Summary

Выражение и очищение Nuclease-бесплатный кислород Scavenger Протокатечуат 3,4-Диоксигеназы

Published: November 08, 2019
doi:

Summary

Протокатчуат 3,4-диоксигеназа (PCD) может ферментативно удалить свободный диатомический кислород из ваневой системы с помощью своего субстрата протокатчуйской кислоты (PCA). Этот протокол описывает экспрессию, очистку и анализ активности этого фермента очистки кислорода.

Abstract

Единая молекула (SM) микроскопия используется в изучении динамических молекулярных взаимодействий флюорофора помечены биомолекулы в режиме реального времени. Тем не менее, фторофоры склонны к потере сигнала через фотоотбеление растворенного кислорода (O2). Для предотвращения фотоотбеления и продления срока службы фторофора, системы очистки кислорода (OSS) используются для уменьшения O2. Коммерчески доступные ПСО могут быть загрязнены нуклеазами, которые повреждают или ухудшают нуклеиновой кислоты, сбивая с толку интерпретацию экспериментальных результатов. Здесь мы подробно протокол для выражения и очистки высокоактивных Pseudomonas putida протокатечуат-3,4-диоксигеназы (PCD) без каких-либо обнаруживаемых загрязнения нуклеазы. PCD может эффективно удалить реактивные O2 видов путем преобразования субстрата протокатчуйской кислоты (PCA) в 3-карбокси-цис, cis-muconic кислоты. Этот метод может быть использован в любой водной системе, где O2 играет пагубную роль в получении данных. Этот метод эффективен в производстве высокоактивных, нуклеаза бесплатно PCD по сравнению с коммерчески доступных PCD.

Introduction

Биофизика одной молекулы (SM) является быстро растущим полем, меняющим то, как мы смотрим на биологические явления. Эта область обладает уникальной способностью связывать фундаментальные законы физики и химии с биологией. Флуоресцентная микроскопия является одним из биофизических методов, которые могут достичь чувствительности СМ. Флуоресценция используется для обнаружения биомолекул, связывая их с небольшими органическими флюорофорами или квантовыми точками1. Эти молекулы могут излучать фотоны, когда возбужденных лазерами до фотоотбелевания необратимо2. Фотоотбеление происходит, когда флуоресцентные этикетки проходят химические повреждения, которые разрушают их способность возбуждать на желаемой длине волны2,3. Присутствие реактивных видов кислорода (ROS) в вавном буфере являются основной причиной фотоотбелевания2,4. Кроме того, ROS может повредить биомолекулы и привести к ошибочным наблюдениям в SM экспериментов5,6. Для предотвращения окислительного повреждения можно использовать системы очистки кислорода (OSS)3,7,8. Глюкоза оксидаза / каталазы (GODCAT) система эффективна при удалении кислорода8, но она производит потенциально опасных перекиси в качестве промежуточных. Они могут нанести ущерб биомолекулам, представляющим интерес в исследованиях СМ.

Кроме того, протокатчуат 3,4 диоксигеназы (PCD) будет эффективно удалить O2 из вогового раствора с помощью субстрата protocatechuic кислоты (PCA)7,9. PCD является металлоэнзим, который использует nonheme железа для координации PCA и катализировать катехиз омрачаемого кольца открытия реакции с помощью растворенного O210. Это один шаг реакции показано, что в целом лучше OSS для улучшения стабильности фторофора в SM экспериментов7. К сожалению, многие коммерчески доступные ферменты OSS, включая ПХД, содержат загрязняющие нуклеазы11. Эти загрязняющие вещества могут привести к повреждению субстратов на основе нуклеиновой кислоты, используемых в экспериментах с СМ. Эта работа позволит разъяснить протокол очистки на основе хроматографии для использования рекомбинантных PcD в системах SM. PCD может быть широко применен к любому эксперименту, где ROS повреждает субстраты, необходимые для получения данных.

Protocol

1. Индуцировать выражение PCD в кишечной палочке Объедините 1 l pVP91A-pcaHG PCD выражение плазмида (20 нг/Зл, Рисунок 1A) и 20 Зл E.coli BL21 (20 л коммерчески доступных клеток, 2 х 106 cfu/qsmid) в трубке. Флик трубки для смешивания. Поместите трубку на лед 5 мин. По…

Representative Results

Коммерчески доступный кислородный мусорщик PCD часто загрязнен нуклеазой ДНК. Загрязнение нуклеаза деятельности может привести к ложным результатам в флуоресцентных исследований, в частности, исследования, которые анализируют ДНК или ДНК взаимодействующих белков. М?…

Discussion

Системы очистки кислорода обычно включаются в одну молекулу флуоресценции микроскопии, чтобы уменьшить фотоотбеление3,7,8. Эти методы микроскопии часто используются для наблюдения нуклеиновых кислот или белковых взаимодействий с нук?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана NIH GM121284 и AI126742 в KEY.

Materials

2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 βME
30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 Bio-Rad 161-0156
Acetic acid, Glacial Certified ACS Fisherl Chemical A38C-212
Agar, Granulated BD Biosciences DF0145-17-0
AKTA FPLC System GE Healthcare Life Sciences AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore UFC201024 10 kDa MWCO
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma F-2262
Ammonium Persulfate (APS) Tablets Amresco K833-100TABS
Ampicillin Amresco 0339-25G
Bacto Tryptone BD Biosciences DF0123173
BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract VWR 90004-092
BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) Sigma-Aldrich B6755-500G
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coomassie Brilliant Blue Amresco 0472-50G
Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate Bio-Rad 2240096EDU
DTT P212121 SV-DTT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML Sigma-Aldrich D8537-500ML PBS
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Granulated LB Broth Miller EMD Biosciences 1.10285.0500
Hi-Res Standard Agarose AGTC Bioproducts AG500D1
Imidazole Sigma-Aldrich I0250-250G
IPTG Goldbio I2481C25
Leupeptin Roche 11017128001
Lysozyme from Chicken Egg White Sigma-Aldrich L6876-1G
Magnesium Chloride Hexahydrate Amresco 0288-1KG
Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability Thermo Fisher ND-2000C
NaCl P212121 RP-S23020
Ni-NTA Superflow (100 ml) Qiagen 30430
Novagen BL21 Competent Cells EMD Millipore 69-449-3 SOC media included
Orange G Fisher Scientific 0-267
Pepstatin Gold Biotechnology P-020-25
PMSF Amresco 0754-25G
Protocatechuic acid Fisher Scientific ICN15642110 PCA
Sodium dodecyl sulfate P212121 CI-00270-1KG
SpectraMax M2 Microplate Reader Molecular Devises
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL Thermo Fisher Scientific 09-741-04
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL Thermo Fisher Scientific 09-741-02
Superose 12 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 17517301
TEMED Amresco 0761-25ML
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager GE Healthcare Life Sciences
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086

References

  1. Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).
  2. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  3. Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
  4. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).
  5. Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).
  6. Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).
  7. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  8. Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).
  9. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
  10. Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
  11. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
  12. Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
  13. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
  14. Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).

Play Video

Cite This Article
Messer, R. K., Lopez Jr., M. A., Senavirathne, G., Yoder, K. E. Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase. J. Vis. Exp. (153), e59599, doi:10.3791/59599 (2019).

View Video