该协议的目的是概述在果蝇黑色素体内实验的设计和性能,以评估与人类疾病相关的罕见基因变异的功能后果。
测序技术的进步使全基因组和全外体数据集更易于用于临床诊断和尖端人类遗传学研究。尽管已经开发了许多silico算法来预测这些数据集中识别的变异的致病性,但功能研究对于确定特定基因组变异如何影响蛋白质功能至关重要,尤其是对于感知错误变异。在未诊断疾病网络(UDN)和其他罕见疾病研究联盟中,模型生物(MO),包括果蝇、甲鱼、斑马鱼和小鼠,被积极用于评估假定的人类疾病引起功能变异。该协议描述了一种用于UDN的模拟生物筛选中心果蝇核心的罕见人类变异的功能评估方法。工作流从从多个公共数据库收集人工和 MO 信息开始,使用 MARRVEL Web 资源评估变体是否可能导致患者病情,并根据可用情况设计有效的实验知识和资源。接下来,生成遗传工具(例如T2A-GAL4和UAS-人cDNA线),以评估果蝇感兴趣的变异的功能。在开发这些试剂后,可以进行基于抢救和过度表达实验的双管齐下的功能测定,以评估变异功能。在抢救分支中,内源性苍蝇基因通过用参考或变异人类转基因取代正交果蝇基因而”人性化”。在过度表达分支中,参考和变异的人类蛋白质在各种组织中被外向驱动。在这两种情况下,任何可感染的表型(例如,杀伤性、眼睛形态学、电生理学)都可以用作读出,而不管感兴趣的疾病如何。参考和变异等位基因之间的差异表明存在变异特异性效应,因此可能具有致病性。该协议允许快速,在体内评估具有已知和未知功能的基因的假定人类致病变异。
患有罕见疾病的患者往往经历一段被称为”诊断奥德赛”的艰难旅程,以获得准确的诊断1。大多数罕见疾病被认为有很强的遗传来源,使得遗传/基因组分析成为临床工作的关键要素。除了基于染色体微阵列的候选基因面板测序和拷贝数变异分析外,全外显体 (WES) 和全基因组测序 (WGS) 技术在过去十年中已成为越来越有价值的工具2 3.目前,在WES和WGS中识别已知致病变异的诊断率为+25%(在儿科病例中较高)4,5。对于大多数在临床WES/WGS后仍未确诊的病例,一个常见的问题是有许多候选基因和变异。下一代测序通常能够识别许多基因中的新奇或超罕见变异,而解释这些变异是否导致疾病表型是具有挑战性的。例如,尽管基因中的大多数无意义突变或帧移突变被认为是功能丧失 (LOF) 等位基因,因为编码转录本的无意义介导衰减,但截断最后一个外源区中发现的突变会逃脱此过程,并可能充当良性或函数增益 (GOF) 等位各位数6.
此外,预测一个误感等位基因的影响是一项艰巨的任务,因为它可能导致许多不同的遗传场景,正如赫尔曼·穆勒在20世纪30年代首次描述的那样(即异构、低态、超态、反变形、新变形或异构)7.在silico计划和方法已经开发了许多预测误感变异的致病性基于进化保护,氨基酸变化的类型,在功能域的位置,等位基因频率在一般人群中,和其他参数8。然而,这些程序不是解决变体解释这一复杂问题的全面解决方案。有趣的是,最近的一项研究表明,五种广泛使用的变异致病性预测算法(Polyphen9,SIFT 10,CADD11,PROVEAN12,突变味觉)同意致病性 +80% 的时间 80%8.值得注意的是,即使所有算法都同意,它们也会在 11% 的时间内返回对致病性的错误预测。这不仅导致有缺陷的临床解释,而且还可能劝阻研究人员跟进新的变种,错误地列出他们为良性。补充目前硅酮建模限制的一个方法是提供实验数据,证明体外、体外(如培养细胞、有机体)或体内变异功能的效果。
对MO中罕见疾病相关变异的体内功能研究具有独特的优势13,已被世界各地的许多罕见疾病研究倡议所采用,包括美国的未诊断疾病网络(UDN)和稀有疾病模型和机制 (RDMM) 网络在加拿大,日本, 欧洲和澳大利亚14.除了这些协调的努力,将MO研究人员纳入全国范围的罕见疾病诊断和机械研究工作流程,临床和MO研究人员之间的一些单独合作研究已导致发现和许多新的人类致病基因和变异的表征82,83,84。
在UDN中,一个集中的模型生物筛选中心(MOSC)接收候选基因和变异的提交,并描述患者的病情,并评估该变异是否可能是病原菌使用信息学工具和体内实验。在UDN的第一阶段(2015-2018年),MOSC由果蝇核心[贝勒医学院(BCM)]和斑马鱼核心(俄勒冈大学)组成,他们合作评估病例。MOSC利用信息学分析和在果蝇和斑马鱼中的若干不同实验策略,迄今已为132名患者的诊断、31种新综合征的识别、发现几种新人类做出了贡献。疾病基因(例如,EBF315、ATP5F1D 16、TBX2 17、IRF2BPL 18、COG4 19、WDR37 20)和已知疾病的型皮扩张基因(例如,CACNA1A21,ACOX122)。
除了UDN内的项目外,MOSC果蝇核心研究人员还与孟德尔基因组学中心和其他倡议(例如,ANKLE223,TM2D3)合作,为新的疾病基因发现做出了贡献。 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) 使用相同的信息学和遗传学集为UDN制定的战略。鉴于MO研究对罕见疾病诊断的重要性,MOSC已扩大到包括UDN第二阶段(2018-2022年)的C.elegans核心和第二斑马鱼核心(均位于圣路易斯华盛顿大学)。
本手稿描述了在UDN MOSC果蝇核中积极使用的体内功能研究方案,以确定误感变异是否对使用表达人类的转基因苍蝇感兴趣的蛋白质产生功能影响蛋白质。该协议的目的是帮助MO研究人员与临床研究组合作,提供实验证据,证明感兴趣的基因中的候选变异具有功能性后果,从而促进临床诊断。在果蝇研究人员与一名临床研究人员接触的情况下,此协议最有用,该患者有一个罕见疾病患者,其基因中具有特定的候选变体。
该协议可以分为三个要素:(1) 收集信息以评估兴趣变异对患者表型负责的可能性,以及在果蝇中进行功能性研究的可行性,(2) 收集现有的遗传工具和建立新的,和(3)在体内进行功能研究。第三个要素可以根据如何评估利益变式的功能(救援实验或基于过度表达的策略)进一步细分为两个子元素。需要注意的是,该协议可以针对罕见单源疾病研究以外的许多情况进行调整和优化(例如,常见疾病、基因环境相互作用和药理学/基因筛选,以确定治疗靶点)。确定变异的功能和致病性的能力不仅通过提供准确的分子诊断使感兴趣的患者受益,而且还将对转化和基础科学研究产生更广泛的影响。
使用果蝇黑色素的实验性研究提供了一个强大的测定系统,以评估与疾病相关的人类变异的后果。这是由于在过去的一个世纪里,许多在飞行领域的研究人员产生了大量的知识和多样化的基因工具。然而,就像任何其他实验系统一样,承认存在的警告和限制是很重要的。
与数据挖掘相关的注意事项
虽然该协议的第一步是挖掘数据库,?…
The authors have nothing to disclose.
我们感谢何塞·萨拉萨尔、王朱莉娅和卡伦·舒尔兹博士对手稿的批判性阅读。我们感谢刘宁博士和罗希博士对这里讨论的TBX2变异的功能特性。未诊断疾病网络模型生物筛选中心通过国家卫生研究院(NIH)共同基金(U54 NS093793)提供支持。H.T.C. 得到了NIH[CNCDP-K12和NINDS(1K12 NS098482)]、美国神经学学会(神经科学研究资助)、伯罗斯·惠康基金(医学科学家职业奖)、儿童神经学学会和儿童神经学基金会() 的进一步支持。PERF Elterman 奖)和 NIH 主任早期独立奖 (DP5 OD026426)。M.F.W.得到了西蒙斯基金会(SFARI奖:368479)的进一步支持。S. Y. 得到了NIH(R01 DC014932)、西蒙斯基金会(SFARI奖:368479)、阿尔茨海默氏症协会(新调查员研究补助金:15-364099)、纳曼家庭基础研究基金和卡罗琳·威斯法律研究基金的支持。分子医学。BCM 的共聚焦显微镜部分由 NIH Grant U54HD083092 支持给智力和发育障碍研究中心 (IDDRC) 神经可视化核心。
Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis | |||
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) | BDSC | #24871 | Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line |
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) | BDSC | #24872 | Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line |
Plasmid DNA | |||
Cloning vector | Thermo Fisher | #12536-017 | Specific Reagent: pDONR221 |
Drosophila transgenesis vector | Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) | Specific Reagent: pGW-HA.attB | |
Molecular biology kits and reagents | |||
Agarose | Sigma-Aldrich | #A2790 | Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade) |
Chemically Competent Cells (E. coli) | Thermo Fisher | #18265017 | Specific Reagent: DH5α |
DNA Gel Extraction kit | Thermo Fisher | #K210012 | Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit |
DNA Isolation and purification kit | Qiagen | #27104 | Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit |
High Fidelity Polymerase | NEB | #M0491 | Specific Reagent: Q5 Polymerase kit |
Recombinase mediated cloning system | Thermo Fisher | #11789020 | Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit |
Recombinase mediated cloning system | Thermo Fisher | #11791100 | Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit |
Site Directed Mutagenesis kit | Agilent | #200523 | Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit |
Electroretinogram Rig related equipment | |||
ERG Analysis | Molecular Devices | N/A | Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package |
ERG Data Collection | LabX | #R150358 | Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier |
ERG Stimulator | Astro-Med | #S48 | Specific Reagent: Square Pulse Stimulator |