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Biochemistry

Expresión y purificación de la distribución de oxígeno libre de nucleasa Protocatechuato 3,4-Dioxigenasa

Published: November 8, 2019 doi: 10.3791/59599
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Cancer Biology and Genetics, College of Medicine, The Ohio State University

Summary

Protocatechuato 3,4-dioxigenasa (PCD) puede eliminar enzimáticamente el oxígeno diatómico libre de un sistema acuoso utilizando su sustrato ácido protocatecúrico (PCA). Este protocolo describe la expresión, purificación y análisis de actividad de esta enzima de barrido de oxígeno.

Abstract

La microscopía de molécula única (SM) se utiliza en el estudio de interacciones moleculares dinámicas de biomoléculas etiquetadas con fluoróforo en tiempo real. Sin embargo, los fluoróforos son propensos a la pérdida de señal a través del fotoblanqueo por oxígeno disuelto (O2). Para evitar el fotoblanqueo y prolongar la vida útil del fluoróforo, se emplean sistemas de barrido de oxígeno (OSS) para reducir O2. El SAO disponible comercialmente puede estar contaminado por nucleasas que dañan o degradan los ácidos nucleicos, interpretando confundiendo los resultados experimentales. Aquí detallamos un protocolo para la expresión y purificación de Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) sin contaminación nucleasa detectable. PCD puede eliminar eficientemente las especies reactivas de O2 mediante la conversión del sustrato ácido protocatecúico (PCA) a 3-carboxy-cis, ácido cis-muconic. Este método se puede utilizar en cualquier sistema acuoso donde O2 desempeña un papel perjudicial en la adquisición de datos. Este método es eficaz en la producción de PCD libre de nucleasas altamente activo en comparación con PCD disponible comercialmente.

Introduction

La biofísica de molécula única (SM) es un campo que cambia rápidamente la forma en que miramos los fenómenos biológicos. Este campo tiene la capacidad única de vincular las leyes fundamentales de la física y la química a la biología. La microscopía de fluorescencia es un método biofísico que puede lograr la sensibilidad SM. La fluorescencia se utiliza para detectar biomoléculas vinculándolas a pequeños fluoróforos orgánicos o puntos cuánticos1. Estas moléculas pueden emitir fotones cuando se excitan con láseres antes de fotoblanquear irreversiblemente2. El fotoblanqueo se produce cuando las etiquetas fluorescentes sufren daños químicos que destruyen su capacidad de excitar a la longitud de onda deseada2,3. La presencia de especies reactivas de oxígeno (ROS) en el tampón acuoso es una causa primaria del fotoblanqueo2,4. Además, ROS puede dañar las biomoléculas y dar lugar a observaciones erróneas en los experimentos SM5,6. Para prevenir el daño oxidativo, se pueden utilizar sistemas de barrido de oxígeno (OSS)3,7,8. El sistema de glucosa oxidasa/catalasa (GODCAT) es eficiente en la eliminación de oxígeno8,pero produce peróxidos potencialmente dañinos como intermedios. Estos pueden ser perjudiciales para las biomoléculas de interés en los estudios SM.

Alternativamente, el protocatechuato 3,4 dioxigenasa (PCD) eliminará eficientemente O2 de una solución acuosa utilizando su sustrato ácido protocatecúico (PCA)7,9. PCD es una metaloenzima que utiliza hierro no hemo para coordinar PCA y catalizar la reacción de apertura del anillo de catecol utilizando O210disuelto. Esta reacción de un paso se ha demostrado para ser un mejor OSS en general para mejorar la estabilidad del fluoróforo en los experimentos SM7. Desafortunadamente, muchas enzimas OSS disponibles comercialmente, incluyendo PCD, contienen nucleasas contaminantes11. Estos contaminantes pueden provocar el daño de sustratos a base de ácido nucleico utilizados en experimentos SM. Este trabajo aclare un protocolo de purificación basado en cromatografía para el uso de PCD recombinante en sistemas SM. PCD se puede aplicar ampliamente a cualquier experimento en el que ROS dañe los sustratos necesarios para la adquisición de datos.

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Protocol

1. Inducir la expresión de PCD en E. coli

  1. Combinar 1 plzantes de expresión PCD pVP91A-pcaHG (20 ng/L, Figura 1A) y 20 l de E.coli BL21 (células disponibles comercialmente de 20 l, > 2 x 106 cfu/g de plásmido) en un tubo. Deslice el tubo para mezclar. Coloque el tubo sobre hielo 5 min.
  2. Coloque la transformación a 42 oC durante 30 s. Luego hielo 2 min.
  3. Añadir medios SOC de 80 l (caldo súper óptimo con represión catabolita: 2,5 mM KCl, 10 mM de NaCl, 2% de triptona, 0,5% de extracto de levadura, 10 mM MgSO4,10 mM MgCl2,20 mM de glucosa). Agitar a 225 revoluciones por minuto (rpm) 37 oC durante 1 h.
  4. Placa de la reacción de transformación en agar LB Amp (agar caldo de luria 1L: 10 g de NaCl, 10 g de bacto-triptona, extracto de levadura de 5 g, agar de 15 g, ampicilina de 50 g/ml; 25 ml por plato petri de 10 cm de diámetro).
  5. Incubar la placa, la tapa hacia abajo, a 37oC durante 16-18 h.
  6. Inoculación 50 mL LB Amp (1L LB: 10 g de bacto-triptolona, 10 g de NaCl, 5 g de extracto de levadura, 50 g/ml de ampicilina) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml con una colonia. Incubar a 37oC para 16-18 h agitando a 225 rpm.
  7. Transfiera el cultivo de 20 ml a un matraz de 4 L con 1 L LB Amp. Agitar a 225 rpm a 37oC.
  8. Cada h mide el cultivo OD600 (densidad óptica a 600 nm). A medida que el cultivo OD600 se acerca a 0,5, aumentar la frecuencia de las mediciones a cada 15 min. La densidad deseada del cultivo es 0,5 OD600.
  9. Transfiera el matraz 4L a un cubo de hielo. Gire el matraz en el baño de hielo para reducir la temperatura de cultivo.
    Nota: El tiempo en el hielo debe mantenerse al mínimo para que las células permanezcan metabólicamente activas. Idealmente las células estarán en hielo menos de 10 min.
  10. La inducción exitosa de PCD se puede observar desnaturalizando el análisis de electroforesis de gel de poliacrilamida de dodecilo sulfato sódico (SDS-PAGE). Cosecha 1 mL del cultivo no inducido en un tubo. Gire la muestra 1 min a 14.000 x g en un microfúge a temperatura ambiente. Decantar al sobrenadante.
    1. Solubilizar las células peletizadas en PBS de 150 l (salina tamponada de fosfato).
    2. Añadir un volumen igual de tinte de carga 2X (1,2% SDS, 30% glicerol, 150 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,0018% azul bromofenol, 15% de mercaptoetanol). Vórtice la muestra para mezclar a fondo.
    3. Hervir la muestra durante 3 minutos y transferirla al hielo. La muestra se puede almacenar en un congelador de -20 oC para su análisis futuro.
      Nota: PBS está disponible comercialmente con o sin CaCl2 y MgCl2. Muchos laboratorios tendrán PBS sin CaCl2 y MgCl2 para métodos de cultivo celular. No hemos encontrado ninguna diferencia con PBS con o sin CaCl2 y MgCl2.
  11. Transfiera el matraz de 4 L a una incubadora a 17oC con 180 rpm de agitación. Continúe monitoreando el OD600 cada 20 min.
  12. A 0,7 OD600 añadir isopropilo-beta-D-tiogalactopyranoside (IPTG) a 0,5 mM de concentración final (0,25 M de solución en stock) y 10 mg/L de hierro de amonio (II) sulfato hexahidrato (Fe(NH4)2(SO4)2, 10 mg/ml de solución en stock). Los genes PCD pcaH y pcaG son inducidos por el promotor T5 mediante la adición de IPTG(Figura 1A). El sulfato de hierro está unido por PCD y es necesario para la actividad catalítica mediante la coordinación del oxígeno durante la apertura del catecol.
  13. Agitar el cultivo a 180 rpm a 17oC durante 18 h.
  14. Coloque el matraz de cultivo en hielo como en 1.2. Cosecha 1 mL de las células inducidas para SDS-PAGE como en 1.3.
  15. Vierta el cultivo bacteriano en botellas apropiadas para la centrifugación. Un cultivo de 1 L puede ser centrifugado en 4 botellas de fondo cónico de 250 ml. Pellet el cultivo a 4 oC durante 20 min a 3000 x g. Decanta los supernatantes. Deseche los residuos líquidos bacterianos adecuadamente.
  16. Pipet para resuspender los pellets en 25 ml de PBS frío (CaCl2 y MgCl2 son opcionales) por cultivo de 1 L.
  17. Transfiera la resuspensión a tubos cónicos de 50 ml (1 tubo de 50 ml por cultivo de 1 L). Peletizar las células a 3000 x g durante 20 min a 4 oC. Decantar el sobrenadante y desechar adecuadamente.
  18. Resuspender las células en 10 ml de tampón de lisis (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM imidazol, 10 % glicerol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 g/ml leupeptina y 87,1 g/mL de fluoruro de fenilsulfonil (PMSF)) mediante pipeteo. Congele la resuspensión con nitrógeno líquido en un matraz Dewar. Almacene los tubos de muestra en un congelador de -80 oC. Hemos purificado PCD a partir de pellets almacenados a -80 oC durante un año sin pérdida aparente de actividad.
  19. Compare las celdas no inducidas e inducidas por SDS-PAGE.
    Nota: No hemos tenido ninguna dificultad con la inducción de heterodímero PCD. Sin embargo, recomendamos probar la inducción antes de continuar con la purificación en caso de que cualquier reactivo haya expirado inesperadamente.
    1. Placas de montaje para SDS-PAGE (dimensiones: 7,3 cm x 8,3 cm x 0,75 mm de espesor). El gel de apilamiento es 1,5 ml 6% de poliacrilamida (6% acrilamida, 125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,1% SDS, 0,1% persulfato de amonio, 0,001% TEMED). El gel de resolución es de 3,5 ml de poliacrilamida al 12% (12% acrilamida, 375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% SDS, 0,1% persulfato de amonio, 0,001% TEMED). Inserte un peine de 10 pozos en la capa de apilamiento.
    2. Cargar 10 oL de muestras bacterianas no inducidas e inducidas. Cargar 4 l de marcadores de peso molecular preconfigurados para proteínas(Figura 1B).
    3. Electroforrese el gel a 16,5 V/cm aproximadamente 1 h. El azul bromofenol debe llegar a la parte inferior del gel.
    4. Coloque el gel en la mancha azul de Coomassie (10% ácido acético, 40% metanol, 0,1% tinte azul de coomassie) en una bañera de plástico. La mancha debe sumergir completamente el gel. Mancha a temperatura ambiente durante 20 min. Rotación suave durante la tinción es opcional.
    5. Reemplace la solución por destaína (10% ácido acético, 40% metanol). Incubar a temperatura ambiente con rotación suave opcional hasta que las bandas proteicas sean fácilmente visibles.
    6. Sustituya el destain por agua desionizada. Entre las proteínas bacterianas, las subunidades PCD inducidas deben ser visibles en las células inducidas. Hexahistidine etiquetada PCD subunit pcaH tiene un peso molecular de 28,3 kDa y la subunidad pcaG es 22.4 kDa. Si las subunidades pcD no son aparentes, se debe realizar una nueva inducción derivada de una colonia novedosa.

2. Purificación de cromatografía de afinidad de níquel de PCD

  1. Descongelar sobre hielo un tubo de 50 ml de células inducidas. Puede tomar 2-3 h para descongelar completamente la muestra.
  2. Manteniendo el tubo sobre hielo, sonicar la muestra a una amplitud del 30% durante 1 min, ciclismo 1 s encendido y apagado. Utilice un sonicador de micropuntas cónicas (diámetro 0,125 pulgadas). La potencia máxima es de 400 W y la frecuencia es de 20 kHz y por pellet de cultivo de 1 L.
  3. Después de la sonicación, añadir lisozyme a 0,2 mg/ml de concentración final (10 mg/ml de solución en stock) y mantener en hielo durante 30 min a 4 oC.
  4. Vierta el lisado bacteriano en una botella de policarbonato preenfriado (dimensiones: 25 mm x 89 mm). La botella debe ser compatible con un rotor ultracentrífugo de ángulo fijo. Otros tubos y/o rotores pueden ser sustituidos, pero se debe mantener la fuerza de gravitación final.
  5. Centrífuga durante 60 min a 120.000 x g a 4oC. Los desechos celulares formarán un pellet. El sobrenadante puede parecer amarillo.
    1. El pellet puede incluirse en el análisis posterior de SDS-PAGE para determinar la solubilidad de PCD(Figura 1B). Solubilizar el pellet vórtice en 10 mL PBS. Transfiera 150 l a un tubo de 1,5 ml. Prepare la muestra para SDS-PAGE como en 1.3.
  6. Vierta el sobrenadante en un tubo cónico frío de 50 ml. Anote el volumen. La contaminación del sobrenadante con ADN bacteriano puede producir una muestra viscosa. El ADN genómico bacteriano podría bloquear el flujo de la columna. El paso de ultracentrifugación 2.2 debe repetirse para peletizar el ADN bacteriano. Un perdigón de este segundo giro puede no ser fácilmente visible o puede ser transparente.
  7. Hacer 500 mL Ni Buffer A (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, y 10% glicerol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 g/ml leupeptina, y 87,1 g/mL PMSF) y 500 mL Ni Buffer B (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% glicerol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 g/mL de leupeptina y 87,1 g/mL de PMSF, 250 mM de pepstatina, 8.00p. Pase ambos búferes de Ni a través de filtros de poro de 0,2 m.
  8. La muestra, los tampones y el sistema FPLC (cromatografía líquida de proteínas rápidas) se encuentran en una sala refrigerada a 4 oC. Lave la bomba A con Ni Buffer A y la bomba B con Ni Buffer B. Lave el sistema con 20 mM imidazol (8% Ni Buffer B, 92% Ni Buffer A) hasta que los rayos UV y la conductividad se estabilicen. Rutinariamente fluyemos búferes a 5 mL/min con un límite de presión de 1.0 MPa. El caudal y el límite de presión deben determinarse por las especificaciones del instrumento FPLC utilizado.
  9. Preparar una columna con resina cargada de níquel de 1,5 ml (dimensiones: 110 mm de largo x 5 mm). La capacidad de unión a resina es de 50 mg/ml y puede tolerar 1 presión MPa. Una columna se puede verter y almacenar a 4 oC antes de la purificación.
    Nota: El tamaño de la columna puede aumentarse proporcionalmente para acomodar más de un tubo de 50 ml de células inducidas si se requiere más proteína. Preferimos una columna fresca para cada preparación para asegurar que ninguna proteína residual contamine nuestra proteína deseada. Sin embargo, las resinas de níquel pueden reciclarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  10. Adjunte la columna de resina cargada de níquel al FPLC. Ejecutar 20 mL de 92% Ni Buffer A y 8% Ni Buffer B (20 mM imidazol) a 0,5 ml/min con un límite de presión de 0,5 MPa a través de la columna para equilibrar. En tiempo real, el FPLC debe medir A280 (280 nm de absorbancia UV) así como la conductividad. Si estos valores no se han estabilizado después de que el volumen de 20 ml haya pasado a través de la columna, fluya los búferes hasta que se hayan estabilizado.
  11. Cargue la muestra en la columna (10 ml) a 0,15 ml/min. Establezca el límite de presión en 0,5 MPa. Recoge el flujo a través.
  12. Lave la columna con 20 ml de Tampón de Ni a 20 mM de imidazol (92% Ni Buffer A y 8% Ni Buffer B). Conservar el lavado en un tubo de 50 ml para su análisis. Lavar la columna con 15 ml de 50% De Buffer A y 50% Ni Buffer B (125 mM imidazol). Recoja la elución en 19 fracciones de 0,8 ml de volumen. Lave la columna con 15 mL 100% Ni Buffer B. Recoja 75 fracciones adicionales de 0,2 ml. Algunos heterodimeros PCD eluirá en el lavado 50% Ni Buffer B, pero la mayoría del heterodimero eluirá en el lavado 100% Ni Buffer B.
  13. Analizar fracciones recogidas en geles SDS-PAGE al 12% para confirmar la presencia de PCD. Agregue volúmenes iguales de tinte de carga 2X al flujo, lave y pico Afracciones 280. Hervir durante 3 minutos Transferir al hielo. Vierta dos geles SDS-PAGE al 12% (como en el paso 1.7). Repita el método de gel como se describe en 1.7.

3. Ensayo de actividad de nucleasa

  1. Basándose en el análisis SDS-PAGE, identifique las fracciones de afinidad de níquel que contienen PCD casi puro. Combinar la fracción de cromatografía de 5 l y 500 ng 3 kb de plásmido superbobinado pXba+ en tampón de reacción (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,1 mM DTT) con un volumen final de 50 l.
    1. Incubar a 37oC durante 1 h.
    2. Incluya un control negativo (sin proteína añadida) y un control positivo (PCD disponible comercialmente). Detenga la reacción con una solución de parada de 10 ml (150 mM EDTA, pH 8,0, 0,6% SDS, 18% glicerol, 0,15% naranja G).
    3. Las muestras pueden conservarse en un congelador de -20 oC para analizarlas más adelante. Cualquier plásmido superbobinado se puede utilizar en un ensayo de nucleasa, siempre y cuando los productos de reacción de círculo superbobinado y relajado puedan resolverse mediante electroforesis de gel de agarosa.
  2. Vierta un gel de agarosa de 120 ml 1% en 1lta de etidio TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA, bromuro de etidio de 0,5 g/mL) en un molde de gel (dimensiones: 15 x 10 cm). Utilice un peine de 15 pozos (dimensiones de pozo: 5 mm x 1,5 mm). Cuando el gel se haya ajustado, sumérgelo en 1x tampodio TAE.
  3. Analizar 30 oL de las reacciones por gel de agarosa. Electroforresa a 10 V/cm a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 h. El frente del tinte Naranja G debe estar al final del gel.
  4. Utilice un escáner de fluorescencia para tomar inmediatamente una imagen de la señal de bromuro de etidio del gel. Si se utilizó un plásmido de 3 kb, la banda más lenta será círculos relajados a 3,5 kb, el ADN lineal funcionará a 3 kb, y el plásmido superbobinado tendrá la movilidad más rápida a 2 kb.
    1. Calcule el volumen total de píxeles de cada carril con el software de análisis de imágenes.
    2. Determinar el volumen de píxeles de las diversas especies de ADN, como los círculos superbobinados, lineales y nicked. Utilice estos valores para determinar el porcentaje de cada especie de ADN. Por ejemplo, el aumento de la presencia de círculos nicked asociados con una fracción en comparación con el control negativo indica la presencia de nucleasas. El volumen de píxeles de los círculos nicked en un carril se divide por el valor de píxel del ADN total. Determine un porcentaje multiplicando este número por 100.
  5. Combine fracciones del segundo pico de elución que contienen heterodímero PCD casi puro basado en el análisis SDS-PAGE y tienen una actividad de nucleasa mínima a indetectable. Nuestro volumen de piscina típico es de 2 ml.
  6. Cargue la muestra en una unidad de filtro centrífugo con un límite de peso molecular de 10 kDa. Centrífuga en una centrífuga de cubo oscilante a 4000 x g durante 40 min a 4oC. Alternativamente, se puede utilizar un rotor de ángulo fijo de 35o a 7500 x g durante 20 minutos a 4 oC.
    1. Repita la centrifugación hasta que el volumen de retención final sea de 100-200 l.
    2. Invierta la unidad de filtro y recupere el retentado por centrifugación a 1000 x g durante 2 min a 4 oC.

4. Purificación cromatografía de exclusión de tamaño de PCD

  1. Hacer tampón de ejecución de cromatografía de exclusión de tamaño de 250 ml (SEC) (100 mM NaCl, Tris-HCl de 50 mM, pH 7,5, 10% glicerol, 0,1 mM de EDTA, Pepstatin a 800 ng/mL, leupeptina de 1 g/ml y 87,1 g/mL. Pasar el tampón a través de un filtro de poros de 0,2 m y almacenar a 4 oC.
    Nota: Realice todos los pasos en una sala refrigerada a 4 oC. La purificación seDE es opcional, pero la proteína debe almacenarse en el búfer de funcionamiento de la SEC. Si se omite la purificación de la SEC, el retentato recogido en 3.6.2. se debe dializar contra 1 L de tampón SEC en tubos de diálisis de 10 kDa MWCO (corte de peso molecular) a 4 oC durante la noche.
  2. Equilibrar una columna SEC de agarosa reticulada (cromatografía de exclusión de tamaño) (dimesiones: 10 mm x 300 mm; volumen de cama de 24 ml; volumen de muestra de 25 a 500 ml; límite de presión de 1,5 MPa; límite de exclusión de 2 x 106 Da; separación de 1 a 300 kDa) con búfer de funcionamiento SEC a 0,5 ml/min.
    Nota: Si se desea un tamaño alternativo, se pueden utilizar columnas SEC de tamaño alternativo.
  3. Cargue las fracciones concentradas en un bucle de inyección de volumen de 200 ml. Cargue la muestra a 0,5 ml/min en la columna. La resolución SEC aumenta con un volumen de carga más pequeño. Elute con búfer de funcionamiento seC de 23 ml y recoja 94 fracciones de 250 l. El cromatograma SEC debe resolver un solo pico A280 que sea el heterodímero PCD. Encontramos que PCD elutes 8.9 mL. El tiempo de elución cambiará con columnas SEC alternativas.

5. Ensayos de oxidación y nucleasa de PCA

  1. Las reacciones al ensayo tanto de oxidación de PCA como de actividad de nucleasa se realizan en una placa de fondo plano de 96 pocillos. Montar las reacciones en una placa de 96 pocillos sobre hielo en una cámara frigorífica de 4oC para evitar la catálisis prematura. Combinar en un volumen final de 50 l: 130 mM de NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 0,1 mM de TDT, PCA de 5 mM, pXba+ de plásmido superbobinado de 10 ng/ml y 10 ml de fracciones individuales de PCD SEC.
    Nota: Las fracciones PCD SEC deben añadirse en último lugar e inmediatamente antes del análisis, ya que la proteína comenzará a catálisis en el momento de la adición.
  2. La oxidación PCD de PCA se traduce en una menor absorción de PCA a 290 nm (A290). Transfiera la placa de 96 pocillos al soporte de placa de un lector de placas a una temperatura interna de 37 oC. Retirar el soporte de la placa en el instrumento y medir A290 a intervalos de 20 s durante 1 h. Pida al instrumento que agite la placa 5 s antes de cada lectura.
  3. Después de 1 h, terminar las reacciones añadiendo una solución de parada de 10 ml (150 mM EDTA, pH 8.0, 0.6% SDS, 18% glicerol, 0.15% Naranja G).
  4. Preparar, cargar y ejecutar un gel de agarosa como en el paso 3.2.
  5. Imagen y análisis del gel de agarosa como en el paso 3.3.
  6. Seleccione fracciones con más actividad de oxidación de PCA y ninguna contaminación de nucleasa observada para almacenamiento a largo plazo a -80 oC. Mida el A280.
  7. Calcular la concentración total de PCD utilizando el A280 y el coeficiente de extinción(280) de 734.700 M-1cm-1.
  8. Congelación rápida de fracciones individuales en nitrógeno líquido. Conservar en un congelador de -80oC. Alternativamente, combine fracciones activas, libres de nucleasas, alícuota, y congele de la misma manera. Nuestro rendimiento típico es de 1-2 mg de PCD por cultivo L. El uso típico en un experimento SM es de 3 g de PCD. Hemos utilizado PCD almacenado a -80 oC durante un máximo de 1 año sin disminución de la actividad.

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Representative Results

El PCD carroñero de oxígeno disponible en el nombre comercial con frecuencia está contaminado con una nucleasa de ADN. La contaminación de la actividad nucleasa podría dar lugar a resultados espurios en estudios fluorescentes, particularmente estudios que analizan el ADN o las proteínas que interactúan con el ADN. Hemos encontrado que el PCD recombinante, un heterodérmero de hexahistidina etiquetado pcaH y pcaG, puede expresarse en E. coli (Figura 1). El heterodimero se purifica primero mediante cromatografía de afinidad de níquel(Figura 2). PcD se eluye en 2 pasos de concentraciones de imidazol. Las fracciones de cromatografía son analizadas por SDS-PAGE. Las fracciones de PCD casi puro se concentran y purifican aún más por la SEC(Figura 3). Las fracciones SEC se analizan individualmente tanto para la actividad de oxidación de PCA como para la actividad de nucleasa(Figura 4). Las fracciones que mostraron una alta actividad de oxidación y ninguna actividad aparente de nucleasa se ensayon para la concentración de proteínas y se mantienen en un congelador de -80 oC para uso experimental.

Figure 1
Figura 1: Inducción de PCD en E. coli. (A) pVP91A-pcaHG se muestra con las subunidades PCD pcaH con etiqueta pcaG y hexahistidina. (B) Representante SDS-PAGE gel de inducción PCD. Los pesos moleculares están indicados a la izquierda. Las movilidades de pcaH etiquetadas con 28,3 kDa con etiqueta hexahistidina y pcaG de 22,4 kDa están a la derecha. E. coli no inducido (Un), E. coli inducido (In), el pellet después de E. coli lysis y ultracentrifugation (P), el sobrenadante después de la ultracentrifugación que se cargará en una columna de níquel (S), fracción representativa después de la cromatografía de níquel (Ni) y fracción representativa después de sec (SE). Esta cifra ha sido modificada de una publicación anterior12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Purificación cromatografía de afinidad de níquel de PCD. (A) Cromatografía de cromatografía de afinidad de níquel de PCD. El A280 se muestra en azul y el porcentaje de concentración de Ni Buffer B se muestra en rojo. La muestra se cargó en una concentración baja de 20 mM de imidazol. El flujo a través (Flw Thr) muestra las proteínas bacterianas solubles que no se unieron a la resina de níquel. La columna fue lavada con 20 ml de tampón de imidazol de 20 mM. Se realizó un segundo lavado de 15 ml con 125 mM de imidazol. La elución de PCD se realizó con 250 mM de imidazol. Algunos PCD eluyó en presencia de 125 mM de imidazol, pero la mayoría de la proteína eluida en 250 mM imidazol. (B) Análisis representativo SDS-PAGE de fracciones de afinidad de níquel. La carga, el flujo (Flw Thr) y el primer lavado mostraron la inducción exitosa de PCD, las proteínas bacterianas solubles que no unieron la resina de níquel, y las proteínas mínimas observadas durante el primer lavado, respectivamente. Se muestran varias fracciones a lo largo del segundo paso de lavado y elución. Las fracciones del segundo lavado incluían proteína PCD, pero también mostraban contaminantes detectables de mayor peso molecular. Las fracciones del paso de elución parecían estar libres de contaminantes. Los pesos moleculares se muestran a la izquierda. Las movilizaciones de pcaH y pcaG se muestran a la derecha. (C) Gel de agarosa de ensayo de nucleasa. La carga de la columna de afinidad de níquel, el flujo, el lavado y varias fracciones se probaron para la actividad de nucleasa. Un control negativo (control) es el plásmido sin proteína añadida. Un control positivo (PCDa) es un PCD disponible comercialmente que se sabe que está contaminado con una nucleasa de ADN. Las especies de ADN están indicadas a la derecha como pequeños fragmentos (SF), supercoiled (SC), lineal (LN), nicked circle (NC) y nicked dimer (ND). (D) Cantidad de las diversas especies de ADN observadas en el ensayo de nucleasas de gel de agarosa. Se midió el volumen total de píxeles de cada carril. El volumen de píxeles de cada especie de ADN se determinó y se expresó como un porcentaje del volumen total de píxeles en el carril. El control negativo fue 81.7% supercoiled con 14.4% nicked circles. El control positivo mostró un aumento significativo de 46,0% de círculos nicked. La carga y el flujo contenían nucleasas bacterianas que convertían el plasma y el ADN de las bacterias contaminantes en pequeños fragmentos. El primer lavado a 20 mM imidazol también parecía contener una actividad significativa de nucleasa, lo que resultó en círculos lineales y nicked. Las fracciones 4-7 del segundo lavado a 125 mM de imidazol también mostraron una actividad significativa de nucleasa (particularmente, las fracciones 4 y 5 que generaron plásmido linealizado observado). Las fracciones 29-38 del paso de elución parecían más similares al control negativo. En este ejemplo, las fracciones 29-38 fueron elegidas para ser combinadas, concentradas y purificadas aún más por la SEC. Esta cifra ha sido modificada de una publicación anterior12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Purificación SEC de PCD. (A) Cromatografía de SEC de fracciones de PCD después de la cromatografía de afinidad de níquel. El A280 se muestra en azul y se indican las fracciones de elución. PCD eludided de SEC como un único pico aparente. (B) Análisis Representativo SDS-PAGE de las fracciones 33-48 de la SEC. La carga es el PCD concentrado después de la purificación de afinidad de níquel. Las fracciones 33-48 abarcan el pico aparente de la SEC. No se observaron contaminantes detectables. (C) Gel de agarosa de ensayo de nucleasa. La carga de la SEC y varias fracciones se probaron para la actividad de nucleasa. Un control negativo (control) es el plásmido sin proteína añadida. Un control positivo (PCDa) es un PCD disponible comercialmente que se sabe que está contaminado con una nucleasa de ADN. Las especies de ADN se indican a la izquierda como supercoiled (SC), nicked circle (NC) y nicked dimer (ND). (D) Cantidad de las diversas especies de ADN observadas en el ensayo de nucleasas de gel de agarosa. Se midió el volumen total de píxeles de cada carril. El volumen de píxeles de cada especie de ADN se determinó y se expresó como un porcentaje del volumen total de píxeles en el carril. El control negativo fue 82.1% supercoiled con sólo 13.7% círculos nicked. El control positivo mostró un aumento significativo de 64.8% círculos nicked. La carga de la SEC no mostró actividad de nucleasa aparente debido a la elección juiciosa de fracciones de la purificación de afinidad de níquel. Del mismo modo, las fracciones 33-48 parecían similares al control negativo. Por ejemplo, la fracción 36 era 82,5% supercoiled y 13.2% nicked circle. En este ejemplo, las fracciones 36 y 37 fueron elegidas para ser cuantificadas, congeladas y mantenidas en un congelador de -80 oC para su uso experimental futuro. Esta cifra ha sido modificada de una publicación anterior12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Actividad de oxidación y nucleasas de PCA de fracciones PCD SEC. La oxidación de PCA se midió por A290. Como PCD oxidala la molécula de PCA, el A290 disminuyó. La oxidación de PCA se midió cada 20 s durante 1 h. Un control negativo sin fracción de PCD añadida (línea azul) no mostró ningún cambio en A290,lo que indica que la molécula de PCA era estable. Los datos de tres fracciones REPRESENTATIVAs de la SEC (36 en rojo, 33 en naranja, 39 en amarillo) muestran que el PCD purificado redujo el A290,lo que indica la oxidación del PCA. Esta cifra ha sido modificada de una publicación anterior12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los sistemas de barrido de oxígeno se incluyen comúnmente en la microscopía de fluorescencia de una sola molécula para reducir el fotoblanqueo3,7,8. Estas técnicas de microscopía se utilizan a menudo para observar ácidos nucleicos o interacciones proteicas con ácidos nucleicos1,13,14. La contaminación de los SSS con nucleasas puede dar lugar a resultados espurios.

Se ha demostrado que los SSA disponibles comercialmente, incluidos GODCAT y PCD, incluyen una contaminación significativa por nucleasas11. Es posible comprar PCD y emplear SEC para eliminar el contaminante de nucleasa11. Sin embargo, el precio de la PCD disponible comercialmente de un proveedor aumentó 5 veces tras la publicación de ese método. Este método genera un heterodímero de PCD libre de nucleasas altamente activo y concebiblemente se puede realizar dentro de 1 semana. En nuestra experiencia, la cantidad de PCD generada por un cultivo de 1 L (1-2 mg) es suficiente para un año de experimentos (3 g/experimento) en un laboratorio productivo con 2 sistemas de imágenes fluorescentes.

La eficiencia de la inducción es clave para el éxito de este método. Si el heterodímero PCD no es inducido y aparente eficientemente por SDS-PAGE, la purificación no tendrá éxito. Se pueden probar dos estrategias alternativas. Primero, intente la inducción de una colonia diferente en la placa de transformación de E. coli. En segundo lugar, hemos tenido éxito previo con BL21, pero se puede probar una cepa alternativa de E. coli para la expresión, como BL21 pLysS. El éxito del ensayo de oxidación PCA se basa en una exposición mínima del sustrato al PCD antes de iniciar el ensayo. Es muy recomendable montar las reacciones de 96 placas de pozo sen hielo en una cámara fría y añadir la muestra de proteína inmediatamente antes de cargar la placa al lector.

La cromatografía de afinidad de níquel puede ser suficiente para identificar fracciones de PCD puro sin actividad de nucleasa contaminante. En este caso, es posible eliminar la purificación SEC. Sin embargo, las fracciones de cromatografía de níquel deben combinarse y dializarse durante la noche a 4 oC en el búfer de funcionamiento SEC. El glicerol presente en el búfer de ejecución de la SEC es importante para el almacenamiento a -80 oC.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por NIH GM121284 y AI126742 a KEY.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 βME
30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 Bio-Rad 161-0156
Acetic acid, Glacial Certified ACS Fisherl Chemical A38C-212
Agar, Granulated BD Biosciences DF0145-17-0
AKTA FPLC System GE Healthcare Life Sciences AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore UFC201024 10 kDa MWCO
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma F-2262
Ammonium Persulfate (APS) Tablets Amresco K833-100TABS
Ampicillin Amresco 0339-25G
Bacto Tryptone BD Biosciences DF0123173
BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract VWR 90004-092
BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) Sigma-Aldrich B6755-500G
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coomassie Brilliant Blue Amresco 0472-50G
Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate Bio-Rad 2240096EDU
DTT P212121 SV-DTT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML Sigma-Aldrich D8537-500ML PBS
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Granulated LB Broth Miller EMD Biosciences 1.10285.0500
Hi-Res Standard Agarose AGTC Bioproducts AG500D1
Imidazole Sigma-Aldrich I0250-250G
IPTG Goldbio I2481C25
Leupeptin Roche 11017128001
Lysozyme from Chicken Egg White Sigma-Aldrich L6876-1G
Magnesium Chloride Hexahydrate Amresco 0288-1KG
Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability Thermo Fisher ND-2000C
NaCl P212121 RP-S23020
Ni-NTA Superflow (100 ml) Qiagen 30430
Novagen BL21 Competent Cells EMD Millipore 69-449-3 SOC media included
Orange G Fisher Scientific 0-267
Pepstatin Gold Biotechnology P-020-25
PMSF Amresco 0754-25G
Protocatechuic acid Fisher Scientific ICN15642110 PCA
Sodium dodecyl sulfate P212121 CI-00270-1KG
SpectraMax M2 Microplate Reader Molecular Devises
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL Thermo Fisher Scientific 09-741-04
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL Thermo Fisher Scientific 09-741-02
Superose 12 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 17517301
TEMED Amresco 0761-25ML
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager GE Healthcare Life Sciences
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086

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References

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  14. Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).

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Bioquímica Número 153 cromatografía protocatequiato-3,4-dioxigenasa (PCD) contaminación por nucleasasas ácido protocatecúrico (PCA) especies reactivas de oxígeno sistemas de barrido de oxígeno (OSS)
Expresión y purificación de la distribución de oxígeno libre de nucleasa Protocatechuato 3,4-Dioxigenasa
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Messer, R. K., Lopez Jr., M. A., Senavirathne, G., Yoder, K. E. Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase. J. Vis. Exp. (153), e59599, doi:10.3791/59599 (2019).

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