Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

توليد الخلايا الجذعية العصبية المستحثة من الخلايا أحادية النووية الطرفية والتمايز نحو سلائف الخلايا العصبية الدوبامين لدراسات زرع

Published: July 11, 2019 doi: 10.3791/59690
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Cell Therapy Center, Beijing Institute of Geriatrics, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, and Key Laboratory of Neurodegeneration, Ministry of Education, 2Center of Neural Injury and Repair, Beijing Institute for Brain Disorders

Summary

يعرض البروتوكول إعادة برمجة الخلايا أحادية النووية في الدم المحيطي للحث على الخلايا الجذعية العصبية عن طريق عدوى فيروس سينداي، والتمايز بين الـ iNSCs في الخلايا العصبية الدوبامينية، وزرع سلائف DA في الآفات من جانب واحد نماذج الماوس مرض باركنسون, وتقييم سلامة وفعالية السلائف DA المستمدة من iNSC لعلاج PD.

Abstract

مرض باركنسون (PD) هو سبب انحطاط الخلايا العصبية الدوبامين (DA) في substantia nigra pars compacta (SNpc) في mesencephalon البطيني (VM). العلاج باستبدال الخلايا يحمل وعدا كبيرا لعلاج PD. في الآونة الأخيرة، ظهرت الخلايا الجذعية العصبية المستحثة (iNSCs) كمرشح محتمل للعلاج استبدال الخلايا بسبب انخفاض خطر تكوين الورم واللدونة التي تؤدي إلى الخلايا العصبية الخاصة بالمنطقة وglia. يمكن إعادة برمجة iNSCs من المصادر الخلوية الجسدية الذاتية، مثل الخلايا الليفية والخلايا أحادية النووية في الدم المحيطي (PBMNCs) وأنواع أخرى مختلفة من الخلايا. بالمقارنة مع أنواع أخرى من الخلايا الجسدية، PBMNCs هي نوع خلية كاتب جذابة بسبب سهولة الوصول والتوسع في الثقافة. Sendai فيروس (SeV)، وهو فيروس RNA غير التكاملي، وترميز عوامل إعادة البرمجة بما في ذلك الإنسان OCT3/4، SOX2، KLF4 و c-MYC ، لديه شعور سلبي ، واحد الذين تقطعت بهم السبل ، الجينوم غير مجزأة التي لا تندمج في الجينوم المضيف، ولكن يتكرر فقط في السيتوبلازم من الخلايا المصابة، وتوفير وسيلة فعالة وآمنة لإعادة برمجة. في هذه الدراسة، ونحن نصف بروتوكول الذي يتم الحصول على iNSCs عن طريق إعادة برمجة PBMNCs، وتميزها في الخلايا العصبية دي أ VM المتخصصة بطريقة من مرحلتين. ثم يتم زرع السلائف DA في من جانب واحد 6-هيروكسيدوبامين (6-OHDA) -نماذج الماوس PD الآفات لتقييم سلامة وفعالية لعلاج PD. توفر هذه الطريقة منصة للتحقيق في وظائف والآثار العلاجية للخلايا العصبية DA الخاصة بالمريض في المختبر وفي الجسم الحي.

Introduction

مرض باركنسون (PD) هو اضطراب عصبي شائع، الناجم عن انحطاط الخلايا العصبية الدوبامين (DA) في substantia nigra pars compacta (SNpc) في mesencephalon البطيني (VM)، مع انتشار أكثر من 1٪ في السكان الذين تزيد أعمارهم عن 60 عاما 1 , 2.على مدى العقد الماضي، والعلاج الخلوي، تهدف إما إلى استبدال الخلايا التنكسية أو التالفة، أو تغذية البيئة الدقيقة حول الخلايا العصبية المتحللة، وقد أظهرت إمكانات في علاج PD3. وفي الوقت نفسه، حققت تكنولوجيا إعادة البرمجة تقدما كبيرا4، والذي يوفر مصدرا الخلوية واعدة للعلاج البديل. وقد ثبت أن الخلايا الجذعية المتعددة القوى التي يسببها الإنسان (iPSCs) والخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) قادرة على التمييز في الخلايا العصبية DA، والتي يمكن أن البقاء على قيد الحياة، والنضج، وتحسين وظائف المحرك عند تطعيمها في نماذج PD الرئيسيات الفئران وغير البشرية5 ،6،7،8. وتمثل هذه المراكز معلماً بارزاً في تكنولوجيات إعادة برمجة الخلايا ولها إمكانات كبيرة في مجال زرع الخلايا؛ ومع ذلك، لا يزال هناك قلق بشأن خطر تكوين الورم من الخلايا المتمايزة بشكل غير كامل. مصدر خلوي بديل لزراعة الخلايا هو الخلايا الجذعية البالغة الملتزمة بالسلالات التي يتم الحصول عليها من خلال إعادة البرمجة المباشرة، مثل الخلايا الجذعية العصبية المستحثة (iNSCs)، والتي يمكن اشتقاقها من الوسطاء غير المستقرين، متجاوزين القوى المتعددة المرحلة9،10،11.

يمكن إعادة برمجة كل من iPSCs وiNSCs من المصادر الخلوية الذاتية، مثل الخلايا الليفية، والخلايا أحادية النووية في الدم المحيطي (PBMNCs) وأنواع أخرى مختلفة من الخلايا12،13،14،مما يقلل من مناعة الخلايا المزروعة إلى حد كبير. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع iPSCs، iNSCs هي متأصلة مع انخفاض خطر تشكيل الورم واللدونة الملتزمة النسب، قادرة فقط على التمييز في الخلايا العصبية وglia11. في الدراسات الأولية، تم إنشاء iPSCs الإنسان أو الماوس وiNSCs من الخلايا الليفية التي تم الحصول عليها من الخزعات الجلدية، وهو إجراء الغازية14،15. وفي هذا الصدد، فإن مركبات PBMNCs هي مصدر خلايا بداية جذاب بسبب عملية أخذ العينات الأقل تدخلاً، وسهولة الحصول على أعداد كبيرة من الخلايا في غضون فترة قصيرة من فترة التوسع16. استخدمت دراسات إعادة البرمجة الأولية أنظمة التسليم التكاملي، مثل ناقلات الفيروسات اللينة أو الفيروسات الرجعية، والتي هي فعالة وسهلة التنفيذ في العديد من أنواع الخلايا17؛ ومع ذلك، قد تسبب أنظمة التسليم هذه طفرات وإعادة تنشيط الجينات المتحولة المتبقية، والتي تقدم قضايا السلامة لأغراض العلاج السريري12. فيروس سينداي (SeV) هو فيروس RNA غير تكاملي مع جينوم سلبي، واحد الذين تقطعت بهم السبل التي لا تندمج في الجينوم المضيف، ولكن يتكرر فقط في السيتوبلازم من الخلايا المصابة، وتقديم وسيلة فعالة وآمنة لإعادة برمجة18 ،19. تتوفر متجهات SeV المؤتلفة التي تحتوي على عوامل إعادة برمجة بما في ذلك OCT3/4الإنسان، SOX2، KLF4 و c-MYC في إطارات القراءة المفتوحة الخاصة بهم. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن زيادة تحسين ناقلات الفيروس SeV عن طريق إدخال طفرات حساسة لدرجة الحرارة، بحيث يمكن إزالتها بسرعة عندما يتم رفع درجة حرارة الثقافة إلى 39 درجة مئوية20. في هذه المقالة، نقوم بوصف بروتوكول لإعادة برمجة PBMNCs إلى iNSCs باستخدام نظام SeV.

وقد ذكرت العديد من الدراسات اشتقاق الخلايا العصبية DA من ESCs الإنسان أو iPSCs باستخدام أساليب مختلفة6،8،21. ومع ذلك، هناك نقص في البروتوكولات التي تصف التمايز بين الخلايا العصبية DA من iNSCs في التفاصيل. في هذا البروتوكول، سوف نقوم بوصف الجيل الفعال من الخلايا العصبية DA من iNSCs باستخدام طريقة على مرحلتين. يمكن زرع السلائف العصبية DA في striatum من نماذج الماوس PD لتقييمات السلامة والفعالية. ستقدم هذه المقالة بروتوكول مفصل يغطي مراحل مختلفة من جيل الخلايا الجذعية العصبية المستحثة بفيروس سينداي، تمايز الـ iNSCs في الخلايا العصبية DA، وإنشاء نماذج PD الماوس، إلى زرع سلائف DA في السترياتوم من نماذج PD. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن للمرء أن يولد iNSCs من المرضى والمانحين الأصحاء وتستمد الخلايا العصبية DA التي هي آمنة، قابلة للتوحيد القياسي، قابلة للتحجيم ومتجانسة لأغراض زرع الخلايا، أو لنمذجة PD في طبق والتحقيق في الآليات بداية المرض الكامنة والتنمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ويجب أن تتبع جميع الإجراءات المبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات المؤسسية للبحوث البشرية. يجب الحصول على موافقة مستنيرة من المرضى أو المتطوعين الأصحاء قبل جمع الدم. وقد وافقت لجنة أخلاقيات البحوث البشرية التابعة للمؤسسة على هذا البروتوكول، وتم تنفيذه وفقاً للمبادئ التوجيهية للمؤسسة المتعلقة برعاية الحيوانات واستخدامها.

1 - جمع مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم وعزلها وتوسيع نطاقها

  1. جمع مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم
    1. جمع 10-20 مل من الدم الوريدي المحيطي للمتبرع عن طريق الوريد مع قارورة حافظة الهيبارين الصوديوم.
      ملاحظة: يجب تخزين عينات الدم أو شحنها في درجة حرارة الغرفة (RT). معالجة عينات الدم في غضون 24 ساعة.
  2. إعداد وسط الثقافة
    1. إعداد المصل المتوسط الحر (SFM) عن طريق الجمع بين المكونات التالية: 245 مل من وسيط دولبكو المعدل ة (IMDM)، 240 مل من F-12 لحم الخنزير، 5 مل من الأنسولين ترانسفيرين سيلينيوم-X الملحق (ITS-X)، 5 مل من 100X محلول مخزون الجلوتامين(جدول المواد)،5 مل من تركيز الدهون المعرفة كيميائيا، 2.5 غرام من مصل البقر الجنيني، 0.025 غرام من حمض الاسكوربيك و 9 ميكرولتر من 1-ثيوغليسيرول. تصفية المتوسطة وتخزينها في 4 درجة مئوية.
      تحذير: حمض الاسكوربيك و 1-ثيوغليسيرول سامة عن طريق ملامسة الجلد والاستنشاق.
    2. لإعداد الخلية أحادية النووية (MNC) المتوسطة، تكملة وسط SFM مع 10 نانوغرام / مل إنترلوكين الإنسان 3 (IL-3)، 2 U /mL الاريثروبويتين (EPO)، 100 نانوغرام / مل عامل الخلايا الجذعية البشرية (SCF)، 40 نانوغرام / مل عامل النمو البشري مثل الأنسولين 1 (منتدى إدارة الإنترنت-1)، 100 ميكروغرام / مل هولو ترانسفيرين و 1 الكساميثازون. تصفية المتوسطة وتخزينها في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: تحضير الوسيطة مباشرة قبل الاستخدام.
  3. عزل مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم
    1. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم مقاعد البدلاء نظيفة قبل الاستخدام. تعقيم جميع الأسطح والمعدات مع الكحول 75٪. تعقيم جميع النصائح باستخدام الأوتوكلاف.
    2. نقل الدم المحيطي (PB) إلى أنبوب مخروطي 50 مل وتخفيف PB مع حجم متساو من المالحة المعقمة دولبكو المخزنة الفوسفات (D-PBS).
    3. إعداد 15 مل من الكثافة المعقمة التدرج المتوسطة (جداولالمواد)في أنبوب مخروطي 50 مل آخر.
      ملاحظة: الاحتفاظ بوسط تدرج الكثافة وPB في RT للسماح بعزل أفضل للمركبات متعددة البروم ثنائية الفينيل.
    4. إمالة الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على وسط تدرج الكثافة عند زاوية 45 درجة، ثم وضع ببطء وبعناية 30 مل من PB المخفف على وسط تدرج الكثافة.
      ملاحظة: خذ الرعاية والسماح للPB لتشغيل ببطء أسفل جانب الأنبوب المخروطي على الطبقة المتوسطة التدرج الكثافة. سوف تترسب خلايا الدم الحمراء في الجزء السفلي من الأنبوب. إمالة الأنبوب بعناية لتقليل تعطيل واجهة الطبقة.
    5. طرد مركزي الأنابيب في 800 × ز لمدة 15 دقيقة في RT مع الفرامل الطرد المركزي تعيين في موقف "إيقاف". قم بإستنسخ طبقة البلازما العلوية الصفراء وتجاهلها. ثم نقل طبقة بيضاء بيضاء رقيقة الفيلم تحتوي على MNCs مع ماصة 10 مل إلى أنبوب مخروطي 50 مل جديدة.
      ملاحظة: إيقاف تشغيل فرامل الطرد المركزي أمر مهم لعزل الشركات المتعددة الجنسيات.
    6. إضافة 30 مل من D-PBS إلى الأنبوب مع MNCs والطرد المركزي في 600 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant ثم قم بإضافة 45 مل من D-PBS لإعادة تعليق الخلايا. الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب تشغيل فرامل الطرد المركزي لهذا وخطوات الطرد المركزي التالية. كما الكريات الخلية كثيفة، إضافة 1-2 مل من D-PBS لإعادة تعليق الكريات بلطف، ثم إضافة D-PBS إلى 45 مل.
    7. تجاهل supernatant وإعادة تعليق الخلايا مع 5 مل من D-PBS وعد الخلايا الحية مع أسلوب الاستبعاد الأزرق trypan.
    8. وبعد وضع الشركات المتعددة الجنسيات اللازمة للتوسع جانباً، قم بتجميد الخلايا المتبقية لاستخدامها في المستقبل.
      ملاحظة: يمكن تجميد ما لا يقل عن 5 × 106 MNCs في قارورة واحدة مع 1 مل من وسط التجميد (جدولالمواد). يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.
  4. توسيع الشركات المتعددة الجنسيات
    1. في اليوم -14، البذور MNCs في كثافة 2-3 × 106 خلايا لكل ملليلتر في بئر واحد من لوحات ستة آبار مع 1.5 مل من pre-warmed (37 °C) MNC المتوسطة. حضانة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لمدة 2 أيام.
    2. في اليوم -11، جمع الخلايا والمتوسطة مع ماصة معقمة ونقلإلى أنبوب مخروطي جديد 15 مل. طرد الخلايا في 250 × ز لمدة 5 دقائق في RT. تجاهل supernatant وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من درجة حرارة مسبقة (37 درجة مئوية) MNC المتوسطة.
    3. عد الخلايا القابلة للحياة مع الأزرق تريبان. بذور MNCs في كثافة 1 × 106 خلايا لكل ملليلتر في MNC ما بين الوسائل المالية الدافئة مسبقا المتوسطة وحضانة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لمدة 3 أيام.
      ملاحظة: من المتوقع أن إجمالي عدد الخلايا قد إنقاص في اليوم -11.
    4. في اليوم -8، كرر الخطوات 1.4.2-1.4.3 وثقافة الخلايا لمدة 3 أيام.
    5. في اليوم -4، كرر الخطوات 1.4.2-1.4.3 وثقافة الخلايا لمدة 3 أيام.
      ملاحظة: بعد 14 يوماً من الثقافة، ينبغي أن يبقى عدد متساوٍ أو أكبر من الشركات المتعددة الجنسيات في الثقافة.

2 - إعادة برمجة مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم في النفثالينات المتعددة الجنسيات بواسطة عدوى النفثالينات المتعددة الأطراف

  1. إعداد الوسيط والثقافة
    1. إعداد حل مخزون بولي د-يسين (PDL) عن طريق حل 100 ملغ من PDL مع 100 مل من H2O إلى تركيز 1 ملغ / مل. يخزن عند -20 درجة مئوية في 1 مل aliquots.
    2. إعداد محلول مخزون الأنسولين عن طريق حل 100 ملغ من الأنسولين في 20 مل من 0.01 N حمض الهيدروكلوريك إلى تركيز 5 ملغ / مل. يخزن عند -20 درجة مئوية في 1 مل aliquots.
    3. لإعداد 200 مل من الوسط القاعدي iNSC، والجمع بين 96 مل من DMEM-F12 و 96 مل من المتوسطة الأساسية (جدولالمواد)مع 2 مل من 100X محلول مخزون الجلوتامين، 2 مل من الأحماض الأمينية غير الضرورية (NEAA)، 2 مل من الملحق N2 و 2 مل من الملحق B27. إضافة 10 نانوغرام / مل المؤتلف سرطان الدم البشري عامل مثبط، 3 μM CHIR99021 و 2 μM SB431542 قبل الاستخدام. تصفية المتوسطة وتخزينها في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: استخدم الوسيطة في غضون أسبوعين. إضافة المؤتلف عامل مثبطة لسرطان الدم البشري، CHIR99021 و SB431542 مباشرة قبل الاستخدام.
  2. إعادة برمجة مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم إلى الـ iNSCs عن طريق عدوى الـ SeV
    1. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم مقاعد البدلاء نظيفة قبل الاستخدام. تعقيم جميع الأسطح والمعدات مع الكحول 75٪. تعقيم جميع النصائح باستخدام الأوتوكلاف.
    2. في اليوم 0، جمع الخلايا في MNC المتوسطة ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل. طرد الخلايا في 200 × ز لمدة 5 دقائق.
    3. عد الخلايا القابلة للحياة مع الأزرق تريبان. إعادة تعليق الخلايا مع ما قبل تسخينها (37 درجة مئوية) MNC المتوسطة إلى تركيز 2 × 105 خلايا لكل بئر في لوحات 24 جيدا.
    4. بعد إزالة أنابيب SeV من -80 درجة مئوية التخزين، ذوبان الأنابيب التي تحتوي على SeV في حمام المياه 37 درجة مئوية لمدة 5-10 ثوان، ومن ثم السماح لهم بالذوبان في RT. بمجرد ذوبانها، وضعها على الجليد على الفور.
    5. إضافة SeV ترميز Klf4 الإنسان، أكتوبر 3/4، SOX2 و C-MyC إلى الآبار، في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 10. خلايا الطرد المركزي مع لوحات في 1000 × ز لمدة 30 دقيقة لتسهيل مرفق الخلايا. ترك الخلايا وsupernatant في لوحات. وضع لوحات في الحاضنة في 37 درجةمئوية، 5٪ CO 2.
      تحذير: يجب تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على SeV في خزانة السلامة، وينبغي التعامل مع جميع النصائح والأنابيب مع الإيثانول أو التبييض قبل التخلص منها.
    6. في اليوم الأول، نقل المتوسطة والخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. شطف البئر مع 1 مل من MNC المتوسطة. طرد مركزي تعليق الخلية في 200 × ز لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: استخدم لوحة منخفضة المرفقات 24 جيدا لمنع مرفق أي خلايا قبل الطلاء على PDL / لامينين.
    7. في اليوم 2، تمييع 1 مل من 1 ملغ / مل PDL مع 19 مل من D-PBS إلى تركيز 50 ميكروغرام / مل. طبقة 6-لوحات جيدا مع 50 ميكروغرام / مل PDL لمدة 2 ساعة على الأقل في RT.
    8. تمييع 200 ميكرولتر من 0.5 ملغ /مل لامينين مع 20 مل من D-PBS إلى تركيز 5 ميكروغرام/مل. يستنشق PDL في لوحات 6-جيدا، وتجف على مقاعد البدلاء نظيفة عمودية.
    9. طبقة 6-لوحات جيدا مع 5 ميكروغرام / مل لامينين وحضانة لمدة 4-6 ح في 37 درجة مئوية. يغسل مع D-PBS قبل الاستخدام.
    10. في اليوم 3، لوحة الخلايا المستحثة التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.2.6 في iNSC المتوسطة على PDL / laminin المغلفة 6-جيدا لوحات.
      ملاحظة: نقل لوحات بلطف إذا لزم الأمر بعد وضع الخلايا على لوحات PDL / laminin المغلفة، في محاولة لعدم إزعاج مرفق الخلايا.
    11. في اليوم 5، أضف 1 مل من التسخين المسبق (37 درجة مئوية) وسيط iNSC في كل بئر في 6 أطباق جيدا بلطف.
      ملاحظة: من المتوقع أن تتعرض الخلايا لوفاة شديدة (>60%)..
    12. في اليوم 7، أضف 1 مل من التسخين المسبق (37 درجة مئوية) وسيط iNSC في كل بئر في 6 أطباق جيدا بلطف.
    13. من اليوم 9 إلى اليوم 28، استبدال المتوسطة التي تنفق مع الطازجة قبل تسخينها (37 درجة مئوية) iNSC المتوسطة كل يوم. رصد ظهور مستعمرات iNSC. اختيار ونقل استنساخ iNSC للتوسع في حوالي 2-3 أسابيع. التقاط المستعمرات مع مورفولوجيا المناسبة باستخدام الماصات الزجاجية المحروقة، باستثناء أي خلايا ملوثة ربما، واستنشاق المستعمرات مع نصائح 200 ميكرولتر.
      ملاحظة: يمكن تجميد iNSCs المميزة للاستخدام في المستقبل مع مستعمرات 2-5 في قارورة واحدة. وتشمل وسيلة التجميد الوسط القاعدي الحر للمصل (جدول المواد) وكبريتيد ثنائي الميثيل مختلطاً بنسبة 9:1، التي ينبغي إعدادها مباشرة قبل الاستخدام. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.

3. تمايز iNSCs إلى الخلايا العصبية الدوبامين

  1. إعداد الوسيط والثقافة
    1. إعداد 200 مل من iNSC التمايز الوسط القاعدي عن طريق الجمع بين 192 مل من DMEM-F12 مع 2 مل من 100X محلول مخزون الجلوتامين, 2 مل من NEAA, 2 مل من الملحق N2 و 2 مل من الملحق B27.
      ملاحظة: استخدم الوسيطة في غضون أسبوعين.
    2. إعداد iNSC التمايز المرحلة الأولى المتوسطة عن طريق استكمال iNSC التمايز الوسط القاعدي ة مع 1 μM SAG1 و 100 نانوغرام / مل FGF8b.
      ملاحظة: استخدم الوسيطة في غضون أسبوعين.
    3. إعداد iNSC التمايز المرحلة 2 المتوسطة عن طريق استكمال iNSC التمايز الوسط القاعدي مع 0.5 مل دوري أدينوسين أحادي الفوسفات (cAMP), 0.2 Mحمض الاسكوربيك, 10 ΜM DAPT, 10 نانوغرام / مل الدماغ المستمدة عامل التغذية العصبية (BDNF), 10 نانوغرام / مل غليال مشتقة عامل نيوتروفيك (GDNF) و 1 نانوغرام/مل تحويل عامل النمو βIII (TGF-βIII).
      ملاحظة: استخدم الوسيطة في غضون أسبوعين.
  2. طلاء أطباق الثقافة
    1. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم مقاعد البدلاء نظيفة قبل الاستخدام. تعقيم جميع الأسطح والمعدات مع الكحول 75٪. تعقيم جميع النصائح باستخدام الأوتوكلاف.
    2. لطلاء PDL، يوم واحد على الأقل قبل إعادة طلاء الخلايا، تخفيف 1 مل من 1 ملغ / مل PDL مع 19 مل من D-PBS إلى تركيز 50 ميكروغرام / مل. معطف 12 مم الأغطية الزجاجية التي تم تعقيمها مع الكحول 75٪ في لوحات 24 جيدا مع 50 ميكروغرام / مل PDL في RT لمدة 2 ساعة على الأقل.
    3. بالنسبة لطلاء اللامينين، تمييع 200 ميكرولتر من 0.5 ملغم/مل لامينين مع 20 مل من D-PBS إلى تركيز 5 ميكروغرام/مل. يستنشق PDL وتجفيف الآبار في مقاعد البدلاء نظيفة. قم بقص الأغطية عيار 12 مم مع 5 ميكروغرام/مل لامينين وحضانة لمدة 4-6 ساعة عند 37 درجة مئوية. يغسل مع D-PBS قبل الاستخدام.
  3. خلايا المرور للتمايز.
    1. عندما يصل التقاء iNSCs المستزرع ة إلى 70-90٪، يستنشق المتوسطة من لوحة الثقافة، وإضافة 1 مل من D-PBS لغسل الخلايا. إضافة 1 مل من الكاشف ينفصل الخلية قبل تسخينها (37 درجة مئوية) (جدولالمواد)لكل بئر وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق لتفكك الخلايا.
    2. بعد الحضانة لمدة 3 دقائق، أصبحت الخلايا شبه عائمة. إضافة 3 مل من pre-warmed (37 درجة مئوية) DMEM-F12 المتوسطة لكل بئر، وخلايا ماصة صعودا وهبوطا لتفكك الكريات الخلية في خلايا واحدة.
    3. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل، والطرد المركزي في 250 × ز لمدة 3 دقائق.
    4. عد الخلايا باستخدام أسلوب الاستبعاد الأزرق trypan. لوحة 5 × 103 خلايا لكل غطاء زجاجي 12 مم في لوحات 24 جيدا وحضانة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
  4. تمييز iNSCs في الخلايا العصبية الدوبامين.
    1. بدء التمايز 24 ساعة بعد إعادة طلاء الخلايا على PDL / لامينين المغلفة الأغطية. يستنشق ثقافة المتوسطة، وغسل الخلايا مرة واحدة مع D-PBS، ومن ثم إضافة 600 درجة مئوية من مرحلة التمايز قبل تسخينها أنا المتوسطة لكل بئر في لوحات 24 جيدا وحضانة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
    2. تغيير المتوسطة كل يوم من اليوم 1 إلى يوم 10 خلال المرحلة الأولى من التمايز.
    3. في اليوم 10، يستنشق وسط الثقافة، وغسل الخلايا مرة واحدة مع D-PBS. إضافة 600 درجة مئوية من مرحلة التمايز قبل الدفء (37 درجة مئوية) وسط 2 لكل بئر في لوحات24 جيدا وحضانة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
    4. تغيير المتوسطة كل يوم من اليوم 11 إلى اليوم 25 خلال المرحلة الثانية من التمايز. يمكن إصلاح الخلايا المتمايزة من قبل paraformaldehyde في نقاط زمنية مختلفة للتحليل.
    5. لتلطيخ الفلورسنت المناعي، اغسل الخلايا مع D-PBS ثلاث مرات بلطف في نقاط الوقت المختارة في يوم التمايز 11 إلى 25.
    6. ماصة 300 ميكرولتر من السطحي غيرالأيونية (جدول المواد) في 100 مل من PBS لجعل السطحي غير الأيونية 0.3٪ في PBS.
      تحذير: السطحي غير الأيونية سامة عن طريق ملامسة الجلد والاستنشاق.
    7. إصلاح الخلايا مع 4٪ بارافورمالدهايد لمدة 10 دقيقة في RT. ثم يغسل مع 0.3٪ في PBS ثلاث مرات.
      تحذير: البارافورمالهايد سام عن طريق ملامسة الجلد واستنشاقه.
    8. سد الخلايا بنسبة 3٪ مصل الحمار لمدة 2 ساعة في RT.
    9. تمييع الجسم المضاد الأساسي في مصل الحمير بنسبة 1٪ بتركيز مناسب وtriturate بلطف لخلط. إضافة 300 درجة مئوية من محلول الأجسام المضادة الأولية لكل بئر من لوحة 24 جيدا. حضانة الخلايا في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. غسل الخلايا مع 0.3٪ السطحي غير الأيونية في PBS ثلاث مرات.
    10. تمييع الجسم المضاد الثانوي في 1٪ مصل الحمار في تركيز مناسب وtriturate بلطف لخلط. إضافة 300 درجة مئوية من محلول الأجسام المضادة الثانوية إلى كل بئر من لوحة 24 جيدا. احتضان الخلايا في RT لمدة 2 ساعة، محمية من الضوء.
    11. غسل الخلايا مع 0.3٪ السطحي غير الأيونية في PBS ثلاث مرات. تخفيف 4', 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) مع PBS مع تخفيف 1:500. احتضان الخلايا في كل بئر من لوحة 24 جيدا مع 300 درجة مئوية من DAPI المخفف لمدة 15 دقيقة في RT، محمية من الضوء. غسل الخلايا مع 0.3٪ السطحي غير الأيونية في PBS ثلاث مرات.
    12. تأخذ بلطف من الأغطية من آبار لوحات مع ملقط. جافة في الظلام بين عشية وضحاها في RT. جبل تحت المجهر الفلوري.

4. إنشاء من جانب واحد 6-الهيروكسيدوبامين (6-OHDA) -الآفات PD نماذج الماوس

  1. لتوليد نماذج الماوس PD لزرع الخلايا، واستخدام الذكور البالغين SCID-البيج الفئران وزنها 20-25 غرام لحقن 6-OHDA.
  2. إعداد الأدوية للجراحة
    1. إعداد محلول حمض الاسكوربيك 0.2٪ عن طريق حل 0.2 غرام من حمض الاسكوربيك في 100 مل من محلول ملحي معقم (0.9٪) وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى يتم استخدامها. في يوم الجراحة، تمييع 0.2٪ محلول حمض الاسكوربيك من قبل 10 مرات للحصول على محلول حمض الاسكوربيك 0.02٪.
      ملاحظة: يتم إضافة حمض الاسكوربيك لمنع أكسدة 6-OHDA إلى شكل غير نشط.
    2. لإعداد حل 6-OHDA، تزن كمية مناسبة من 6-OHDA في أنبوب معقمة 1 مل، ومن ثم إضافة بعض حجم حمض الاسكوربيك 0.02٪ لجعل 5 ميكروغرام / ميكرولتر 6-OHDA الحل. يُرفع المزيج إلى أن يذوب. ضع 6-OHDA على الجليد حتى الاستخدام.
      ملاحظة: 6-OHDA هو درجة الحرارة والضوء الحساسة. كن حذرا لحماية الحل من الضوء وإبقائه على الجليد قبل الاستخدام.
  3. إعداد المعدات الجراحية المعقمة عن طريق الأوتوكلاف قبل الجراحة. تنظيف جميع المعدات والمناطق السطحية مع الإيثانول عند إعداد الإطار stereotaxic. إعداد قفص استعادة الماوس تحت مصباح التدفئة.
  4. إجراء عملية جراحية لإنشاء نماذج الماوس من جانب واحد 6-OHDA-الآفة.
    1. وزن كل فأر، وتسجيل الوزن وحساب كمية الدواء الذي يحتاج إلى أن تدار. يتلقى كل فأر 0.5 ملغم/كغم من الأتروبين 20 دقيقة قبل العمليات. التخدير الماوس مع 80 ملغ / كغ الكيتامين و 10 ملغ / كغ xylazine.
    2. إدارة 0.5 مغ/كغ الأتروبين عن طريق الحقن داخل قنابية.
    3. التخدير الماوس مع 80 ملغ / كغ الكيتامين و 10 ملغ / كغ xylazine عن طريق الحقن داخل اقابية 20 دقيقة بعد إعطاء الأتروبين.
    4. ضع الماوس في غرفة مغلقة. بعد 3-5 دقائق، سيتم التخدير بعمق الماوس دون استجابة لقرصة الساق الخلفية.
      ملاحظة: من المتوقع أن الفأر الذي تلقى التخدير سوف تواجه فترة الإثارة.
    5. حليقة رأس الماوس وتطبيق مرهم العين الاريثروميسين على عيون الماوس للحماية من تطوير قرحة القرنية.
    6. وضع الماوس على جهاز stereotaxic. إصلاح الماوس مع أشرطة القاطع أولا. أدخل أكواب الأذن بشكل صحيح لجعل رأس الماوس في وضع مسطح وآمن.
    7. تعقيم رأس الماوس مع اليود البوفيدون والكحول ايزوبروبيل. قطع شق المترهل (~ 1.5 سم) على جلد الرأس مع شفرة مشرط، وفضح الجمجمة. اضبط شريط القواطع وقضبان الأذن لتقليل فرق الارتفاع بين البريما ولامدا إلى أقل من 0.1 مم.
      ملاحظة: يقع بريغما الماوس عند تقاطع الغرز الإكليلية والمترهلة، ويقع لامدا عند تقاطع الغرز اللامدوية والمترهلة.
    8. تتحرك ببطء وخفض غيض من الإبرة نحو بريجما وعلاج بريغا كنقطة الصفر. نقل الطرف إلى موضع مع إحداثيات A /P +0.5 مم، M/L -2.1 مم نسبة إلى بريغا. اسحب الطرف ووضع علامة على النقطة. حفر حفرة صغيرة في الجمجمة.
    9. استخراج 2 ميكرولتر من 5 ميكروغرام / ميكرولتر 6-OHDA الحل في المحقنة الدقيقة (جدولالمواد). إرجاع الإبرة إلى النقطة التي تم وضع علامة عليها، وإدراج الإبرة إلى D / V -3.2 ملم.
    10. حقن 2 ميكرولتر من 5 ميكروغرام/ميكرولتر 6-OHDA الحل (10 ميكروغرام المجموع) بمعدل 1 ميكرولتر / دقيقة. بعد الانتهاء من حقن 6-OHDA، وترك الإبرة في مكانها لمدة 5 دقائق أخرى. ثم سحب إبرة الحقن ببطء.
    11. أغلق الشق مع الغرز وتطبيق مرهم العين الاريثروميسين على عيون الماوس. تقديم 0.5 مل ملحي تحت الجلد لمنع الجفاف، وتطبيق مرهم المضادات الحيوية مباشرة على الجلد خياطة.
    12. إزالة الماوس من جهاز stereotaxic ووضعها في قفص الانتعاش. وضع الماوس مرة أخرى والسماح بالوصول إلى الغذاء والماء حتى يستعيد وعيه. علاج الماوس مع مسكن في مياه الشرب يوميا بعد الجراحة لمدة 2-3 أيام، والجرعة الموصى بها من ايبوبروفين هو 0.03 ملغ / غرام من وزن الجسم في اليوم الواحد.
    13. فحص الماوس يوميا بعد الجراحة.

5. التقييم السلوكي بعد من جانب واحد 6-OHDA الآفات

  1. بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من الجراحة، إجراء تقييم سلوكي لتقدير أعراض PD. وزن كل فأر، وتسجيل وزنهم وحساب كمية الدواء التي ينبغي أن تدار (0.5 ملغ / كغ أبومورفين قبل التقييم).
  2. إدارة 0.5 مغ/كغ أبومورفين عن طريق الحقن تحت الجلد قبل التقييم ووضع الماوس في اسطوانة زجاجية.
  3. بعد فترة سكن لمدة 5 دقائق، عد عدد الدورات التعارضية وipsilateral نسبة إلى الجانب الآفة في الدقيقة الواحدة وتسجيل نشاطهم مع كاميرا فيديو.
  4. تعتبر الفئران ذات الدوران اتّسحد ناقص ipsilateral >7 دورة في الدقيقة/دقيقة ناجحة ومختارة كمرشحين لتجارب زرع الخلايا. أعد الفئران إلى أقفاص السكن بعد 30 دقيقة من الراحة.
    ملاحظة: إذا كان الماوس قد أُفِّر بنجاح، فإن الماوس المحقون 6-OHDA سوف يظهر تحيزًا أكبر في التحول نحو الجانب المنافي لأن ناهض DA ينشط striatum denervated فائق الحساسية من الجانب المُقمّر غالبًا.
  5. إجراء التقييم السلوكي قبل أسبوع واحد و2، 4، 6، 8، 12، 16 أسابيع بعد زرع الخلايا.

6- زرع الخلايا لسلائف DA

  1. إعداد تعليق الخلية للزرع. لتطعيم الخلايا، تعليق 2 × 105 السلائف DA مختلطة من قبل D10 و D13 DA السلائف بنسبة 1:7 في 4 ميكرولتر من 5 غرام L-1 الجلوكوز في محلول الملح المتوازن (جدولالمواد)من زرع العازلة.
  2. إجراء جراحة زرع الخلايا بعد الإجراءات الموضحة في القسم 4.4، باستثناء أن 6-OHDA يتم استبدالها بتعليق الخلايا السليفة DA أو العازلة.
  3. إجراء التقييم السلوكي 2، 4، 6، 8، 12، 16 أسابيع بعد زرع الخلايا من سلائف DA بعد الإجراءات الموصوفة في القسم 5. عد عدد الدورات المضادة الناجمة عن apomorphine نسبة إلى الجانب الآفة في الدقيقة الواحدة وتسجيل نشاطهم مع كاميرا فيديو.
    ملاحظة: بعد الزرع، يشير انخفاض معدل الدوران اتّصالي إلى تحسين وظيفة المحرك.
  4. في 4، 8، 12، و 16 أسابيع بعد زرع الخلايا، وperfuse الماوس تحت التخدير العميق مع 4٪ paraformaldehyde حتى يصبح جسم الماوس قاسية والكبد من الماوس يصبح شاحبا.
  5. فصل الدماغ من الماوس بلطف ووضع الدماغ في 4٪ بارافورماليدهايد في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  6. في اليوم الثاني، ضع الدماغ في 30٪ السكروز للجفاف حتى يغرق الدماغ إلى القاع.
  7. شريحة العقول في سمك 40 درجة مئوية باستخدام ميكروتومي تجميد.
  8. إجراء تلطيخ المناعة كما هو موضح سابقا في الخطوات 3-4-5-3-4-12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هنا، نقوم بالإبلاغ عن بروتوكول يغطي مراحل مختلفة من العلاج الخلوي iNSC-DA لعلاج نماذج PD. أولاً، تم عزل مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم وتوسيعها، وإعادة برمجتها لتصبح من الـ iNSCs عن طريق عدوى الـ SeV. ويرد في الشكل 1تمثيل تخطيطي للإجراءات مع توسيع PBMNC وتحريض iNSC. وفي اليوم -14، تم عزل مركبات ثنائي الفينيلمتعدد البروم باستخدام وسيط تدرج الكثافة (جدول المواد). قبل الطرد المركزي، تم فصل الدم المخفف مع PBS وكثافة التدرج المتوسطة إلى طبقتين. بعد الطرد المركزي، ظهرت أربع طبقات متدرجة (من أسفل إلى أعلى): الطبقة السفلية تحتوي على المحببات وكريات الدم الحمراء. تحتوي الطبقة الثانية على وسط تدرج الكثافة؛ أما الثالثة فتحتوي على مركبات ثنائية الفينيل متعددة البروم (سهم أحمر)؛ تحتوي الطبقة العليا على البلازما الغنية بالصفائح الدموية (الشكل2A). بعد 14 يوما من التوسع، تم إصابة PBMNCs مع SeV كما اليوم 0. في اليوم 1، تمت إزالة المتوسطة مع SeV (الشكل2B). وكما هو موضح في الشكل 2باء، من المتوقع أن يتم تخفيض عدد الخلايا تدريجيا. تعرضت الخلايا لوفاة شديدة (>60%) حتى اليوم 5 (الشكل2ب). ظهرت مستعمرات iNSC في اليوم 12 في أقرب وقت (الشكل2B). بعد التقاط ونقل استنساخ iNSC للتوسع لعدد من المقاطع، يظهر مورفولوجيا الخلايا في الشكل 2C. وأظهرت المراكز الانسانجية القومية المتوسطة وجود مورفولوجيا جيدة ويمكن أن تجدد نفسها بدرجة كبيرة في وسط iNSC، إما في شكل طبقة أحادية أو كمجالات (الشكل2جيم).

iNSCs يمكن أن تؤدي إلى الخلايا العصبية DA باستخدام طريقة على مرحلتين (الشكل1). خلال المرحلة الأولى التي استمرت 10 أيام، تم التعامل مع iNSCs مع SAG1 وFGF8b للحث على مواصفات خلايا لوحة أرضية VM مع إمكانات العصبية. ثم تم التعامل مع الخلايا مع حمض الاسكوربيك، BDNF، GDNF، AMP، DAPT، TGF-βIII في المرحلة الثانية (الشكل 1). مع هذا الأسلوب على مرحلتين، يمكن الحصول على السلائف DA قرب نهاية المرحلة الأولى، ويمكن توليد الخلايا العصبية DA أكثر نضجا في نهاية المرحلة الثانية. بعد 24 يوما من التمايز، يمكن تحديد iNSCs بكفاءة إلى الخلايا العصبية DA كما أعرب معظمهم forkhead مربع A2 (FOXA2)، الفئة الخاصة بالخلايا العصبية III β-tubulin (TUJ1) وهيدروكسيلاز التيروزين (TH) (الشكل 3).

بعد ثلاثة أسابيع من إنشاء نماذج الماوس PD من جانب واحد 6-OHDA-الآفات، تم إجراء تقييم سلوكي لتقدير أعراض PD (الشكل4A). ثم بعد أسبوع واحد، تم زرع السلائف الدوبامين إلى نماذج الماوس PD (الشكل4A). تم إجراء التقييم السلوكي قبل أسبوع واحد و2، 4، 6، 8، 12 أسبوع بعد زرع الخلايا (الشكل4A). وأظهرت الفئران التي تلقت زرع الخلايا تحسنا كبيرا في وظيفة المحرك (الشكل4باء). ويمكن التحقق من مدى 6-OHDA الناجمة عن الآفات عن طريق تلطيخ الفلورسنت المناعي بعد الوفاة لTH في striatum، حزمة الدماغ الأمامي الوسيط (MFB) وSNpc (الشكل4C). تم استعادة الإشارات الإيجابية TH في الفئران غير المشروعة إلى حد كبير في السترياتوم حيث تم زرع الخلايا وتعافى بشكل معتدل في SNpc (الشكل4C). بعد ثلاثة أشهر من زرع، حوالي 13.84٪ كانت الخلايا العصبية TH+ DA بين الخلايا الباقية على قيد الحياة (الشكل4D،E). تم التعبير عن حوالي 91.72٪ و 86.76٪ من TH+ الخلايا مستقبلات النووية اليتيمة (NURR1) وFOXA2، على التوالي (الشكل4D،E). حوالي 98.77٪ من TH+ تم تسمية الخلايا مع G-البروتين المقترنة بالمعدل الداخلي البوتاسيوم (GIRK2) (الشكل4D،E).

Figure 1
الشكل 1 تمثيل تخطيطي للإجراءات المتعلقة بتوسيع PBMNC، وتحريض iNSC وتمييز iNSCs في سلائف DA. تم عزل PBMNCs وتوسيعها في MNC المتوسطة لأكثر من 14 يوما، ومن ثم إصابة مع SeV ترميز SOX2 البشرية، OCT3/4، ج-MYC وKLF4. ظهرت مستعمرات iNSC في وقت مبكر من 12 يوما بعد العدوى SeV. بعد 3-4 أسابيع، تم اختيار مستعمرات iNSC وتمييزها في سلائف DA بطريقة من مرحلتين. PBMNCs: خلايا الدم الطرفية أحادية النووية؛ MNC: الخلايا أحادية النووية; iNSCs: الخلايا الجذعية العصبية المستحثة; SeV: فيروس سينداي; DA: الدوبامين; PDL: بولي-د-يسين; BDNF: عامل التغذية العصبية المستمدة من الدماغ; GDNF: عامل التغذية العصبية المستمدة من خط الخلايا الغلية; AA: حمض الاسكوربيك; cAMP: ثنائي بوتيرايلادينوسين دوري أحادي الفوسفات; TGF: تحويل عامل النمو. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 يتم عزل PBMNCs وتوسيعها، ثم إعادة برمجتها إلى iNSCs عن طريق عدوى SeV. (أ) مثال على مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم قبل وبعد الطرد المركزي التدرجي. قبل الطرد المركزي، تم فصل عينات الدم المخففة وكثافة التدرج المتوسط إلى طبقتين. بعد الطرد المركزي، أربع طبقات تدرج الكثافة شكلت من أسفل إلى أعلى: الطبقة السفلية تحتوي على المحببات وكريات الدم الحمراء. تحتوي الطبقة الثانية على وسط تدرج الكثافة؛ تحتوي الطبقة الثالثة على مركبات PBMNCs (سهم أحمر)؛ تحتوي الطبقة العليا على البلازما الغنية بالصفائح الدموية. (ب) صور للمورفولوجيا النموذجية للخلايا بعد إصابة مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم بفيروس نقص المناعة البشرية في الأيام 1 و2 و5 و12. وبعد إصابة مركبات PBMNCs بفيروس نقص المناعة البشرية، ماتت بعض الخلايا وانخفض عدد الخلايا تدريجياً. وبقي عدد قليل من الخلايا في اليوم الخامس. في اليوم 12، ظهرت مستعمرات iNSCs. شريط مقياس، 100 ميكرومتر. (ج) المورفولوجيا النموذجية للـ iNSCs من المقطع رقم 20 في ثقافة الطبقة الأحادية والمجال. شريط مقياس، 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 تمايز iNSCs إلى الخلايا العصبية الدوبامين. تلطيخ الفلورسنت المناعي لFOXA2، TH، TUJ1، DAPI والصور المدمجة في اليوم 24 على الخلايا المتمايزة عن iNSCs. شريط مقياس، 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 زرع السلائف DA المختلفة iNSC في نماذج الماوس PD من جانب واحد 6-OHDA-الآفات. (أ) الجدول الزمني لزراعة الخلايا والاختبارات السلوكية. (B) نتائج الاختبارات السلوكية في نقاط زمنية مختلفة من مجموعة الخلايا 6-OHDA + (n = 10) و 6-OHDA+ مجموعة المخزن المؤقت (n = 8) ومجموعة التحكم (n = 3). يتم عرض البيانات على أنها متوسط ± خطأ قياسي من المتوسط (SEM). p < 0.001 بتحليل ثنائي الاتجاه للفرق (ANOVA) مع اختبار المقارنة المتعددة لـ Dunnett. (C) تلطيخ الفلورسنت المناعي بعد الوفاة لTH في striatum، حزمة الدماغ الأمامي الأوسط (MFB) وsubstantia نيغرا (SN) من 6-OHDA-leisioned نصف الكرة الأرضية، 6-OHDA + خلايا نصف الكرة الأرضية، ومجموعة التحكم. قضبان مقياس، 100 ميكرومتر. (د) النسب المئوية من FOXA2/TH، NURR1/TH، GIRK2/TH، TH / HNA في الفئران غير المشروعة بعد 3 أشهر من زرع. HNA: الأجسام المضادة النوى البشرية. يتم تقديم البيانات على أنهايعني ± SEM. (E) تلطيخ الفلورسنت المناعي لFOXA2، NURR1، GIRK2، TH وHNA على شرائح الدماغ من الفئران PD 12 أسابيع بعد زرع الخلايا. HNA: الأجسام المضادة النوى البشرية. تم تعديل هذا الرقم من يوان وآخرون11. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا قدمنا بروتوكول التي غطت مراحل مختلفة من العلاج الخلوي iNSC-DA لنماذج PD. وتشمل الجوانب الحاسمة لهذا البروتوكول ما يلي: (1) عزل وتوسيع مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم، وإعادة برمجة مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم في النفثالينات المتعددة البروم على النفثالينات المتعددة الأطراف عن طريق العدوى بفيروس نقص المناعة إلى جانب الـ SeV، (2) التمييز بين النفثالينات والأمراض المنقولة بالاتصال الجنسي بالخلايا العصبية في دا، (3) إنشاء نماذج ماوس PD أحادية 6-OHDA وسلوكية تقييم، و (4) زرع الخلايا من السلائف DA والتقييم السلوكي.

في هذا البروتوكول، يتضمن الجزء الأول جمع وتوسيع PBMNCs في وسط خالية من المصل (MNC المتوسطة)، والتي توسع بشكل تفضيلي الكريات الحمر ولا تدعم انتشار الخلايا الليمفاوية. في الدراسات السابقة، تم إعادة برمجة العديد من أنواع الخلايا الجسدية إلى iPSCs أو iNSCs12،13،14. وبالمقارنة مع الأنواع الأخرى من الخلايا الجسدية، تمتلك مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم عدة مزايا. الميزة الأكثر أهمية هي أنماط التعبير الجيني المواتية وملامح علم الوراثة. وتكون مركبات PBMNCs قصيرة العمر في الجسم الحي ويتم تجديدها بشكل متكرر من الخلايا الجذعية المكونة للدم المنشطة، وقد تتراكم طفرات أقل من الخلايا الليفية الجلدية. أيضا، فإن طريقة تذوق PBMNCs أقل الغازية من تلك التي للفليولس، ويستغرق فترة أقصر من الوقت لتوسيع PBMNCs (حوالي 14 يوما) مقابل الخلايا الليفية (حوالي 28 يوما)16،22. وبعد الطرد المركزي باستخدام وسيط تدرج الكثافة، تتشكل أربعة تدرجات الكثافة من أسفل إلى أعلى؛ الطبقة السفلية تحتوي على المحببات وكريات الدم الحمراء، والطبقة السفلى الثانية تحتوي على وسط تدرج الكثافة، والطبقة الثالثة تحتوي على MNCs، والطبقة العليا تحتوي على البلازما. ويختلف محصول مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم عادة بين الأفراد، ولا سيما الأفراد من مختلف الأعمار. وبوجه عام، يميل الشباب إلى أن يكون عدد هم أكبر من عدد مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم من كبار السن. ومع البروتوكول الموصوف، يمكن عزل حوالي 1.8-3.4 x 107 PBMNCs من 15 مل من PB. ومن بين مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم، فإن CD34+ الخلايا الجذعية المكونة للدم معرضة نسبياً لإعادة البرمجة، وقد تثري وسائل MNC CD34+ الخلايا الجذعية المكونة للدم إلى حد ما. ومن المتوقع أن يبقى عدد متساو أو أكبر من الخلايا المرئية المستزرعة مع وسط MNC بعد 14 يوما من التوسع. SeV، وهو فيروس غير تكاملي RNA، لديه شعور سلبي، واحد تقطعت بهم السبل، الجينوم غير مجزأة التي لا تندمج في الجينوم المضيف، ولكن يكرر فقط في السيتوبلازم من الخلايا المصابة18،19. المؤتلف SeV ترميز عوامل إعادة برمجة OCT3/4، SOX2، KLF4 و c-MYC،يمكن أن تولد كمتحولة حساسة لدرجة الحرارة، والتي يمكن إزالتها بسهولة في 39 درجة مئوية20. مع هذا البروتوكول، استمدنا 8-20 مستعمرات iNSC عن طريق إعادة برمجة PBMNCs من متطوع أو مريض صحي واحد باستخدام 15 مل من PB. بعد ذلك باحثات استطاع اخترت مستعمرات مع مورفولوجيات جيّدة لأبعد [بسّينغ] وخطّ إقامة. وفي التقرير المنشور، أظهرت المراكز الإحصائية الدولية للأرقام 10 و20 و30 معدلات انتشار مماثلة، ويمكن تجاوزها أكثر من 50 مرة، مما يدل على قدرة جيدة على التجديد الذاتي والانتشار11. يمكن أن تتميز iNSCs باختبارات التمايز وتلطيخ المناعة لعلامات الخلايا الجذعية العصبية SOX2، PAX6، NESTIN وOLIG2، وعلامة التكاثر Ki67. يجب على iNSCs التعبير عن تلك علامات الخلايا الجذعية العصبية وتمتلك القدرة على التمايز لتصبح TUJ1+، MAP2+ الخلايا العصبية (بعد 6 أسابيع)، GFAP+ الخلايا النجمية (بعد 6 أسابيع) وOLIG2+، O1+ oligodendrocytes (بعد 7-8 أسابيع)11. ومع ذلك، فإن أحد القيود المفروضة على هذا البروتوكول هو أن وسط المجلس الوطني الانتقالي موات بشكل تفضيلي لتوسيع الاريثروبلاست، مما قد يجعله غير مناسب لتوليد الـ iNSCs من المرضى الذين يعانون من نقص في تطوير الاريثروبلاست. وإلى جانب ذلك، فإن كفاءة إعادة برمجة مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم في البلدان النامية غير الوطنية غير ذات المستوى الدولي ليست عالية. يمكن للمرء أن يعزز كفاءة إعادة البرمجة باستخدام جزيئات صغيرة معينة أو زيادة الغلة باستخدام المزيد من PBMNCs بدء23.

الطريقة حول تمايز iNSCs في الخلايا العصبية DA الموصوفة هنا يبني على عدد كبير من البروتوكولات للتمايز العصبي. كما هو سبب PD أساسا من تدهور الخلايا العصبية DA الموجودة في منتصف الدماغ1،2، ويركز الهدف من البروتوكولات على اشتقاق الخلايا العصبية المتخصصة VM DA ، والتي تنشأ من خلايا لوحة الكلمة خلال التنمية24. التعريفي من خلايا لوحة أرضية VM مع إمكانات العصبية يعتمد على اثنين منmorphogens الرئيسية، SHH وFGF8b 6،25،26. SHH هو مورفجين بطني، يفرزها notochord26،27. هنا استبدلنا SHH مع جزيء صغير SAG1، وهو ناهض مسار SHH التي هي أكثر اقتصادا من SHH. أيضا، الثقافة العصبية الأساسيةالمتوسطة والملحق (جدول المواد) مهمة للبقاء على قيد الحياة العصبية والتمايز. مع هذا البروتوكول، تم الحصول على السلائف DA قرب نهاية المرحلة الأولى، وولدت الخلايا العصبية DA أكثر نضجا في نهاية المرحلة الثانية. زيادة الفترة الزمنية للمرحلة الثانية إلى 40-55 يوما يمكن أن تزيد من تعزيز نسبة الخلايا العصبية DA ناضجة في الثقافة. وشملت في المرحلة الثانية المتوسطة حمض الريتينويك, BDNF, GDNF, TGF-βIII, DAPT وcAMP, التي ثبت أن تكون قادرة على تعزيز نضج الخلايا العصبية DA والبقاء على قيد الحياة. لاختبار كفاءة iNSCs في التمايز في الخلايا العصبية DA، تم فحص الخلايا المتمايزة للتعبير عن علامات NURR1، FOXA2، GIRK2 وTH. في دراسة سابقة، في نهاية المرحلة الأولى (اليوم 10)، 87.76٪ و 65.33٪ الخلايا أعرب NURR1 وFOXA2، على التوالي11. في نهاية المرحلة الثانية (اليوم 24)، وصلت نسبة NURR1+ الخلايا إلى 95.58٪ وبلغت نسبة FOXA2+ الخلايا 77.33٪11. في هذه المرحلة، كانت 57.23٪ و 28.55٪ الخلايا إيجابية لTH وGIRK2، على التوالي11. على غرار ما لوحظ للتمايز iPSC نحو الخلايا العصبية DA، دفعة إلى دفعة / خط إلى خط الاختلاف للتمايز iNSC موجود أيضا، والذي يتأثر بعوامل مثل حالة الخلية، ونشاط الجزيئات الصغيرة المستخدمة، واللدونة من الخلايا الجذعية من أشخاص مختلفين. ومن الجدير بالذكر أيضا أن أحد العوامل الرئيسية المحددة لكفاءة التمايز هو كثافة الخلايا. ينصح بكثافة البذر من 5 × 103 خلايا لكل غطاء زجاجي 12 مم في لوحات 24-well. في الواقع، iNSCs تظهر معدل انتشار جيد خلال مرحلة التمايز الأول. من شأن الـ iNSCs التي تم زرعها في بئر واحد من طبق من 24 بئرًا أن تؤدي إلى عدد كافٍ من سلائف DA بحلول يوم التمايز 10-13 لزرعها في فأر واحد (2 × 105 لكل فأر).

يقدم هذا البروتوكول طريقة لإنشاء نماذج الماوس PD القابلة للاستنساخ ومستقرة من جانب واحد 6-OHDA-الآفات. يمكن تقدير مدى آفة 6-OHDA عن طريق التقييم السلوكي الذي يقيس التناوب اتّصالي ّ بعد حقن المورفين. أيضا، يمكن قياس درجة الآفة 6-OHDA الناجمة عن قبل تلطيخ الفلورسنت المناعي بعد الوفاة لTH في SNpc. نوع آخر من السموم العصبية المستخدمة في النمذجة PD هو 1-ميثيل-4-فينيل-1,2,3,6-تيرتادوبيريدين (MPTP), الذي يعطل أيضا مسارات الدوبامين. وبالمقارنة مع وزارة العمل والشؤون الاقتصادية، يمكن إدارة 6-OHDA على أساس أحادي أو ثنائي. أيضا، طريقة MPTP هو أكثر حساسية لعمر الحيوان، ونوع الجنس والإجهاد، وبالتالي قد تظهر درجة أعلى من الاختلاف بين الحيوانات28. وتشمل العوامل الحاسمة اختيار الفئران ذات الوزن المماثل، وحقن محلول 6-OHDA المعد حديثًا، وإجراء الجراحة بدقة وسرعة.

إجراءات زرع الخلايا من السلائف DA في striatum من الفئران الآفات هي في الأساس نفس الإجراءات لتوليد 6-OHDA-الآفات PD نماذج الماوس، إلا أن يتم استبدال 6-OHDA بسلائف DA في خطوة الحقن. العامل الرئيسي في هذا الجزء هو البحث في الإطار الزمني الأمثل للتمايز خلية DA لزرع. وقد ثبت أن درجة أعلى من الجذعية يرتبط مع ارتفاع معدل البقاء على قيد الحياة ولكن إمكانية أقل من المواصفات في الخلايا العصبية DA ناضجة11. ومع ذلك، فإن مرحلة أكثر نضجا من الخلايا العصبية هي أكثر عرضة للخطر، وتظهر انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة بعد زرع11. ولذلك، فإن إيجاد نافذة زمنية مناسبة توازن بين القدرة على النضج والبقاء أمر ذو أهمية. في دراسة سابقة، زرعنا خلايا من التمايز اليوم 10 و 13 في striatum من الفئران SCID البيج نقص المناعة11. بعد شهر واحد من الطعوم، كشفت نتائج تلطيخ الفلورسنت المناعي أن حوالي 88.63٪ و 93.13٪ كانت TUJ1 إيجابية لليوم 10 واليوم 13 مجموعات، على التوالي، وبعض TH+ الخلايا (5.30٪) تم الكشف عن مجموعة اليوم 13 ولكن عدد قليل TH+ الخلايا من مجموعة اليوم 10. ومع ذلك، بالمقارنة مع اليوم 13 الخلايا، اليوم 10 الخلايا أدى إلى ارتفاع طفيف في معدل البقاء على قيد الحياة الكلي11. وكشفت النتائج أن اليوم 10 إلى يوم 13 هو نافذة زمنية مثالية من الخلايا لتطعيم11. في هذا البروتوكول، استخدمنا خليط من خلايا DA من يوم التمايز 10 واليوم 13 بنسبة 1:7 للتطعيم، والتي أظهرت نتيجة جيدة للبقاء على قيد الحياة والتمايز11. استخدام خليط من الخلايا من اليوم 10 واليوم 13 استند إلى فرضية أن الخلايا العصبية غير ناضجة نسبيا وناضجة، عندما وضعت معا، قد تدعم بعضها البعض، تذكرنا الوضع في الجسم الحي في الفئران حيث تحيط الخلايا الجذعية العصبية العصبية من الخلايا العصبية الناضجة.

يعرض هذا البروتوكول طريقة توليد الـ iNSCs من PBMNCs عن طريق عدوى SeV، والتمييز بين الـ iNSCs في الخلايا العصبية DA، وزرع سلائف DA في نماذج ماوس PD ذات الآفات 6-OHDA. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن للمرء أن يولد iNSCs مع إمكانات ليس فقط لعلاج PD، ولكن أيضا من الأمراض العصبية الأخرى. وبما أن الـ iNSCs تمثل مرحلة بدائية من مراحل مجلس الأمن القومي، يمكن تحديدها في خلايا عصبية مختلفة خاصة بالمنطقة، مثل الخلايا العصبية للحبل الشوكي أو الخلايا العصبية الحركية، والتي قد تكون ذات فائدة واعدة لعلاج التصلب الجانبي الضموري أو إصابة الحبل الشوكي. وإلى جانب ذلك، توفر المراكز المستمدة من مرضى الأمراض الأسرية منبرالة لدراسة الآليات الكامنة وراء ظهور الأمراض وتطورها، وإجراء اختبارات فحص العقاقير.

هناك أكثر من طريقة للحصول على الخلايا العصبية DA لدراسات زرع. يمكن أيضًا إنشاء خلايا DA من iPSCs أو عن طريق التحويل المباشر29. بالمقارنة مع iPSCs، iNSCs متأصلة مع انخفاض خطر تشكيل الورم، وفترة أقصر من إعادة برمجة وإنشاء خط، واللدونة الملتزمة النسب - قادرة فقط على التمييز في الخلايا العصبية وglia11. بالمقارنة مع التحويل المباشر، فإن التمييز بين سلائف DA من الـ iNSCs يؤدي إلى ارتفاع الغلة والكفاءة30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم العمل من خلال المنح التالية: الخلية الجذعية والترجمة المشروع الرئيسي الوطني (2016YFA0101403)، المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81661130160، 81422014، 81561138004)، مؤسسة بكين البلدية للعلوم الطبيعية (5142005)، مؤسسة بكين للمواهب (201700021223TD03)، مشروع دعم المعلمين رفيعي المستوى في جامعات بلدية بكين في فترة الخطة الخمسية الثالثة عشرة (CIT & TCD20180333)، جائزة بكين للمواهب ذات المستوى العالي (2015-3-063)، بكين صندوق لجنة الصحة البلدية (PXM 2018_026283_000002)، صندوق بكين 100،000 و10000 مواهب (2018A03)، إدارة بلدية بكين لتطوير الطب السريري من دعم التمويل الخاص (ZYLX201706)، و الزمالة المتقدمة للجمعية الملكية - نيوتن (NA150482).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15-ml conical tube Corning 430052
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M6145 Toxic for inhalation and skin contact
24-well plate Corning 3337
50-ml conical tube  Corning 430828
6-OHDA Sigma-Aldrich H4381
6-well plate Corning 3516
Accutase Invitrogen A11105-01 Cell dissociation reagent
Apomorphine Sigma-Aldrich A4393
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A92902 Toxic with skin contact 
B27 supplement  Invitrogen 17504044
BDNF Peprotech 450-02 Brain derived neurotrophic factor
Blood collection tubes containing sodium heparin BD 367871
BSA yisheng 36106es60 Fetal bovine serum
cAMP Sigma-Aldrich D0627 Dibutyryladenosine cyclic monophosphate
CellBanker 2 ZENOAQ 100ml Used as freezing medium for PBMNCs
Chemically defined lipid concentrate Invitrogen 11905031
CHIR99021 Gene Operation 04-0004
Coverslip Fisher 25*25-2
DAPI Sigma-Aldrich D8417-10mg
DAPT Sigma-Aldrich D5942
Dexamethasone Sigma-Aldrich D2915-100MG
DMEM-F12 Gibco 11330
DMEM-F12 Gibco 11320
Donkey serum Jackson 017-000-121
EPO Peprotech 100-64-50UG Human Erythropoietin
FGF8b Peprotech 100-25
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-02 P=1.077, density gradient medium
GDNF Peprotech 450-10 Glial derived neurotrophic factor
GlutaMAX Invitrogen 21051024 100 × Glutamine stock solution
Ham's-F12 Gibco 11765-054
HBSS Invitrogen 14175079 Balanced salt solution
Human leukemia inhibitory factor Millpore LIF1010
Human recombinant SCF Peprotech 300-07-100UG
IGF-1 Peprotech 100-11-100UG Human insulin-like growth factor 
IL-3 Peprotech 200-03-10UG Human interleukin 3
IMDM Gibco 215056-023 Iscove's modified Dulbecco's medium
Insulin Roche  12585014
ITS-X Invitrogen 51500-056 Insulin-transferrin-selenium-X supplement
Knockout serum replacement Gibco 10828028 Serum free basal medium
Laminin Roche  11243217001
Microsyringe Hamilton 7653-01
N2 supplement  Invitrogen 17502048
NEAA Invitrogen 11140050 Non-essential amino acid
Neurobasal Gibco 10888 Basic medium
PDL Sigma-Aldrich P7280 Poly-D-lysine
SAG1 Enzo ALX-270-426-M01
SB431542 Gene Operation 04-0010-10mg Store from light at -20?
Sendai virus Life Technologies MAN0009378
Sucrose baiaoshengke
TGFβ? Peprotech 100-36E Transforming growth factor  β?
Transferrin R&D Systems 2914-HT-100G
Triton X 100 baiaoshengke Nonionic surfactant
Trypan blue Gibco T10282
Xylazine Sigma-Aldrich X1126

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams-Gray, C. H., et al. The distinct cognitive syndromes of Parkinson's disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort. Brain. 132, Pt 11 2958-2969 (2009).
  2. Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radical Biology and Medicine. 62, 132-144 (2013).
  3. Chen, Z. Cell Therapy for Parkinson's Disease: New Hope from Reprogramming Technologies. Aging and Disease. 6 (6), 499-503 (2015).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  5. Doi, D., et al. Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
  6. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
  7. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12543-12548 (2004).
  8. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  9. Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S. Progress in the reprogramming of somatic cells. Circulation Research. 112 (3), 562-574 (2013).
  10. Tang, X., et al. Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors. Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).
  11. Yuan, Y., et al. Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson's disease model. Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).
  12. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  13. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  14. Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  15. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  16. Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).
  17. Bazley, F. A., et al. Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells. Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).
  18. Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).
  19. Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method. Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).
  20. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).
  21. Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).
  22. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).
  23. Zhu, S., et al. Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds. Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).
  24. Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
  25. Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).
  26. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  27. Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).
  28. Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson's disease. Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).
  29. Sheng, C., et al. Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors. Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).
  30. Prasad, A., et al. A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation. Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).

Tags

علم الأحياء التنموية العدد 149 علم الأعصاب الخلايا الجذعية العصبية المستحثة مرض باركنسون إعادة برمجة تمايز زرع خلايا الدم الطرفية أحادية النووية فيروس سينداي 6-OHDA الخلايا العصبية الدوبامين
توليد الخلايا الجذعية العصبية المستحثة من الخلايا أحادية النووية الطرفية والتمايز نحو سلائف الخلايا العصبية الدوبامين لدراسات زرع
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zheng, W., Chen, Z. Generation of… More

Zheng, W., Chen, Z. Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies. J. Vis. Exp. (149), e59690, doi:10.3791/59690 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter