Summary

التعبير وتنقيه الأكسجين خاليه من النيوداز الزبال بروتوكاتيتشواتي 3 ، 4-ديوكسيجيناسي

Published: November 08, 2019
doi:

Summary

بروتوكاتيتشواتي 3, 4-ديوكسيجيناسي (PCD) يمكن انزيمي أزاله الأكسجين ثنائي الذرة الحرة من نظام مائي باستخدام الركيزة بروتوكاتيتشويك حمض (PCA). يصف هذا البروتوكول التعبير ، وتنقيه ، وتحليل النشاط لهذا الانزيم الكسح الأوكسجين.

Abstract

ويستخدم المجهر جزيء واحد (SM) في دراسة التفاعلات الجزيئية الديناميكية من فلوكوفيري المسمية الجزيئات الحيوية في الوقت الحقيقي. ومع ذلك ، فان الفلوروبيورس عرضه لفقدان الاشاره عن طريق الرشح بواسطة الأكسجين المذاب (O2). لمنع الارتشاح الضوئي وأطاله عمر الفلوفيبيوم ، يتم استخدام أنظمه المسح بالأكسجين (OSS) لتقليل O2. وقد تكون البرمجيات المتاحة تجاريا ملوثه بالأحماض النووية التي تلحق ضررا أو تحللا ، وتفسر النتائج التجريبية تفسيرا محيرا. هنا نقوم بالتفصيل بروتوكول للتعبير وتنقيه الزائفة النشطة للغاية putida بروتوكاتيتشواتي-3 ، ديوكسيجيناسي (PCD) مع عدم وجود تلوث النواز قابل للكشف. يمكن PCD أزاله بكفاءة O2 الأنواع التفاعلية عن طريق تحويل الركيزة حمض بروتوكاتيتشويك (PCA) إلى 3-كربوكسي كومنولث الدول المستقلة ، وحمض كومنولث الدول المستقلة-muconic. ويمكن استخدام هذا الأسلوب في اي نظام مائي حيث O2 يلعب دورا ضارا في الحصول علي البيانات. هذا الأسلوب هو فعال في إنتاج النشطة للغاية ، النواز الحرة PCD بالمقارنة مع PCD المتاحة تجاريا.

Introduction

جزيء واحد (SM) الفيزياء الحيوية هو حقل ينمو بسرعة تغيير الطريقة التي ننظر فيها إلى الظواهر البيولوجية. هذا المجال لديه القدرة الفريدة لربط القوانين الاساسيه للفيزياء والكيمياء إلى علم الاحياء. المجهر الفلوري هو الطريقة البيوفيزيائية واحده التي يمكن ان تحقق حساسية SM. يستخدم الفلوري للكشف عن الجزيئات الحيوية عن طريق ربطها بالفلور العضوية الصغيرة أو النقاط الكمية1. هذه الجزيئات يمكن ان تنبعث منها الفوتونات عندما متحمس باشعه الليزر قبل التسرب الضوئي لا رجعه فيه2. يحدث الرشح الضوئي عندما تخضع الملصقات الفلورية للضرر الكيميائي الذي يدمر قدرتها علي الاثاره عند الموجه الموجية المطلوبة2،3. وجود أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في العازلة المائية هي السبب الرئيسي لتسرب الصور2،4. بالاضافه إلى ذلك ، روس يمكن ان تتلف الجزيئات الحيوية ويؤدي إلى ملاحظات خاطئه في التجارب SM5،6. لمنع الضرر التاكسدي ، ويمكن استخدام أنظمه المسح الأوكسجين (OSS)3،7،8. نظام اكسيداز الجلوكوز/catalase (GODCAT) هو فعال في أزاله الأكسجين8، ولكنه ينتج الأكاسيد الفوقية الضارة المحتملة كوسيطه. قد تكون هذه الاضرار إلى الجزيئات الحيوية للاهتمام في دراسات SM.

بدلا من ذلك ، بروتوكاتيتشواتي 3, 4 ديوكسيجيناسي (PCD) سوف يزيل بكفاءة O2 من محلول مائي باستخدام الركيزة بروتوكاتيتشويك حمض (PCA)7,9. PCD هو الانزيم الفلزي الذي يستخدم الحديد اللاهيمي لتنسيق PCA وتحفيز حلقه الكاتهول رد فعل الافتتاح باستخدام المذاب O210. ويظهر هذا التفاعل خطوه واحده ليكون أفضل OSS عموما لتحسين الاستقرار فلوكوفيري في تجارب SM7. لسوء الحظ ، تحتوي العديد من الانزيمات OSS المتاحة تجاريا ، بما في ذلك PCD ، تلوث النوكليميس11. ويمكن ان تؤدي هذه الملوثات إلى تلف الركائز المستندة إلى الأحماض النووية المستخدمة في تجارب SM. سيوضح هذا العمل بروتوكول تنقيه يستند إلى الفصل اللوني لاستخدام PCD المؤتلف في أنظمه SM. يمكن تطبيق PCD علي نطاق واسع علي اي تجربه حيث تتلف الركائز اللازمة للحصول علي البيانات.

Protocol

1. الحث علي التعبير PCD في e. كولاي الجمع بين 1 μl pVP91A pcahg PCD التعبير البلازميد (20 نانوغرام/μl ، الشكل 1ا) و 20 μl من e. القولونية BL21 (20 μl الخلايا المتاحة تجاريا ، > 2 × 106 كفو/ميكروغرام البلازميد) في أنبوب. نفض الغبار الأنبوب لخلط. وضع الأنبوب علي الجليد 5 دق?…

Representative Results

المتاحة تجاريا الأوكسجين الزبال PCD غالبا ما تكون ملوثه بنواه الحمض النووي. تلوث النشاط النيوداز يمكن ان يؤدي إلى نتائج زائفه في الدراسات الفلورية ، وخاصه الدراسات التي تحلل الحمض النووي أو الحمض النووي التفاعل البروتينات. وقد وجدنا ان PCD المؤتلف ، وهو مغاير من hexahistidine الم…

Discussion

وعاده ما يتم تضمين أنظمه المسح الأوكسجين في جزيء واحد المجهر المجهري للحد من التصوير الضوئي3,7,8. وغالبا ما تستخدم هذه التقنيات المجهرية لمراقبه الأحماض النووية أو تفاعلات البروتين مع الأحماض النووية1،13?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة GM121284 و AI126742 إلى KEY.

Materials

2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 βME
30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 Bio-Rad 161-0156
Acetic acid, Glacial Certified ACS Fisherl Chemical A38C-212
Agar, Granulated BD Biosciences DF0145-17-0
AKTA FPLC System GE Healthcare Life Sciences AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore UFC201024 10 kDa MWCO
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma F-2262
Ammonium Persulfate (APS) Tablets Amresco K833-100TABS
Ampicillin Amresco 0339-25G
Bacto Tryptone BD Biosciences DF0123173
BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract VWR 90004-092
BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) Sigma-Aldrich B6755-500G
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coomassie Brilliant Blue Amresco 0472-50G
Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate Bio-Rad 2240096EDU
DTT P212121 SV-DTT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML Sigma-Aldrich D8537-500ML PBS
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Granulated LB Broth Miller EMD Biosciences 1.10285.0500
Hi-Res Standard Agarose AGTC Bioproducts AG500D1
Imidazole Sigma-Aldrich I0250-250G
IPTG Goldbio I2481C25
Leupeptin Roche 11017128001
Lysozyme from Chicken Egg White Sigma-Aldrich L6876-1G
Magnesium Chloride Hexahydrate Amresco 0288-1KG
Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability Thermo Fisher ND-2000C
NaCl P212121 RP-S23020
Ni-NTA Superflow (100 ml) Qiagen 30430
Novagen BL21 Competent Cells EMD Millipore 69-449-3 SOC media included
Orange G Fisher Scientific 0-267
Pepstatin Gold Biotechnology P-020-25
PMSF Amresco 0754-25G
Protocatechuic acid Fisher Scientific ICN15642110 PCA
Sodium dodecyl sulfate P212121 CI-00270-1KG
SpectraMax M2 Microplate Reader Molecular Devises
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL Thermo Fisher Scientific 09-741-04
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL Thermo Fisher Scientific 09-741-02
Superose 12 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 17517301
TEMED Amresco 0761-25ML
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager GE Healthcare Life Sciences
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086

References

  1. Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).
  2. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  3. Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
  4. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).
  5. Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).
  6. Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).
  7. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  8. Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).
  9. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
  10. Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
  11. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
  12. Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
  13. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
  14. Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).

Play Video

Cite This Article
Messer, R. K., Lopez Jr., M. A., Senavirathne, G., Yoder, K. E. Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase. J. Vis. Exp. (153), e59599, doi:10.3791/59599 (2019).

View Video