이 프로토콜의 목표는 인간 질병과 관련된 희귀 유전자 변이체의 기능적 결과를 평가하기 위해 Drosophila melanogaster에서 생체 내 실험의 설계 및 성능을 설명하는 것입니다.
시퀀싱 기술의 발전으로 전체 게놈 및 전체 엑솜 데이터 세트는 임상 진단 및 최첨단 인간 유전학 연구 모두에 더 쉽게 접근할 수 있게 되었습니다. 이러한 데이터 세트에서 확인된 변이체의 병원성을 예측하기 위해 여러 가지 실리코 알고리즘이 개발되었지만, 기능적 연구는 특정 게놈 변이체가 단백질 기능에 미치는 영향을 결정하는 데 매우 중요합니다. 변종. 진단되지 않은 질병 네트워크 (UDN) 및 기타 희귀 질환 연구 컨소시엄에서, Drosophila, C. elegans,제브라피시 및 마우스를 포함하는 모형 유기체 (MO)는 가치 인간 질병의 기능을 평가하기 위하여 적극적으로 이용됩니다 변종. 이 프로토콜은 UDN의 모델 유기체 스크리닝 센터 초파리 코어에 사용되는 희귀 인간 변이체의 기능적 평가를 위한 방법을 기술한다. 워크플로는 여러 공용 데이터베이스에서 인간 및 MO 정보를 수집하는 것으로 시작하여 MARRVEL 웹 리소스를 사용하여 변형이 환자의 상태에 기여할 가능성이 있는지 여부와 사용 가능한 실험을 기반으로 효과적인 실험을 설계하는 것으로 시작됩니다. 지식과 자원을 활용합니다. 다음으로, 유전 적 도구 (예를 들어, T2A-GAL4 및 UAS-인간 cDNA 라인)는 초파리에서관심있는 변이체의 기능을 평가하기 위해 생성됩니다. 이러한 시약의 개발시, 구조 및 과발현 실험에 기초한 두 갈래 의 기능성 실험이 변형 기능을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 구조 분지에서, 내인성 비행 유전자는 참조 또는 변이체 인간 형질전환유전자로 정형고성 Drosophila 유전자를 대체해서 “인간화”됩니다. 과발현 분지에서, 참조 및 변이체 인간 단백질은 다양한 조직에서 외인성으로 구동된다. 두 경우 모두, 임의의 코랭킹 표현형(예를 들어, 치사성, 눈 형태학, 전기생리학)은 관심 있는 질병에 관계없이 판독값으로 사용될 수 있다. 기준과 변이체 둘레 사이에 관찰된 차이는 변이체 특이적 효과, 따라서 가능성이 있는 병원성을 시사한다. 이 프로토콜은 알려진 및 알려지지 않은 기능을 가진 유전자의 가증한 인간 질병 유발 변이체의 신속하고 생체 내 평가를 허용합니다.
희귀 질환 환자는 종종 정확한 진단을 얻기 위해 “진단 오디세이”라고불리는 힘든 여행을 겪습니다 1. 대부분의 희귀 한 질병은 유전 / 게놈 분석 임상 작업의 중요한 요소를 만드는 강한 유전 적 기원을 가지고 생각된다. 염색체 마이크로어레이에 기초한 후보 유전자 패널 염기서열 분석 및 카피 수 변이 분석 이외에, 전체 엑소메(WES) 및 전체 게놈 염기서열 분석(WGS) 기술은 지난 10년 동안 점점 더 가치 있는 도구가 되고 있다2, 3. 현재 WES 및 WGS에서 알려진 병원성 변이체를 확인하기 위한 진단율은 ~25%(소아의 경우 더 높는)4,5. 임상 WES/WGS 후에 진단되지 않는 남아 있는 대부분의 케이스를 위해, 일반적인 문제는 많은 후보 유전자 및 이체가 있다는 것입니다. 차세대 염기서열 분석은 종종 많은 유전자에서 신규또는 매우 드문 변이체를 식별하고, 이러한 변이체가 질병 표현형에 기여하는지 여부를 해석하는 것은 도전적입니다. 예를 들면, 유전자에 있는 대부분의 말도 안되는 또는 프레임 시프트 돌연변이는 인코딩된 전사체의 말도 안되는 중재된 부패 때문에 기능 상실 (LOF) eeles로 생각되더라도, 마지막 exons에서 찾아낸 돌연변이를 잘린 이 프로세스를 탈출하고 같이 기능할 수 있습니다 양성 또는 기능 의 이득 (GOF) 알레일6.
또한, 1930 년대에 허먼 뮬러에 의해 처음 설명 된 바와 같이 다른 유전 시나리오의 숫자 (즉, 변형, 가형, 과모프, 안티 모프, 네오모프, 또는 이소모프) 7 을 초래할 수 있기 때문에, 잘못된 알탐지 알레일의 효과를 예측하는 것은 어려운 작업입니다7 . 수많은 실리코 프로그램 및 방법론은 진화적 보존, 아미노산 변화의 유형, 기능적 영역 내위치, 일반 인구의 대문자 빈도에 기초하여 잘못된 변이체의 병원성을 예측하기 위해 개발되었으며, 및 기타 매개 변수8. 그러나 이러한 프로그램은 변형 해석의 복잡한 문제를 해결하기위한 포괄적 인 솔루션이 아닙니다. 흥미롭게도, 최근 연구는 5 개의 광범위하게 사용되는 변이체 병원성 예측알고리즘 (폴리펜 9, SIFT10,CADD11,PROVEAN12,돌연변이 테이스터)이 병원성 ~80 %에 동의한다는 것을 보여주었습니다8 . 특히, 모든 알고리즘이 동의하더라도, 그들은 시간의 11 %까지 병원성의 잘못된 예측을 반환합니다. 이것은 뿐만 아니라 결함이 있는 임상 해석으로 이끌어 냅니다 그러나 또한 양성으로 그(것)들을 거짓으로 나열하여 새로운 변이체에 후속에서 연구원을 단념할 수 있습니다. 실리코 모델링에서 현재의 한계를 보완하는 한 가지 방법은 시험관 내, 생체 외(예를 들어, 배양된 세포, 오르가노이드) 또는 생체내 변이체 기능의 효과를 입증하는 실험 데이터를 제공하는 것이다.
MO에 있는 희소한 질병 관련이체의 생체 내 기능적인 연구 결과는 13의 유일한 강점이 있고 미국에 있는 진단되지 않은 질병 네트워크 (UDN) 및 희소한을 포함하여 세계에 있는 많은 희소한 질병 연구 이니셔티브에 의해 채택되었습니다 캐나다, 일본, 유럽 및 호주의 질병 모델 및 메커니즘 (RDMM) 네트워크14. MO 연구자를 희귀 질환 진단 및 기계론 적 연구의 워크플로우에 통합하기 위한 이러한 협력적 노력 외에도 임상 및 MO 연구자 간의 다수의 개별 공동 연구결과가 발견으로 이어졌습니다. 및 많은 새로운 인간 질병을 일으키는 유전자및 변이체82,83,84의특성화.
UDN에서, 중앙 집중식 모형 유기체 검열 센터 (MOSC)는 환자의 상태에 대한 설명과 함께 후보 유전자 및 변이체의 제출을 수신하고 이체가 정보학 도구 및 생체 내에서 병원성일 가능성이 있는지 여부를 평가합니다. 실험. UDN의 단계 I (2015-2018)에서, MOSC는 Drosophila 코어 [의학의 베일러 대학 (BCM)] 및 얼룩말 물고기 코어 (오리건 대학)로 구성 사례를 평가하기 위해 협력했다. 정보학 분석 및 Drosophila와 zebrafish에 있는 다른 실험 전략의 수를 사용하여, MOSC는 지금까지 132명의 환자의 진단, 31의 새로운 증후군55의확인, 몇몇 새로운 인간발견의 진단에 기여했습니다 질병 유전자 (예를 들어, EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720)및 알려진 질병의 현상치 확장 유전자 (예: CACNA1A21,ACOX122).
UDN 내의 프로젝트 이외에, MOSC Drosophila 코어 연구원은 Mendelian 유전체학 및 그밖 이니셔티브를 위한 센터와 협력하여 새로운 질병 유전자 발견에 기여했습니다 (예를 들면, ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29)동일한 정보학 및 유전 적 세트를 사용 UDN을 위해 개발된 전략. 희귀 질환 진단에 대한 MO 연구의 중요성을 감안할 때, MOSC는 UDN의 단계 II (2018-2022)에 대한 C. 예쁜 꼬마 코어와 두 번째 얼룩말 코어 (세인트 루이스의 워싱턴 대학 모두)를 포함하도록 확장되었습니다.
이 원고는 UDN MOSC Drosophila Core에서 활발히 사용되는 생체 내 기능적 연구 프로토콜을 설명하여 잘못된 변형이 인간을 발현하는 형질전환 파리를 사용하여 관심 단백질에 기능적 영향을 미치는지 여부를 결정합니다. 단백질. 이 프로토콜의 목표는 MO 연구원이 임상 연구 그룹과 협력하여 관심 유전자의 후보 변형이 기능적 결과를 가지고 있다는 실험적 증거를 제공하도록 돕고 임상 진단을 용이하게하는 것입니다. 이 프로토콜은 Drosophila 연구원이 관심있는 유전자에 있는 특정 후보 이체를 가진 희소한 질병 환자가 있는 임상 조사체에 의해 접근하는 시나리오에서 가장 유용합니다.
이 프로토콜은 세 가지 요소로 나눌 수 있습니다: (1) 환자 표현형및 Drosophila에서기능적 연구의 타당성에 대한 책임이 있는 관심의 변이체의 가능성을 평가하기 위해 정보를 수집, (2) 수집 기존 유전 도구 및 새로운 도구를 확립하고, (3) 생체 내에서 기능 적 연구를 수행. 세 번째 요소는 관심 있는 변형의 기능을 평가하는 방법(구조 실험 또는 과발현 기반 전략)에 따라 두 개의 하위 요소로 더 세분화될 수 있습니다. 이 프로토콜은 희귀 한 단일 원성 질환 연구 (예 : 일반적인 질병, 유전자 환경 상호 작용 및 약리학 / 유전 스크린)를 제외한 많은 시나리오에 적응하고 최적화 할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 변이체의 기능과 병원성을 결정하는 능력은 정확한 분자 진단을 제공함으로써 관심있는 환자에게 유익할뿐만 아니라 번역 및 기본 과학 연구 모두에 더 광범위한 영향을 미칠 것입니다.
Drosophila melanogaster를 이용한 실험 적인 연구 결과는 질병 관련 인간 이체의 결과를 평가하기 위하여 강력한 분석 시스템을 제공합니다. 이것은 지난 세기89년 동안 비행 필드에 있는 많은 연구원에 의해 생성된 지식 그리고 다양한 유전 공구의 큰 바디 때문이. 그러나 다른 실험 시스템과 마찬가지로 존재하는 주의 사항과 한계를 인정하는 것이 중요합니다.
<p class="jove_co…The authors have nothing to disclose.
호세 살라자르, 줄리아 왕, 카렌 슐제 박사에게 원고를 비판적으로 읽어주신 것에 감사드립니다. 우리는 여기에 논의 된 TBX2 변종의 기능적 특성에 대해 닝 리우 박사와 Xi Luo 박사를 인정합니다. 진단되지 않은 질병 네트워크 모형 유기체 검열 센터는 건강의 국가 학회 (NIH) 공동 기금 (U54 NS093793)를 통해 지원되었습니다. H. T. C. NIH [CNCDP-K12 및 NINDS (1K12 NS098482)], 미국 신경학 아카데미 (신경 과학 연구 보조금), 버로우스 웰컴 기금 (의료 과학자를위한 경력 상), 아동 신경학회 및 아동 신경학 재단 ( PERF 엘터만 교부금), NIH 이사 조기 독립상 (DP5 OD026426). M. F. W. 사이먼스 재단 (SFARI 상: 368479)에 의해 추가 지원되었다. S. Y.는 NIH (R01 DC014932), 사이먼스 재단 (SFARI 상 : 368479), 알츠하이머 협회 (새로운 조사자 연구 보조금 : 15-364099), 기초 연구를위한 나만 가족 기금 및 캐롤라인 비스 법률 기금에 의해 추가지원되었습니다. 분자 의학. BCM의 공초점 현미경 검사법은 NIH Grant U54HD083092에 의해 부분적으로 지적 발달 장애 연구 센터 (IDDRC) 신경 시각화 코어에 의해 지원됩니다.
Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis | |||
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) | BDSC | #24871 | Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line |
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) | BDSC | #24872 | Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line |
Plasmid DNA | |||
Cloning vector | Thermo Fisher | #12536-017 | Specific Reagent: pDONR221 |
Drosophila transgenesis vector | Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) | Specific Reagent: pGW-HA.attB | |
Molecular biology kits and reagents | |||
Agarose | Sigma-Aldrich | #A2790 | Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade) |
Chemically Competent Cells (E. coli) | Thermo Fisher | #18265017 | Specific Reagent: DH5α |
DNA Gel Extraction kit | Thermo Fisher | #K210012 | Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit |
DNA Isolation and purification kit | Qiagen | #27104 | Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit |
High Fidelity Polymerase | NEB | #M0491 | Specific Reagent: Q5 Polymerase kit |
Recombinase mediated cloning system | Thermo Fisher | #11789020 | Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit |
Recombinase mediated cloning system | Thermo Fisher | #11791100 | Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit |
Site Directed Mutagenesis kit | Agilent | #200523 | Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit |
Electroretinogram Rig related equipment | |||
ERG Analysis | Molecular Devices | N/A | Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package |
ERG Data Collection | LabX | #R150358 | Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier |
ERG Stimulator | Astro-Med | #S48 | Specific Reagent: Square Pulse Stimulator |