Summary

Expression und Reinigung von Nuklease-freier Sauerstofffänger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Published: November 08, 2019
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Summary

Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) kann mit seinem Substrat Protocatechuic Säure (PCA) enzymatisch freien diatomischen Sauerstoff aus einem wässrigen System entfernen. Dieses Protokoll beschreibt die Expressions-, Reinigungs- und Aktivitätsanalyse dieses Sauerstoff-Aufräumenzyms.

Abstract

Die Einzelmolekülmikroskopie (SM) wird bei der Untersuchung dynamischer molekularer Wechselwirkungen von Fluorophor-markierten Biomolekülen in Echtzeit eingesetzt. Fluorophore sind jedoch anfällig für Signalverluste durch Photobleichung durch gelösten Sauerstoff (O2). Um Photobleichungen zu verhindern und die Lebensdauer des Fluorophors zu verlängern, werden Sauerstoff-Aufräumsysteme (OSS) eingesetzt, um O2zu reduzieren. Kommerziell erhältliche OSS können durch Nukleasen kontaminiert sein, die Nukleinsäuren schädigen oder abbauen, was die Interpretation experimenteller Ergebnisse verwirrend. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Expression und Reinigung von hochaktiven Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) ohne nachweisbare Nukleasekontamination. PCD kann reaktiveO2-Arten effizient entfernen, indem das Substrat Protocatechuinsäure (PCA) in 3-Carboxy-cis,cis-Muconinsäure umgestellt wird. Diese Methode kann in jedem wässrigen System verwendet werden, bei dem O2 eine nachteilige Rolle bei der Datenerfassung spielt. Diese Methode ist effektiv bei der Herstellung hochaktiver, nukleasefreier PCD im Vergleich zu handelsüblichen PCD.

Introduction

Die Biophysik von Einzelmolekülen (SM) ist ein schnell wachsendes Feld, das die Art und Weise verändert, wie wir biologische Phänomene betrachten. Dieses Feld hat die einzigartige Fähigkeit, grundlegende Gesetze der Physik und Chemie mit der Biologie zu verknüpfen. Fluoreszenzmikroskopie ist eine biophysikalische Methode, die SM-Empfindlichkeit erreichen kann. Fluoreszenz wird verwendet, um Biomoleküle zu erkennen, indem sie mit kleinen organischen Fluorophoren oder Quantenpunkten1verbunden werden. Diese Moleküle können Photonen emittieren, wenn sie durch Laservor dem ireversibel photobleichen2. Photobleaching tritt auf, wenn die fluoreszierenden Etiketten chemischen Schäden unterzogen werden, die ihre Fähigkeit zerstören, bei der gewünschten Wellenlänge2,3zu erregen. Das Vorhandensein von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in wässrigen Puffer sind eine primäre Ursache für Photobleichmittel2,4. Darüber hinaus kann ROS Biomoleküle schädigen und zu fehlerhaften Beobachtungen in SM-Experimenten5,6führen. Zur Vorbeugung von oxidativen Schäden können Sauerstoffräumsysteme (OSS) verwendet werden3,7,8. Das Glukoseoxidase/Kataalase-System (GODCAT) ist effizient bei der Entfernung von Sauerstoff8, produziert aber potenziell schädliche Peroxide als Zwischenprodukte. Diese können Biomoleküle namto schädigen, die in SM-Studien von Interesse sind.

Alternativ wird Protocatechuat 3,4 Dioxygenase (PCD)o2 effizient aus einer wässrigen Lösung mit seinem Substrat Protocatechuic Säure (PCA)7,9entfernen. PCD ist ein Metalloenzym, das Nicht-Häm-Eisen verwendet, um PCA zu koordinieren und die Katechol-Ringöffnungsreaktion mit gelöstem O210zu katalysieren. Diese einstufige Reaktion zeigt sich als insgesamt besseres OSS zur Verbesserung der Fluorophorstabilität in SM-Experimenten7. Leider enthalten viele kommerziell erhältliche OSS-Enzyme, einschließlich PCD, kontaminierende Nukleasen11. Diese Verunreinigungen können zur Schädigung von Substraten auf Nukleinsäurebasis führen, die in SM-Experimenten verwendet werden. Diese Arbeit wird ein chromatographiebasiertes Reinigungsprotokoll für den Einsatz rekombinanter PCD in SM-Systemen aufklären. PCD kann in jedem Experiment, bei dem ROS schädliche Substrate für die Datenerfassung benötigt werden, weit verbreitet werden.

Protocol

1. Induzieren PcD-Expression in E. coli Kombinieren Sie 1 l pVP91A-pcaHG PCD-Expressionsplasmid (20 ng/l, Abbildung 1A) und 20 l E.coli BL21 (20 l kommerziell erhältliche Zellen, > 2 x 106 cfu/g Plasmid) in einer Röhre. Streichen Sie das Rohr zu mischen. Legen Sie die Röhre auf Eis 5 min. Transformation bei 42 °C für 30 s platzieren. Dann Eis 2 min. Fügen Sie 80 L SOC-Medien hinzu (super optimale Brühe mit Kat…

Representative Results

Kommerziell erhältliche Sauerstofffänger-PCD ist häufig mit einer DNA-Nuklease kontaminiert. Die Kontaminierende Nukleaseaktivität könnte zu falschen Ergebnissen in fluoreszierenden Studien führen, insbesondere in Studien, die DNA- oder DNA-interagierende Proteine analysieren. Wir haben herausgefunden, dass rekombinante PCD, ein Heterodimer von Hexahistidin mit phäzidierten PcaH und pcaG, in E. coli exprimiert werden kann (Abbildung 1). Der Heterodimer…

Discussion

Sauerstoff-Aufräumsysteme sind üblicherweise in einzelmolekülfluoreszenzmikroskopische Fluoreszenzmikroskopie enthalten, um Photobleichmittel zu reduzieren3,7,8. Diese Mikroskopie-Techniken werden oft verwendet, um Nukleinsäuren oder Protein-Wechselwirkungen mit Nukleinsäuren1,13,14zu beobachten. Die Kontamination von OSS mit Nukle…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von NIH GM121284 und AI126742 an KEY unterstützt.

Materials

2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 βME
30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 Bio-Rad 161-0156
Acetic acid, Glacial Certified ACS Fisherl Chemical A38C-212
Agar, Granulated BD Biosciences DF0145-17-0
AKTA FPLC System GE Healthcare Life Sciences AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore UFC201024 10 kDa MWCO
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma F-2262
Ammonium Persulfate (APS) Tablets Amresco K833-100TABS
Ampicillin Amresco 0339-25G
Bacto Tryptone BD Biosciences DF0123173
BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract VWR 90004-092
BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) Sigma-Aldrich B6755-500G
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coomassie Brilliant Blue Amresco 0472-50G
Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate Bio-Rad 2240096EDU
DTT P212121 SV-DTT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML Sigma-Aldrich D8537-500ML PBS
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Granulated LB Broth Miller EMD Biosciences 1.10285.0500
Hi-Res Standard Agarose AGTC Bioproducts AG500D1
Imidazole Sigma-Aldrich I0250-250G
IPTG Goldbio I2481C25
Leupeptin Roche 11017128001
Lysozyme from Chicken Egg White Sigma-Aldrich L6876-1G
Magnesium Chloride Hexahydrate Amresco 0288-1KG
Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability Thermo Fisher ND-2000C
NaCl P212121 RP-S23020
Ni-NTA Superflow (100 ml) Qiagen 30430
Novagen BL21 Competent Cells EMD Millipore 69-449-3 SOC media included
Orange G Fisher Scientific 0-267
Pepstatin Gold Biotechnology P-020-25
PMSF Amresco 0754-25G
Protocatechuic acid Fisher Scientific ICN15642110 PCA
Sodium dodecyl sulfate P212121 CI-00270-1KG
SpectraMax M2 Microplate Reader Molecular Devises
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL Thermo Fisher Scientific 09-741-04
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL Thermo Fisher Scientific 09-741-02
Superose 12 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 17517301
TEMED Amresco 0761-25ML
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager GE Healthcare Life Sciences
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086

References

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Cite This Article
Messer, R. K., Lopez Jr., M. A., Senavirathne, G., Yoder, K. E. Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase. J. Vis. Exp. (153), e59599, doi:10.3791/59599 (2019).

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