Summary
Il protocollo presenta la riprogrammazione delle cellule mononucleari del sangue periferiche per indurre le cellule staminali neurali mediante l'infezione da virus Sendai, la differenziazione degli iNSC in neuroni dopaminergici, il trapianto di precursori DA nei precursori unilateralmente Modelli murini del morbo di Parkinson e valutazione della sicurezza e dell'efficacia dei precursori DA derivati da iNSC per il trattamento con LA PD.
Abstract
Il morbo di Parkinson (PD) è causato dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici (DA) alla substantia nigra pars compacta (SNpc) nel mesencephalon ventrale (VM). La terapia sostitutiva cellulare promette molto per il trattamento della PD. Recentemente, le cellule staminali neurali indotte (iNSC) sono emerse come potenziale candidato per la terapia sostitutiva cellulare a causa del ridotto rischio di formazione del tumore e della plasticità di dare origine a neuroni e glia specifici della regione. Gli iNSC possono essere riprogrammati da fonti cellulari somatiche autologhe, come fibroblasti, cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCNC) e vari altri tipi di cellule. Rispetto ad altri tipi di celle somatiche, i PBMCC sono un tipo di cellula di partenza accattivante a causa della facilità di accesso ed espansione nella coltura. Il virus Sendai (SeV), un virus RNA non integrativo, che codifica i fattori di riprogrammazione tra cui l'uomo OCT3/4, SOX2, KLF4 e c-MYC, ha un genoma a senso negativo, a filamento singolo e non segmentato che non si integra genoma ospite, ma si replica solo nel citoplasma delle cellule infette, offrendo un veicolo efficiente e sicuro per la riprogrammazione. In questo studio viene descritto un protocollo in cui gli iNSC vengono ottenuti riprogrammando i PBMCNC, e differenziati in neuroni VM DA specializzati con un metodo a due stadi. Poi i precursori DA vengono trapiantati in modelli murini PD a 6-hyroxydopamina (6-OHDA) per valutare la sicurezza e l'efficacia per il trattamento della PD. Questo metodo fornisce una piattaforma per studiare le funzioni e gli effetti terapeutici delle cellule neurali DA specifiche del paziente in vitro e in vivo.
Introduction
Il morbo di Parkinson (PD) è un disturbo neurodegenerativo comune, causato dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici (DA) alla substantia nigra pars compacta (SNpc) nella mesincephalon ventrale (VM), con una prevalenza di oltre l'1% della popolazione sopra i 60 anni di età 1 : il nome del , 2. Nell'ultimo decennio, la terapia cellulare, volta a sostituire le cellule degenerative o danneggiate, o a nutrire il microambiente intorno ai neuroni degeneranti, ha mostrato un potenziale nel trattamento della PD3. Nel frattempo, la tecnologia di riprogrammazione ha fatto progressi significativi4, che fornisce una fonte cellulare promettente per la terapia sostitutiva. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC) e le cellule staminali embrionali (ESC) hanno dimostrato di essere in grado di differenziarsi nelle cellule neurali DA, che potrebbero sopravvivere, maturarsi e migliorare le funzioni motorie quando innestate nei modelli di PD di ratti e primati non umani5 ,6,7,8. Gli iPSC rappresentano una pietra miliare nelle tecnologie di riprogrammazione cellulare e hanno un grande potenziale nel trapianto di cellule; tuttavia, c'è ancora una preoccupazione circa il rischio di formazione del tumore dalle cellule incompletamente differenziate. Una fonte cellulare alternativa per il trapianto di cellule è costituita da cellule staminali adulte impegnate nel lignaggio ottenute attraverso la riprogrammazione diretta, come le cellule staminali neurali indotte (iNSC), che possono essere derivate dagli intermedi instabili, bypassando la pluripotenza fase9,10,11.
Sia gli iPSC che gli iNSC possono essere riprogrammati da fonti cellulari autologhe, come fibroblasti, cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCNC) e vari altri tipi di cellule12,13,14, riducendo così la immunogenicità delle cellule trapiantate in gran parte. Inoltre, rispetto agli iPSC, gli iNSC sono intrinseci con ridotto rischio di formazione del tumore e plasticità impegnata nel lignaggio, solo in grado di differenziarsi in neuroni e glia11. Negli studi iniziali, iPSC umani o topi e iNSC sono stati generati da fibroblasti ottenuti da biopsie cutanee, che è una procedura invasiva14,15. A questo proposito, i PBMNC Sono una fonte di cellule di partenza attraente a causa del processo di campionamento meno invasivo e della facilità di ottenere un gran numero di cellule entro un breve periodo di tempo di espansione16. Gli studi iniziali di riprogrammazione hanno impiegato sistemi di erogazione integrativi, come vettori lentivirali o retrovirali, che sono efficienti e facili da implementare in molti tipi di cellule17; tuttavia, questi sistemi di somministrazione possono causare mutazioni e riattivazione di transgeni residui, che presentano problemi di sicurezza per scopi terapeutici clinici12. Il virus Sendai (SeV) è un virus RNA non integrativo con un genoma a singolo filamento negativo che non si integra nel genoma dell'ospite, ma si replica solo nel citoplasma delle cellule infette, offrendo un veicolo efficiente e sicuro per la riprogrammazione18 ,19. Sono disponibili vettori SeV ricombinanti che contengono fattori di riprogrammazione, tra cui l'oggetto OCT3/4, SOX2, KLF4 e c-MYC nei frame di lettura aperti. Inoltre, i vettori virali SeV possono essere ulteriormente migliorati introducendo mutazioni sensibili alla temperatura, inmodo che possano essere rapidamente rimossi quando la temperatura di coltura viene aumentata a 39 . In questo articolo viene descritto un protocollo per riprogrammare i PBMNN in iNSC utilizzando il sistema SeV.
Molti studi hanno riportato la derivazione di neuroni DA da ESC umani o iPSC utilizzando vari metodi6,8,21. Tuttavia, c'è una carenza di protocolli che descrivono la differenziazione dei neuroni DA da iNSC nei dettagli. In questo protocollo, descriveremo la generazione efficiente di neuroni DA da iNSC utilizzando un metodo a due stadi. I precursori neuronali DA possono essere trapiantati nello striato dei modelli murini della PD per le valutazioni di sicurezza ed efficacia. Questo articolo presenterà un protocollo dettagliato che copre varie fasi dalla generazione di cellule staminali neurali indotte dal virus Sendai, la differenziazione di iNSC in neuroni DA, la creazione di modelli di PD murino, al trapianto di precursori DA nello striato dei modelli PD. Utilizzando questo protocollo, si possono generare iNSC da pazienti e donatori sani e derivare neuroni DA sicuri, standardizzati, scalabili e omogenei ai fini del trapianto di cellule, o per la modellazione della PD in un piatto e lo studio dei meccanismi l'insorgenza e lo sviluppo della malattia sottostante.
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Protocol
Tutte le procedure devono seguire le linee guida del comitato etico istituzionale per la ricerca umana. Il consenso informato deve essere ottenuto da pazienti o volontari sani prima della raccolta del sangue. Questo protocollo è stato approvato dal comitato etico della ricerca umana dell'istituzione ed è stato eseguito secondo le linee guida dell'istituzione per la cura e l'uso degli animali.
1. Raccolta, isolamento ed espansione di PBMNC
- Raccolta di PBMNC
- Raccogli 10-20 mL di sangue velenoso periferico del donatore con venipuncture con una fiala conservante di eparina di sodio.
NOTA: I campioni di sangue devono essere conservati o spediti a temperatura ambiente (RT). Elaborare i campioni di sangue entro 24 ore.
- Raccogli 10-20 mL di sangue velenoso periferico del donatore con venipuncture con una fiala conservante di eparina di sodio.
- Preparazione del mezzo culturale
- Preparare il seme senza siero (SFM) combinando i seguenti componenti: 245 mL del mezzo di Dulbecco (IMDM) modificato di Iscove (IMDM), 240 mL di F-12 di Ham, 5 mL di supplemento insulino-trasferiscibile-X (ITS-X), 5 mL di 100x soluzione di broamina di glutamina (Tabella di Materiali), 5 mL di concentrato lipidico definito chimicamente, 2,5 g di siero bovino fetale, 0,025 g di acido ascorbico e 9 -L di 1-thiolicerolo. Filtrare il mezzo e conservarlo a 4 gradi centigradi.
AVVISO: L'acido ascorbico e il 1-thiolicerolo sono tossici per contatto con la pelle e per inalazione. - Per preparare il mezzo a cellule mononucleari (MNC), integrare il mezzo SFM con 10 ng/mL di interleuchina umana pari a 3 (IL-3), 2 U/mL erythropoietin (EPO), 100 ng/mL fattore di cellule staminali umane (SCF), 40 ng/mL fattore di crescita umano simile all'insulina 1 (IGF-1), 100 M dexamethasone. Filtrare il mezzo e conservarlo a 4 gradi centigradi.
NOTA: Preparare il supporto immediatamente prima dell'uso.
- Preparare il seme senza siero (SFM) combinando i seguenti componenti: 245 mL del mezzo di Dulbecco (IMDM) modificato di Iscove (IMDM), 240 mL di F-12 di Ham, 5 mL di supplemento insulino-trasferiscibile-X (ITS-X), 5 mL di 100x soluzione di broamina di glutamina (Tabella di Materiali), 5 mL di concentrato lipidico definito chimicamente, 2,5 g di siero bovino fetale, 0,025 g di acido ascorbico e 9 -L di 1-thiolicerolo. Filtrare il mezzo e conservarlo a 4 gradi centigradi.
- Isolamento dei PBMNC
- Ultraviolet-sterilizzare una panca pulita prima dell'uso. Sterilizzare tutte le superfici e le attrezzature con il 75% di alcol. Sterilizzare tutti i suggerimenti utilizzando un'autoclave.
- Trasferire il sangue periferico (PB) in un tubo conico da 50 mL e diluire il PB con un volume uguale di salina (D-PBS) di Dulbecco.
- Preparare 15 mL di gradiente di densità sterilizzato medio (Tabelle dei materiali) in un altro tubo conico da 50 mL.
NOTA: mantenere il gradiente di densità medio e PB a RT per consentire un migliore isolamento dei PBMNC. - Inclinare il tubo conico contenente il mezzo di pendenza di densità con un angolo di 45 gradi, quindi posare lentamente e con cura 30 mL di PB diluito sul mezzo di pendenza di densità.
NOTA: fare attenzione e lasciare che il PB scorra lentamente lungo il lato del tubo conico sul livello medio del gradiente di densità. I globuli rossi si depositano sul fondo del tubo. Inclinare il tubo con attenzione per ridurre al minimo l'interruzione dell'interfaccia del livello. - Centrifugare i tubi a 800 x g per 15 min a RT con il freno centrifuga impostato in posizione "off". Aspirare lo strato di plasma superiore giallo e scartato. Quindi trasferire lo strato di pellicola sottile torbida bianca contenente MNC con una pipetta da 10 mL in un nuovo tubo conico da 50 mL.
NOTA: lo spegnimento del freno di centrifuga è importante per l'isolamento degli MNC. - Aggiungere 30 mL di D-PBS al tubo con MNC e centrifugare a 600 x g per 10 min a 4 gradi centigradi. Eliminare il supernatante, quindi aggiungere 45 mL di D-PBS per sospendere nuovamente le celle. Centrifuga a 400 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
NOTA: Il freno centrifuga deve essere acceso per questo e le seguenti fasi di centrifugazione. Poiché i pellet cellulari sono densi, aggiungere 1-2 mL di D-PBS per sospendere delicatamente i pellet, quindi aggiungere D-PBS a 45 mL. - Eliminare il supernatante e sospendere nuovamente le celle con 5 mL di D-PBS e contare le celle vive con il metodo di esclusione blu trypan.
- Dopo aver messo da parte gli MNC necessari per l'espansione, congelare le celle rimanenti per un uso futuro.
NOTA: almeno 5 x 106 MNC possono essere congelati in una fiala con 1 mL di mezzo di congelamento (Tabella dei materiali). Il protocollo può essere messo in pausa qui.
- Espansione delle MNC
- Il giorno -14, semina mNC ad una densità di 2-3 x 106 celle per millili, in un pozzo di sei pozzetti con 1,5 mL di mezzo MNC preriscaldato (37 gradi centigradi). Incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO2 per 2 giorni.
- Il giorno -11, raccogliere le cellule e il mezzo con una pipetta sterilizzata e trasferirli in un nuovo tubo conico da 15 mL. Centrifugare le cellule a 250 x g per 5 min a RT. Scartare il supernatante e ri-sospendere le cellule in 1 mL di preriscaldato (37 s) mezzo MNC.
- Contare le cellule vitali con trypan blu. Semina le MNC ad una densità di 1 x 106 cellule per millilivolante in mezzo MNC preriscaldato e incuba a 37 c, 5% di CO2 per 3 giorni.
NOTA: Si prevede che il numero totale di celle possa diminuire il giorno -11. - Il giorno -8 ripetere i passaggi da 1.4.2-1.4.3 e fare la coltura delle celle per 3 giorni.
- Il giorno -4 ripetere i passaggi da 1.4.2-1.4.3 e fare la coltura delle celle per 3 giorni.
NOTA: dopo 14 giorni di cultura, un numero uguale o maggiore di MNC deve rimanere nella coltura.
2. Riprogrammazione di PBMNC a iNSC mediante infezione SeV
- Preparazione della soluzione e del mezzo di coltura
- Preparare una soluzione di riserva polid-lysina (PDL) sciogliendo 100 mg di PDL con 100 mL di H2O a una concentrazione di 1 mg/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in 1 mL aliquote.
- Preparare una soluzione di stock di insulina sciogliendo 100 mg di insulina in 20 mL di 0,01 N HCl a una concentrazione di 5 mg/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in 1 mL aliquote.
- Per preparare 200 mL di iNSC basal medium, combinare 96 mL di DMEM-F12 e 96 mL di mezzo di base (Tabella dei materiali) con 2 mL di 100x soluzione stock di glutammina, 2 mL di aminoacido non essenziale (NEAA), 2 mL di supplemento N2 e 2 mL di supplemento B27. Aggiungere 10 ng/mL fattore inibitorio della leucemia umana ricombinante, 3 -M CHIR99021 e 2 SB431542 prima dell'uso. Filtrare il mezzo e conservarlo a 4 gradi centigradi.
NOTA: utilizzare il supporto entro 2 settimane. Aggiungere immediatamente prima l'uso del fattore inibitorio della leucemia umana ricombinante, CHIR99021 e SB431542.
- Riprogrammazione di PBMNC a iNSC da parte dell'infezione SeV
- Ultraviolet-sterilizzare una panca pulita prima dell'uso. Sterilizzare tutte le superfici e le attrezzature con il 75% di alcol. Sterilizzare tutti i suggerimenti utilizzando un autoclave.
- Il giorno 0, raccogliere le celle nel mezzo MNC e trasferire in un tubo conico 15 mL. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min. Aspirate the supernatant e ri-sospendere le cellule con 1 mL di mezzo MNC preriscaldato.
- Contare le cellule vitali con trypan blu. Sospendere nuovamente le cellule con un mezzo MNC preriscaldato (37 gradi centigradi) a una concentrazione di 2 x 105 cellule per pozzo in piastre di 24 pozzetti.
- Dopo aver rimosso i tubi SeV dallo stoccaggio di -80 gradi centigradi, scongelare i tubi contenenti SeV in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 5-10 s, quindi lasciarli scongelare a RT. Una volta scongelato, metteteli immediatamente sul ghiaccio.
- Aggiungere la codifica SeV umana Klf4, Oct3/4, SOX2 e c-MyC ai pozzi, ad una molteplicità di infezione (MOI) di 10. Centrifugare le cellule con piastre a 1.000 x g per 30 min per facilitare l'attaccamento delle cellule. Lasciare le cellule e supernatali nelle piastre. Collocare le piastre nell'incubatrice a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
AVVISO: Tutte le procedure che coinvolgono SeV devono essere eseguite in un armadio di sicurezza e tutte le punte e i tubi devono essere trattati con etanolo o candeggina prima dello smaltimento. - Il primo giorno, trasferire il mezzo e le cellule in un tubo di centrifuga di 15 mL. Sciacquare il pozzo con 1 mL di mezzo MNC. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5 min. Aspirate the supernatant e ri-sospendere le cellule con 500 .L di mezzo MNC preriscaldato fresco in piastre 24-well.
NOTA: Utilizzare una piastra a basso fissaggio 24-po ' per evitare l'attacco di tutte le cellule prima della placcatura su PDL / lamina. - Il giorno 2 diluire 1 mL di 1 mg/mL PDL con 19 mL di D-PBS a una concentrazione di 50 g/mL. Cappotto 6 lastre con 50 g/mL PDL per almeno 2 h a RT.
- Diluire 200 ll di 0,5 mg/mL di laminina con 20 mL di D-PBS a una concentrazione di 5 g/mL. Aspirate PDL nelle piastre a 6 pozzi, e asciugare sul banco verticale pulito.
- Cappotto 6 lastre con 5 g/mL di laminina e incubare per 4-6 h a 37 gradi centigradi. Lavare con D-PBS prima dell'uso.
- Il giorno 3, piastrare le cellule trasdotte ottenute al passo 2.2.6 in mezzo iNSC su piastre a 6 velo rivestite di PDL/lamininin.
NOTA: Spostare delicatamente le piastre se necessario dopo che le cellule sono state posizionate su piastre rivestite di PDL / laminani, cercando di non disturbare l'attaccamento delle cellule. - Il giorno 5, aggiungere 1 mL di mezzo preriscaldato (37 gradi centigradi) in ogni pozzo in 6 piatti delicatamente.
NOTA: Si prevede che le cellule subiranno una morte drastica (>60%). - Il giorno 7, aggiungere 1 mL di mezzo preriscaldato (37 gradi centigradi) in ogni pozzo in 6 piatti delicatamente.
- Dal giorno 9 al giorno 28, sostituire mezzo trascorso con fresco preriscaldato (37 gradi centigradi) mezzo iNSC ogni giorno. Monitorare l'emergere delle colonie iNSC. Scegli e trasferisci i cloni iNSC per l'espansione in circa 2-3 settimane. Raccogliere colonie con morfologia appropriata utilizzando pipette di vetro bruciate, escludendo eventuali cellule contaminanti, e aspirare le colonie con 200 punte.
NOTA: Gli iNSC caratterizzati possono essere congelati per un uso futuro con 2-5 colonie in una fiala. Il mezzo di congelamento comprende il mezzo basale senza siero (Tabella dei materiali) e il basaforno dimetilo miscelato ad un rapporto di 9:1, che deve essere preparato immediatamente prima dell'uso. Il protocollo può essere messo in pausa qui.
3. Differenziazione degli iNSC ai neuroni dopaminergici
- Preparazione della soluzione e del mezzo di coltura
- Preparare 200 mL di iNSC differenziazione basale medium combinando 192 mL di DMEM-F12 con 2 mL di 100x soluzione stock di glutamina, 2 mL di NEAA, 2 mL di supplemento N2 e 2 mL di supplemento B27.
NOTA: utilizzare il supporto entro 2 settimane. - Preparare il supporto I della fase di differenziazione iNSC integrando il supporto basale di differenziazione iNSC con 1 -M SAG1 e 100 ng /mL FGF8b.
NOTA: utilizzare il supporto entro 2 settimane. - Preparare il mezzo iNSC dedere lo stadio di differenziazione iNSC II medio integrando il mezzo basale di differenziazione iNSC con 0,5 mm di adenosina ciclica monofosfata (cAMP), 0,2 mM di acido ascorbico, 10M DAPT, 10 ng/mL cervello derivato fattore neurotrofico (BDNF), 10 ng/mL derivato gliale fattore neutrofico (GDNF) e 1 ng/mL che trasforma il fattore di crescita di ZIII (TGF-III).
NOTA: utilizzare il supporto entro 2 settimane.
- Preparare 200 mL di iNSC differenziazione basale medium combinando 192 mL di DMEM-F12 con 2 mL di 100x soluzione stock di glutamina, 2 mL di NEAA, 2 mL di supplemento N2 e 2 mL di supplemento B27.
- Rivestimento dei piatti della cultura
- Ultraviolet-sterilizzare una panca pulita prima dell'uso. Sterilizzare tutte le superfici e le attrezzature con il 75% di alcol. Sterilizzare tutti i suggerimenti utilizzando un autoclave.
- Per il rivestimento PDL, almeno un giorno prima di ri-placcare le cellule, diluire 1 mL di 1 mg/mL PDL con 19 mL di D-PBS ad una concentrazione di 50 g/mL. Coat 12 mm vetro coprelabbra che sono stati sterilizzati con 75% di alcool nelle piastre 24-pozzo con 50 g /mL PDL a RT per almeno 2 h.
- Per il rivestimento di lamino, diluire 200 - L di 0,5 mg/mL di laminina con 20 mL di D-PBS a una concentrazione di 5 g/mL. Aspirate PDL e asciugare i pozzi nella panca pulita. Rivestire i copricapi da 12 mm con 5 laminina da 12 g/mL e incubare per 4-6 h a 37 gradi centigradi. Lavare con D-PBS prima dell'uso.
- Celle di passaggio per differenziazione.
- Quando la confluenza di iNSC coltivati raggiunge il 70-90%, aspira il mezzo dalla piastra di coltura e aggiunge 1 mL di D-PBS per lavare le cellule. Aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione cellulare preriscaldato (37 gradi centigradi) (Tabella dei materiali) per pozzo e incubare a 37 gradi centigradi per 3 min per dissociare le cellule.
- Dopo l'incubazione per 3 min, le cellule sono diventate semi-galleggianti; aggiungere 3 mL di preriscaldato (37 gradi centigradi) di DMEM-F12 medio per pozzo, e le cellule pipette su e giù per dissociare i pellet cellulari in singole cellule.
- Trasferire le cellule in un tubo conico da 15 mL, e centrifugare a 250 x g per 3 min. Aspirate the supernatant, ri-sospendere le cellule con il volume appropriato di preriscaldato (37 c) iNSC medio in base al numero di cellule.
- Contare le celle utilizzando il metodo di esclusione blu trypan. Piastra 5 x 103 celle per coprivele di vetro da 12 mm in piastre a 24 piani e incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
- Differenziare iNSC in neuroni dopaminergici.
- Iniziare la differenziazione 24 h dopo aver ri-placcato le cellule su copritrici rivestite di PDL / laminina. Aspirare il mezzo di coltura, lavare le cellule una volta con D-PBS, quindi aggiungere 600 l di fase di differenziazione preriscaldata I medio per bene in piastre 24 pozzetti e incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
- Cambia media ogni giorno dal giorno 1 al giorno 10 durante la prima fase di differenziazione.
- Il giorno 10, aspirare il mezzo di coltura, e lavare le cellule una volta con D-PBS. Aggiungete 600 l di fase di differenziazione preriscaldata (37 gradi centigradi) medio II per pozzo in piastre di 24 pozzetti e incubate a 37 gradi centigradi, 5% di CO2.
- Cambiare media a giorni alterni dal giorno 11 al giorno 25 durante la seconda fase di differenziazione. Le cellule differenziate possono essere fissate da paraformaldeide in diversi momenti di analisi.
- Per la colorazione immunofluorescente, lavare le cellule con D-PBS tre volte delicatamente nei punti temporali scelti entro il giorno di differenziazione 11-25.
- Pipette 300 - L di surfactant nonionico (Tabella dei materiali) in 100 mL di PBS per fare un surfactant nonionico dello 0,3% in PBS.
INFORMATIVA: Il surfactant non ionico è tossico per contatto con la pelle e per inalazione. - Fissare le cellule con 4% paraformaldeide per 10 min a RT. Quindi lavare con lo 0,3% in PBS tre volte.
AVVISO: la paraformaldeide è tossica per contatto con la pelle e inalazione. - Bloccare le cellule del 3% di siero d'asino per 2 h a RT.
- Diluire l'anticorpo primario in 1% siero d'asino ad una concentrazione appropriata e triturare delicatamente per mescolare. Aggiungere 300 l della soluzione anticorpale primaria ad ogni pozzo della piastra di 24 pozze. Incubare le cellule a 4 gradi centigradi durante la notte. Lavare le cellule con 0.3% surfactant nonionico in PBS tre volte.
- Diluire l'anticorpo secondario in 1% siero d'asino ad una concentrazione appropriata e triturare delicatamente per mescolare. Aggiungere 300 l della soluzione anticorpale secondaria ad ogni pozzetto della piastra di 24 pozze. Incubare le cellule a RT per 2 h, protetto dalla luce.
- Lavare le cellule con 0.3% surfactant nonionico in PBS tre volte. Diluito 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) con PBS con 1:500 diluizione. Incubare le cellule in ogni pozzetto della piastra di 24 pozze con 300 l di DAPI diluito per 15 min a RT, protetto dalla luce. Lavare le cellule con 0.3% surfactant nonionico in PBS tre volte.
- Estrarre delicatamente i coperchi dai pozzetti delle piastre con pinze. Asciugare al buio durante la notte al Monto RT. al microscopio a fluorescenza.
4. Istituzione di modelli murini unilaterali da 6-hyroxydopamina (6-OHDA)
- Per generare modelli murini PD per il trapianto di cellule, utilizzare topi maschi adulti SCID-beige del peso di 20-25 g per l'iniezione di 6-OHDA.
- Preparazione di farmaci per la chirurgia
- Preparare una soluzione di acido ascorbico dello 0,2% sciogliendo 0,2 g di acido ascorbico in 100 mL di salina sterilizzata (0,9%) e conservare a -80 gradi centigradi fino all'uso. Il giorno dell'intervento, diluire la soluzione dell'acido ascorbico dello 0,2% di 10 volte per ottenere una soluzione di acido ascorbico dello 0,02%.
NOTA: Viene aggiunto acido ascorbico per prevenire l'ossidazione di 6-OHDA a una forma inattiva. - Per preparare una soluzione 6-OHDA, pesare la quantità appropriata di 6-OHDA in un tubo sterilizzato da 1 mL, quindi aggiungere un po' di volume di acido ascorbico dello 0,02% per creare una soluzione a 5 g/L 6-OHDA. Vorticare la miscela fino a quando non è sciolto. Posizionare il 6-OHDA sul ghiaccio fino all'uso.
NOTA: 6-OHDA è sensibile alla temperatura e alla luce. Fare attenzione a proteggere la soluzione dalla luce e tenerla sul ghiaccio prima dell'uso.
- Preparare una soluzione di acido ascorbico dello 0,2% sciogliendo 0,2 g di acido ascorbico in 100 mL di salina sterilizzata (0,9%) e conservare a -80 gradi centigradi fino all'uso. Il giorno dell'intervento, diluire la soluzione dell'acido ascorbico dello 0,2% di 10 volte per ottenere una soluzione di acido ascorbico dello 0,02%.
- Preparare l'apparecchiatura chirurgica sterilizzata autoclaving prima dell'intervento chirurgico. Pulire tutte le attrezzature e le aree di superficie con etanolo durante la configurazione del telaio stereotassico. Impostare una gabbia di recupero del mouse sotto una lampada di riscaldamento.
- Condurre un intervento chirurgico per stabilire modelli murini unilaterali 6-OHDA-lesioned.
- Pesare ogni topo, registrare il peso e calcolare la quantità di farmaco che deve essere somministrato. Ogni topo riceve 0,5 mg/kg di atropina 20 min prima delle operazioni. Anestesizzare il topo con 80 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilizina.
- Somministrare 0,5 mg/kg di atropina mediante iniezione intraperitoneale.
- Anestesizzare il topo con 80 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilografia mediante iniezione intraperitoneale 20 min dopo la somministrazione di atropina.
- Mettere il mouse in una camera chiusa. Dopo 3-5 min, il mouse sarà profondamente anetizzato senza risposta al pizzico della gamba posteriore.
NOTA: Si prevede che il topo che ha ricevuto l'anestesia sperimenterebbe un periodo di eccitazione. - Rasare la testa di topo e applicare erithromycin unguento occhio sugli occhi del mouse per la protezione da sviluppare ulcere corneali.
- Posizionare il mouse sull'apparato stereotassico. Fissare il mouse con le barre di incisivo in primo luogo. Inserire correttamente le cuffie auricolari per rendere la testa del mouse in una posizione piatta e sicura.
- Sterilizzare la testa del topo con iodio povidone e alcool isopropile. Tagliare un'incisione sagittale (1,5 cm) sulla pelle della testa con una lama del bisturi ed esporre il cranio. Regolare la barra di incisione e le barre dell'orecchio per ridurre la differenza di altezza tra bregma e lambda a meno di 0,1 mm.
NOTA: Il topo bregma si trova all'intersezione di suture coronali e sagittali, e lambda si trova all'intersezione di suture lambdoid e sagittali. - Spostare lentamente e abbassare la punta dell'ago verso il bregma e trattare il bregma come un punto zero. Spostare la punta in una posizione con le coordinate A/P 0,5 mm, M/L -2,1 mm rispetto al bregma. Ritirare la punta e contrassegnare il punto. Burr un piccolo buco nel cranio.
- Estraete nella microsiringe 2 -G/L 6-OHDA (Tabella dei materiali). Riportare l'ago al punto contrassegnato e inserire l'ago in D/V -3,2 mm.
- Iniettare 2 luna di 5 soluzione di 6-OHDA (10 g in totale) ad una velocità di 1 L/min. Dopo l'iniezione di 6-OHDA è completato, lasciare l'ago in posizione per altri 5 min. Quindi ritrarre lentamente l'ago di iniezione.
- Chiudere l'incisione con suture e applicare unguento occhio erithromycin sugli occhi del mouse. Consegnare sottocutaneamente 0,5 mL per prevenire la disidratazione e applicare un unguento antibiotico direttamente sulla pelle suturata.
- Rimuovere il mouse dall'apparato stereotassico e metterlo nella gabbia di recupero. Rimettere il mouse indietro e consentire l'accesso al cibo e all'acqua fino a quando non riacquista conoscenza. Trattare il mouse con analgesico in acqua potabile ogni giorno dopo l'intervento chirurgico per 2-3 giorni, e un dosaggio raccomandato di Ibuprofene è 0.03 mg/g di peso corporeo al giorno.
- Ispezionare il mouse quotidiano post-chirurgia.
5. Valutazione comportamentale dopo 6-OHDA unilaterale
- Due o tre settimane dopo l'intervento chirurgico, condurre la valutazione comportamentale per stimare i sintomi della PD. Pesare ogni topo, registrare il loro peso e calcolare la quantità di farmaco che deve essere somministrato (0,5 mg/kg di apomorfina prima della valutazione).
- Somministrare 0,5 mg/kg di apomorfina mediante iniezione sottocutanea prima della valutazione e posizionare il mouse in un cilindro di vetro.
- Dopo un periodo di abitudine di 5 minuti, contare il numero di rotazioni contralaterali e ipsilaterali rispetto al lato di lesione al minuto e registrare la loro attività con una videocamera.
- I topi con rotazioni con controlaterale meno ipsilaterali >7 rpm/min sono considerati riscioni e selezionati con successo come candidati per esperimenti di trapianto di cellule. Riportare i topi nelle gabbie di alloggiamento dopo un riposo di 30 min.
NOTA: Se il topo è stato lesionato con successo, 6-OHDA iniettato mouse mostrerà una maggiore distorsione nel girare verso il lato contralaterale dal momento che l'agonista DA attiva lo striato denervato supersensibile del lato lesioned prevalentemente. - Condurre la valutazione comportamentale una settimana prima e 2, 4, 6, 8, 12, 16 settimane dopo il trapianto di cellule.
6. Trapianto di cellule di precursori DA
- Preparare la sospensione cellulare per il trapianto. Per l'innesto cellulare, sospendere 2 x 105 precursori DA miscelati dai precursori D10 e D13 DA a un rapporto di 1:7 in 4 : L di 5 g di glucosio L-1 in soluzione di sale equilibrato (Tabella dei materiali) del buffer di trapianto.
- Eseguire un trapianto di cellule seguendo le procedure descritte nella sezione 4.4, ad eccezione del fatto che 6-OHDA è sostituito da DA prima della sospensione cellulare o buffer.
- Eseguire la valutazione comportamentale 2, 4, 6, 8, 12, 16 settimane dopo il trapianto di cellule dei precursori DA seguendo le procedure descritte nella sezione 5. Contare il numero di rotazioni contralaterali indotte da apomorfina rispetto al lato di lesione al minuto e registrare la loro attività con una videocamera.
NOTA: Dopo il trapianto, un tasso ridotto di rotazioni contralaterali suggerisce una funzione motoria migliorata. - A 4, 8 ,12, e 16 settimane dopo il trapianto di cellule, perfedire il topo in anestesia profonda con 4% paraformaldeide fino a quando il corpo del topo diventa rigido e il fegato del topo diventa pallido.
- Separare delicatamente il cervello del topo e mettere il cervello in 4% paraformaldeide a 4 gradi centigradi durante la notte.
- Il secondo giorno, mettere il cervello nel 30% saccarosio per la disidratazione fino a quando il cervello affonda sul fondo.
- Affettare il cervello a 40 m di spessore utilizzando un microtoma di congelamento.
- Eseguire l'immunostaining come descritto in precedenza nei passaggi 3.4.5-3.4.12.
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Representative Results
Qui, segnaliamo un protocollo che copre le diverse fasi della terapia cellulare iNSC-DA per il trattamento dei modelli PD. In primo luogo, i PBMNC sono stati isolati e ampliati e riprogrammati in iNSC dall'infezione da SeV. Nella figura 1è illustrata una rappresentazione schematica delle procedure con espansione PBMNC e induzione iNSC. Il giorno -14, i PBMNC sono stati isolati utilizzando un supporto di sfumatura di densità (Tabella dei materiali). Prima della centrifuga, il sangue diluito con PBS e il mezzo di pendenza di densità sono stati separati in due strati. Dopo la centrifuga, apparvero quattro strati di gradiente (dal basso verso l'alto): lo strato inferiore conteneva granulociti ed eritrociti; il secondo strato conteneva un gradiente di densità medio; il terzo conteneva PBMNC (freccia rossa); lo strato superiore conteneva plasma ricco di piastrine (Figura 2A). Dopo 14 giorni di espansione, i PBMNC sono stati infettati con SeV come giorno 0. Il giorno 1, media con SeV è stato rimosso (Figura 2B). Come illustrato nella figura 2B, si prevede che il numero di celle sia stato ridotto gradualmente. Le cellule hanno subito una morte drastica (>60%) fino al giorno 5 (Figura 2B). Le colonie iNSC sono emerse al primo giorno (Figura2B). Dopo aver raccolto e trasferito cloni iNSC per l'espansione per una serie di passaggi, la morfologia delle cellule è mostrata figura 2C. Gli iNSC hanno mostrato una buona morfologia e potrebbero auto-rinnovarsi stabilmente nel mezzo iNSC, sia in forma monostrato o come sfere (Figura 2C).
Gli iNSC potrebbero dare origine ai neuroni DA utilizzando un metodo a due stadi (Figura 1). Durante la prima fase, durata 10 giorni, gli iNSC sono stati trattati con SAG1 e FGF8b per indurre la specifica delle cellule della piastra VM con potenzialità neurogeniche. Quindi le cellule sono state trattate con acido ascorbico, BDNF, GDNF, cAMP, DAPT, TGF-III nella seconda fase (Figura 1). Con questo metodo a due stadi, i precursori DA potrebbero essere ottenuti verso la fine della prima fase, e i neuroni DA più maturi potrebbero essere generati alla fine del secondo stadio. Dopo 24 giorni di differenziazione, gli iNSC potevano essere specificati in modo efficiente ai neuroni DA come la maggior parte di loro esprimeva la scatola a forcella A2 (FOXA2), la classe specifica del neurone III-tubulina (TUJ1) e l'idrossilasi di tirosina (TH) (Figura 3).
Tre settimane dopo l'istituzione di modelli murini unilaterali 6-OHDA-lesioned PD, valutazione comportamentale è stata condotta per stimare i sintomi della PD (Figura 4A). Poi, una settimana dopo, i precursori dopaminergici sono stati trapiantati ai modelli murini della PD (Figura 4A). La valutazione comportamentale è stata effettuata una settimana prima e 2, 4, 6, 8, 12 settimane dopo il trapianto di cellule (Figura 4A). I topi che avevano ricevuto il trapianto di cellule hanno mostrato un miglioramento significativo nella funzione motoria (Figura 4B). L'estensione del lesioning indotto da 6-OHDA può essere verificata mediante colorazione immunofluorescente post-mortem per TH presso il fascio di striato, il prosencefalo mediale (MFB) e il SNpc (Figura 4C). I segnali positivi alla TH nei topi engrafted sono stati notevolmente recuperati nello striato dove le cellule sono state impiantate e leggermente recuperate a SNpc (Figura 4C). Tre mesi dopo il trapianto, circa il 13,84% erano i neuroni THe DA tra le cellule sopravvissute (Figura 4D,E). Circa il 91,72% e l'86,76% delle cellule di TH sono state espresse rispettivamente recettore nucleare orfano (NURR1) e FOXA2 (Figura 4 D,E). Circa il 98,77% delle cellule di TH sono state co-etichettate con il rettificatore interno accoppiato con proteina G (GIRK2) (Figura4D,E).
Figura 1 : una rappresentazione schematica delle procedure relative all'espansione PBMNC, all'induzione di iNSC e alla differenziazione degli iNSC in precursori DA. I PBMNC Sono stati isolati ed espansi nel supporto MNC per oltre 14 giorni e quindi infettati dalla codifica SeV soX2, OCT3/4, c-MYC e KLF4. Le colonie iNSC sono emerse già 12 giorni dopo l'infezione da SeV. Dopo 3-4 settimane, le colonie iNSC sono state raccolte e differenziate in precursori DA con un metodo a due stadi. PBMNC: cellule mononucleari del sangue periferico; MNC: cellule mononucleari; iNSC: cellule staminali neurali indotte; SeV: virus Sendai; DA: dopaminergico; PDL: polid-lysina; BDNF: fattore neurotrofico derivato dal cervello; GDNF: fattore neurotrofico derivato dalla linea delle cellule gliali; AA: acido ascorbico; cAMP: monofafato ciclico dibutyryladenosine; TGF: fattore di crescita trasformante. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : i PBMCNC vengono isolati ed espansi, quindi riprogrammati in iNSC dall'infezione da SeV. (A) Un esempio di PBMNCC prima e dopo la centrifugazione del gradiente. Prima della centrifuga, i campioni di sangue diluito e il mezzo di gradiente di densità erano separati in due strati. Dopo la centrifugazione, quattro strati di gradiente di densità formati dal basso verso l'alto: lo strato inferiore conteneva granulociti ed eritrociti; il secondo strato conteneva il gradiente medio di densità; il terzo strato conteneva PBMNC (freccia rossa); lo strato superiore conteneva plasma ricco di piastrine. (B) Le immagini della morfologia tipica delle cellule dopo i PBMNC sono state infettate da SeV nei giorni 1, 2, 5 e 12. Dopo che i PBMCNC sono stati infettati da SeV, alcune cellule sono morte e il numero di cellule è stato ridotto gradualmente. Un piccolo numero di cellule è rimasto il giorno 5. Il giorno 12, sono emerse colonie di iNSC. Barra della scala, 100 m. (C) La tipica morfologia degli iNSC del passaggio numero 20 nella coltura monostrato e sfera. Barra della scala, 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : differenziazione degli iNSC ai neuroni dopaminergici. Colorazione immunofluorescente per FOXA2, TH, TUJ1, DAPI e immagini fuse il giorno 24 su cellule differenziate da iNSC. Barra della scala, 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Trapianto di precursori DA differenziati da INSC in modelli murini unilaterali pd 6-OHDA. (A) Cronologia per il trapianto di cellule e i test comportamentali. (B) I risultati dei test comportamentali in momenti diversi dal gruppo 6-OHDA-cellule (n - 10), 6-OHDA-buffer group (n ) e gruppo di controllo (n - 3). I dati sono presentati come media : errore standard della media (SEM). p < 0.001 da analisi bidirezionale della varianza (ANOVA) con test di confronto multiplo di Dunnett. (C) Colorazione immunofluorescente post-mortem per TH presso il fascio di striati, fascio di prosencefalo mediale (MFB) e sostanziale nigra (SN) dell'emisfero 6-OHDA, dell'emisfero a 6-OHDA e del gruppo di controllo. Barre della scala, 100 m. (D) Percentuali di FOXA2/TH, NURR1/TH, GIRK2/TH, TH/HNA in topi innestati 3 mesi dopo il trapianto. HNA: anticorpo dei nuclei umani. I dati sono presentati come media - SEM. (E) Colorazione immunofluorescente per FOXA2, NURR1, GIRK2, TH e HNA su fette cerebrali da topi PD 12 settimane dopo il trapianto di cellule. HNA: anticorpo dei nuclei umani. Questa cifra è stata modificata daYuan et al. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui abbiamo presentato un protocollo che ha coperto diverse fasi della terapia cellulare iNSC-DA per i modelli PD. Gli aspetti critici di questo protocollo includono: (1) isolamento e espansione dei PBMCNC e riprogrammazione dei PBMCNC in iNSC mediante infezione da SeV, (2) differenziazione degli iNSC ai neuroni DA, (3) creazione di modelli murini PD unilaterali 6-OHDA-lesioned e (4) il trapianto di cellule dei precursori da DA e la valutazione comportamentale.
In questo protocollo, la prima parte prevede la raccolta e l'espansione di PMCCN in un mezzo senza siero (mezzo MNC), che espande preferibilmente gli erithroblasts e non supporta la proliferazione dei linfociti. Negli studi precedenti, diversi tipi di cellule somatiche sono stati riprogrammati in iPSC o iNSC12,13,14. Rispetto ad altri tipi di celle somatiche, i PBMNC hanno diversi vantaggi. Il vantaggio più significativo sono i loro modelli favorevoli di espressione genica e i profili epigenetici. I PBMCNC sono in vivo di breve durata e si riforniscono frequentemente da cellule staminali ematopoietiche attivate e possono accumulare meno mutazioni rispetto ai fibroblasti cutanei. Inoltre, il modo per campionare i PBMNC è meno invasivo di quello per i fibroblasti e ci vuole un periodo di tempo più breve per espandere i PBMCNC (circa 14 giorni) rispetto ai fibroblasti (circa 28 giorni)16,22. Dopo la centrifugazione utilizzando un mezzo di pendenza di densità, quattro gradienti di densità saranno formati dal basso verso l'alto; lo strato inferiore contiene granulociti ed eritrociti, il secondo strato inferiore contiene il mezzo di gradiente di densità, il terzo strato contiene MNC e il livello superiore contiene plasma. La resa dei PBMNC varia normalmente da individuo a individuo, in particolare da quelli di età diverse. In generale, i giovani tendono ad avere un numero maggiore di PBMNC rispetto agli anziani. Con il protocollo descritto, circa 1,8 x 3,4 x 107 PBMNCC potrebbero essere isolati da 15 mL di PB. Tra i PBMNC, il CD34- cellule staminali ematopoietiche sono relativamente inclini alla riprogrammazione, e il mezzo MNC può arricchire il CD34- cellule staminali ematopoietiche in una certa misura. Si prevede che un numero uguale o maggiore di cellule visibili coltivate con mezzo MNC rimanga dopo 14 giorni di espansione. SeV, un virus RNA non integrativo, ha un genoma di senso negativo, a singolo filamento, non segmentato che non si integra nel genoma ospite, ma si replica solo nel citoplasma delle cellule infette18,19. Riprogrammazione della codifica SeV ricombinante OCT3/4, SOX2, KLF4 e c-MYC, possono essere generaticome un mutante sensibile alla temperatura, che potrebbe essere rimosso facilmente a 39 . Con questo protocollo, abbiamo ricavato 8-20 colonie iNSC riprogrammando PBMNCC da un volontario o paziente sano utilizzando 15 mL di PB. Poi i ricercatori potrebbero selezionare colonie con buone morfologie per ulteriori passaggi e la creazione di linea. Nel rapporto pubblicato, iNSC di numeri di passaggio 10, 20 e 30 hanno mostrato tassi di proliferazione simili, e potrebbero essere passaggi più di 50 volte, mostrando un buon auto-rinnovamento e capacità proliferativa11. gli iNSC potrebbero essere caratterizzati da saggi di differenziazione e immunostaining per marcatori di cellule staminali neurali SOX2, PAX6, NESTIN e OLIG2, e il marcatore proliferante Ki67. gli iNSC dovrebbero esprimere quei marcatori delle cellule staminali neurali e possedere una capacità di differenziazione per diventare TUJ1,MAP2, neuroni (dopo 6 settimane), GFAP, astrociti (dopo 6 settimane) e OLIG2,O1 oligodendrociti (dopo 7-8 settimane)11. Tuttavia, una limitazione di questo protocollo è che il mezzo MNC è preferibilmente favorevole all'espansione erithroblast, che può renderlo non adatto per la generazione di iNSC da pazienti che sono carenti nello sviluppo di erithroblast. Inoltre, l'efficienza della riprogrammazione dei PBMCNC agli iNSC non è elevata. Si può migliorare l'efficienza di riprogrammazione utilizzando alcune piccole molecole o aumentando la resa utilizzando più PBMNCCs di partenza23.
Il metodo sulla differenziazione degli iNSC nei neuroni DA descritti qui si basa su un gran numero di protocolli per la differenziazione neurale. Poiché la PD è causata principalmente dalla degenerazione dei neuroni DA situati nel midbrain1,2, l'obiettivo dei protocolli è focalizzato sulla derivazione dei neuroni VM DA specializzati, che derivano dalle cellule della piastra del pavimento durante lo sviluppo24. L'induzione di cellule del pavimento VM con potenzialità neurogeniche dipende da due morfogeni chiave, SHH e FGF8b6,25,26. SHH è un morfogeno ventralizzante, secreto da notocordo26,27. Qui abbiamo sostituito SHH con la piccola molecola SAG1, un agonista del percorso SHH che è più economico di SHH. Inoltre, mezzo di coltura neurale di base e supplemento (Tabella dei materiali) sono importanti per la sopravvivenza neuronale e differenziazione. Con questo protocollo, i precursori DA sono stati ottenuti verso la fine del primo stadio, e neuroni DA più maturi sono stati generati alla fine del secondo stadio. Aumentando il periodo di tempo del secondo stadio a 40-55 giorni potrebbe ulteriormente migliorare la proporzione di maturi neuroni DA in coltura. Nel mezzo di seconda fase sono inclusi l'acido retinoico, il BDNF, il GDNF, il TGF-III, il DAPT e il cAMP, che hanno dimostrato di essere in grado di promuovere la maturazione e la sopravvivenza dei neuroni DA. Per testare l'efficienza degli iNSC nella differenziazione nei neuroni DA, sono state esaminate le cellule differenziate per l'espressione dei marcatori NURR1, FOXA2, GIRK2 e TH. In uno studio precedente, alla fine della fase I (giorno 10), 87,76% e 65,33% cellule hanno espresso NURR1 e FOXA2, rispettivamente11. Alla fine della fase II (giorno 24), la percentuale di cellule NURR1- ha raggiunto il 95,58% e la percentuale di cellule FOXA2 ha raggiunto il 77,33%11. A questo punto, 57.23% e 28.55% cellule erano positive per TH e GIRK2, rispettivamente11. Simile a quanto è stato osservato per la differenziazione iPSC verso i neuroni DA, esiste anche un batch per la variazione batch/linea per la variazione di linea per la differenziazione iNSC, che è influenzato da fattori come lo stato cellulare, l'attività di piccole molecole utilizzate e la plasticità di cellule staminali di persone diverse. È anche interessante notare che un fattore determinante dell'efficienza di differenziazione è la densità cellulare. Si consiglia una densità di semina di 5 x 103 celle per coprivele di vetro da 12 mm in piastre da 24 pozzetti. Infatti, gli iNSC presentano un buon tasso di proliferazione durante la fase di differenziazione I. Gli iNSC seminato in un pozzo di una piastra di 24 pozze direbbe origine a un numero sufficiente di precursori DA entro il giorno di differenziazione 10-13 per il trapianto in un topo (2 x 105 per ogni topo).
Questo protocollo presenta un metodo per la creazione di modelli murini PD unilaterali 6-OHDA-lesioned riproducibili e stabili. L'estensione della lesione 6-OHDA può essere stimata mediante valutazione comportamentale che misura le rotazioni contralaterali dopo l'iniezione di apomorfina. Inoltre, il grado di lesione indotta da 6-OHDA può essere quantificato mediante colorazione immunofluorescente post-mortem per TH nello SNpc. Un altro tipo di neurotossina utilizzata nella modellazione PD è 1-metil-4-phenyl-1,2,3,6-tertaidropiriride (MPTP), che interrompe anche le vie dopaminergiche. Rispetto a MPTP, 6-OHDA potrebbe essere somministrato in modo non i-o bilaterale. Inoltre, il metodo MPTP è più sensibile all'età animale, al sesso e alla tensione e quindi può mostrare un maggiore grado di variazione tra gli animali28. I fattori critici includono la selezione di topi con peso corrispondente, l'iniezione di soluzione 6-OHDA appena preparata ed eseguire interventi chirurgici in modo accurato e rapido.
Le procedure di trapianto cellulare di precursori DA nello striato dei topi lesionati sono fondamentalmente le stesse delle procedure per la generazione di modelli murini PD a 6-OHDA, ad eccezione del fatto che 6-OHDA viene sostituito da precursori DA durante la fase di iniezione. Il fattore chiave in questa parte è la ricerca dell'intervallo temporale ottimale di differenziazione cellulare DA per il trapianto. È stato dimostrato che un più alto grado di stelo è correlato con un più alto tasso di sopravvivenza, ma un minore potenziale di specifica in maturi neuroni DA11. Tuttavia, uno stadio più maturo delle cellule neurali sono più vulnerabili e mostrano un tasso di sopravvivenza inferiore dopo il trapianto11. Pertanto, trovare una finestra temporale adatta che equilibri la capacità di maturazione e sopravvivenza è importante. In uno studio precedente, abbiamo trapiantato cellule del giorno di differenziazione 10 e 13 nello striato di topi immunodeficienti SCID-beige11. Un mese dopo l'innesto, i risultati delle macchie immunofluorescenti hanno rivelato che circa l'88,63% e il 93,13% erano TUJ1 positivi rispettivamente per i gruppi del giorno 10 e 13, e alcune cellule TH (5,30%) sono stati rilevati dal giorno 13 gruppo, ma poche cellule TH- dal giorno 10 gruppo. Tuttavia, rispetto al giorno 13 cellule, giorno 10 cellule hanno dato luogo ad un tasso di sopravvivenza globale leggermente superiore11. I risultati hanno rivelato che il giorno 10 al giorno 13 è una finestra temporale ottimale di cellule per l'innesto11. In questo protocollo, abbiamo usato una miscela di cellule DA dal giorno di differenziazione 10 e giorno 13 ad un rapporto di 1:7 per l'innesto, che ha mostrato un buon risultato di sopravvivenza e differenziazione11. L'uso di una miscela di cellule del giorno 10 e del giorno 13 si basava su un'ipotesi secondo cui le cellule neurali relativamente mature e mature, se messe insieme, possono supportarsi a vicenda, che ricordano la situazione in vivo nei topi dove le cellule staminali sono circondate da neuroni neurali maturi.
Questo protocollo presenta il metodo di generare iNSC da PBMNC per infezione da SeV, differenziare gli iNSC in neuroni DA e trapiantare precursori DA in 6 modelli murini PD lesionati da OHDA. Utilizzando questo protocollo, si possono generare iNSC con potenziali non solo per il trattamento della PD, ma anche di altre malattie neurodegenerative. Poiché gli iNSC rappresentano uno stadio NSC primitivo, possono essere specificati in diverse cellule neurali specifiche della regione, come i neuroni del midollo spinale o dei motoneuroni, che possono essere di promettente utilità per il trattamento della sclerosi laterale amiotrofica o della lesione del midollo spinale. Inoltre, gli iNSC derivati da pazienti affetti da malattia familiare offrono una piattaforma per studiare i meccanismi alla base dell'insorgenza e dello sviluppo della malattia e per condurre test di screening farmacologico.
C'è più di un modo per ottenere cellule neurali DA per gli studi di trapianto. Le cellule DA possono anche essere generate da iPSC o mediante conversione diretta29. Rispetto agli iPSC, gli iNSC sono inerenti alla riduzione del rischio di formazione del tumore, a un periodo più breve di riprogrammazione e stabilimento di linea e alla plasticità impegnata nel lignaggio - in grado di differenziarsi solo in neuroni e glia11. Rispetto alla conversione diretta, differenziare i precursori DA da iNSC dà luogo a un rendimento e a un'efficienza più elevati30.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il lavoro è stato sostenuto dalle seguenti sovvenzioni: Stem Cell and Translation National Key Project (2016YFA010101403), National Natural Science Foundation of China (81661130160, 81422014, 815611138004), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Talents Foundation (2017000021223TD03), Progetto di sostegno degli insegnanti di alto livello nelle università comunali di Pechino nel periodo del tredicesimo piano quinquennale (CIT e TCD2018033), Beijing Medical System High Level Talent Award (2015-3-063), Pechino Fondo della Commissione Sanitaria Comunale (PXM 2018_026283_000002), Beijing One Hundred, Thousand, and Ten Ten Thousand Talents Fund (2018A03), Amministrazione Municipale di Medicina Clinica degli Ospedali Sviluppo di Sostegno Royal Society-Newton Advanced Fellowship (NA150482).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15-ml conical tube | Corning | 430052 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic for inhalation and skin contact |
| 24-well plate | Corning | 3337 | |
| 50-ml conical tube | Corning | 430828 | |
| 6-OHDA | Sigma-Aldrich | H4381 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Cell dissociation reagent |
| Apomorphine | Sigma-Aldrich | A4393 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A92902 | Toxic with skin contact |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | Brain derived neurotrophic factor |
| Blood collection tubes containing sodium heparin | BD | 367871 | |
| BSA | yisheng | 36106es60 | Fetal bovine serum |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dibutyryladenosine cyclic monophosphate |
| CellBanker 2 | ZENOAQ | 100ml | Used as freezing medium for PBMNCs |
| Chemically defined lipid concentrate | Invitrogen | 11905031 | |
| CHIR99021 | Gene Operation | 04-0004 | |
| Coverslip | Fisher | 25*25-2 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417-10mg | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915-100MG | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11330 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320 | |
| Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
| EPO | Peprotech | 100-64-50UG | Human Erythropoietin |
| FGF8b | Peprotech | 100-25 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | P=1.077, density gradient medium |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | Glial derived neurotrophic factor |
| GlutaMAX | Invitrogen | 21051024 | 100 × Glutamine stock solution |
| Ham's-F12 | Gibco | 11765-054 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175079 | Balanced salt solution |
| Human leukemia inhibitory factor | Millpore | LIF1010 | |
| Human recombinant SCF | Peprotech | 300-07-100UG | |
| IGF-1 | Peprotech | 100-11-100UG | Human insulin-like growth factor |
| IL-3 | Peprotech | 200-03-10UG | Human interleukin 3 |
| IMDM | Gibco | 215056-023 | Iscove's modified Dulbecco's medium |
| Insulin | Roche | 12585014 | |
| ITS-X | Invitrogen | 51500-056 | Insulin-transferrin-selenium-X supplement |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | Serum free basal medium |
| Laminin | Roche | 11243217001 | |
| Microsyringe | Hamilton | 7653-01 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| NEAA | Invitrogen | 11140050 | Non-essential amino acid |
| Neurobasal | Gibco | 10888 | Basic medium |
| PDL | Sigma-Aldrich | P7280 | Poly-D-lysine |
| SAG1 | Enzo | ALX-270-426-M01 | |
| SB431542 | Gene Operation | 04-0010-10mg | Store from light at -20? |
| Sendai virus | Life Technologies | MAN0009378 | |
| Sucrose | baiaoshengke | ||
| TGFβ? | Peprotech | 100-36E | Transforming growth factor β? |
| Transferrin | R&D Systems | 2914-HT-100G | |
| Triton X 100 | baiaoshengke | Nonionic surfactant | |
| Trypan blue | Gibco | T10282 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 |
References
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