5 एमपीए के लिए दबाव सीमा निर्धारित करें। प्रवाह के माध्यम से ले लीजिए।
  12. 20 mM इमिडाजोल (92% नी बफर ए और 8% नी बफर बी) पर 20 mL नी बफर के साथ कॉलम धोएं। विश्लेषण के लिए 50 मीटर ट्यूब में वॉश बनाए रखें। कॉलम को 50% नी बफर ए और 50% नी बफर बी (125 एम इमिडाजोल) के 15 एमएल से धोएं। 0.8 mL मात्रा के 19 अंशों में एल्यूशन लीजिए। कॉलम को 15 mL 100% नी बफर बी के साथ धोएं 0.2 mL के अतिरिक्त 75 अंश एकत्र करें। कुछ पीसीडी विषमता 50% नी बफर बी वॉश में इल्यूट करेंगे, लेकिन हेट्रोमर का बहुमत 100% नी बफर बी वॉश में होगा।
  13. पीसीडी की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए 12% एसडी-पेज जैल पर एकत्र अंशों का विश्लेषण करें। 2X लोडिंग रंग के बराबर मात्रा के माध्यम से प्रवाह में जोड़ें, धोने, और एक280 अंश चोटी। बर्फ में 3 मिन ट्रांसफर के लिए उबाल लें। दो 12% एसडीएस-पेज जैल डालो (कदम 1.7 के रूप में)। 1.7 में वर्णित जेल विधि को दोहराएं।

3. न्यूक्लीज गतिविधि परख

  1. एसडीएस-पेज विश्लेषण के आधार पर, निकल आत्मीयता अंशों की पहचान करें जिनमें लगभग शुद्ध पीसीडी होता है। रिएक्शन बफर (50 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.5, 100 एमएम एनएसीएल, 5 एमएम एमजीसीएल2,0.1 एमएम डीटीटी) में 5 माइक्रोनल क्रोमेटोग्राफी अंश और 500 एनजी 3 केबी सुपरकॉग्निल्ड प्लाज्मिड पीसीबीए+ को 50 माइक्रोन की अंतिम मात्रा के साथ मिलाएं।
    1. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    2. एक नकारात्मक नियंत्रण (कोई जोड़ा प्रोटीन) और एक सकारात्मक नियंत्रण (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीसीडी) शामिल हैं । 10 माइक्रोन स्टॉप सॉल्यूशन (150 एमएम ईटीए, पीएच 8.0, 0.6% एसडी, 18% ग्लाइसेरोल, 0.15% ऑरेंज जी) के साथ प्रतिक्रिया बंद करें।
    3. नमूनों को बाद में विश्लेषण करने के लिए एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखा जा सकता है। किसी भी सुपरकॉग्निल्ड प्लाज्मिड का उपयोग न्यूक्लीज परख में तब तक किया जा सकता है जब तक कि सुपरकॉग्निल्ड और आराम से सर्कल रिएक्शन उत्पादों को अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा हल किया जा सकता है।
  2. 1X टीएई एफिडियम बफर (40 एम ट्रिस-एसीटेट, 1 एमएम ईटीए, 0.5 μg/mL ethidium ब्रोमाइड) में एक 120 एमएल 1% अगारोज जेल डालो एक जेल कास्ट (आयाम: 15 x 10 सेमी) में। 15 अच्छी तरह से कंघी (अच्छी तरह से आयाम: 5 मिमी x 1.5 मिमी) का उपयोग करें। जब जेल सेट हो जाता है, तो इसे 1X टीएई एटिडिनियम बफर में विसर्जित करें।
  3. अगारोज जेल द्वारा प्रतिक्रियाओं के 30 μL का विश्लेषण करें। लगभग 1 घंटे के लिए परिवेश के तापमान पर 10 V/cm पर इलेक्ट्रोफोरीज । ऑरेंज जी डाया सामने जेल के अंत में होना चाहिए।
  4. जेल के एथिडियम ब्रोमाइड सिग्नल को तुरंत इमेज करने के लिए फ्लोरेसेंस स्कैनर का इस्तेमाल करें। यदि 3 केबी प्लाज्मिड का उपयोग किया गया था, तो सबसे धीमी बैंड ~ 3.5 केबी पर आराम से सर्कल होगा, रैखिक डीएनए 3 केबी पर चलेगा, और सुपरकॉइलप्लाज्मिड में ~ 2 केबी में सबसे तेज गतिशीलता होगी।
    1. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ प्रत्येक लेन के कुल पिक्सेल मात्रा की गणना करें।
    2. विभिन्न डीएनए प्रजातियों की पिक्सेल मात्रा निर्धारित करें, जैसे सुपरकॉइल, रैखिक और निकड सर्कल। प्रत्येक डीएनए प्रजाति के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए इन मूल्यों का उपयोग करें। उदाहरण के लिए, नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में एक अंश से जुड़े निकेड सर्कलकी उपस्थिति में वृद्धि नक्लीज की उपस्थिति को इंगित करती है। एक लेन में निकेड सर्कल्स की पिक्सेल वॉल्यूम को कुल डीएनए के पिक्सल वैल्यू से बांटा गया है । इस संख्या को 100 से गुणा करके एक प्रतिशत निर्धारित करें।
  5. दूसरी एल्यूशन चोटी से अंशों को मिलाएं जिनमें एसडी-पेज विश्लेषण के आधार पर लगभग शुद्ध पीसीडी हेटेरोडोर होते हैं और अज्ञेय न्यूक्लीज गतिविधि के लिए न्यूनतम होते हैं। हमारी ठेठ पूल्ड मात्रा ~ 2 मिलीएल है।
  6. 10 केडीए आणविक वजन कटऑफ के साथ एक अपकेंद्रित्र फिल्टर यूनिट के लिए नमूना लोड करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 40 00 x ग्राम के लिए 4000 x ग्राम पर एक झूल बाल्टी अपकेंद्रित्र में अपकेंद्रित्र। वैकल्पिक रूप से 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मीटर के लिए 7500 x ग्राम पर 35 डिग्री तय कोण रोटर का उपयोग किया जा सकता है।
    1. केंद्रीकरण दोहराएं जब तक कि अंतिम रिटेनटेट वॉल्यूम 100-200 माइक्रोन न हो जाए।
    2. फिल्टर यूनिट को उलटकर 2 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिन के लिए 1000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज्ड करके रिटेनटेट ठीक करें।

4. पीसीडी का आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी शुद्धि

  1. 250 मीटर आकार बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी (एसईसी) रनिंग बफर (100 एमएम नैसीएल, 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.5, 10% ग्लाइसॉल, 0.1 एम एम ईटीए, 800 एनजी/एमएल पेप्स्टेटिन, 1 μg/mL Leupeptin, और 87.1 μg/mL PMSF) बनाओ। बफर को 0.2 माइक्रोन पोर फिल्टर के माध्यम से पास करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रेफ्रिजरेटेड कमरे में सभी कदम प्रदर्शन करते हैं। एसईसी शुद्धि वैकल्पिक है, लेकिन प्रोटीन एसईसी रनिंग बफर में संग्रहीत किया जाना चाहिए। यदि एसईसी शुद्धि को छोड़ दिया जाता है, तो रिटेनटेट 3.6.2 में एकत्र किया जाता है। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 केडीए एमडब्ल्यूसीओ (आणविक वजन कट ऑफ) डायलिसिस ट्यूबिंग में एसईसी बफर के 1 एल के खिलाफ डायलिसिस किया जाना चाहिए।
  2. एक क्रॉस-लिंक्ड एगरोज एसईसी (आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी) कॉलम (डिमिशियन: 10 मिमी x 300 मिमी; 24 एमएल बेड वॉल्यूम; 25 -500 माइक्रोन नमूना मात्रा; 1.5 एमपीए दबाव सीमा; 2 x 10 6 डीए अपवर्जन सीमा; 1 से 300 केडीए अलगाव) एसईसी रनिंग बफर के साथ 0.5 mL/min पर एक क्रॉस-लिंक्ड एग्रोज एसईसी (आकार बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी) कॉलम (डिमिशियन्स: 10 मिमी x 300 मिमी; 24 एमएल बिस्तर की मात्रा; 2 x 106 डीए अपवर्जन सीमा; 1 से 300 केडीए अलगाव) को समरूप करें।
    नोट: यदि वांछित वैकल्पिक आकार एसईसी कॉलम का उपयोग किया जा सकता है।
  3. केंद्रित अंशों को 200 माइक्रोन वॉल्यूम इंजेक्शन लूप पर लोड करें। 0.5 mL/मिन पर नमूना कॉलम में लोड करें। एसईसी संकल्प छोटे लोड की मात्रा के साथ बढ़ जाता है। 23 mL सेकंड रनिंग बफर के साथ Elute और 250 μL के 94 अंशों को इकट्ठा। एसईसी क्रोमेटोग्राम को एक एकलए 280 चोटी का समाधान करना चाहिए जो पीसीडी हेटेरोमर है। हम पाते हैं कि पीसीडी 8.9 मिलीएल को कम करता है। एल्यूशन टाइमिंग वैकल्पिक एसईसी कॉलम के साथ बदल जाएगी।

5. पीसीए ऑक्सीकरण और न्यूक्लीज गतिविधि परख

  1. पीसीए और न्यूलीज गतिविधि के ऑक्सीकरण दोनों परख के लिए प्रतिक्रियाएं 96-अच्छी तरह से फ्लैट-बॉटम प्लेट में की जाती हैं। समय से पहले उत्प्रेरक को रोकने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस ठंडे कमरे में बर्फ पर 96 अच्छी तरह से प्लेट में प्रतिक्रियाओं को इकट्ठा करें। 50 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में गठबंधन करें: 130 एमएम एनसीएल, 50 एम एम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.5, 5 एमएम एमजीसीएल2,0.1 एमएम डीटीटी, 5 एमएम पीसीए, 10 एनजी/एमएल सुपरकॉल्ड प्लाज्मिड पीएक्सबीए +, और 10 माइक्रोन ऑफ इंडिविजुअल पीसीडी एसईसी अंश।
    नोट: पीसीडी एसईसी अंशों को विश्लेषण से तुरंत पहले और तुरंत जोड़ा जाना चाहिए क्योंकि प्रोटीन इसके अलावा के समय उत्प्रेरक शुरू हो जाएगा।
  2. पीसीए के पीसीडी ऑक्सीकरण के परिणामस्वरूप पीसीए का 290 एनएम (ए290)पर कम अवशोषित होता है। 96 अच्छी प्लेट को प्लेट रीडर के प्लेट धारक को 37 डिग्री सेल्सियस के आंतरिक तापमान पर स्थानांतरित करें। प्लेट धारक को साधन में वापस लें और 1 घंटे के लिए 20 एस अंतराल पर290 को मापें। प्रत्येक पढ़ने से पहले यंत्र थाली 5 एस हिला है।
  3. 1 घंटे के बाद, 10 माइक्रोन स्टॉप सॉल्यूशन (150 मीटर ईटीए, पीएच 8.0, 0.6% एसडीएस, 18% ग्लाइसेरोल, 0.15% ऑरेंज जी) जोड़कर प्रतिक्रियाओं को समाप्त करें।
  4. 3.2 चरण में एक अगारोज जेल तैयार करें, लोड करें और चलाएं।
  5. 3.3 चरण में अगारोज जेल की छवि और विश्लेषण करें।
  6. सबसे पीसीए ऑक्सीकरण गतिविधि के साथ अंशों का चयन करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक भंडारण के लिए कोई मनाया नकोलीज संदूषण। ए280को मापें ।
  7. 734,700 एम-1सेमी-1के ए280 और विलुप्त होने वाले गुणांक (ε280)का उपयोग करके कुल पीसीडी एकाग्रता की गणना करें।
  8. स्नैप तरल नाइट्रोजन में व्यक्तिगत अंशों को फ्रीज करता है। एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें। वैकल्पिक रूप से, सक्रिय, न्यूक्लीज-मुक्त अंशों, एलिकोट और उसी तरह फ्रीज को मिलाएं। हमारी विशिष्ट उपज प्रति एल संस्कृति 1-2 मिलीग्राम पीसीडी है। एसएम प्रयोग में विशिष्ट उपयोग 3 μg पीसीडी है। हमने गतिविधि में कोई कमी नहीं होने के साथ 1 वर्ष तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत पीसीडी का उपयोग किया है।

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Representative Results

व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ऑक्सीजन मेहतर पीसीडी अक्सर डीएनए न्यूकलीज से दूषित होता है। न्यूक्लीज गतिविधि को दूषित करने से फ्लोरोसेंट अध्ययनों में नकली परिणाम हो सकते हैं, विशेष रूप से अध्ययन जो डीएनए या डीएनए इंटरैटिंग प्रोटीन का विश्लेषण करते हैं । हमने पाया है कि रेकॉम्बिनेंट पीसीडी, हेक्साहिस्टिडीन टैग पीसीएएच और पीसीएजी का एक विषमता, ई. कोलाई(चित्रा 1)में व्यक्त किया जा सकता है। हेटेरोडिमर को पहले निकल एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी(चित्रा 2)द्वारा शुद्ध किया जाता है। पीसीडी इमिडाजोल सांद्रता के 2 चरणों में जटिल है। एसडीएस-पेज द्वारा क्रोमेटोग्राफी अंशों का विश्लेषण किया जाता है। लगभग शुद्ध पीसीडी के अंश केंद्रित होते हैं और एसईसी(चित्रा 3)द्वारा आगे शुद्ध होते हैं। एसईसी अंशों को पीसीए ऑक्सीकरण गतिविधि और न्यूलीज गतिविधि(चित्रा 4)दोनों के लिए व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण किया जाता है। उच्च ऑक्सीकरण गतिविधि प्रदर्शित करने वाले अंश और कोई स्पष्ट न्यूक्लीज गतिविधि प्रोटीन एकाग्रता के लिए नहीं की जाती है और प्रयोगात्मक उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखा जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: ई. कोलाईमें पीसीडी का शामिल । (A) pVP91A-pcaHG पीसीएजी (α) और हेक्साहिस्टिडीन-टैग पीसीएएच (ए) पीसीडी सबयूनिट्स के साथ दिखाया गया है। (ख) प्रतिनिधि एसडी-पीसीडी इंडक्शन के पेज जेल । बाईं ओर आणविक वजन दर्शाया जाता है। 28.3 केडीए हेक्साहिस्टिडीन-टैग ्डपीसीए एच और 22.4 केडीए पीसीएजी की गतिशीलता दाईं ओर है। अप्रेरित ई. कोलाई (संयुक्त राष्ट्र), ई. कोलाई लिसिस और अल्ट्रासेंटरिफुगेशन (पी) के बाद गोली प्रेरित, अल्ट्रासेंट्रिफेशन के बाद अधिनायक को निकल कॉलम (एस), निकेल क्रोमेटोग्राफी (एनआई) के बाद प्रतिनिधि अंश, और एसईसी (एसई) के बाद प्रतिनिधि अंश के लिए लोड किया जाएगा। इस आंकड़े को पिछलेप्रकाशन 12से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: पीसीडी की निकल एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी शुद्धि। (क) पीसीडी की निकल एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी का क्रोमेटोग्राम। एक२८० नीले रंग में दिखाया गया है और नी बफर बी की प्रतिशत एकाग्रता लाल रंग में दिखाया गया है । सैंपल कम 20 एमएम इमिडाजोल कंसंट्रेशन में लोड किया गया था। फ्लोथ्रू (Flw Thr) घुलनशील बैक्टीरियल प्रोटीन है कि निकल रेसिन के लिए बाध्य नहीं किया दिखाता है । कॉलम को 20 एम इमिडाजोल बफर के 20 एमएल के साथ धोया गया था। 125 एम इमिडाजोल के साथ दूसरा 15 मिलीएम वॉश किया गया। पीसीडी के एल्यूशन को 250 एमएम इमिडाजोल के साथ किया गया। कुछ पीसीडी 125 mM इमिडाजोल की उपस्थिति में eluted, लेकिन प्रोटीन के बहुमत 250 mM इमिडाजोल में eluted. (ख) प्रतिनिधि SDS-निकल आत्मीयता अंशों के पृष्ठ विश्लेषण । लोड, फ्लोथ्रू (Flw Thr), और पहले धोने ने पीसीडी के सफल इंडक्शन, घुलनशील बैक्टीरियल प्रोटीन को दिखाया जो निकल रेसिन को बांध नहीं था, और पहले धोने के दौरान देखे गए न्यूनतम प्रोटीन क्रमशः। दूसरे धोने और एल्यूशन चरणों में कई अंश दिखाए जाते हैं। दूसरे धोने से अंश पीसीडी प्रोटीन शामिल है, लेकिन यह भी पता लगाने योग्य उच्च आणविक वजन संदूषक प्रदर्शित । एलुशन स्टेप के अंश संदूषकों से मुक्त दिखाई दिए । बाईं ओर आणविक वजन दिखाया गया है। पीसीएएच और पीसीएजी की गतिशीलता दाईं ओर दिखाई जाती है। (ग) न्यूलीज परख का अगारोज जेल । निकल एफ़िनिटी कॉलम लोड, फ्लोथ्रू, वॉश और कई अंशों का परीक्षण न्यूस्लीज गतिविधि के लिए किया गया था। एक नकारात्मक नियंत्रण (नियंत्रण) जोड़ा प्रोटीन के बिना प्लाज्मिड है। एक सकारात्मक नियंत्रण (पीसीडीए)एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीसीडी है जिसे डीएनए न्यूकलीज से दूषित होने के लिए जाना जाता है। डीएनए प्रजातियों को सही पर छोटे टुकड़े (एसएफ), सुपरकॉल्ड (एससी), रैखिक (एलएन), निकेड सर्कल (नेकां) और निकेड डिमर (एनडी) के रूप में इंगित किया जाता है। (D) अगारोज जेल न्यूक्लीज परख में देखी गई विभिन्न डीएनए प्रजातियों की मात्रा। प्रत्येक लेन की कुल पिक्सेल मात्रा मापी गई थी। प्रत्येक डीएनए प्रजाति के पिक्सेल की मात्रा निर्धारित की गई थी और लेन में कुल पिक्सेल मात्रा के प्रतिशत के रूप में व्यक्त की गई थी। नकारात्मक नियंत्रण 14.4% निकेड सर्कल के साथ 81.7% सुपरकॉइल था। सकारात्मक नियंत्रण 46.0% nicked हलकों की एक महत्वपूर्ण वृद्धि प्रदर्शित की. लोड और प्रवाह के माध्यम से बैक्टीरियल न्यूकलीज निहित है जो प्लाज्मिड और दूषित बैक्टीरिया डीएनए को छोटे टुकड़ों में परिवर्तित करता है। 20 एमएम इमिडाजोल में पहले धोने में भी महत्वपूर्ण न्यूक्लीज गतिविधि दिखाई दी, जिसके परिणामस्वरूप रैखिक और निकड सर्कल होते हैं। 125 mm इमिडाजोल में दूसरे वॉश से 4-7 अंशों ने महत्वपूर्ण न्यूक्लीज गतिविधि (विशेष रूप से, अंश 4 और 5 प्रदर्शित किए गए हैं जो देखी गई रैखिकीकृत प्लाज्मिड उत्पन्न करते हैं)। एल्यूशन स्टेप से 29-38 अंश नकारात्मक नियंत्रण के समान दिखाई दिए। इस उदाहरण में, अंश 29-38 को संयुक्त, केंद्रित और एसईसी द्वारा आगे शुद्ध करने के लिए चुना गया था। इस आंकड़े को पिछलेप्रकाशन 12से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: पीसीडी का एसईसी शुद्धिकरण। (क) निकेल एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी के बाद पीसीडी अंशों के एसईसी का क्रोमेटोग्राम। ए280 नीले रंग में दिखाया गया है और एल्यूशन अंशों को इंगित किया जाता है। पीसीडी एसईसी से एक स्पष्ट चोटी के रूप में उभरा। (ख) एसईसी अंशों का प्रतिनिधि एसडीएस-पेज विश्लेषण 33-48। लोड निकल आत्मीयता शुद्धि के बाद केंद्रित पीसीडी है। अंश 33-48 स्पष्ट सेकंड चोटी अवधि । कोई पता लगाने योग्य संदूषकनहीं नहीं देखा गया । (ग) न्यूलीज परख का अगारोज जेल । एसईसी लोड और कई अंशों का परीक्षण न्यूलीज गतिविधि के लिए किया गया था। एक नकारात्मक नियंत्रण (नियंत्रण) जोड़ा प्रोटीन के बिना प्लाज्मिड है। एक सकारात्मक नियंत्रण (पीसीडीए)एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीसीडी है जिसे डीएनए न्यूकलीज से दूषित होने के लिए जाना जाता है। डीएनए प्रजातियों को सुपरकॉडिलेटेड (एससी), निकेड सर्कल (नेकां) और निकेड डिमर (एनडी) के रूप में बाईं ओर इंगित किया जाता है । (D) अगारोज जेल न्यूक्लीज परख में देखी गई विभिन्न डीएनए प्रजातियों की मात्रा। प्रत्येक लेन की कुल पिक्सेल मात्रा मापी गई थी। प्रत्येक डीएनए प्रजाति के पिक्सेल की मात्रा निर्धारित की गई थी और लेन में कुल पिक्सेल मात्रा के प्रतिशत के रूप में व्यक्त की गई थी। नकारात्मक नियंत्रण केवल 13.7% निकेड सर्कल के साथ 82.1% सुपरकॉइल था। सकारात्मक नियंत्रण 64.8% nicked हलकों की एक महत्वपूर्ण वृद्धि प्रदर्शित की। एसईसी लोड निकल आत्मीयता शुद्धि से अंशों की विवेकपूर्ण पसंद के कारण कोई स्पष्ट nuclease गतिविधि प्रदर्शित की । इसी तरह, अंश 33-48 नकारात्मक नियंत्रण के समान दिखाई दिया। उदाहरण के लिए, अंश 36 82.5% सुपरकॉइन्ड और 13.2% निकड सर्कल था। इस उदाहरण में, अंश 36 और 37 को क्वांटिफाइड, फ्रोजन और भविष्य के प्रयोगात्मक उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखा गया था। इस आंकड़े को पिछलेप्रकाशन 12से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: पीसीए ऑक्सीकरण और पीसीडी एसईसी अंशों की नग्न गतिविधि। पीसीए ऑक्सीकरण एक290द्वारा मापा गया था . जैसे ही पीसीडी ने पीसीए अणु को ऑक्सीकृत किया, ए290 की कमी आई। पीसीए ऑक्सीकरण 1 घंटे के लिए हर 20 एस मापा गया था । कोई जोड़ा पीसीडी अंश (ब्लू लाइन) के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण एक२९०में कोई परिवर्तन नहीं दिखाया, पीसीए अणु का संकेत स्थिर था । तीन प्रतिनिधि एसईसी अंशों से डेटा (लाल रंग में ३६, नारंगी में ३३, पीले रंग में ३९) से पता चलता है कि शुद्ध पीसीडी एक२९०कम, पीसीए के ऑक्सीकरण का संकेत है । इस आंकड़े को पिछलेप्रकाशन 12से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

ऑक्सीजन स्कैलिंग सिस्टम आमतौर पर फोटोब्लीचिंग3,7,8को कम करने के लिए एकल अणु फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी में शामिल होते हैं . इन माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग अक्सर न्यूक्लिक एसिड या प्रोटीन इंटरैक्शन को न्यूक्लिक एसिड1,13,14के साथ देखने के लिए किया जाता है । न्यूक्लीज के साथ ओएसएसएस के संदूषण से नकली परिणाम हो सकते हैं।

गोडकैट और पीसीडी सहित व्यावसायिक रूप से उपलब्ध OSSS, महत्वपूर्ण nuclease संदूषण11शामिल करने के लिए दिखाया गया है । पीसीडी खरीदना और न्यंध संदूक11को हटाने के लिए एसईसी को नियोजित करना संभव है । हालांकि, एक विक्रेता से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीसीडी की कीमत उस विधि के प्रकाशन के बाद 5 गुना बढ़ गई। यह विधि एक अत्यधिक सक्रिय, न्यूलीज मुक्त पीसीडी हेटेरोडिमर उत्पन्न करती है और 1 सप्ताह के भीतर किया जा सकता है। हमारे अनुभव में, एक 1 एल संस्कृति (1-2 मिलीग्राम) द्वारा उत्पन्न पीसीडी की मात्रा 2 फ्लोरोसेंट इमेजिंग सिस्टम के साथ एक उत्पादक प्रयोगशाला में प्रयोगों (3 μg/प्रयोग) के एक वर्ष के लिए पर्याप्त है ।

प्रेरण दक्षता इस विधि की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। यदि पीसीडी विषमताकोड़ी को एसडीएस-पेज द्वारा कुशलतापूर्वक प्रेरित और स्पष्ट नहीं किया जाता है, तो शुद्धि असफल हो जाएगी। दो वैकल्पिक रणनीतियों की कोशिश की जा सकती है । सबसे पहले, ई. कोलाई परिवर्तन प्लेट पर एक अलग कॉलोनी से शामिल करने का प्रयास करें। दूसरा, हम BL21 के साथ पिछली सफलता मिली है, लेकिन अभिव्यक्ति के लिए एक वैकल्पिक ई. कोलाई तनाव, जैसे BL21 pLysS, की कोशिश की जा सकती है । पीसीए ऑक्सीकरण परख की सफलता परख शुरू करने से पहले पीसीडी के लिए सब्सट्रेट के न्यूनतम जोखिम पर निर्भर करती है। यह अत्यधिक एक ठंडे कमरे में बर्फ पर ९६ अच्छी तरह से थाली प्रतिक्रियाओं को इकट्ठा करने और पाठक के लिए थाली लोड होने से पहले तुरंत प्रोटीन नमूना जोड़ने की सिफारिश की है ।

निकल एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी शुद्ध पीसीडी के अंशों की पहचान करने के लिए पर्याप्त हो सकती है जिसमें कोई दूषित न्यूक्लीज गतिविधि नहीं है। इस मामले में, एसईसी शुद्धि को खत्म करना संभव है। हालांकि, निकल क्रोमेटोग्राफी अंशों को संयुक्त किया जाना चाहिए और एसईसी रनिंग बफर में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर डायलिसि किया जाना चाहिए। एसईसी रनिंग बफर में मौजूद ग्लाइसेरोल -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए महत्वपूर्ण है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच जीएम 121284 और एआई 126742 ने सीके को सपोर्ट किया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 βME
30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 Bio-Rad 161-0156
Acetic acid, Glacial Certified ACS Fisherl Chemical A38C-212
Agar, Granulated BD Biosciences DF0145-17-0
AKTA FPLC System GE Healthcare Life Sciences AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore UFC201024 10 kDa MWCO
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma F-2262
Ammonium Persulfate (APS) Tablets Amresco K833-100TABS
Ampicillin Amresco 0339-25G
Bacto Tryptone BD Biosciences DF0123173
BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract VWR 90004-092
BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) Sigma-Aldrich B6755-500G
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coomassie Brilliant Blue Amresco 0472-50G
Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate Bio-Rad 2240096EDU
DTT P212121 SV-DTT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML Sigma-Aldrich D8537-500ML PBS
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Granulated LB Broth Miller EMD Biosciences 1.10285.0500
Hi-Res Standard Agarose AGTC Bioproducts AG500D1
Imidazole Sigma-Aldrich I0250-250G
IPTG Goldbio I2481C25
Leupeptin Roche 11017128001
Lysozyme from Chicken Egg White Sigma-Aldrich L6876-1G
Magnesium Chloride Hexahydrate Amresco 0288-1KG
Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability Thermo Fisher ND-2000C
NaCl P212121 RP-S23020
Ni-NTA Superflow (100 ml) Qiagen 30430
Novagen BL21 Competent Cells EMD Millipore 69-449-3 SOC media included
Orange G Fisher Scientific 0-267
Pepstatin Gold Biotechnology P-020-25
PMSF Amresco 0754-25G
Protocatechuic acid Fisher Scientific ICN15642110 PCA
Sodium dodecyl sulfate P212121 CI-00270-1KG
SpectraMax M2 Microplate Reader Molecular Devises
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL Thermo Fisher Scientific 09-741-04
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL Thermo Fisher Scientific 09-741-02
Superose 12 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 17517301
TEMED Amresco 0761-25ML
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager GE Healthcare Life Sciences
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086

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References

  1. Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).
  2. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  3. Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
  4. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).
  5. Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).
  6. Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).
  7. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  8. Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).
  9. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
  10. Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
  11. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
  12. Senavirathne, G., Lopez, M. A. Jr, Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
  13. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
  14. Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).

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बायोकेमिस्ट्री इश्यू 153 क्रोमेटोग्राफी प्रोटोकैकेट-3,4-डाइऑक्सीजनेज (पीसीडी) न्यूक्लीज संदूषण प्रोटोकाटेचुइक एसिड (पीसीए) प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां ऑक्सीजन स्कैलपसिस्टम (ओएसएस)
न्यूक्लीज-फ्री ऑक्सीजन स्कैवेंडर प्रोटोकैकेट 3,4-डिऑक्सिकाज़ की अभिव्यक्ति और शुद्धि
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Messer, R. K., Lopez Jr., M. A., Senavirathne, G., Yoder, K. E. Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase. J. Vis. Exp. (153), e59599, doi:10.3791/59599 (2019).

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