Summary
Protokollen præsenterer omprogrammering af mononukleære celler i perifert blod for at inducere neurale stamceller ved Sendai-virus infektion, differentiering af iNSCs i dopaminerge neuroner, transplantation af DA-prækursorer til den ensidigt læsionerede Parkinsons sygdom-musemodeller og evaluering af sikkerheden og effekten af iNSC-afledte DA-prækursorer til PD-behandling.
Abstract
Parkinsons sygdom (PD) er forårsaget af degeneration af dopaminerge (DA) neuroner på substantia nigra pars Compacta (SNpc) i ventrale mesencephalon (VM). Celle substitutionsterapi har stor løfte om behandling af PD. for nylig er inducerede neurale stamceller (iNSCs) dukket op som en potentiel kandidat til celle substitutionsbehandling på grund af den reducerede risiko for tumordannelse og plasticiteten til at give anledning til Regionspecifikke neuroner og glia. iNSCs kan omprogrammeres fra autologt somatiske cellulære kilder, såsom fibroblaster, mononukleære celler i perifert blod (PBMNCs) og forskellige andre typer celler. Sammenlignet med andre typer af somatiske celler, PBMNCs er en tiltalende starter celletype på grund af den lethed at få adgang til og udvide i kulturen. Sendai virus (SeV), en RNA ikke-Integrativ virus, kodning omprogrammering faktorer, herunder Human OCT3/4, SOX2, KLF4 og c-MYC, har en negativ-Sense, enkelt-strandede, ikke-segmenteret genom, der ikke integreres i Host Genome, men kun replikater i cytoplasmaet af inficerede celler, der tilbyder et effektivt og sikkert køretøj til omprogrammering. I denne undersøgelse beskriver vi en protokol, hvor iNSCs opnås ved at omprogrammere PBMNCs, og differentieret til specialiserede VM DA neuroner ved en totrins metode. Så DA prækursorer er transplanteres i ensidigt 6-hyroxydopamin (6-OHDA)-lesioned PD musemodeller til at evaluere sikkerheden og effekten for behandling af PD. Denne metode giver en platform til at undersøge de funktioner og terapeutiske virkninger af patientspecifikke DA neurale celler in vitro og in vivo.
Introduction
Parkinsons sygdom (PD) er en almindelig neurodegenerativ lidelse, forårsaget af degeneration af dopaminerge (DA) neuroner på substantia nigra pars Compacta (SNpc) i ventrale mesencephalon (VM), med en prævalens på mere end 1% i populationen over 60 år 1 , 2. i løbet af det seneste årti, celleterapi, der har til formål enten at erstatte de degenerative eller beskadigede celler, eller nærende mikromiljø omkring degenererede neuroner, har vist potentiale i behandling af PD3. I mellemtiden har omprogrammering teknologi gjort betydelige fremskridt4, som giver en lovende cellulære kilde til substitutionsterapi. Humane inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) og embryonale stamceller (ESCs) har vist sig at være i stand til at differentiere sig i DA neurale celler, som kunne overleve, modnes, og forbedre motoriske funktioner, når podet i rotte og ikke-humane primat PD modeller5 ,6,7,8. iPSCs repræsenterer en milepæl i cellulære omprogrammering teknologier og har et stort potentiale i celletransplantation; Men, der er stadig en bekymring over risikoen for tumordannelse fra ufuldstændigt differentierede celler. En alternativ cellulær kilde til celletransplantation er Lineage-forpligtede voksne stamceller opnået gennem direkte omprogrammering, såsom inducerede neurale stamceller (iNSCs), som kan udledes af de ustabile mellemprodukter, uden om pluripotens etape9,10,11.
Både ipscs og inscs kan omprogrammeres fra autologt cellulære kilder, såsom fibroblaster, mononukleære celler i perifert blod (pbmncs) og forskellige andre typer af celler12,13,14, hvilket reducerer immunogenicitet af transplanterede celler i stor grad. Desuden, sammenlignet med iPSCs, iNSCs er iboende med reduceret risiko for tumordannelse og Lineage-engageret plasticitet, kun i stand til at skelne til neuroner og glia11. I de indledende undersøgelser, humane eller mus ipscs og inscs blev genereret fra fibroblaster opnået fra hudbiopsier, som er en invasiv procedure14,15. Med denne respekt, PBMNCs er en tiltalende starter celle kilde på grund af den mindre invasive prøvetagning proces, og den lethed at opnå et stort antal celler inden for en kort periode med ekspansion tid16. Indledende omprogrammering undersøgelser ansat Integrative levering systemer, såsom lentiviral eller antiretroviral vektorer, som er effektive og nemme at implementere i mange typer af celler17; disse leveringssystemer kan dog forårsage mutationer og reaktivering af rest transgener, som frembyder sikkerhedsproblemer til kliniske terapeutiske formål12. Sendai virus (SeV) er en ikke-Integrativ RNA-virus med en negativ fornuft, enkelt-strandede genom, der ikke integreres i Host genom, men kun replikater i cytoplasmaet af inficerede celler, tilbyder et effektivt og sikkert køretøj til omprogrammering18 ,19. Rekombinant SeV vektorer er tilgængelige, der indeholder omprogrammering faktorer, herunder Human OCT3/4, SOX2, KLF4 og c-MYC i deres åbne læse rammer. Desuden kan de virale vektorer forbedres yderligere ved at indføre temperaturfølsomme mutationer, så de hurtigt kan fjernes, når dyrknings temperaturen hæves til 39 °C20. I denne artikel beskriver vi en protokol til at omprogrammere PBMNCs til iNSCs ved hjælp af SeV-systemet.
Mange undersøgelser har rapporteret afberegning af da neuroner fra humane esc'er eller ipscs ved hjælp af forskellige metoder6,8,21. Der er imidlertid mangel på protokoller, som beskriver differentieringen af DA-neuroner fra iNSCs i detaljer. I denne protokol vil vi beskrive den effektive generation af DA neuroner fra iNSCs ved hjælp af en to-trins metode. DA neuronal prækursorer kan transplanteres i striatum af PD musemodeller for sikkerhed og effektivitet evalueringer. Denne artikel vil præsentere en detaljeret protokol, der dækker forskellige stadier fra generation af induceret neurale stamceller af Sendai virus, differentiering af iNSCs ind i DA neuroner, etablering af mus PD modeller, til transplantation af DA prækursorer i striatum af PD-modellerne. Ved hjælp af denne protokol kan man generere iNSCs fra patienter og raske donorer og udlede DA neuroner, der er sikre, standardiserbare, skalerbare og homogene til celletransplantation formål, eller til modellering PD i en skål og undersøgelse af mekanismerne underliggende sygdomsudbrud og-udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer skal følge retningslinjerne i den institutionelle etiske komité for human forskning. Informeret samtykke skal indhentes fra patienter eller raske frivillige før blod opsamling. Denne protokol blev godkendt af instituttets etiske komité for human forskning og blev udført i overensstemmelse med institutionens retningslinjer for pasning og anvendelse af dyr.
1. indsamling, isolering og udvidelse af Pbmn'er
- Samling af Pbmn'er
- Saml 10-20 mL donor perifert veneblod ved venepunktur med et hætteglas med natrium-heparin-konserveringsmiddel.
Bemærk: blodprøver skal opbevares eller sendes ved stuetemperatur (RT). Behandl blodprøverne inden for 24 timer.
- Saml 10-20 mL donor perifert veneblod ved venepunktur med et hætteglas med natrium-heparin-konserveringsmiddel.
- Forberedelse af kulturmedium
- Forbered serumfrit medium (SFM) ved at kombinere følgende komponenter: 245 mL Iscove modificerede Dulbecco's medium (IMDM), 240 mL skinke F-12,5 mL insulin-transferrin-selen-X supplement (dens-X), 5 mL 100x glutamin stamopløsning (tabel af 5 ml kemisk defineret lipid koncentrat, 2,5 g føtal kvægserum, 0,025 g ascorbinsyre og 9 μl af 1-thioglycerol. Filtrer mediet, og opbevar det ved 4 °C.
Forsigtig: ascorbinsyre og 1-thioglycerol er giftige ved hudkontakt og indånding. - For at tilberede mononuklealcelle (MNC) medium, supplere SFM-mediet med 10 ng/mL humant interleukin 3 (IL-3), 2 U/mL erythropoietin (EPO), 100 ng/mL Human stamcellefaktor (SCF), 40 ng/mL humant insulin-lignende vækstfaktor 1 (IGF-1), 100 μg/mL Holo-transferrin og 1 μM dexamethason. Filtrer mediet, og opbevar det ved 4 °C.
Bemærk: Forbered mediet umiddelbart før brug.
- Forbered serumfrit medium (SFM) ved at kombinere følgende komponenter: 245 mL Iscove modificerede Dulbecco's medium (IMDM), 240 mL skinke F-12,5 mL insulin-transferrin-selen-X supplement (dens-X), 5 mL 100x glutamin stamopløsning (tabel af 5 ml kemisk defineret lipid koncentrat, 2,5 g føtal kvægserum, 0,025 g ascorbinsyre og 9 μl af 1-thioglycerol. Filtrer mediet, og opbevar det ved 4 °C.
- Isolering af Pbmn'er
- Ultraviolet-Steriliser en ren bænk før brug. Steriliser alle overflader og udstyr med 75% alkohol. Steriliser alle spidser ved hjælp af en autoklave.
- Det perifere blod (PB) overføres til et 50 mL konisk rør, og PB fortyndes med et tilsvarende rumfang steril Dulbecco's fosfat-bufferet saltvand (D-PBS).
- Klargør 15 mL steriliseret densitet gradient medium (tabeller af materialer) i en anden 50 ml konisk rør.
Bemærk: hold tætheden gradient medium og PB på RT at give mulighed for bedre isolering af Pbmn'er. - Hæld det koniske rør, der indeholder tætheden gradient medium i en 45 ° vinkel, og derefter langsomt og forsigtigt lægge 30 mL fortyndet PB på tætheden gradient medium.
Bemærk: pas på og lad PB langsomt køre ned ad siden af det koniske rør på tætheden gradient medium lag. Røde blodlegemer vil deponere til bunden af røret. VIP røret forsigtigt for at minimere forstyrrelsen af laggrænsefladen. - Centrifuger rørene ved 800 x g i 15 minutter ved rt med centrifuge bremsen sat til positionen "off". Aspirér det gule, øvre plasma lag og kassér det. Derefter overføres det hvide overskyede tynde film lag indeholdende multinationale selskaber med en 10 mL pipette til et nyt 50 mL konisk rør.
Bemærk: det er vigtigt at skifte centrifuge bremse fra for at isolere multinationale selskaber. - 30 mL D-PBS tilsættes til røret med multinationale selskaber og centrifugeres ved 600 x g i 10 minutter ved 4 °c. Kassér supernatanten, og tilsæt derefter 45 mL D-PBS for at suspendere cellerne igen. Centrifugeres ved 400 x g i 10 minutter ved 4 °c.
Bemærk: centrifuge bremsen skal tændes for dette og følgende Centrifugerings trin. Da cellen pellets er tætte, tilsættes 1-2 mL D-PBS til forsigtigt re-suspendere pellets, og derefter tilføje D-PBS til 45 mL. - Kassér supernatanten og re-suspendere cellerne med 5 mL D-PBS og tælle levende celler med trypan og et blå udelukkelsesmetode.
- Efter ophævelse af de multinationale selskaber, der er nødvendige for ekspansion, fryse de resterende celler til fremtidig brug.
Bemærk: mindst 5 x 106 multinationale selskaber kan fryses i et hætteglas med 1 ml fryse medium (tabel over materialer). Protokollen kan sættes på pause her.
- Udvidelse af multinationale selskaber
- På dag-14, frø multinationale selskaber med en tæthed på 2-3 x 106 celler pr. milliliter i en brønd af seks-brønd plader med 1,5 ml præ-opvarmet (37 °C) MNC medium. Inkubere ved 37 °C, 5% CO2 i 2 dage.
- På dag 11 opsamles cellerne og mediet med en steriliseret pipette og overføres til et nyt 15 mL konisk rør. Cellerne centrifugeres ved 250 x g i 5 minutter ved rt. kassér supernatanten og re-suspendere cellerne i 1 ml forvarmet (37 °C) MNC medium.
- Tæl de levedygtige celler med trypan og et Blue. Frø de multinationale selskaber ved en densitet på 1 x 106 celler pr. milliliter i præ-VARMET MNC medium og inkubere ved 37 °c, 5% Co2 for 3 dage.
Bemærk: det forventes, at det samlede antal celler kan falde på dag-11. - På dag-8 skal du gentage trin 1.4.2-1.4.3 og kultur cellerne i 3 dage.
- På dag-4 skal du gentage trin 1.4.2-1.4.3 og kultur cellerne i 3 dage.
Bemærk: efter 14 dages kultur bør et tilsvarende eller større antal multinationale selskaber forblive i kulturen.
2. omprogrammering af Pbmn'er til iNSCs ved SeV-infektion
- Fremstilling af opløsning og kulturmedium
- Forbered en poly-D-lysin (PDL) stamopløsning ved at opløse 100 mg PDL med 100 mL H2O til en koncentration på 1 mg/ml. Opbevares ved-20 °C i 1 mL aliquoter.
- Forbered en insulin stamopløsning ved at opløse 100 mg insulin i 20 mL 0,01 N HCl til en koncentration på 5 mg/mL. Opbevares ved-20 °C i 1 mL aliquoter.
- For at forberede 200 ml INsc basal medium, kombinere 96 ml DMEM-F12 og 96 ml grundlæggende medium (tabel over materialer) med 2 ml af 100x glutamin stamopløsning, 2 ml uvæsentlige aminosyre (neaa), 2 ml af N2 supplement og 2 ml B27 supplement. Tilsæt 10 ng/mL rekombinant Human leukæmi hæmmende faktor, 3 μM CHIR99021 og 2 μM SB431542 før brug. Filtrer mediet, og opbevar det ved 4 °C.
Bemærk: Brug mediet inden for 2 uger. Tilsæt rekombinant Human leukæmi hæmmende faktor, CHIR99021 og SB431542 umiddelbart før brug.
- Omprogrammering af Pbmn'er til iNSCs ved SeV-infektion
- Ultraviolet-Steriliser en ren bænk før brug. Steriliser alle overflader og udstyr med 75% alkohol. Steriliser alle spidser med en autoklave.
- På dag 0, indsamle cellerne i MNC medium og overføre til en 15 mL konisk rør. Cellerne centrifugeres ved 200 x g i 5 min. Aspirér supernatanten, og gensuspender cellerne med 1 ml præ-opvarmet MNC-medium.
- Tæl de levedygtige celler med trypan og et Blue. Re-suspendere cellerne med præ-varmet (37 ° c) MNC medium til en koncentration af 2 x 105 celler pr brønd i 24-brønden plader.
- Efter fjernelse af SeV-rørene fra-80 °C-opbevaring, tø de rør, der indeholder SeV i 37 °C vandbad for 5-10 s, og lad dem derefter tø på RT. Når optøet, Placer dem på is med det samme.
- Tilsæt SeV encoding Human Klf4, Oct3/4, SOX2 og c-MYC til brøndene, ved en mangfoldighed af infektion (Moi) af 10. Centrifuge celler med plader ved 1.000 x g i 30 min for at lette fastgørelse af celler. Efterlad cellerne og supernatanten i pladerne. Pladerne placeres i inkubator ved 37 °C, 5% CO2.
Forsigtig: alle procedurer, der involverer SeV, skal udføres i et sikkerhedskabinet, og alle spidser og rør skal behandles med ethanol eller blegemiddel inden bortskaffelse. - På dag 1 overføres mediet og cellerne til et 15 mL centrifugeglas. Skyl brønden med 1 mL MNC medium. Centrifuger cellesuspensionen ved 200 x g i 5 min. Aspirér supernatanten, og gensuspender cellerne med 500 μl frisk forvarmet MNC-medium i 24-brønd plader.
Bemærk: Brug en lav vedhæftet fil 24-brønd plade for at forhindre fastgørelse af nogen celler før plating på PDL/Laminin. - På dag 2 fortyndes 1 mL af 1 mg/mL PDL med 19 mL D-PBS til en koncentration på 50 μg/mL. Frakke 6-brønd plader med 50 μg/mL PDL i mindst 2 timer ved RT.
- 200 μL af 0,5 mg/mL laminat fortyndes med 20 mL D-PBS til en koncentration på 5 μg/mL. Aspirer PDL i 6-brønden plader, og tør på den lodrette Clean bænk.
- Frakke 6-brønd plader med 5 μg/mL Laminin og Inkuber til 4-6 h ved 37 °C. Vask med D-PBS før brug.
- På dag 3 plade de transducerede celler opnået i trin 2.2.6 i iNSC medium på PDL/Laminin-coated 6-brønd plader.
Bemærk: Flyt pladerne forsigtigt, hvis det er nødvendigt, efter at cellerne er placeret på PDL/Laminin-coated plader, forsøger ikke at forstyrre fastgørelsen af cellerne. - På dag 5 tilsættes 1 mL forvarmet (37 °C) iNSC medium i hver brønd i 6-brønd plader forsigtigt.
Bemærk: det forventes, at cellerne vil gennemgå en drastisk død (> 60%). - På dag 7 tilsættes 1 mL præ-opvarmet (37 °C) iNSC-medium i hver brønd i 6-brønd plader forsigtigt.
- Fra dag 9 til dag 28 udskiftes det brugte medium med frisk forvarmet (37 °C) iNSC-medium hver dag. Overvåge fremkomsten af iNSC-kolonier. Pick og Overfør iNSC kloner til ekspansion i omkring 2-3 uger. Saml kolonier med passende morfologi ved hjælp af brændte glas pipetter, bortset fra eventuelt kontaminerende celler, og Aspirer kolonierne med 200 μL spidser.
Bemærk: de karakteriserede iNSCs kan fryses til fremtidig brug med 2-5 kolonier i et hætteglas. Den frysende medium omfatter serum frie basal medium (tabel over materialer) og dimethylsulfoxid blandet i et forhold på 9:1, som skal tilberedes umiddelbart før brug. Protokollen kan sættes på pause her.
3. differentiering af iNSCs til dopaminerge neuroner
- Fremstilling af opløsning og kulturmedium
- Forbered 200 mL iNSC differentiering basal medium ved at kombinere 192 mL DMEM-F12 med 2 mL 100x glutamin stamopløsning, 2 mL NEAA, 2 mL N2 supplement og 2 mL B27 supplement.
Bemærk: Brug mediet inden for 2 uger. - Forbered iNSC differentiering fase I medium ved at supplere iNSC differentiering basal medium med 1 μM SAG1 og 100 ng/ml FGF8b.
Bemærk: Brug mediet inden for 2 uger. - Forbered iNSC differentiering fase II medium ved at supplere iNSC differentiering basal medium med 0,5 mM cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP), 0,2 mM ascorbinsyre, 10 μM DAPT, 10 ng/mL hjernen afledt neurotrofisk faktor (BDNF), 10 ng/mL gliaceller afledt neutrofisk faktor (GDNF) og 1 ng/mL omdanne vækstfaktor βIII (TGF-βIII).
Bemærk: Brug mediet inden for 2 uger.
- Forbered 200 mL iNSC differentiering basal medium ved at kombinere 192 mL DMEM-F12 med 2 mL 100x glutamin stamopløsning, 2 mL NEAA, 2 mL N2 supplement og 2 mL B27 supplement.
- Belægning af kultur retterne
- Ultraviolet-Steriliser en ren bænk før brug. Steriliser alle overflader og udstyr med 75% alkohol. Steriliser alle spidser med en autoklave.
- For PDL-belægning fortyndes mindst én dag før omklædningen af cellerne 1 mL 1 mg/mL PDL med 19 mL D-PBS til en koncentration på 50 μg/mL. Frakke 12 mm glas dæksedler, der er blevet steriliseret med 75% alkohol i 24-brønden plader med 50 μg/mL PDL på RT i mindst 2 h.
- For Laminin belægning fortyndes 200 μL af 0,5 mg/mL laminat med 20 mL D-PBS til en koncentration på 5 μg/mL. Aspirere PDL og tørre brøndene i den rene bænk. Coat de 12 mm dæksedler med 5 μg/mL Laminin og Inkuber i 4-6 h ved 37 °C. Vask med D-PBS før brug.
- Passage celler til differentiering.
- Når sammenløbet af de dyrkede iNSCs når 70-90%, aspirere medium fra kultur pladen, og tilsæt 1 mL D-PBS til at vaske cellerne. Tilsæt 1 mL forvarmet (37 °C) celle dissociations reagens (tabel over materialer) pr. brønd og inkuber ved 37 °c i 3 min. for at adskille cellerne.
- Efter inkubation i 3 min, er cellerne blevet halvflydende; Tilsæt 3 mL forvarmet (37 °C) DMEM-F12 medium pr. brønd, og pipette cellerne op og ned for at adskille celle pellets i enkeltceller.
- Overfør cellerne til et 15 mL konisk rør, og centrifugeres ved 250 x g i 3 min. Aspirér supernatanten, re-suspendere cellerne med passende volumen af præ-varmet (37 °C) INsc medium i henhold til antallet af celler.
- Tæl cellerne ved hjælp af metoden trypan og et Blue eksklusion. Plade 5 x 103 celler pr. 12 mm glas dækseddel i 24-brønd plader og inkuber ved 37 °c, 5% Co2.
- Differentiere iNSCs i dopaminerge neuroner.
- Begynd differentieringen 24 timer efter re-plating cellerne på PDL/Laminin-coated dæksedler. Aspirér dyrkningsmediet, vask cellerne én gang med D-PBS, og tilsæt derefter 600 μL forvarmet differentierings stadie i medium pr. brønd i 24-brønde plader og Inkuber ved 37 °C, 5% CO2.
- Skift medium hver dag fra dag 1 til dag 10 i den første fase af differentiering.
- På dag 10, aspirere dyrkningsmediet, og vaske celler en gang med D-PBS. Tilsæt 600 μL forvarmet (37 °C) differentierings fase II-medium pr. brønd i 24-brønd plader og Inkuber ved 37 °C, 5% CO2.
- Skift medium hver anden dag fra dag 11 til dag 25 i anden fase af differentiering. De differentierede celler kan fastsættes ved PARAFORMALDEHYD på forskellige tidspunkter til analyse.
- For immunfluorescent farvning vaskes cellerne med D-PBS tre gange forsigtigt på valgte tidspunkter inden for differentierings dag 11 til 25.
- Der afpipetteres 300 μL nonionisk overfladeaktivt stof (tabel over materialer) i 100 ml PBS for at fremstille et 0,3% nonionisk overfladeaktivt stof i PBS.
Forsigtig: nonionisk overfladeaktivt stof er giftigt ved hudkontakt og indånding. - Fastgør cellerne med 4% PARAFORMALDEHYD i 10 minutter ved RT. Derefter vaskes med 0,3% i PBS tre gange.
Forsigtig: PARAFORMALDEHYD er giftigt ved hudkontakt og indånding. - Bloker cellerne med 3% æsel serum i 2 timer ved RT.
- Det primære antistof fortyndes i 1% æsel serum i en passende koncentration og blidt triturat blandes. Tilsæt 300 μL af den primære antistof opløsning til hver brønd på 24-brønd pladen. Cellerne inkubates ved 4 °C natten over. Cellerne vaskes med 0,3% nonionisk overfladeaktivt stof i PBS tre gange.
- Det sekundære antistof fortyndes i 1% æsel serum i en passende koncentration og blidt triturat blandes. Tilsæt 300 μL af den sekundære antistof opløsning til hver brønd på 24-brønd pladen. Inkuber cellerne ved RT for 2 timer, beskyttet mod lys.
- Cellerne vaskes med 0,3% nonionisk overfladeaktivt stof i PBS tre gange. 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) fortyndes med PBS med 1:500 fortynding. Cellerne i hver brønd af 24-brønd pladen inkubates med 300 μL fortyndet DAPI i 15 minutter ved RT, beskyttet mod lys. Cellerne vaskes med 0,3% nonionisk overfladeaktivt stof i PBS tre gange.
- Tag forsigtigt dæksedlerne ud af pladerne med tang. Tør i mørke natten over på RT. Mount under et fluorescens mikroskop.
4. etablering af ensidige 6-hyroxydopamin (6-OHDA)-lesioned PD musemodeller
- For at generere PD-musemodeller til celletransplantation skal du bruge voksne mandlige SCID-beige mus, som vejer 20-25 g for 6-OHDA injektion.
- Forberedelse af lægemidler til kirurgi
- Der forberedes en 0,2% ascorbinsyreopløsning ved at opløse 0,2 g ascorbinsyre i 100 mL steriliseret saltvand (0,9%) opbevares ved-80 °C indtil brug. På operationsdagen fortyndes 0,2% ascorbinsyre opløsning med 10 gange for at opnå en 0,02% ascorbinsyre opløsning.
Bemærk: ascorbinsyre tilsættes for at forhindre oxidation af 6-OHDA til en inaktiv form. - For at tilberede en 6-OHDA opløsning, vejes passende mængde 6-OHDA i et steriliseret 1 mL rør, og tilsæt derefter et volumen på 0,02% ascorbinsyre for at lave en 5 μg/μL 6-OHDA opløsning. Hvirvel blandingen, indtil den opløses. Placer 6-OHDA på isen indtil brug.
Bemærk: 6-OHDA er temperatur og let følsom. Vær omhyggelig med at beskytte opløsningen mod lys, og opbevar den på is før brug.
- Der forberedes en 0,2% ascorbinsyreopløsning ved at opløse 0,2 g ascorbinsyre i 100 mL steriliseret saltvand (0,9%) opbevares ved-80 °C indtil brug. På operationsdagen fortyndes 0,2% ascorbinsyre opløsning med 10 gange for at opnå en 0,02% ascorbinsyre opløsning.
- Forbered steriliseret kirurgisk udstyr ved autoklave iser før operationen. Rengør alt udstyr og overfladeareal med ethanol ved opsætning af stereotaxisk ramme. Indstil en mus opsving bur under en varmelampe.
- Udfør kirurgi for at etablere ensidige 6-OHDA-læsioned musemodeller.
- Vejning hver mus, registrere vægten og beregne mængden af stof, der skal administreres. Hver mus modtager 0,5 mg/kg atropin 20 min før operationer. Bedøve musen med 80 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazine.
- Giv 0,5 mg/kg atropin ved intraperitoneal injektion.
- Bedøvende musen med 80 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazin ved intraperitoneal injektion 20 min efter administration af atropin.
- Sæt musen i et lukket kammer. Efter 3-5 min, vil musen være dybt bedøvet uden respons på bagbenet knivspids.
Bemærk: det forventes, at musen, der har fået anæstesi ville opleve en excitation periode. - Barberer hovedet af musen og anvende erythromycin øjensalve på øjnene af musen for beskyttelse mod at udvikle hornhinde sår.
- Placer musen på stereotaksisk apparatet. Fix musen med fortand bars for det første. Indsæt ørekopperne korrekt for at gøre muse hovedet i en flad og sikker position.
- Steriliser hovedet af musen med povidon jod og isopropylalkohol. Skær en sagittale indsnit (~ 1,5 cm) på hoved huden med en skalpel klinge, og udsætte kraniet. Juster indsnit stangen og ørestængerne for at reducere højdeforskellen mellem bregma og lambda til mindre end 0,1 mm.
Bemærk: musen bregma er placeret i skæringspunktet mellem koronal og sagittale suturer, og lambda er i skæringspunktet mellem lambdoid og sagittale sutures. - Bevæg og sænk langsomt spidsen af nålen mod bregma og Behandl bregma som et nulpunkt. Flyt spidsen til en position med koordinater for A/P + 0,5 mm, M/L-2,1 mm i forhold til bregma. Træk spidsen tilbage, og marker punktet. Burr et lille hul i kraniet.
- Udpak 2 μL 5 μg/μL 6-OHDA opløsning i mikrosprøjten (tabel over materialer). Vend kanylen tilbage til det markerede punkt, og sæt nålen på D/V-3,2 mm.
- Der indsprøjtes 2 μL 5 μg/μL 6-OHDA opløsning (10 μg i alt) med en hastighed på 1 μL/min. Efter injektion af 6-OHDA er afsluttet, lad nålen på plads til en anden 5 min. Træk derefter injektions nålen tilbage langsomt.
- Luk incisionen med suturer og anvende erythromycin øjensalve på øjnene af musen. Levere 0,5 mL saltvand subkutant for at forhindre dehydrering, og anvende en antibiotika salve direkte på den suturerede hud.
- Fjern musen fra stereotaksisk apparater og sætte det i Recovery bur. Sæt musen tilbage og give adgang til mad og vand, indtil det genvinder bevidstheden. Behandl musen med analgetikum i drikkevand daglig post-kirurgi for 2-3 dage, og en anbefalet dosis af ibuprofen er 0,03 mg/g legemsvægt pr. dag.
- Undersøg musen dagligt efter operationen.
5. adfærdsmæssig bedømmelse efter ensidig 6-OHDA-lesioning
- To til tre uger efter operationen, foretage adfærdsmæssige vurdering at estimere PD symptomer. Veje hver mus, registrere deres vægt og beregne mængden af lægemiddel, der skal administreres (0,5 mg/kg Apomorphin før vurdering).
- Giv 0,5 mg/kg Apomorphin ved subkutan injektion før vurdering, og Placer musen i en glascylinder.
- Efter en 5 min tilvænning periode, tælle antallet af kontralaterale og ipsilaterale rotationer i forhold til læsion side per minut og registrere deres aktivitet med et videokamera.
- Mus med kontralateral minus ipsilaterale rotationer > 7 rpm/min anses med held skam og valgt som kandidater til celletransplantation eksperimenter. Returner musene til husets bure efter 30 minutters hvile.
Bemærk: Hvis musen blev skam med succes, vil 6-ohda indsprøjtet mus vise en større skævhed i drejning mod kontralateral side, da da agonist aktiverer det sensitive denerverede striatum af den læsionerede side overvejende. - Udføre den adfærdsmæssige vurdering en uge før og 2, 4, 6, 8, 12, 16 uger efter celletransplantation.
6. celletransplantation af DA-prækursorer
- Forbered cellesuspension til transplantation. For celle engraftment, suspendere 2 x 105 da prækursorer blandet af D10 og D13 da prækursorer i et forhold på 1:7 i 4 μl af 5 g L-1 glucose i afbalanceret saltopløsning (tabel over materialer) af transplantations buffer.
- Udføre celletransplantation kirurgi efter de procedurer, der er beskrevet i punkt 4,4, bortset fra, at 6-OHDA er erstattet af DA forløber cellesuspension eller buffer.
- Udføre den adfærdsmæssige vurdering 2, 4, 6, 8, 12, 16 uger efter celletransplantation af DA prækursorer efter de procedurer, der er beskrevet i punkt 5. Tæl antallet af Apomorphin-inducerede kontralaterale rotationer i forhold til læsions siden pr. minut, og Optag deres aktivitet med et videokamera.
Bemærk: efter transplantation antyder en reduceret frekvens af kontralaterale rotationer en forbedret motorisk funktion. - Ved 4, 8, 12 og 16 uger efter celletransplantation, perfuse musen under dyb anæstesi med 4% PARAFORMALDEHYD indtil kroppen af musen bliver stiv og leveren af musen bliver bleg.
- Adskil hjernen af musen forsigtigt og sætte hjernen i 4% PARAFORMALDEHYD ved 4 °C natten over.
- På den anden dag, sætte hjernen i 30% saccharose til dehydrering, indtil hjernen synker til bunden.
- Skær hjernen ved 40 μm tykkelse ved hjælp af en frysende mikrotom.
- Foretag immun farvning som tidligere beskrevet i trin 3.4.5-3.4.12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her rapporterer vi en protokol, der dækker forskellige stadier af iNSC-DA celleterapi til behandling af PD-modeller. For det første, Pbmn'er blev isoleret og udvidet, og omprogrammeret i iNSCs af SeV infektion. En skematisk gengivelse af procedurerne med PBMNC ekspansion og iNSC induktion er vist i figur 1. På dag-14, blev Pbmn'er isoleret ved hjælp af en tæthed gradient medium (tabel over materialer). Før centrifugering, blod fortyndet med PBS og tætheden gradient medium blev opdelt i to lag. Efter centrifugering, fire gradient lag dukkede (fra bund til top): det nederste lag indeholdt granulocytter og erythrocytter; det andet lag indeholdt tæthed gradient medium; den tredje indeholdt Pbmn'er (rød pil); det øverste lag indeholdt blodplade-rige plasma (figur 2A). Efter 14 dages ekspansion blev Pbmn'er inficeret med SeV som dag 0. På dag 1 blev medium med SeV fjernet (figur 2B). Som illustreret i figur 2B, forventes det, at antallet af celler blev reduceret gradvist. Celler gennemgik en drastisk død (> 60%) indtil dag 5 (figur 2B). iNSC-kolonierne opstod tidligst på dag 12 (figur 2B). Efter plukning og overførsel af iNSC kloner til ekspansion for en række passager, er morfologien af celler vist i figur 2C. Inscs viste en god morfologi og kunne selv forny stabilt i INsc medium, enten i en enkeltlags form eller som kugler (figur 2C).
iNSCs kunne give anledning til DA neuroner ved hjælp af en to-trins metode (figur 1). Under fase et, der varede 10 dage, iNSCs blev behandlet med SAG1 og FGF8b til at fremkalde specifikation af VM gulvplade celler med neurogene potentialer. Derefter blev cellerne behandlet med ascorbinsyre, BDNF, GDNF, cAMP, DAPT, TGF-βIII i anden fase (figur 1). Med denne to-trins metode, DA prækursorer kunne opnås mod slutningen af den første fase, og mere modne DA neuroner kunne genereres i slutningen af anden fase. Efter 24 dages differentiering kunne iNSCs specificeres effektivt til DA neuroner, da de fleste af dem udtrykte forkhead box a2 (FOXA2), neuron-specifik klasse III β-Tubulin (TUJ1) og tyrosin hydroxylase (TH) (figur 3).
Tre uger efter etableringen af unilaterale 6-OHDA-lesioned PD-musemodeller blev der udført adfærdsmæssig vurdering for at estimere PD-symptomer (figur 4A). En uge senere blev dopaminerge prækursorer transplanteret til PD-muse modellerne (figur 4A). Den adfærdsmæssige vurdering blev udført en uge før og 2, 4, 6, 8, 12 uger efter celletransplantation (figur 4A). De mus, der havde modtaget celletransplantation, viste signifikant forbedring i motorisk funktion (figur 4B). Omfanget af 6-ohda-induceret lesioning kan verificeres ved post mortem immunfluorescent farvning for th ved striatum, mediale forhjernen Bundle (MFB) og snpc (figur 4C). De TH-positive signaler i engrafede mus blev i høj grad genfundet i striatum, hvor cellerne blev implanteret og mildt genvundet ved SNpc (figur 4C). Tre måneder efter transplantationen var ca. 13,84% TH+ da neuroner blandt de overlevende celler (figur 4D, E). Ca. 91,72% og 86,76% af TH+- cellerne blev udtrykt som henholdsvis forældreløs nuklear receptor (NURR1) og FOXA2 (figur 4D, E). Ca. 98,77% af TH+ -cellerne var Co-mærket med G-protein-koblet indadgående ensretter kalium (GIRK2) (figur 4D, E).
Figur 1 : En skematisk gengivelse af procedurer vedrørende PBMNC ekspansion, iNSC induktion og differentiering af iNSCs i da prækursorer. Pbmn'er blev isoleret og udvidet i MNC medium for over 14 dage, og derefter inficeret med SeV kodning Human SOX2, OCT3/4, c-MYC og KLF4. iNSC kolonier opstod så tidligt som 12 dage efter SeV infektion. Efter 3-4 uger blev iNSC kolonier plukket og differentieret i DA prækursorer ved en to-trins metode. PBMNCs: mononukleære celler i perifert blod; MNC: mononukleare celler; iNSCs: inducerede neurale stamceller; SeV: Sendai virus; DA: dopaminerge; PDL: poly-D-lysin; BDNF: hjerne-afledt neurotrofisk faktor; GDNF: gliaceller cellelinje-afledt neurotrofisk faktor; AA: ascorbinsyre; Lejr: dibutyryladenosin cyklisk monophosphat; TGF: omdanne vækstfaktor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Pbmn'er isoleres og udvides og omprogrammeres derefter til iNSCs ved en infektion. A) et eksempel på Pbmn'er før og efter gradient centrifugering. Før centrifugering blev fortyndede blodprøver og tæthed gradient medium adskilt i to lag. Efter centrifugering, fire tæthed gradient lag dannet fra bund til top: det nederste lag indeholdt granulocytter og erythrocytter; det andet lag indeholdt tætheden gradient medium; det tredje lag indeholdt Pbmn'er (rød pil); det øverste lag indeholdt blodplade-rige plasma. (B) billeder af den typiske morfologi af celler efter Pbmn'er blev inficeret med SeV på dag 1, 2, 5 og 12. Efter at Pbmn'erne var inficeret med SeV, døde nogle af cellerne, og antallet af celler blev gradvist reduceret. Et lille antal celler forblev på dag 5. På dag 12 opstod iNSCs kolonier. Skala bjælke, 100 μm. (C) den typiske morfologi af inscs af passage nummer 20 i enkeltlags og sfære kultur. Skala bjælke, 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Differentiering af iNSCs til dopaminerge neuroner. Immunofluorescent farvning for FOXA2, TH, TUJ1, DAPI og fusionerede billeder på dag 24 på celler differentieret fra iNSCs. Skala bjælke, 50 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Transplantation af iNSC-differentierede da-prækursorer til ensidige 6-OHDA-lesionerede PD-musemodeller. (A) tidslinje for celletransplantation og adfærdsmæssige tests. B) resultaterne af adfærdsmæssige tests på forskellige tidspunkter fra 6-ohda +-celle gruppen (n = 10), 6-ohda + buffer gruppe (n = 8) og kontrolgruppe (n = 3). Data præsenteres som middelværdien ± standardfejl af middelværdien (SEM). p < 0,001 ved tovejs analyse af variansen (ANOVA) med Dunnetts multiple sammenligningstest. (C) post mortem immunfluorescent farvning for th ved striatum, mediale forhjernen Bundle (MFB) og substantia nigra (SN) af 6-ohda-leisioned halvkugle, 6-ohda + celler halvkugle, og kontrolgruppe. Skala stænger, 100 μm. D) procentdele af FOXA2/th, NURR1/th, GIRK2/TH, th/Hna ved indpodede mus 3 måneder efter transplantation. HNA: humant nuklei-antistof. Data præsenteres som middel ± SEM.E) Immunofluorescent farvning for FOXA2, NURR1, GIRK2, th og Hna på hjerne skiver fra PD-mus 12 uger efter celletransplantation. HNA: humant nuklei-antistof. Dette tal er blevet ændret fra yuan et al.11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterede vi en protokol, der dækkede forskellige stadier af iNSC-DA celleterapi for PD-modeller. Kritiske aspekter af denne protokol omfatter: (1) isolering og udvidelse af Pbmn'er og omprogrammering af Pbmn'er til iNSCs ved en infektion, (2) differentiering af iNSCs til DA neuroner, (3) etablering af ensidige 6-OHDA-lesioned PD-musemodeller og adfærdsmæssige vurdering og (4) celletransplantation af DA-prækursorer og adfærds vurdering.
I denne protokol omfatter den første del indsamling og udvidelse af Pbmn'er i et serumfrit medium (MNC medium), som fortrinsvis udvider erythroblaster og ikke understøtter lymfocyt proliferation. I tidligere undersøgelser er flere somatiske celletyper blevet omprogrammeret til ipscs eller inscs12,13,14. I sammenligning med andre typer af somatiske celler, PBMNCs besidder flere fordele. Den mest betydningsfulde fordel er deres gunstige genekspressions mønstre og epigenetiske profiler. Pbmn'er er kortvarige in vivo og genopfyldes hyppigt fra aktiverede hæmatopoietiske stamceller og kan akkumulere færre mutationer end hudfibroblaster. Også, den måde at prøve pbmncs er mindre invasive end for fibroblaster, og det tager en kortere periode at udvide pbmncs (omkring 14 dage) versus fibroblaster (omkring 28 dage)16,22. Efter centrifugering ved hjælp af en tæthed gradient medium, fire tæthed gradienter vil blive dannet fra bund til top; det nederste lag indeholder granulocytter og erythrocytter, det andet nedre lag indeholder tætheden gradient medium, det tredje lag indeholder multinationale selskaber, og det øverste lag indeholder plasma. Udbyttet af Pbmn'er varierer normalt mellem individer, især i forskellige aldre. Generelt har yngre mennesker en tendens til at have et større antal Pbmn'er end ældre mennesker. Med den beskrevne protokol kan ca. 1,8 − 3,4 x 107 pbmn'er isoleres fra 15 ml PB. Blandt Pbmn'er, CD34+ hæmatopoietiske stamceller er relativt tilbøjelige til at omprogrammere, og MNC medium kan berige CD34+ hæmatopoietiske stamceller til en vis grad. Det forventes, at et tilsvarende eller større antal synlige celler, der dyrkes med MNC medium, forbliver efter 14 dages ekspansion. SeV, en RNA ikke-Integrativ virus, har en negativ-Sense, enkelt-strandede, ikke-segmenteret genom, der ikke integreres i Host genom, men kun replikater i cytoplasmaet af inficerede celler18,19. Rekombinant SeV-kodning af omprogrammerings faktorer OCT3/4, SOX2, KLF4 og c-MYCkan genereres som en temperaturfølsom mutant, som let kan fjernes ved 39 °c20. Med denne protokol afledte vi 8-20 iNSC kolonier ved at omprogrammere PBMNCs fra en sund frivillig eller patient ved hjælp af 15 mL PB. Så forskerne kunne vælge kolonier med gode morfologier for yderligere passaging og linje etablering. I den offentliggjorte rapport, inscs af passage numre 10, 20 og 30 viste lignende spredning satser, og kunne urerne mere end 50 gange, viser en god selvfornyelse og proliferativ kapacitet11. inscs kunne karakteriseres ved differentiering assays og immun farvning for neurale stamceller markører SOX2, PAX6, nestin og OLIG2, og den proliferativ markør Ki67. iNSCs bør udtrykke disse neurale stamcelle markører og besidder en differentierings evne til at blive TUJ1+, MAP2+ neuroner (efter 6 uger), GFAP+ astrocytter (efter 6 uger) og OLIG2+, O1+ oligodendrocytter (efter 7-8 uger)11. Men, en begrænsning af denne protokol er, at MNC medium er fortrinsvis gunstige for erythroblast ekspansion, som kan gøre det ikke egnet til at generere iNSCs fra patienter, der er mangelfuld i erythroblast udvikling. Desuden er effektiviteten af omprogrammering PBMNCs til iNSCs ikke høj. Man kan forbedre omprogrammering effektivitet ved hjælp af visse små molekyler eller øge udbyttet ved at bruge mere start PBMNCs23.
Metoden om differentiering af iNSCs i DA neuroner beskrevet her bygger på et stort antal protokoller for neurale differentiering. Da PD primært er forårsaget af degeneration af da neuroner placeret i hjernen1,2, er formålet med protokollerne fokuseret på afderisering af specialiserede VM da neuroner, der opstår fra gulvplade celler under udvikling24. Induktion af VM-gulvplade celler med neurogene potentialer afhænger af to vigtige morfogener, Shh og FGF8b6,25,26. Shh er en ventralizing morphogen, udskilt af notochord26,27. Her erstattede vi SHH med det lille molekyle SAG1, en SHH pathway agonist, der er mere økonomisk end SHH. Også, grundlæggende neurale kulturmedium og supplement (tabel over materialer) er vigtige for neuronal overlevelse og differentiering. Med denne protokol, DA prækursorer blev opnået mod slutningen af den første fase, og mere modne DA neuroner blev genereret i slutningen af anden fase. Forøgelse af tidsrummet for anden etape til 40-55 dage kunne yderligere øge andelen af modne DA neuroner i kulturen. Inkluderet i anden fase medium er retinsyre, BDNF, GDNF, TGF-βIII, DAPT og cAMP, som har vist sig at være i stand til at fremme DA neuron modning og overlevelse. For at teste effektiviteten af iNSCs i differentiering i DA neuroner, de differentierede celler blev undersøgt for ekspression af markører NURR1, FOXA2, GIRK2 og TH. I en tidligere undersøgelse, i slutningen af fase I (dag 10), 87,76% og 65,33% celler udtrykt NURR1 og FOXA2, henholdsvis11. I slutningen af fase II (dag 24) nåede procentdelen af NURR1+ celler op på 95,58%, og ANDELEN af FOXA2+ celler nåede 77,33%11. På dette tidspunkt, 57,23% og 28,55% celler var positive for TH og GIRK2, henholdsvis11. Svarende til det, der er observeret for iPSC-differentiering mod DA-neuroner, findes der også en batch-til-linje variation for iNSC-differentiering, som påvirkes af faktorer som celle tilstand, aktiviteten af små molekyler, der anvendes, og plasticiteten af stamceller fra forskellige personer. Det er også bemærkelsesværdigt, at en vigtig afgørende for differentierings effektiviteten er celletæthed. En såningstæthed på 5 x 103 celler pr. 12 mm glas dækseddel i 24-brønd plader anbefales. Faktisk udviser iNSCs en god proliferativ hastighed under differentierings stadiet I. INSCs seedet i en brønd af en 24-brønd plade ville give anledning til et tilstrækkeligt antal af DA prækursorer ved differentiering dag 10 − 13 for transplantation i en mus (2 x 105 for hver mus).
Denne protokol indeholder en metode til etablering af reproducerbare og stabile unilaterale 6-OHDA-læsionerede PD-musemodeller. Omfanget af 6-OHDA læsion kan estimeres ved adfærdsmæssig vurdering, der måler de kontralaterale rotationer efter injektion af Apomorphin. Også, graden af 6-ohda-induceret læsion kan kvantificeres ved post mortem immunfluorescent farvning for th i snpc. En anden type af nervegift anvendes i PD modellering er 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tertahydropyridin (MPTP), som også forstyrrer dopaminerge veje. Sammenlignet med MPTP, 6-OHDA kunne administreres uni-eller bilateralt. Desuden er MPTP-metoden mere følsom over for dyrenes alder, køn og stamme og kan således vise en højere grad af variation mellem dyrene28. De kritiske faktorer omfatter valg af mus med matchende vægt, injektion af frisklavet 6-OHDA-opløsning og udførelse af kirurgi nøjagtigt og hurtigt.
Procedurerne for celletransplantation af da prækursorer i striatum af læsionerede mus er dybest set de samme som procedurerne for generering af 6-ohda-skam PD-musemodeller, bortset fra at 6-ohda erstattes af da prækursorer ved Indsprøjtnings trinnet. Den vigtigste faktor i denne del er at søge den optimale tidsvindue af DA Celledifferentiering for transplantation. Det er blevet påvist, at en højere grad af stemthed korrelerer med en højere overlevelsesrate, men et lavere potentiale af specifikation i modne DA neuroner11. Men en mere moden fase af neurale celler er mere sårbare, og viser en lavere overlevelsesrate efter transplantation11. Derfor, at finde et passende tidsvindue, der balancerer evnen til modning og overlevelse er af betydning. I en tidligere undersøgelse, vi transplanterede celler af differentiering dag 10 og 13 i striatum af immunodedygtige SCID-beige mus11. En måned efter engraftment, immunfluorescent farvning resultater afslørede, at omkring 88,63% og 93,13% var TUJ1-positive for dag 10 og dag 13 grupper, henholdsvis, og nogle th+ celler (5,30%) blev detekteret fra dag 13 gruppe, men få TH+ celler fra dag 10 gruppe. Ikke desto mindre, sammenlignet med dag 13 celler, dag 10 celler gav anledning til en lidt højere samlede overlevelsesrate11. Resultaterne afslørede, at dag 10 til dag 13 er et optimalt tidsvindue af celler til engraftment11. I denne protokol, vi brugte en blanding af DA celler fra differentiering dag 10 og dag 13 i et forhold på 1:7 for engraftment, som viste et godt resultat af overlevelse og differentiering11. Ved hjælp af en blanding af celler fra dag 10 og dag 13 var baseret på en hypotese, at relativt umodne og modne neurale celler, når de sættes sammen, kan støtte hinanden, der minder om in vivo situation i mus, hvor neurale stamceller er omgivet af modne neuroner.
Denne protokol præsenterer metoden til at generere iNSCs fra PBMNCs af SeV infektion, differentiere iNSCs ind i DA neuroner, og Trans plere DA forstadier i 6-OHDA-lesioned PD musemodeller. Ved hjælp af denne protokol, kan man generere iNSCs med potentialer ikke kun til behandling af PD, men også af andre neurodegenerative sygdomme. Da iNSCs repræsenterer en primitiv NSC etape, kan de specificeres i forskellige region-specifikke neurale celler, såsom rygmarvs neuroner eller motoriske neuroner, som kan være af lovende nytte til behandling af amyotrofisk lateral sklerose eller rygmarvsskade. Udover, iNSCs afledt af familiær sygdom patienter tilbyder en platform til at studere mekanismer underliggende sygdomsudbrud og udvikling, og til at gennemføre Drug screening tests.
Der er mere end én måde at få DA neurale celler til transplantation undersøgelser. DA-celler kan også genereres fra iPSCs eller ved direkte konvertering29. Sammenlignet med iPSCs, iNSCs er iboende med reduceret risiko for tumordannelse, en kortere periode med omprogrammering og linje etablering, og Lineage-engageret plasticitet-kun i stand til at differentiere sig til neuroner og glia11. Sammenlignet med direkte omstilling giver differentiering af DA-prækursorer fra iNSCs en højere ydelse og effektivitet30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Arbejdet blev støttet af følgende tilskud: stamcelle og Translation National Key Project (2016YFA0101403), National Natural Science Foundation i Kina (81661130160, 81422014, 81561138004), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Talents Foundation (2017000021223TD03), støtteprojekt af højt niveau lærere i Beijing kommunale universiteter i perioden 13:5-årige plan (CIT & TCD20180333), Beijing Medical system højt niveau talent Award (2015-3-063), Beijing Kommunale sundhed provision fond (PXM 2018_026283_000002), Beijing 100, tusind, og 10000 talenter Fund (2018A03), Beijing kommunale administration af hospitaler klinisk medicin udvikling af særlig støtte (ZYLX201706), og Royal Society-Newton Advanced Fellowship (NA150482).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15-ml conical tube | Corning | 430052 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic for inhalation and skin contact |
| 24-well plate | Corning | 3337 | |
| 50-ml conical tube | Corning | 430828 | |
| 6-OHDA | Sigma-Aldrich | H4381 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Cell dissociation reagent |
| Apomorphine | Sigma-Aldrich | A4393 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A92902 | Toxic with skin contact |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | Brain derived neurotrophic factor |
| Blood collection tubes containing sodium heparin | BD | 367871 | |
| BSA | yisheng | 36106es60 | Fetal bovine serum |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dibutyryladenosine cyclic monophosphate |
| CellBanker 2 | ZENOAQ | 100ml | Used as freezing medium for PBMNCs |
| Chemically defined lipid concentrate | Invitrogen | 11905031 | |
| CHIR99021 | Gene Operation | 04-0004 | |
| Coverslip | Fisher | 25*25-2 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417-10mg | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915-100MG | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11330 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320 | |
| Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
| EPO | Peprotech | 100-64-50UG | Human Erythropoietin |
| FGF8b | Peprotech | 100-25 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | P=1.077, density gradient medium |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | Glial derived neurotrophic factor |
| GlutaMAX | Invitrogen | 21051024 | 100 × Glutamine stock solution |
| Ham's-F12 | Gibco | 11765-054 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175079 | Balanced salt solution |
| Human leukemia inhibitory factor | Millpore | LIF1010 | |
| Human recombinant SCF | Peprotech | 300-07-100UG | |
| IGF-1 | Peprotech | 100-11-100UG | Human insulin-like growth factor |
| IL-3 | Peprotech | 200-03-10UG | Human interleukin 3 |
| IMDM | Gibco | 215056-023 | Iscove's modified Dulbecco's medium |
| Insulin | Roche | 12585014 | |
| ITS-X | Invitrogen | 51500-056 | Insulin-transferrin-selenium-X supplement |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | Serum free basal medium |
| Laminin | Roche | 11243217001 | |
| Microsyringe | Hamilton | 7653-01 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| NEAA | Invitrogen | 11140050 | Non-essential amino acid |
| Neurobasal | Gibco | 10888 | Basic medium |
| PDL | Sigma-Aldrich | P7280 | Poly-D-lysine |
| SAG1 | Enzo | ALX-270-426-M01 | |
| SB431542 | Gene Operation | 04-0010-10mg | Store from light at -20? |
| Sendai virus | Life Technologies | MAN0009378 | |
| Sucrose | baiaoshengke | ||
| TGFβ? | Peprotech | 100-36E | Transforming growth factor β? |
| Transferrin | R&D Systems | 2914-HT-100G | |
| Triton X 100 | baiaoshengke | Nonionic surfactant | |
| Trypan blue | Gibco | T10282 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 |
References
- Williams-Gray, C. H., et al. The distinct cognitive syndromes of Parkinson's disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort. Brain. 132, Pt 11 2958-2969 (2009).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radical Biology and Medicine. 62, 132-144 (2013).
- Chen, Z. Cell Therapy for Parkinson's Disease: New Hope from Reprogramming Technologies. Aging and Disease. 6 (6), 499-503 (2015).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Doi, D., et al. Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12543-12548 (2004).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S.
- Tang, X., et al. Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors. Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).
- Yuan, Y., et al. Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson's disease model. Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).
- Bazley, F. A., et al. Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells. Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).
- Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method. Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).
- Zhu, S., et al. Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds. Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).
- Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).
- Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson's disease. Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).
- Sheng, C., et al. Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors. Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).
- Prasad, A., et al. A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation. Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).
