Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

जलीय-कमी सूखी आंख रोग का एक खरगोश मॉडल Concanavalin द्वारा प्रेरित Lacrimal ग्रंथियों में एक इंजेक्शन: दवा प्रभावकारिता अध्ययन के लिए आवेदन

Published: January 24, 2020 doi: 10.3791/59631
Automatic Translation
1, 2,3, 2
1Department of Ophthalmology, Stony Brook University, 2Department of Preventive Medicine, Stony Brook University, 3Medicon Pharmaceuticals, Inc.

Summary

यह लेख कक्षीय लैक्रिमल ग्रंथि प्रणाली के सभी भागों में कॉन्सेवलिन ए इंजेक्शन द्वारा खरगोशों में तीव्र या पुरानी शुष्क नेत्र रोग को प्रेरित करने के लिए एक विधि के विकास का वर्णन करता है। यह विधि, पहले से रिपोर्ट किए गए लोगों से बेहतर है, औषधीय एजेंटों के अध्ययन के लिए उपयुक्त सूखी आंखों का एक प्रजनन योग्य, स्थिर मॉडल उत्पन्न करती है।

Abstract

शुष्क नेत्र रोग (DED), नेत्र सतह की एक बहुकारक भड़काऊ बीमारी, जीवन की गुणवत्ता और स्वास्थ्य देखभाल लागत के लिए चौंका देने वाला निहितार्थ के साथ दुनिया भर में 6 मनुष्यों में 1 को प्रभावित करता है । जानकारीपूर्ण पशु मॉडल की कमी है कि अपनी प्रमुख सुविधाओं को संक्षिप्त DED के लिए नए चिकित्सीय एजेंटों के लिए खोज में बाधा डालता है । उपलब्ध डीईडी पशु मॉडल में सीमित प्रजनन क्षमता और प्रभावकारिता है। यहां एक मॉडल प्रस्तुत किया गया है जिसमें डीईडी को खरगोशों की कक्षीय लैक्रिमल ग्रंथियों में माइटोजेन कॉन्सवीन ए (कॉन ए) इंजेक्शन द्वारा प्रेरित किया जाता है। इस मॉडल के अभिनव पहलू अल्ट्रासाउंड (यूएस) मार्गदर्शन का उपयोग कर रहे हैं ताकि ईकॉन ए के इष्टतम और प्रजनन योग्य इंजेक्शन को अवर लैक्रिमल ग्रंथि में सुनिश्चित किया जा सके; सभी कक्षीय लैक्रिमल ग्रंथियों में कांग्रेस ए का इंजेक्शन जो आंसुओं के प्रतिपूरक उत्पादन को सीमित करता है; और कांग्रेस ए के आवधिक दोहराने इंजेक्शन का उपयोग करें जो डीईडी की स्थिति को लम्बा करदेगा। डीईडी और परीक्षण एजेंटों के प्रति इसकी प्रतिक्रिया पर उन मापदंडों के एक पैनल के साथ नजर रखी जाती है जो आंसू उत्पादन, आंसू फिल्म की स्थिरता और कॉर्नियल और कंजक्टिव म्यूकोसा की स्थिति का आकलन करते हैं। इनमें आंसू ऑस्मोलैरिटी, आंसू तोड़ने का समय, Schirmer के आंसू परीक्षण, गुलाब बंगाल धुंधला, और आंसू लैक्टोफेरिन का स्तर शामिल हैं । डीईडी को शामिल करने और उसके मापदंडों की निगरानी में विस्तार से बताया गया है। यह मॉडल सरल, मजबूत, प्रजनन योग्य और जानकारीपूर्ण है। यह पशु मॉडल आंसू शरीर विज्ञान और डीडी के रोगविज्ञान के अध्ययन के साथ-साथ डीडीडी के उपचार के लिए उम्मीदवार एजेंटों की प्रभावकारिता और सुरक्षा के आकलन के लिए उपयुक्त है।

Introduction

शुष्क नेत्र रोग (डीईडी) उच्च व्यापकता और रुग्णता1,2,3,4के साथ एक पुरानी स्थिति है । सूजन इसके रोगजनक5,6में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है . डीईडी के रोगविज्ञान को या तो कम उत्पादन या आंसुओं के अधिक वाष्पीकरण से प्राप्त होने के रूप में संकल्पित किया जाता है; पूर्व भी जलीय कमी DED7के रूप में जाना जाता है . Sjögren सिंड्रोम, डीईडी के एक बड़े पैमाने पर अध्ययन किए गए प्रोटोटाइप कारण, मुख्य रूप से लैक्रिमल ग्रंथियों (एलजी) को प्रभावित करता है और डीईडी के रोगजनकता में उनके महत्व का एक उल्लेखनीय उदाहरण है। डीईडी को अक्सर कृत्रिम आंसुओं के साथ इलाज किया जाता है जो अस्थायी राहत प्रदान करते हैं, या साइक्लोस्पोरिन या लिफिटेग्रास्ट के साथ, दोनों जो नेत्र सूजन को दबाते हैं। डीईडी के लिए उपलब्ध उपचारों में से कोई भी इष्टतम नहीं है, जिससे नए एजेंटों के विकास की आवश्यकताहै8,9।

DED के लिए नए चिकित्सीय एजेंटों की खोज तीन प्रमुख चुनौतियों से बाधित होती है: एक मान्यता प्राप्त दवा देने योग्य आणविक लक्ष्य की कमी, जो डीईडी की रोगविज्ञानी जटिलता को देखते हुए मायावी हो सकती है; होनहार एजेंटों की विरलता; और पशु मॉडल की कमी जो डीडी की प्रमुख विशेषताओं को संक्षिप्त करता है।

अधिकांश दवा विकास प्रयासों के साथ, डीईडी के सूचनात्मक पशु मॉडल एक महत्वपूर्ण खोजी उपकरण हैं, इसके बावजूद कि कोई भी पशु मॉडल पूरी तरह से मानव रोग को फिर से तैयार नहीं करता है। DED के माउस, चूहा और खरगोश मॉडल का सबसे अधिक उपयोग किया जाता है जबकि कुत्तों और वानरों का उपयोग कभी-कभी10,11किया जाता है। 12 से अधिक खरगोश डीडी मॉडलों ने आज तक एलजी को हटाकर या उनके कार्य को बाधित करके12,13,14 ,15,16को आंसू उत्पादन कम करने का प्रयास किया . इस तरह के दृष्टिकोण ों में आईएलजी का सर्जिकल रिसेक्शन शामिल है; इसके मलन वाहिनी को बंद करना; और निम्नलिखित में से एक के विकिरण या इंजेक्शन द्वारा एलजी कार्य को ख़राब करना: सक्रिय लिम्फोसाइट्स, माइटोजेन्स, बोटुलिनम टॉक्सिन, एट्रोपाइन, या बेंजलक्लाकोनियम। इन तरीकों की प्रमुख सीमाएं उनकी असंगतता और आंसू उत्पादन के लगातार आंशिक दमन हैं ।

Concanavalin ए (कांग्रेस ए), संयंत्र मूल का एक व्याख्यान, एक शक्तिशाली उत्तेजक टी सेल सबसेट है और हेपेटाइटिस17 और DED18के प्रयोगात्मक मॉडल में इस्तेमाल किया गया है । मूल कांग्रेस ए आधारित मॉडल को अपनी सापेक्ष सादगी सहित महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करने की सूचना दी गई थी; एलजी में भड़काऊ सेल प्रवाह, Sjogren जैसे रोगों की नकल उतार; भड़काऊ साइटोकिन्स आईएल-1ए, आईएल-8 और टीजीएफ-ए1 की उत्तेजना; आंसू फ्लोरेसिन क्लीयरेंस और आंसू ब्रेक-अप समय (TBUT) को मापने के द्वारा निगरानी किए गए आंसू समारोह; और एक विरोधी भड़काऊ कोर्टिकोस्टेरॉयड के लिए दिखाया गया दवा जवाबदेही।

जब इस आशाजनक विधि लागू किया गया था, इसके लाभ के अलावा, सीमाओं की पहचान की है कि अपने समग्र संशोधन और कठोर सुधार की आवश्यकता थी । विधि की तीन महत्वपूर्ण कमियों का दस्तावेजीकरण किया जाता है। सबसे पहले, मॉडल एक तीव्र था; प्रेरित DED के बारे में 1 सप्ताह के बाद थम गया । दूसरा, जानवरों की प्रतिक्रिया असंगत थी । के रूप में प्रदर्शन किया, अवर एलजी (ILG) के लिए "अंधा" ट्रांसक्यूटेरस इंजेक्शन में, कांग्रेस एक लक्षित ग्रंथि के लिए केवल बेतरतीब ढंग से दिया गया था । ILG के शरीर रचना विज्ञान के विस्तृत अध्ययन से पता चला है कि इसके आकार के रूप में ज्यादा के रूप में 4 गुना19 इस तरह के इंजेक्शन "हिट या याद आती है" प्रयासों बनाने के रूप में भिंन हो सकता है । अंत में, यहां तक कि जब ILG इंजेक्शन था, बेहतर एलजी (SLG) अक्सर कम आंसू प्रवाह के लिए मुआवजा, मॉडल समस्याग्रस्त बना रही है ।

इन प्रमुख सीमाओं को विधि में तीन संशोधनों को पेश करके दूर किया गया था, जो डीईडी का एक बेहतर पशु मॉडल पैदा कर रहा था। सबसे पहले, ILG में कांग्रेस ए के इंजेक्शन अल्ट्रासाउंड (अमेरिका) मार्गदर्शन के तहत किया गया था, यह सुनिश्चित करना है कि कांग्रेस एक ग्रंथि में प्रवेश किया । इंजेक्शन की सफलता के बाद एक इंजेक्शन अमेरिकी छवि प्राप्त करके पुष्टि की थी, जैसा कि चित्रा 1में दिखाया गया है। दूसरा, SLG के प्रतिपूरक आंसू योगदान को दूर करने के लिए, इस ग्रंथि के दोनों पालेब्रल और कक्षीय भागों कांग्रेस ए के साथ इंजेक्शन थे । अंत में, DED के इस तीव्र मॉडल को हर 7-10 दिनों में कॉन ए के बार-बार इंजेक्शन द्वारा एक पुरानी में परिवर्तित कर दिया गया था। इन खरगोशों में 2 महीने की अवधि का डीडी आसानी से प्राप्त होता है। इस दृष्टिकोण की सफलता का दस्तावेजीकरण19किया गया है .

जैसा कि पहले ही उल्लेख किया गया है, डीईडी के पशु मॉडलका एक महत्वपूर्ण अनुप्रयोग उम्मीदवार चिकित्सीय एजेंटों की प्रभावकारिता और सुरक्षा का निर्धारण करना है। इस मॉडल की उपयोगिता फॉस्फोसुलिंडाक (OXT-328), एक उपन्यास विरोधी भड़काऊ छोटे अणु20,21 आंख की बूंदों के रूप में प्रशासित के अध्ययन से प्रदर्शित किया गया था। इसकी प्रभावकारिता को डीईडी19के मापदंडों के एक पैनल के आधार पर प्रदर्शित किया गया था । इस मॉडल की सापेक्ष सादगी और जानकारीपूर्ण प्रकृति ने अपनी मजबूत प्रीक्लिनिकल श्रेष्ठता का प्रदर्शन करते हुए डीईडी, साइक्लोस्पोरिन और लिफिटेग्रास्ट के लिए दो एफडीए अनुमोदित दवाओं को फॉस्फोसुलिंडाक की साइड-बाय-साइड तुलना की अनुमति दी।

Protocol

सभी पशु अध्ययनों को पथरीले ब्रूक विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था और नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए ARVO बयान के अनुसार प्रदर्शन किया गया था ।

1. पशु और आवास

  1. न्यूजीलैंड व्हाइट (NZW) खरगोशों का अधिग्रहण 2-3 किलो वजनी।
  2. सख्त तापमान (65 ± 5 डिग्री एफ) और आर्द्रता (45 ± 5%) नियंत्रण. प्रकाश पर एक 12 घंटे पर/बंद चक्र होना चाहिए ।
  3. पानी और मानक खरगोश चाउ के लिए असीमित पहुंच प्रदान करते हैं। आहार संवर्धन को खत्म करें क्योंकि उनमें विटामिन ए हो सकता है जो आंखों को प्रभावित करता है।
  4. बेसलाइन उपायों या सूखी आंखों को शामिल करने से पहले कम से कम 2 सप्ताह के लिए जानवरों को acclimate।

2. संज्ञाहरण और इच्छामृत्यु के तरीके

नोट: सभी प्रक्रियाओं को कांग्रेस एक इंजेक्शन है कि मध्यम sedation की आवश्यकता के अलावा हल्के sedation की आवश्यकता है ।

  1. हल्के सेडेशन के लिए, 26 गेज सुई का उपयोग करके कंधों पर एसीप्रोमाज़ीन (1 मिलीग्राम/किलो) को नीचे इंजेक्ट करें। हल्के से डेसेशन के लिए एंडपॉइंट: जानवर कान के पालि के साथ एक आराम से सिर की स्थिति बनाए रखते हैं जो अब पूरी तरह से ईमानदार नहीं है।
    नोट: यदि उचित अंतिम बिंदु तक नहीं पहुंचा है, तो एसीप्रोमाज़ीन का एक अतिरिक्त इंजेक्शन दिया जा सकता है। जानवरों को हमेशा जागते रहना चाहिए, अपनी मूंछ को छूने के लिए उत्तरदायी होना चाहिए, और कभी भी धीमी सांस नहीं दिखानी चाहिए।
  2. मध्यम सेडेशन के लिए, पहले ऊपर के रूप में जानवरों acepromazine दे। एंडपॉइंट तक पहुंचने के बाद (ऊपर दिए गए नोट देखें), 1 एल/मिन और आइसोफ्लोरीन डिलीवरी सेट पर ओ2 फ्लो सेट के साथ गैस मास्क का उपयोग करके आइसोफ्लोरीन को 5%(चित्रा 2)पर सेट करें।
  3. जब तक खरगोश के शरीर टोन पूरी तरह से आराम से और कान पूरी तरह से फ्लॉपी हैं, तब तक आइसोफ्लोरीन का प्रशासन करें।
    नोट: कोई प्रतिपूरक मांसपेशियों आंदोलनों होना चाहिए जब जानवर अपनी तरफ मुड़ गया है; श्वास हमेशा सहज रहती है।
  4. सहज वसूली 2-5 मिनट के भीतर होती है: संकेतों में सहज सिर आंदोलन और वृद्धि या सामान्य मांसपेशियों टोन शामिल हैं। प्रायोगिक प्रक्रिया मध्यम सेडेशन के साथ पूरा होने के बाद, खरगोशों को लगभग 30 न्यूनतम के लिए या जब तक उनका व्यवहार सामान्य नहीं हो जाता तब तक निरीक्षण करें।
    नोट: नेत्र मलहम के किसी भी रूप में नेत्र मलहम की आवश्यकता नहीं है। 1) हल्के सेडेशन में, जानवर अभी भी सतर्क हैं और पलक पलटा बनाए रखते हैं। मध्यम सेडेशन में, पलक पलटा का अवरोध इतना कम है कि नेत्र सतह खतरे में नहीं है। 2) नेत्र सतह पर नेत्र मलहम की नियुक्ति परीक्षण के दौरान मूल्यांकन की गई संरचनाओं के दृश्य को पहले से ही रोकती है।
  5. इच्छामृत्यु: नसों में पेंटोबार्बिटल (100 मिलीग्राम/किलो) की अधिक मात्रा का उपयोग करें।

3. निसीटीटिंग झिल्ली को हटाना

  1. कॉर्निया के पूर्ण और सटीक मूल्यांकन की अनुमति देने के लिए अनुकूलन अवधि (आमतौर पर पहले सप्ताह) के दौरान हटाने का प्रदर्शन करें।
  2. सही निक्टिटिंग झिल्ली के लिए इंजेक्शन
    नोट: यदि दोनों आंखों की निक्टिटिंग झिल्ली को हटाया जाना है, तो एक सत्र में ऐसा करना सबसे सरल है। एक आंख से शुरू करें और वर्णित के रूप में आगे बढ़ें। विवरण की स्पष्टता के लिए, यह विधि दाईं आंख से शुरू होती है।
    1. खरगोश को उचित आकार के निरोधक बैग में रखें।
    2. चरण 2.1 में वर्णित हल्के सेडेशन को प्रेरित करें।
    3. माइक्रोपाइपेट का उपयोग करके दाईं आंख में परिरक्षक मुक्त लिडोकेन के 25 माइक्रोन लागू करें।
    4. पलकों के बीच एक लचीला तार ढक्कन वीक्षक रखें।
    5. 0.3 संदंश (या समकक्ष) का उपयोग करना, अपने शीर्ष पर निक्टिटिंग झिल्ली को समझें और इसे कॉर्निया पर बढ़ाएं।
    6. 26 गेज तेज सुई(चित्रा 3ए)का उपयोग करके 1:100,000 एपिनेफ्रीन के आधार पर लिडोकेन 1% इंजेक्ट करें। एक मध्यम ब्लीब को निसीटीटिंग झिल्ली पर होना चाहिए।
    7. वीक्षक निकालें।
  3. बाईं निक्तीन झिल्ली के लिए एक समान इंजेक्शन करें।
  4. निसीटीटिंग झिल्ली को काटना
    1. लगभग 5 मिन के बाद, ढक्कन वीक्षक को दाईं आंख में वापस रखें। 0.3 संदंश (या इसी तरह) का उपयोग करके अपने शीर्ष पर निक्टिटिंग झिल्ली को समझें और वापस लें।
    2. वेस्टकॉट कैंची या समकक्ष(चित्रा 3बी)का उपयोग करके अपने आधार पर निसीटीटिंग झिल्ली को काट लें।
      नोट: रक्तस्राव कम से कम है और आमतौर पर कारण की आवश्यकता नहीं होती है। फिर भी, अतिरिक्त हेमोस्टासिस की आवश्यकता होने की स्थिति में एक उच्च तापमान वाली बैटरी कॉटरी हमेशा पास रखी जाती है।
    3. वीक्षक निकालें।
    4. आंख पर सामयिक एंटीबायोटिक मरहम रखें (जैसे, नियोमाइसिन, पॉलीमाइक्सिन, बैसिट्रासिन और हाइड्रोकॉर्टिसोन)।
  5. हरदिया ग्रंथि को अक्षुण्ण छोड़ दें। हार्डियन ग्रंथि कभी-कभी देखी जाती है जब निसीटीटिंग झिल्ली मुकर जाती है।
    नोट: यदि एक बड़े सफेद द्रव्यमान या ऊतक ऊंचाई नाक या बेहतर उप-संबंधी क्षेत्र में देखा जाता है, तो झिल्ली को अपने आधार के बहुत करीब रखा गया था जिससे हार्डियन ग्रंथि अनायास ही प्रोलैप्स हो जाती है। बाद की प्रक्रियाओं में इसे रोकने के लिए, आधार पर निसीटीटिंग झिल्ली को अधिक छोड़ दें।
  6. नेत्र सतह को कम से कम 1 सप्ताह तक ठीक होने दें इससे पहले कि आगे जोड़तोड़ किए जाएं या नेत्र सतह परख किए जाएं।

4. सूखी आंख मापदंडों की माप और आंसू नमूनों के संग्रह

नोट: अध्ययन प्रोटोकॉल की जरूरतों के आधार पर डीईडी मापदंडों को मापें (उदाहरण के लिए, बेसलाइन पर और उसके बाद निर्दिष्ट समय बिंदु)। डीईडी के लिए माप निम्नलिखित क्रम में किया जाना चाहिए, कठोर प्रयास के साथ ईमानदारी से उन्हें हर बार दोहराने के लिए। सर्कैडियन विविधताओं को कम करने के लिए दिन के लगभग एक ही समय (± 1 एच) पर सभी जानवरों का परीक्षण करें। इन मापों को आमतौर पर दो जांचकर्ताओं की एक टीम की आवश्यकता होती है।

  1. खरगोश को निरोधक बैग में रखें। हल्के सेडेशन को प्रेरित करें।
  2. आंसू ओस्मोलैरी22
    1. मैन्युअल रूप से पलकों को 5-10 बार पलकों को समान रूप से नेत्र सतह पर आंसू परत वितरित करने के लिए झपकी दें।
    2. धीरे-धीरे निचले ढक्कन को वापस लें।
    3. निचले फोर्निक्स के साथ पालेब्रल और बुलबार कंजक्टिवा के जंक्शन पर TearLab Osmometer के साथ नमूना आंसू, बस छोटा निक्टिका झिल्ली के आधार पर पीछे ।
    4. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए TearLab Osmolarity परीक्षण का उपयोग कर ओस्मोलैरिटी उपाय करें।
  3. आंसू तोड़ने का समय (TBUT)
    1. इस परख के लिए कमरे को काला करें।
    2. पलकों के बीच एक तार ढक्कन वीक्षक रखें।
    3. माइक्रोपाइपेट का उपयोग करके कॉर्नियल सतह पर 0.2% फ्लोरोसेइन की 50 माइक्रोन ड्रॉप लागू करें। यदि कॉर्निया पर फ्लोरेसिन का वितरण भी पहली बूंद के साथ प्राप्त नहीं किया जाता है, तो दूसरी बूंद रखें।
    4. तुरंत एक टाइमर शुरू करें।
    5. नीली रोशनी के नीचे प्री-कॉर्नियल आंसू फिल्म का निरीक्षण करें। TBUT को ब्लैक डॉट्स, लाइनों या फ्लोरेसिन फिल्म(चित्रा 4)के स्पष्ट व्यवधान को विकसित करने में लगने वाले समय के रूप में परिभाषित किया गया है। यदि आवश्यक हो, तो सर्जिकल लूप्स का उपयोग करें जो ब्रेक-अप के शुरुआती संकेतों की बेहतर कल्पना करने के लिए +1.50 आवर्धन प्रदान करते हैं। 1 मिन तक के लिए मॉनिटर; यदि यहां परिभाषित ब्रेक-अप 1 मिन के बाद होता है, तो केवल 60 एस के लिए रिकॉर्ड TBUT।
  4. Schirmer आंसू परीक्षण (एसटीटी)
    1. ओकुलर सतह पर प्रिजर्वेटिव-फ्री लिडोकेन की 25 माइक्रोन ड्रॉप लागू करें।
    2. अवशिष्ट लिडोकेन और किसी भी आंसू तरल पदार्थ को अवशोषित करने के लिए अवर फोनिक्स में एक Weck सेल सर्जिकल भाला रखें। यदि आवश्यक हो, तो स्पंज के समीपस्थ अंत को कवर करने के लिए निचली पलक का उपयोग करें ताकि इसे जगह में रखने में मदद मिल सके(चित्र 5ए)।
    3. लगभग 30 एस के बाद, वेक स्पंज को हटा दें।
    4. तुरंत निचले ढक्कन के मध्य बिंदु पर कॉर्निया और पालेब्रल कंजक्टिवा के बीच अंतरिक्ष में एक Schirmer आंसू परीक्षण पट्टी डालें ।
    5. तुरंत एक टाइमर शुरू(चित्रा 5बी)।
    6. 5 मिन के बाद, पट्टी के गीले हिस्से की लंबाई को मापें; यह एसटीटी मूल्य है।
    7. ट्रिपलमें उपाय करें और एसटीटी मूल्य के रूप में 3 रीडिंग के औसत की रिपोर्ट करें।
  5. आंसू के नमूनों का संग्रह
    1. एसटीटी मूल्य 5 मिन में दर्ज होने के बाद, लैक्टोफेरिन जैसे विभिन्न एनालाइट्स के स्तर को परगने के लिए आंसू के नमूने एकत्र करने के लिए, पट्टी को कम से कम 20 मिमी गीला होने तक छोड़ दें।
      नोट: यदि डीईडी को प्रेरित किए जाने के बाद पर्याप्त गीला नहीं होता है, तो उचित समय में इस अंतिम बिंदु तक पहुंचने में मदद करने के लिए कम फोरनिक्स में गहरी पट्टी को आगे बढ़ाएं।
    2. गीला पट्टी काटें और तुरंत ठंडा आंसू संग्रह बफर (4% बीएसए, 1M NaCl, 0.1% ट्वीन-20 में प्रोटीनयुक्त अवरोधक कॉकटेल के साथ पीबीएस में) के 490 माइक्रोन में रखें।
    3. नमूनों को बर्फ पर तब तक रखें जब तक कि उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत नहीं किया जा सकता है, जहां उन्हें परख़ तक रहना चाहिए।
  6. गुलाब बंगाल धुंधला (आरबीएस)
    1. माइक्रो-पिपेट का उपयोग करके कॉर्निया में 1% प्रिजर्वेटिव-फ्री लिडोकेन का 50 माइक्रोन लागू करें।
    2. 30 एस के बाद, 1% गुलाब बंगाल के 25 μL को नेत्र सतह पर रखें और इसे समान रूप से वितरित करने के लिए पलक झपकते हैं।
    3. तुरंत एक टाइमर शुरू करें।
    4. 3.5 मिन में, ढक्कन के बीच एक तार ढक्कन वीक्षक रखें।
    5. 4.0 मिन में, बेहतर कंजक्टिव लक और कॉर्नियल सतह(चित्रा 6)की तस्वीर।
      नोट: उपयोग किए जा रहे कैमरे के प्रकार को समायोजित करें। विशिष्ट सेटिंग्स: डिजिटल सिंगल-लेंस रिफ्लेक्स कैमरा, अपर्चर प्रायोरिटी मोड (अपर्चर 13 या उससे अधिक), आईएसओ 6000, 100 मिमी मैक्रो लेंस दो 12.5 मिमी एक्सटेंशन ट्यूब, मैनुअल फोकस मोड, अधिकतम आवर्धन पर लेंस, और मैक्रो/रिंग फ्लैश सेट से रोशनी के माध्यम से स्वचालित करने के लिए लेंस मोड के माध्यम से। रिंग फ्लैश का फोकस लैंप कॉर्निया पर ध्यान केंद्रित करने के लिए चालू है।
    6. 1 मिनट के भीतर दोनों आंखों के लिए सभी तस्वीरें पूरी करें।
  7. एनईआई विधि का उपयोग करके ओक्यूलर सतह धुंधला स्कोर23 को इस प्रकार संशोधित कियागया है। ग्रेड 6 अलग कंजक्टिव जोन न करें। प्रत्येक आंख के बेहतर कंजक्टिवा स्कोर। यह कंजक्टिव सतह का हिस्सा है जो दुनिया में हेरफेर किए बिना आसानी से फोटो खिंचवाता है। हेरफेर संवेरल सतह के धुंधला बदल सकता है ।
  8. आंसू लैक्टोफेरिन का स्तर लैक्रिमल ग्रंथियों से आंसू उत्पादन का एक किराए का उपाय कर रहे हैं । परख आंसू लैक्टोफेरिन एक एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोरतुला परख24 किट का उपयोग करके ऊपर के रूप में एकत्र आंसू निर्माता के निर्देशों का पालन ।

5. सूखी आंख का प्रेरण और उपचार

नोट: कक्षीय लैक्रिमल ग्रंथि प्रणाली के तीन भागों को इंजेक्ट किया जाता है।

  1. एसेप्रोमाज़ीन 0.2 मिलीग्राम/किलोग्राम के साथ खरगोशों को बेहोश करें।
  2. पेरिऑर्बिटल और खोपड़ी क्षेत्र में फर से कतरनी और नायर का उपयोग करके किसी भी अवशिष्ट फर को पूरी तरह से हटा दें। शारीरिक पहचान और कॉन्वलिन ए(चित्रा 7)के अमेरिका निर्देशित इंजेक्शन के बेहतर दृश्य के लिए त्वचा को पूरी तरह से चिकनी छोड़ दें।
  3. ऊपर वर्णित मध्यम सेडेशन को प्रेरित करें।
  4. बेहतर लैक्रिमल ग्रंथि (पीएसएलजी) के पालेब्रल हिस्से का इंजेक्शन
    नोट: पहले पीएसएलजी का इंजेक्शन करें।
    1. माइक्रोपाइपेट के साथ प्रिजर्वेटिव-फ्री लिडोकेन 1% की उपयुक्त आंख 25 माइक्रोन पर लागू करें।
    2. ऊपरी पलक एवर्ट और पीछे कक्षीय रिम के लिए कोमल मध्यस्थ दबाव लागू जब तक ग्रंथि के पाले वाले हिस्से अंकन प्रोट्यूबरेंस देखा जाता है । पीएसएलजी ऊपरी ढक्कन के पीछे (लौकिक) हिस्से में एक छोटे बल्बस ऊंचाई के रूप में दिखाई देता है।
      नोट: सीखने की प्रक्रिया के दौरान ग्रंथि ऊतक को देखने के लिए, क्षेत्र के लिए 5% फ्लोरेसिन लागू करें(चित्रा 8ए)। बल्बस पीएसएलजी से आंसुओं को स्ट्रीमिंग करते देखा जा सकता है । कॉन ए के प्रशासन के लिए फ्लोरेसिन के आवेदन की आवश्यकता नहीं है; यह केवल ग्रंथि ऊतक दिखाने के लिए चित्रण प्रयोजनों के लिए किया जाता है।
    3. एक कंद सिरिंज पर ठीक दांतेदार संदंश और 27 गेज सुई का उपयोग करना, सीधे एक ट्रांसकॉन्जुक्टिव दृष्टिकोण का उपयोग करके ग्रंथि में प्रवेश करें। सुई 2 मिमी को ऊतक में अग्रिम करें और 0.1 एमएल(चित्रा 8बी)की मात्रा में कॉन ए के 500 माइक्रोग्राम इंजेक्ट करें।
      नोट: यह इंजेक्शन कभी-कभी दर्दनाक हो सकता है। यदि आवश्यक हो, तो जानवरों को इस इंजेक्शन के पूरा होने तक आइसोफ्लोरीन के तहत रखें।
  5. कक्षीय सुपीरियर लैक्रिमल ग्रंथि का इंजेक्शन (OSLG)
    नोट: OSLG तेजी से उत्तराधिकार में इस प्रकार है ।
    1. दुनिया के लिए मध्यस्थ दबाव लागू करें जिससे ओएसएलजी पीछे के बीमा से फैल ता है (यदि आवश्यक हो तो शरीर रचना विज्ञान के लिए रेफरी25 देखें)। पीछे के बीमा से ओएसएलजी के प्रोट्यूबरेंस के साथ दुनिया पर मध्यस्थ दबाव लागू करें(चित्र 9, लाल तीर)। प्रोटबेंस पीछे के बीमा को खोजने के लिए सकल स्थानीयकरण के रूप में कार्य करता है।
    2. खोपड़ी में बोनी खोलने महसूस होने तक क्षेत्र को मांगने के लिए बंद युक्तियों के साथ घुमावदार संदंश का उपयोग करें। यह प्रोटबेंस के तहत पूर्वकाल/पीछे के निर्देशन के साथ भट्ठा की तरह होगा ।
    3. त्वचा में एक इंडेंटेशन छोड़ने के लिए संदंश के साथ मामूली दबाव लागू करें, जो सुई प्लेसमेंट के लिए मील का पत्थर के रूप में काम करेगा(चित्रा 10ए)।
    4. एक सुई डालें (एक 27 गेज के साथ कंद सिरिंज, 5/8 इंच सुई) इंडेंटेशन मार्क पर त्वचा के लिए लंबवत(चित्रा 10बी)~ 1/4 इंच incisure में, तो सुई पीछे और बाह्य पार्श्व canthus की ओर अनुप्रेषित इंजेक्शन साइट और बोनी कक्षीय रिम के बीच मध्य बिंदु के लिए लक्ष्य ।
      नोट: यदि बीमा ठीक सुई के साथ लक्षित नहीं है, खोपड़ी अपनी उन्नति ब्लॉक ।
    5. एक बार सुई का केंद्र पहुंच जाने के बाद, धीरे-धीरे 0.2 मीटर(चित्रा 10सी)की मात्रा में कॉन ए के 1000 μg इंजेक्ट करते हैं।
  6. 2-3 मिनट के भीतर पीएसएलजी और ओएसएलजी दोनों का इंजेक्शन पूरा करें।
  7. आइसोफ्लोरीन सेडेशन (यदि अभी तक नहीं किया गया है) से जानवर को निकालें। अवर लैक्रिमल ग्रंथि (आईएलजी) का इंजेक्शन आमतौर पर आगे से सजे बिना पूरा किया जा सकता है।
  8. अवर लैक्रिमल ग्रंथि का इंजेक्शन
    1. पक्ष से जानवर देखें। आईएलजी की प्रमुखता कक्षा के निचले पूर्वकाल भाग(चित्रा 11ए)के साथ देखी जा सकती है।
    2. त्वचा पर सर्जिकल मार्किंग पेन या उपयुक्त स्थायी मार्कर का उपयोग करके एक ऊर्ध्वाधर रेखा खींचें जहां ILG ग्रंथि का सतही हिस्सा अपने सतही (अधिक बाहरी) से कक्षा में अपने अधिक मध्यस्थ स्थान पर जाइगोमैटिक हड्डी पर आराम करने वाली जगह है। यह आमतौर पर पूर्वकाल लिंबस(चित्रा 11ए)से कमतर होता है।
    3. त्वचा पर इस लाइन के पार खड़ी आयोजित अमेरिकी जांच व्यापक द्वारा zygomatic हड्डी के अंत की पहचान करें । आईएलजी संक्रमण तब होता है जहां ग्रंथि की छवि स्पष्ट रूप से घिरा हुआ (जाइगोमैटिक हड्डी की हाइपरइकोइक लाइन छवि में ग्रंथि के निचले किनारे के साथ देखी जाती है) बिना पहचानने योग्य औसत सीमा के (ज़िगोमैटिक हड्डी की गूंज अब मौजूद नहीं है, चित्रा 1)।
    4. जब अमेरिकी स्क्रीन इस परिवर्तन को दिखाती है तो त्वचा पर खींची गई रेखा के लिए हाथ-टुकड़ा की सापेक्ष स्थिति का निरीक्षण करें। यह "इंजेक्शन साइट" है जहां कांग्रेस ए दिया जाना चाहिए ।
    5. इंजेक्शन की गहराई को नियंत्रित करें ताकि कॉन ए को एक बिंदु पर ग्रंथि में रखें, जो ज़िगोमैटिक आर्क हड्डी के लिए बस मध्यस्थता करता है।
    6. इंजेक्शन की गहराई को इस प्रकार निर्धारित करें: इंजेक्शन की वांछित गहराई को जाइगोमैटिक हड्डी (हाइपरइकोइकोइक सिग्नल) प्लस 1 मिमी की गहराई के रूप में सेट करें। सुई की ज्ञात लंबाई (इस उदाहरण में 15 मिमी) से इस मूल्य को घटाएं।
    7. "इंजेक्शन साइट" ~ 12 मिमी पर ग्रंथि में सुई डालें, फिर धीरे-धीरे इसे तब तक वापस लें जब तक कि शरीर के बाहर उजागर सुई की लंबाई (सर्जिकल कैलिपर्स से मापा जाता है) 5.8.6(चित्रा 12)में गणना किए गए अंतर के बराबर है। 0.2 मीटर में कॉन ए के 1000 μg इंजेक्ट।
      नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि ग्रंथि के कैप्सूल को छेदा गया है और केवल सुई द्वारा धक्का नहीं दिया गया है, सुई को अपनी वापसी शुरू होने से पहले ~ 12 मिमी या लगभग हब में डाला जाना चाहिए।
    8. इंजेक्शन की सफलता की पुष्टि करने के लिए अमेरिका दोहराएं। आईएलजी को एक विशेषता हाइपोइकोइक स्पेस दिखाना चाहिए(चित्रा 1)।
      नोट: ILG इंजेक्शन एक सबसे अच्छा जानवरों द्वारा सहन किया जाता है26 और इसलिए, पिछले किया है ।
  9. 10 मिनट के भीतर दोनों आंखों की सभी ग्रंथियों को इंजेक्ट करने के लिए पूरी प्रक्रिया पूरी करें। इसके लिए प्रक्रिया में योग्यता की उपलब्धि की आवश्यकता होगी ।
    नोट: 2 कक्षीय लैक्रिमल ग्रंथियों में इंजेक्शन का एक सेट तीव्र DED स्थायी 1-2 सप्ताह प्रेरित करेगा।
  10. लंबी अवधि के डीईडी के लिए, हर 7 दिनों में ठीक उसी तरह कॉन को इंजेक्ट करें। इस तरह के 6 इंजेक्शन सफलतापूर्वक किए गए हैं।

6. पोस्ट-प्रोसीजर केयर

  1. कांग्रेस ए के इंजेक्शन के बाद, कम से कम 10-20 मिन के लिए अपने निरोधक बैग में जानवरों की निगरानी, या जब तक संवेदनावक प्रभाव से पहना है ।
  2. जानवरों को उपेक्षित मत छोड़ो जब तक कि वे स्टर्नल रीक्यूबेंसी बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना हासिल न कर लें। उन्हें अपने व्यक्तिगत पिंजरों में वापस न करें जब तक कि वे पूरी तरह से ठीक न हो जाएं।
  3. प्रक्रिया के बाद दर्द आमतौर पर हल्के होते हैं और खरगोश के ग्रिमलेस पैमाने के साथ दर्द का आकलन करते हैं। जरूरत पड़ने पर चमड़े केटोरोलैक (5 मिलीग्राम/किलो) की एक खुराक दें। अधिक गंभीर दर्द के लिए, हर 8 घंटे में चमड़े के नीचे बुप्रेनोरफिन 0.1 मिलीग्राम/किलो दें।

Representative Results

कांग्रेस एक इंजेक्शन एक घने लिम्फोसाइटिक घुसपैठ(चित्रा 13)की विशेषता लाक्रिमल ग्रंथियों में एक मजबूत भड़काऊ प्रतिक्रिया प्रेरित, कम आंसू उत्पादन के साथ । सभी आंसू मापदंडों को स्पष्ट रूप से बदल दिया गया था(तालिका 1 और तालिका 2)। इसके अलावा, आंसू लैक्टोफेरिन के स्तर को दबा दिया गया (नियंत्रण = 3.1 ± 0.45 बनाम कॉन ए इंजेक्ट = 2.7 ± 0.02 एनजी/एमजी प्रोटीन (मतलब ± एसईएम); पीएंड एलटी;0.03)। अंतिम परिणाम एक समझौता कॉर्नियल और कंजक्टिव एपिथेलियम था, जो गुलाब बंगाल धुंधला(चित्रा 6)का सबूत है ।

एलजी के तीन ों ऊतकों के इंजेक्शन ने पिछले तरीकोंसेप्राप्त राज्यों के विपरीत एक सुसंगत और समान डीडी राज्य का उत्पादन किया। इस परिणाम में प्रमुख योगदानकर्ता ओं में आईएलजी का अमेरिका निर्देशित इंजेक्शन और ओएसएलजी का इंजेक्शन था । तालिका 1 इस विधि के मुख्य परिणामों का सारांश देता है। सभी परिवर्तन गंभीर डीईडी के अनुरूप हैं।

कांग्रेस का एक सेट एक इंजेक्शन के बारे में 1 सप्ताह तक चलने DED पैदा करता है; सभी नैदानिक पैरामीटर 10 दिन(तालिका 2)से सामान्य हो जाते हैं। अनुक्रमिक कांग्रेस एक इंजेक्शन के बारे में 1 सप्ताह के अलावा DED की अवधि तदनुसार का विस्तार । उदाहरण के लिए, 7 दिन पर कांग्रेस ए इंजेक्शन का दूसरा सेट 2 सप्ताह और इतने पर डीडी का रखरखाव करता है। इंजेक्शन के लगभग 5 सेट के बाद, डीईडी राज्य अक्सर आगे इंजेक्शन की आवश्यकता के बिना स्थायी हो जाता है।

जब कॉन ए-प्रेरित DED के साथ खरगोशों का उपन्यास एजेंट फॉस्फोसुलिंडाक के साथ इलाज किया गया, तो इसने बीमारी को स्पष्ट रूप से दबा दिया। उदाहरण के लिए, इस एजेंट TBUT के साथ एक सप्ताह के उपचार के बाद वाहन का इलाज जानवरों की तुलना में स्पष्ट रूप से वृद्धि हुई (43.6 ± 4.0 बनाम 12.2 ± 2.8 एस; पी एंड एलटी; 0.001; मतलब ± एसईएम क्रमशः, इन और निम्नलिखित मूल्यों के लिए) जबकि आंसू ओस्मोलैरिटी सामान्यीकृत किया गया था (294 ± 4.6 बनाम 311 ± 2.0 mOsm/L, p&02)। मशीनिस्टी रूप से, फॉस्फोसुलिंडाक ने दो महत्वपूर्ण इंटरल्यूकिन, आईएल-1ए (8.4 ± 1.2 बनाम 21.2 ± 6.6 पीजी/एमजी प्रोटीन; पीएंडएलटी;0.03) और आईएल-8 (4.9 ± 1.7 बनाम 13.5 ± 5.0 पीजी/एमजी प्रोटीन; पीएंडएलटी;0.05)19के स्तर में कमी की ।

Figure 1
चित्रा 1: अवर लैक्रिमल ग्रंथि की अल्ट्रासाउंड छवि। ऊपरी पैनल: ILG के रूप में यह कक्षा में गहरी चालके लिए zygomatic आर्क के नीचे झूठ । धराशायी लाइन त्वचा पर लाइन का प्रतिनिधित्व करता है जिसके पार अमेरिकी जांच बह रही है । मध्य पैनल: के रूप में हाथ टुकड़ा इस लाइन के पार बह जाता है, परीक्षक zygomatic हड्डी गूंज है कि बाईं छवि(तीर)में मौजूद है और सही में गायब हो जाता है के नुकसान के लिए लग रहा है । निचले पैनल: ग्रंथि के भीतर एक बड़े सिस्टिक अंतरिक्ष के कॉन ए विकास के पहले(बाएं)और बाद(दाएं)इंजेक्शन से पहले ली गई आईएलजी की छवियां उचित वितरण की पुष्टि करती हैं। अनुमति के साथ फिर से मुद्रित19। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: गैस मास्क सेडान। इस तस्वीर को गैस मास्क isoflurane के साथ संक्षिप्त मध्यम sedation प्रदान से पता चलता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: निसीटीटिंग झिल्ली को हटाना। (क) लिडोकेन/एपिनेफ्रीन का इंजेक्शन। (ख) वेस्टकॉट कैंची के साथ अपने आधार पर निक्टिटिंग झिल्ली का ट्रंकेशन । (ग) नेत्र सतह ने निक्टिटिंग झिल्ली को हटाने के बाद अधिक आसानी से कल्पना की । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: आंसू तोड़ने के समय माप । (क) फ्लोरेसिन बूंदों के आवेदन के तुरंत बाद नीली रोशनी के नीचे कॉर्नियल सतह की समान हरी आंसू फिल्म उपस्थिति । (ख) कॉर्नियल सतह जो पहले ही फ्लोरेसिन में कई काले घेरे और रैखिक धारियों द्वारा प्रमाणित चिह्नित ब्रेक-अप से गुजर चुकी है । ब्रेक-अप समय पहले डार्क स्पॉट या लाइन विकसित होते ही दर्ज किया जाता है। दो हल्के नीले घेरे कॉर्निया के प्रकाश स्रोत के प्रतिबिंब हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: Schirmer आंसू परीक्षण । (क) किसी भी अवशिष्ट सामयिक लिडोकेन समाधान और बेसलाइन आंसुओं को दूर करने के लिए कम फोनिक्स में वेक-सेल स्पंज का उचित प्लेसमेंट । निचले ढक्कन मार्जिन के तहत त्रिकोणीय स्पंज के पीछे के किनारे रखकर, कोई भी आंसू स्ट्रिप्स के प्लेसमेंट से पहले नेत्र सतह को सुखाने के लिए एक बहुत ही समान तकनीक बनाए रख सकता है। (ख) ग्लोब और लोअर लिड (पालेब्रल कंजक्टिवा) के बीच निचले ढक्कन की मध्य स्थिति में उचित रूप से रखा गया एक आंसू पट्टी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: गुलाब बंगाल धुंधला । ऊपरी: कॉर्नियल सतह की तस्वीरें। बाएं: कोई गुलाब बंगाल धुंधला कांग्रेस ए के साथ उपचार से पहले मौजूद है । सही: फैलाना कॉर्नियल और कंजक्टिव धुंधला ऊपरी नाक चतुर्भुज पोस्ट इंजेक्शन (ऊपरी सही) में देखा जाता है । कम: बेहतर बुलबार कंजक्टिवा से कंजक्टिव इंप्रेशन साइटोलॉजी। बाएं: उपचार से पहले कई गोबलेट कोशिकाएं मौजूद हैं। सही: एपिथेलियल कोशिकाएं मौजूद हैं लेकिन गोबलेट कोशिकाएं उपचार के बाद अनुपस्थित हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: एक इंजेक्शन concanavalin के लिए खरगोश की तैयारी। (क) छोटे कैंची का उपयोग फर को हटाने के लिए किया जाता है, जिससे स्थलों के कक्षीय सुपीरियर लैक्रिमल ग्रंथि की पहचान करने के लिए स्थलों की आसान दृश्यकरण की अनुमति होती है । (ख) नायर का उपयोग बाल काटने के बाद बने बालों को हटाने के लिए किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: पालेब्रल लैक्रिमल ग्रंथि का इंजेक्शन। (क) पाल्पल लैक्रिमल ग्रंथि, ऊपरी ढक्कन के पीछे लौकिक हिस्से में एक बल्बस ऊंचाई के रूप में दिखाई दे रही है । 2% फ्लोरेसिन की एक बूंद लगाने के बाद इस ग्रंथि की सतह से आंसू स्ट्रीमिंग करते हुए देखे जाते हैं । (ख) खरगोश को मध्यम सेडेशन प्राप्त करते समय पालेब्रल लैक्रिमल ग्रंथि का इंजेक्शन लगाया जा रहा है । एक अन्वेषक पलक को वापस लेता है, ग्रंथि के जोखिम को अनुकूलित करता है, और मुखौटा को सुरक्षित करता है जबकि दूसरा अन्वेषक ग्रंथि इंजेक्ट करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्र9: कक्षीय बेहतर लैक्रिमल ग्रंथि का स्थानीयकरण। त्वचा की आकृति में परिवर्तन OSLG के स्थान को इंगित करता है क्योंकि यह पीछे के बीमा के माध्यम से फैलता है। दुनिया पर बारी-बारी से मध्यस्थता दबाव(बड़े तीर)बेहतर कक्षीय ग्रंथि को प्रोलैप्स का कारण बनता है, जिसे त्वचा में एक छोटी ऊंचाई के रूप में देखा जाता है। यह ऊंचाई आकार में वृद्धि होगी हर बार दबाव लागू किया जाता है(छोटे तीर)। इस ग्रंथि का स्थान आमतौर पर पीछे कक्षीय रिम के अनुरूप होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 10
चित्रा 10: कक्षीय सुपीरियर लैक्रिमल ग्रंथि का इंजेक्शन। (क) इस क्षेत्र में ठीक दांतेदार संदंश के साथ खोपड़ी पर कोमल दबाव का आवेदन जो 9 अंकमें के रूप में prolapseed । खोपड़ी में एक पतली भट्ठा की तरह खोलने के लिए टटोलना किया जा सकता है । संदंश के साथ एक छोटे से इंडेंटेशन मार्क को छोड़ना इंजेक्शन के दौरान सुई की प्लेसमेंट को बहुत एड्स करता है। (ख) सुई को बीमा के माध्यम से लंबवत रूप से डाला जा रहा है । यदि गलत तरीके से रखा जाता है, तो इसके मार्ग को बोनी खोपड़ी द्वारा बंद कर दिया जाता है। (ग) सुई पार्श्व कैंटस की ओर अंतिम स्थिति में है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 11
चित्रा 11: अवर लैक्रिमल ग्रंथि का स्थानीयकरण। (क) निचले ढक्कन के माध्यम से देखे गए आईएलजी के सतही हिस्से की प्रमुखता । वक्रीय पेन मार्क ग्रंथि की निचली स्थिति को दर्शाता है। नाक के अंगों के नीचे ऊर्ध्वाधर रेखा, अनुमानित स्थिति को दर्शाती है जहां आईएलजी कक्षा के भीतर एक गहरी स्थिति में संक्रमण करता है और अमेरिका के लिए एक दृश्य संदर्भ के रूप में कार्य करता है। (ख) ऊर्ध्वाधर रेखा के क्षेत्र में अमेरिका का हाथ-टुकड़ा व्यापक; अमेरिकी मॉनिटर दिखाएगा कि ज़ीगोमैटिक हड्डी कहां समाप्त होती है, जहां आईएलजी संक्रमण और जहां कॉन ए इंजेक्शन दिया जाना चाहिए ("इंजेक्शन साइट")। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 12
चित्रा 12: अवर लैक्रिमल ग्रंथि का इंजेक्शन। आईएलजी का इंजेक्शन अमेरिका द्वारा पहचाने गए स्थान पर किया जाता है। इंजेक्शन की गहराई की गणना पाठ (चरण 5.8.6) में वर्णित के रूप में की जाती है। कैलिपर्स (सुई के पीछे देखा जाता है) यह सुनिश्चित करते हैं कि इंजेक्शन से पहले सुई को उचित गहराई पर रखा गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 13
चित्रा 13: लैक्रिमल ग्रंथियों की हिटोलॉजी। ठेठ तुबुलो-अल्वेलर संरचना (ए) के साथ एक सामान्य अवर लैक्रिमल ग्रंथि के ऊतक वर्गऔर कॉन ए (बी)के इंजेक्शन के बाद, संरचना के प्रभावके साथ चिह्नित लिम्फोसाइटिक घुसपैठ दिखाते हैं। इसी तरह की भड़काऊ घुसपैठ बेहतर लैक्रिमल ग्रंथियों में देखी जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

इंजेक्शन विधि TBUT, सेकंड आंसू ओस्मोलेटी, ओएसएम/एल एसटीटी, मिमी
आधार रेखा इंजेक्शन के बाद आधार रेखा इंजेक्शन के बाद आधार रेखा इंजेक्शन के बाद
मतलब ± एसईएम, % परिवर्तन
अमेरिकी मार्गदर्शन के बिना ILG 58.5 ± 1.5 44.5 ± 7.7 297 ± 4.9 300 ± 3.8 15.2 ± 0.9 12.9 ± 2.2
%परिवर्तन -23% 1% -15%
पी=0.05 पी=0.36 पी=0.21
अमेरिका निर्देशित ILG + PSLG 59.4 ± 0.6 11.4 ± 4.2 296 ± 4.7 326 ± 3.7 15.1 ± 1.3 10.7 ± 1.8
% परिवर्तन -81% 10% -29%
पीएंडएलटी;0.0001 पीएंडएलटी;0.0001 पीएंडएलटी;0.03
अमेरिका निर्देशित ILG + PSLG + OSLG 60 ± 0.0 6.2 ± 1.3 299 ± 2.9 309 ± 2.8 14.6 ± 0.9 9.9 ± 1.3
% परिवर्तन -90% 3% -32%
पीएंडएलटी;0.0001 पीएंडएलटी;0.008 पीएंडएलटी;0.002
सभी मूल्यों को सूचीबद्ध ग्रंथियों में कांग्रेस ए के एक इंजेक्शन के बाद 6 दिन पर मापा गया था । सभी तुलना बेसलाइन से की गई । * आईएलजी, अवर लैक्रिमल ग्रंथि; पीएसएलजी, बेहतर लैक्रिमल ग्रंथि का पल्पीब्रल हिस्सा; OSLG, बेहतर लैक्रिमल ग्रंथि का कक्षीय हिस्सा; अमेरिका, अल्ट्रासाउंड।

तालिका 1: इंजेक्शन तकनीक का प्रभाव और सूखी आंख की गंभीरता पर इंजेक्शन साइटों की संख्या।

आधार रेखा 6 दिन दिन 13 21 दिन
1 इंजेक्शन 2 इंजेक्शन 3 इंजेक्शन
TBUT, सेकंड 58.5 ± 1.5 44.5 ± 7.7 29.2 ± 7.8 12.8 ± 3.9
% परिवर्तन -24% -50% -78%
पी=0.17 पी=0.001 पीएंडएलटी;0.0001
TOsm, Osm/L 297 ± 4.9 300 ± 3.9 308 ± 4.9 313 ± 2.7
% परिवर्तन 1% 4% 5%
पी=0.36 पी=0.04 पी=0.003
एसटीटी, मिमी 15.2 ± 0.9 9.3 ± 1.6 12.9 ± 1.6 7.4 ± 1.1
% परिवर्तन -39% -15% -51%
पी=0.17 पी=0.13 पी=0.008
बेसलाइन से तुलना की गई ।

तालिका 2: डीईडी की अवधि पर आईएलजी में बार-बार चुनाव ए इंजेक्शन का प्रभाव।

Discussion

DED के अध्ययन के लिए खरगोश बेहद आकर्षक हैं। उनके कॉर्निया और कंजक्टिवा में चूहों और चूहों की तुलना में मनुष्यों के करीब एक सतह क्षेत्र होता है; एस्टरासेस जैसे ड्रग मेटाबोलाइजिंग एंजाइमों का उनका पूरक, और उनकी लैक्रिमल ग्रंथियों का हिस्टोरोलॉजी मनुष्यों के समान है, और उनकी आंखें सूचनात्मक फार्माकोकाइनेटिक अध्ययनों के लिए काफी बड़ी हैं। सूअरों और बंदरों की तुलना में, जिसके साथ वे इसी तरह की विशेषताओं को साझा करते हैं, वे कम लागत और उनके प्रयोगात्मक हेरफेर आसान है । यदि मशीनी अध्ययनों पर विचार किया जाता है, तो चूहों की तुलना में खरगोश की एक सापेक्ष खामी यह है कि कम अभिकर्मक (जैसे, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी) उपलब्ध हैं। दूसरी ओर, खरगोश फार्माकोकाइनेटिक और बायोडिस्ट्रीब्यूशन अध्ययनों के लिए चूहों से कहीं बेहतर है क्योंकि व्यक्तिगत ऊतकआसानी से विच्छेदित होते हैं और विश्लेषणात्मक कार्य के लिए पर्याप्त आकार के होते हैं, "नमूना पूलिंग" से बचते हैं।

एक महत्वपूर्ण सामान्य पैरामीटर खरगोशों की अनुकूलन अवधि है। जानवरों को उन परिस्थितियों में विक्रेता से भेज दिया जाता है जो अक्सर उचित तापमान या आर्द्रता के परिवहन वातावरण को सुनिश्चित नहीं करते हैं। हो सकता है कि कुछ जानवरों ने आगमन पर पहले से ही सूखी आंख विकसित कर ली हो। अनुकूलन की दो सप्ताह की अवधि की सिफारिश की जाती है। समान रूप से महत्वपूर्ण आर्द्रता और अंतरिक्ष के तापमान पर ईमानदार ध्यान है जहां अध्ययन खरगोशों vivarium में रखे जाते हैं । किसी भी स्थिति में विचलन उनकी आंख की स्थिति में भारी बदलाव को प्रेरित कर सकता है। हाथ पर बैक-अप ह्यूमिडिफायर्स और डिह्यूमिडिफायर्स हैं। यदि केंद्रीय प्रणाली विफल हो जाती है, तो बैक-अप उपकरणों का उपयोग करके परिवेश आर्द्रता को बहाल करने के लिए जल्दी से कार्य करें। ध्यान रखें कि गर्मी के महीनों में इस तरह के दुर्भाग्यपूर्ण घटनाएं अधिक आम हैं। हालांकि, खरगोशों में डीईडी को सफलतापूर्वक प्रेरित करने के लिए तीन सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) आईएलजी की पहचान करने और कॉन ए के इंजेक्शन को निर्देशित और पुष्टि करने के लिए यूएस इमेजिंग का कुशल उपयोग; 2) दोनों ILG और SLG के दो भागों के इंजेक्शन सुनिश्चित करने; और 3) मज़बूती से और पुन: उत्पादन DED के मापदंडों परसते हैं।

आवश्यक प्रायोगिक कौशल का विकास तुच्छ नहीं है, लेकिन किसी भी गंभीर अन्वेषक को रोकते नहीं होना चाहिए । उम्मीद है कि सीखने की अवस्था पांच पुनरावृत्तियों के भीतर पूरी हो जाएगी। उचित गुणवत्ता की एक अमेरिकी इमेजिंग प्रणाली आवश्यक है। अमेरिका द्वारा शारीरिक पहचान की मान्यता महत्वपूर्ण है, इसलिए, अन्वेषक को खरगोश शरीर रचना विज्ञान की समीक्षा करनी चाहिए। डेविस25,एक क्लासिक द्वारा खरगोश शरीर रचना विज्ञान का उत्कृष्ट वर्णन, बेहद उपयोगी हो सकता है । इसके अलावा आईएलजी के आकार में भिन्नता को भी ध्यान में रखें। इस के लिए परिणाम यह है कि कांग्रेस की सफलता एक हमेशा इमेजिंग का पालन के साथ पुष्टि की जानी चाहिए । खरगोशों के एक समूह में कॉन ए की प्रतिक्रिया में भिन्नता अक्सर इंजेक्शन तकनीक (असफल या आंशिक रूप से सफल इंजेक्शन) के कारण होती है या आंसुओं के अधिक उत्पादन के साथ क्षतिपूर्ति करने के लिए अवशिष्ट लैक्रिमल ग्रंथि ऊतकों की क्षमता की अनदेखी करती है। जो लोग इंजेक्शन तकनीक में महारत हासिल करना चाहते हैं, उनके लिए मेथिलीन ब्लू को इंजेक्ट करना जिसके बाद त्वरित शारीरिक विच्छेदन मददगार हो सकता है; यदि यह लैक्रिमल ग्रंथि तक पहुंचता है या पड़ोसी ऊतकों पर फैल जाता है तो दृश्य प्राप्त होता है। आज तक, इस इंजेक्शन विधि को लेखकों द्वारा एक भी जटिलता के बिना 270 से अधिक बार किया गया है।

ऊपर प्रस्तुत DED के पांच मापदंडों को कहना उतना ही मुश्किल हो सकता है जितना कि नैदानिक अभ्यास में उनका दृढ़ संकल्प है। यद्यपि सर्कैडियन विविधताओं को अभी तक औपचारिक रूप से उनमें से किसी में प्रलेखित नहीं किया गया है, लेकिन आंख28 में ऐसी घटनाओं के पर्याप्त पृष्ठभूमि सबूत हैं कि उन्हें दिन के एक ही समय (± 1 एच) पर परख दिया जाना चाहिए, खासकर जब दोहराने वाले परखों को प्रदर्शन किया जाना है और एक दूसरे की तुलना में। इन परखों के प्रदर्शन में निरंतरता जरूरी है। दो की टीम की जरूरत है। एक ही कमरे में चार या अधिक जांचकर्ताओं परखों में भाग लेने के विघटनकारी हो सकता है, यह देखते हुए कि कुछ कदम सख्त समय की आवश्यकता है । उपयुक्त और उच्च गुणवत्ता वाले फोटोग्राफिक दस्तावेज, जहां इंगित किया गया है, महत्वपूर्ण है।

यह मॉडल आदर्श रूप से दवा विकास अध्ययन के लिए अनुकूल है। पशु मॉडल और परख तकनीकों की महारत प्रभावकारिता और सुरक्षा अध्ययन के उत्कृष्ट प्रजननक्षमता 19 सुनिश्चित की ।

यह एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक दृष्टिकोण है क्योंकि यह पूर्व मॉडलों की भ्रामक परिवर्तनशीलता को समाप्त करता है, पशु मॉडल को सुव्यवस्थित किया है और अनिवार्य रूप से डीईडी के पांच मापदंडों को परसने के लिए मानकीकृत है। एक उम्मीदवार चिकित्सकीय एजेंट के अध्ययन के लिए इस मॉडल के सफल आवेदन उपन्यास एजेंटों की हताश जरूरत में एक रोग के लिए एक जानकारीपूर्ण पशु मॉडल के रूप में अपनी व्यावहारिक उपयोगिता की पुष्टि की है और इसके रोगजनकता की गहरी समझ की ।

Disclosures

लेखक बीआर के अलावा कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं, जिनके पास मेडिसन फार्मास्यूटिकल्स, इंक और एपीआईएस थेराप्यूटिक्स, एलएलसी में इक्विटी की स्थिति है; और एलएच, मेडिसन फार्मास्यूटिकल्स, इंक के एक कर्मचारी एपीआईएस चिकित्सा विज्ञान, एलएलसी में एक इक्विटी की स्थिति के साथ ।

Acknowledgments

सभी प्रासंगिक नियामक और संस्थागत दिशा-निर्देशों के अनुसार और अनुपालन के अनुसार सभी पशु अध्ययन पूरे किए गए । सभी अध्ययनों को पथरीले ब्रूक विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था और नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए ARVO बयान के अनुसार प्रदर्शन किया गया था ।

इन अध्ययनों को पथरीले ब्रूक विश्वविद्यालय स्कूल ऑफ मेडिसिन (ग्रांट नंबर 1149271-1-82502) से एक लक्षित अनुसंधान अवसर अनुदान और मेडिसन फार्मास्यूटिकल्स, इंक, सेतुकेट, NY से एक शोध अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक संपादकीय समर्थन के लिए मिशेल मैकटर्नन का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm macro lens Canon EF 100mm f/2.8L IS USM 3554B002
26 gauge needles (5/8) Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ 305115 Needles for injecting ConA into the lacrimal glands
27 gauge needles (5/8) Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ 305921 Needles for injecting ConA into the lacrimal glands
Aceproinj (acepromazine) Henry Schein Animal Health, Dublin, OH NDC11695-0079-8 0.1ml/kg subcutaneously injection for rabbit sedation
Anesthesia vaporizer VetEquip, Pleasanton, CA Item #911103
Bishop Harmon Forceps Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ E1500-C Tissue forceps
Caliper Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ E-2404 Caliper used to measure length of needle during ConA injection
Concanavalin A Sigma, St. Louis, MO C2010 Make 5mg/ml in PBS for injection into rabbit lacrimal glands
DSLR camera Canon EOS 7D DSLR 3814B004 Digital single lens reflex camera
fluorescein AKRON, Lake Forest, IL NDC17478-253 Dilute to 0.2% with PBS to measure TBUT
Isoflurane Henry Schein, Melville, NY 29405
Lactoferrin ELISA kit MyBiosource, San Diego, CA MBS032049 Measure tear lactoferrin level
lidocaine Sigma, St. Louis, MO L5647 1% in PBS for anesthesia agent
macro/ring flash Canon Macro Ring Lite MR-14EXII 9389B002AA
Osmolarity tips TearLab Corp., San Diego, CA #100003 REV R Measure tear osmolarity
PBS (phosphate buffered saline) Mediatech, Inc. Manassas, VA 21-031-CV
Rabbit, New Zealand White or Dutch Belted (as described in text) Charles River Labs, Waltham, MA 2-3 kg Research animals
Rose Bengal Amcon Laboratories Inc., St. Louis, MO NDC51801-004-40 1% in PBS, stain the ocular surface
Schirmer strips Eaglevision, Katena products. Denville, NJ AX13613 Measure tear production
Surgical Loupes +1.50 Designs for Vision, Bohemia, NY Specialty item Provide magnificantion of ocular surface while observing tear break up and performing Concanavalin A injections.
TearLab Osmometer TearLab Corp., San Diego, CA Model #200000W REV A Measure tear osmolarity
Ultrasound probe VisualSonics Toronto, Ont MX 550 S Untrasonography-guide Con A injection for inferior lacrimal gland

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paulsen, A. J., et al. Dry eye in the Beaver Dam Offspring Study: prevalence, risk factors, and health-related quality of life. American Journal of Ophthalmology. 157 (4), 799-806 (2014).
  2. Vehof, J., Kozareva, D., Hysi, P. G., Hammond, C. J. Prevalence and risk factors of dry eye disease in a British female cohort. British Journal of Ophthalmology. 98 (12), 1712-1717 (2014).
  3. Tan, L. L., Morgan, P., Cai, Z. Q., Straughan, R. A. Prevalence of and risk factors for symptomatic dry eye disease in Singapore. Clinical and Experimental Optometry. 98 (1), 45-53 (2015).
  4. Craig, J. P., et al. TFOS DEWS II Report Executive Summary. The Ocular Surface. 15 (4), 802-812 (2017).
  5. Baudouin, C., et al. Clinical impact of inflammation in dry eye disease: proceedings of the ODISSEY group meeting. Acta Ophthalmologica (Copenhagen). 96 (2), 111-119 (2018).
  6. Calonge, M., et al. Dry eye disease as an inflammatory disorder. Ocular Immunology and Inflammation. 18 (4), 244-253 (2010).
  7. Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. The Pathophysiology of Dry Eye Disease: What We Know and Future Directions for Research. Ophthalmology. 124 (11S), S4-S13 (2017).
  8. Buckley, R. J. Assessment and management of dry eye disease. Eye (London, England). 32 (2), 200-203 (2018).
  9. Clayton, J. A. Dry Eye. New England Journal of Medicine. 378 (23), 2212-2223 (2018).
  10. Barabino, S. Animal models of dry eye. Archivos de la Sociedad Española de Oftalmología. 80 (12), 695-696 (2005).
  11. Stern, M. E., Pflugfelder, S. C. What We Have Learned From Animal Models of Dry Eye. International Ophthalmology Clinics. 57 (2), 109-118 (2017).
  12. Chen, Z. Y., Liang, Q. F., Yu, G. Y. Establishment of a rabbit model for keratoconjunctivitis sicca. Cornea. 30 (9), 1024-1029 (2011).
  13. Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Gray, K. L. A new rabbit model for keratoconjunctivitis sicca. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (2), 225-228 (1987).
  14. Guo, Z., et al. Autologous lacrimal-lymphoid mixed-cell reactions induce dacryoadenitis in rabbits. Experimenal Eye Research. 71 (1), 23-31 (2000).
  15. Burgalassi, S., Panichi, L., Chetoni, P., Saettone, M. F., Boldrini, E. Development of a simple dry eye model in the albino rabbit and evaluation of some tear substitutes. Ophthalmic Research. 31 (3), 229-235 (1999).
  16. Xiong, C., et al. A rabbit dry eye model induced by topical medication of a preservative benzalkonium chloride. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (5), 1850-1856 (2008).
  17. Heymann, F., Hamesch, K., Weiskirchen, R., Tacke, F. The concanavalin A model of acute hepatitis in mice. Lab Animal. 49 (1 Suppl), 12-20 (2015).
  18. Nagelhout, T. J., Gamache, D. A., Roberts, L., Brady, M. T., Yanni, J. M. Preservation of tear film integrity and inhibition of corneal injury by dexamethasone in a rabbit model of lacrimal gland inflammation-induced dry eye. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 21 (2), 139-148 (2005).
  19. Honkanen, R. A., Huang, L., Xie, G., Rigas, B. Phosphosulindac is efficacious in an improved concanavalin A-based rabbit model of chronic dry eye disease. Translational Research. 198, 58-72 (2018).
  20. Huang, L., et al. The novel phospho-non-steroidal anti-inflammatory drugs, OXT-328, MDC-22 and MDC-917, inhibit adjuvant-induced arthritis in rats. British Journal of Pharmacology. 162 (7), 1521-1533 (2011).
  21. Mattheolabakis, G., et al. Topically applied phospho-sulindac hydrogel is efficacious and safe in the treatment of experimental arthritis in rats. Pharmaceutical Research. 30 (6), 1471-1482 (2013).
  22. Osmalek, T., Froelich, A., Tasarek, S. Application of gellan gum in pharmacy and medicine. International Journal of Pharmaceutics. 466 (1-2), 328-340 (2014).
  23. Lemp, M. A. Report of the National Eye Institute/Industry workshop on Clinical Trials in Dry Eyes. Contact Lens Association of Ophthalmologists Journal. 21 (4), 221-232 (1995).
  24. Dal Piaz, F., Braca, A., Belisario, M. A., De Tommasi, N. Thioredoxin system modulation by plant and fungal secondary metabolites. Current Medicinal Chemistry. 17 (5), 479-494 (2010).
  25. Davis, F. A. The Anatomy and Histology of the Eye and Orbit of the Rabbit. Transactions of the American Ophthalmological Society. 27, 402-441 (1929).
  26. Lima, L., Lange, R. R., Turner-Giannico, A., Montiani-Ferreira, F. Evaluation of standardized endodontic paper point tear test in New Zealand white rabbits and comparison between corneal sensitivity followed tear tests. Veterinary Ophthalmology. 18 (Suppl 1), 119-124 (2015).
  27. Zheng, W., et al. Therapeutic efficacy of fibroblast growth factor 10 in a rabbit model of dry eye. Mol Med Report. 12 (5), 7344-7350 (2015).
  28. Wiechmann, A. F., Summers, J. A. Circadian rhythms in the eye: the physiological significance of melatonin receptors in ocular tissues. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (2), 137-160 (2008).

Tags

रिऐक्शन इश्यू 155 ड्राई आई ड्राई आई डिजीज ड्राई आई सिंड्रोम खरगोश मॉडल कॉनकॉन्वलिन ए आंसू तोड़ने का समय शिमर का आंसू परीक्षण आंसू ऑस्मोलैरिटी गुलाब बंगाल धुंधला नेत्र औषधि विकास
जलीय-कमी सूखी आंख रोग का एक खरगोश मॉडल Concanavalin द्वारा प्रेरित Lacrimal ग्रंथियों में एक इंजेक्शन: दवा प्रभावकारिता अध्ययन के लिए आवेदन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Honkanen, R. A., Huang, L., Rigas,… More

Honkanen, R. A., Huang, L., Rigas, B. A Rabbit Model of Aqueous-Deficient Dry Eye Disease Induced by Concanavalin A Injection into the Lacrimal Glands: Application to Drug Efficacy Studies. J. Vis. Exp. (155), e59631, doi:10.3791/59631 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter