Summary
Le protocole présente la reprogrammation des cellules mononucléaires périphériques de sang pour induire des cellules souches neurales par l'infection de virus de Sendai, différenciation des iNSCs dans les neurones dopaminergiques, transplantation des précurseurs de DA dans le unilatéralement-lesioned Modèles de souris de la maladie de Parkinson, et évaluation de l'innocuité et de l'efficacité des précurseurs d'AD dérivés de l'iNSC pour le traitement de la MALADIE.
Abstract
La maladie de Parkinson (MP) est causée par la dégénérescence des neurones dopaminergiques (DA) à la substantia nigra pars compacta (SNpc) dans le mesencephalon ventral (VM). La thérapie de remplacement de cellules est grande promesse pour le traitement de la. Récemment, les cellules souches neurales induites (iNSC) ont émergé en tant que candidat potentiel pour la thérapie de remplacement cellulaire due au risque réduit de formation de tumeur et à la plasticité pour donner lieu à neurones et gliales spécifiques à la région. Les iNSC peuvent être reprogrammés à partir de sources cellulaires somatiques autologues, telles que les fibroblastes, les cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMNC) et divers autres types de cellules. Comparé à d'autres types de cellules somatiques, les PBMNC sont un type attrayant de cellule de démarrage en raison de la facilité d'accès et d'expansion dans la culture. Le virus Sendai (SeV), un virus non intégrateur à ARN, codant des facteurs de reprogrammation tels que l'OCT3/4humain, LE SOX2, le KLF4 et le c-MYC, a un génome à sens négatif, à brin unique et non segmenté qui ne s'intègre pas dans génome hôte, mais ne se reproduit que dans le cytoplasme des cellules infectées, offrant un véhicule efficace et sûr pour la reprogrammation. Dans cette étude, nous décrivons un protocole dans lequel les iNSCs sont obtenus en reprogrammant des PBMNC, et différenciés en neurones spécialisés de DA de VM par une méthode en deux étapes. Ensuite, les précurseurs d'AD sont transplantés dans des modèles de souris à lésion à 6-hyroxydopamine (6-OHDA) pour évaluer l'innocuité et l'efficacité du traitement de la. Cette méthode fournit une plate-forme pour étudier les fonctions et les effets thérapeutiques des cellules neurales DA spécifiques au patient in vitro et in vivo.
Introduction
La maladie de Parkinson (MP) est un trouble neurodégénératif commun, causé par la dégénérescence des neurones dopaminergiques (DA) à la substantia nigra pars compacta (SNpc) dans le mésencéphalon ventral (VM), avec une prévalence de plus de 1% dans la population de plus de 60 ans 1 Fois , 2. Au cours de la dernière décennie, la thérapie cellulaire, visant à remplacer les cellules dégénératives ou endommagées, ou à nourrir le microenvironnement autour des neurones en dégénérescence, a montré un potentiel dans le traitement de la3. Pendant ce temps, la technologie de reprogrammation a fait des progrès significatifs4, qui fournit une source cellulaire prometteuse pour la thérapie de remplacement. Il a été prouvé que les cellules souches pluripotentes induites par l'homme (iPSC) et les cellules souches embryonnaires (ESC) sont capables de se différencier en cellules neurales DA, qui pourraient survivre, maturate et améliorer les fonctions motrices lorsqu'elles sont greffées dans des modèles de MP de primates non humains5 ,6,7,8. iPSCs représentent une étape importante dans les technologies de reprogrammation cellulaire et ont un grand potentiel dans la transplantation cellulaire; cependant, il y a toujours une préoccupation au sujet du risque de formation de tumeur des cellules incomplètement différenciées. Une autre source cellulaire pour la transplantation cellulaire est les cellules souches adultes établies par lignée obtenues par reprogrammation directe, telles que les cellules souches neurales induites (iNSC), qui peuvent être dérivées des intermédiaires instables, en contournant la pluripotence étape9,10,11.
Les iPSC et les iNSC peuvent être reprogrammés à partir de sources cellulaires autologues, telles que les fibroblastes, les cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMNC) et divers autres types de cellules12,13,14, réduisant ainsi le immunogénicité des cellules transplantées dans une large mesure. En outre, par rapport aux iPSC, les iNSC sont inhérents à un risque réduit de formation tumorale et de plasticité liée à la lignée, seulement capable de se différencier en neurones et en gliales11. Dans les études initiales, les iPSC humains ou de souris et les iNSC ont été générés à partir de fibroblastes obtenus à partir de biopsies de la peau, qui est une procédure invasive14,15. À cet égard, les PBMNC sont une source attrayante de cellules de démarrage en raison du processus d'échantillonnage moins invasif, et de la facilité d'obtenir un grand nombre de cellules dans un court laps de temps d'expansion16. Les premières études de reprogrammation ont utilisé des systèmes d'administration intégratif, tels que des vecteurs lentiviraux ou rétroviraux, qui sont efficaces et faciles à mettre en œuvre dans de nombreux types de cellules17; cependant, ces systèmes d'administration peuvent causer des mutations et la réactivation des transgènes résiduels, qui présentent des problèmes de sécurité à des fins thérapeutiques cliniques12. Le virus Sendai (SeV) est un virus à ARN non intégratif dont le génome à un seul brin à sens négatif ne s'intègre pas dans le génome de l'hôte, mais qui ne se reproduit que dans le cytoplasme des cellules infectées, offrant un véhicule efficace et sûr pour la reprogrammation18 ,19. Des vecteurs SeV recombinants sont disponibles qui contiennent des facteurs de reprogrammation, y compris l'humain OCT3/4, SOX2, KLF4 et c-MYC dans leurs cadres de lecture ouverts. En outre, les vecteurs viraux SeV peuvent être encore améliorés en introduisant des mutations sensibles à la température, de sorte qu'ils pourraient être rapidement enlevés lorsque la température de la culture est élevée à 39 oC20. Dans cet article, nous décrivons un protocole pour reprogrammer PBMNCs aux iNSCs utilisant le système de SeV.
De nombreuses études ont rapporté la dérivation des neurones DA à partir d'ESC sais humains ou iPSCs en utilisant diverses méthodes6,8,21. Cependant, il ya une pénurie de protocoles décrivant la différenciation des neurones DA des iNSCs dans les détails. Dans ce protocole, nous décrirarons la génération efficace de neurones DA à partir d'iNSCs en utilisant une méthode en deux étapes. Les précurseurs neuronaux DA peuvent être transplantés dans le striatum des modèles de souris pour des évaluations de l'innocuité et de l'efficacité. Cet article présentera un protocole détaillé qui couvre diverses étapes de la génération de cellules souches neurales induites par le virus Sendai, la différenciation des iNSCs dans les neurones DA, l'établissement de modèles de de souris, à la transplantation des précurseurs de DA dans le striatum des modèles. En utilisant ce protocole, on peut générer des iNSC à partir de patients et de donneurs sains et dériver des neurones DA qui sont sûrs, standardisables, évolutifs et homogènes à des fins de transplantation cellulaire, ou pour la modélisation de la DP dans un plat et l'étude des mécanismes l'évolution et le développement de la maladie sous-jacente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures doivent suivre les lignes directrices du comité institutionnel d'éthique de la recherche humaine. Le consentement éclairé doit être obtenu auprès de patients ou de volontaires en bonne santé avant la collecte de sang. Ce protocole a été approuvé par le comité d'éthique de la recherche humaine de l'établissement et a été exécuté conformément aux lignes directrices de l'établissement en matière de soins et d'utilisation des animaux.
1. Collecte, isolement et expansion des PBMNC
- Collection de PBMNCs
- Recueillir 10-20 ml de sang veineux périphérique du donneur par venipuncture à l'aide d'un flacon de conservation de l'héparine de sodium.
REMARQUE : Les échantillons de sang doivent être entreposés ou expédiés à température ambiante (RT). Traiter les échantillons de sang dans les 24 h.
- Recueillir 10-20 ml de sang veineux périphérique du donneur par venipuncture à l'aide d'un flacon de conservation de l'héparine de sodium.
- Préparation du milieu de culture
- Préparer le milieu sans sérum (SFM) en combinant les composants suivants : 245 ml du milieu modifié de Dulbecco (IMDM) d'Iscove, 240 mL de F-12 de Ham, 5 mL de supplément d'insuline-transferin-sélénium-X (ITS-X), 5 mL de solution de stock de glutamine 100x (tableaude Matériaux), 5 ml de concentré lipidique défini chimiquement, 2,5 g de sérum bovin fœtal, 0,025 g d'acide ascorbique et 9 l de 1 thioglycérol. Filtrer le milieu et le conserver à 4 oC.
CAUTION : L'acide ascorbique et le 1-thioglycérol sont toxiques par contact cutané et par inhalation. - Pour préparer le milieu des cellules mononucléaires (MNC), compléter le milieu SFM par un interleukin humain de 10 ng/mL 3 (IL-3), 2 U/mL érythropoïétine (EPO), 100 ng/mL facteur de cellules souches humaines (SCF), 40 ng/mL facteur de croissance humain ressemblant à une insuline 1 (IGF-1), 100 g/mL holo-transfert et 1 M dexamethasone. Filtrer le milieu et le conserver à 4 oC.
REMARQUE : Préparer le milieu immédiatement avant l'utilisation.
- Préparer le milieu sans sérum (SFM) en combinant les composants suivants : 245 ml du milieu modifié de Dulbecco (IMDM) d'Iscove, 240 mL de F-12 de Ham, 5 mL de supplément d'insuline-transferin-sélénium-X (ITS-X), 5 mL de solution de stock de glutamine 100x (tableaude Matériaux), 5 ml de concentré lipidique défini chimiquement, 2,5 g de sérum bovin fœtal, 0,025 g d'acide ascorbique et 9 l de 1 thioglycérol. Filtrer le milieu et le conserver à 4 oC.
- Isolement des PBMNC
- Stériliser les ultraviolets sur un banc propre avant de l'utiliser. Stériliser toutes les surfaces et l'équipement avec 75% d'alcool. Stériliser tous les conseils à l'aide d'un autoclave.
- Transférer le sang périphérique (PB) dans un tube conique de 50 ml et diluer le PB avec un volume égal de salin tamponné par le phosphate (D-PBS) de Dulbecco.
- Préparer 15 ml de milieu de gradient de densité stérilisée (Tables of Materials) dans un autre tube conique de 50 ml.
REMARQUE : Maintenir le milieu de gradient de densité et le PB à RT pour permettre un meilleur isolement des PBMNC. - Inclinez le tube conique contenant le milieu de gradient de densité à un angle de 45 degrés, puis déposez lentement et soigneusement 30 ml de PB dilué sur le milieu de gradient de densité.
REMARQUE : Faites attention et laissez le PB couler lentement sur le côté du tube conique sur la couche moyenne de gradient de densité. Les globules rouges se déposeront au fond du tube. Inclinez soigneusement le tube pour minimiser les perturbations de l'interface de la couche. - Centrifuger les tubes à 800 x g pendant 15 min à RT avec le frein de centrifugeuse réglé à la position "off". Aspirez la couche de plasma jaune supérieure et jetez-la. Transférer ensuite la couche de film mince nuageuse blanche contenant des MNC avec une pipette de 10 ml à un nouveau tube conique de 50 ml.
REMARQUE : Il est important de changer de frein de centrifugeuse pour l'isolement des MNC. - Ajouter 30 ml de D-PBS au tube avec les MNC et la centrifugeuse à 600 x g pendant 10 min à 4 oC. Jeter le supernatant, puis ajouter 45 ml de D-PBS pour re-suspendre les cellules. Centrifugeuse à 400 x g pendant 10 min à 4 oC.
REMARQUE : Le frein de centrifugeuse doit être allumé pour cela et les étapes suivantes de centrifugation. Comme les granulés cellulaires sont denses, ajouter 1-2 ml de D-PBS pour re-suspendre doucement les granulés, puis ajouter D-PBS à 45 ml. - Jetez le supernatant et re-suspendre les cellules avec 5 ml de D-PBS et compter les cellules vivantes avec la méthode d'exclusion bleu trypan.
- Après avoir mis de côté les MNC nécessaires à l'expansion, congelez les cellules restantes pour une utilisation future.
REMARQUE : Au moins 5 x 106 MNC peuvent être congelés dans une fiole avec 1 ml de milieu de congélation (Tableau des matériaux). Le protocole peut être mis en pause ici.
- Expansion des MNC
- Le jour -14, les MNC de semence à une densité de 2-3 x 106 cellules par millilitre dans un puits de six-puits plaques avec 1,5 ml de pré-chauffé (37 oC) MNC milieu. Incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pendant 2 jours.
- Le jour -11, recueillir les cellules et le milieu avec une pipette stérilisée et transférer à un nouveau tube conique de 15 ml. Centrifuger les cellules à 250 x g pendant 5 min à RT. Jeter le supernatant et re-suspendre les cellules dans 1 ml de milieu MNC pré-chauffé (37 oC).
- Comptez les cellules viables avec le bleu trypan. Ensemencer les MNC à une densité de 1 x 106 cellules par millilitre dans le milieu MNC pré-chauffé et incuber à 37 oC, 5% CO2 pendant 3 jours.
REMARQUE : On s'attend à ce que le nombre total de cellules diminue le jour -11. - Le jour -8, répétez les étapes 1.4.2-1.4.3 et culture les cellules pendant 3 jours.
- Le jour -4, répétez les étapes 1.4.2-1.4.3 et culture les cellules pendant 3 jours.
REMARQUE : Après 14 jours de culture, un nombre égal ou supérieur de MNC devrait rester dans la culture.
2. Reprogrammation des PBMNC aux iNSC par infection à seV
- Préparation de la solution et du milieu de culture
- Préparer une solution de bouillon de poly-D-lysine (PDL) en dissolvant 100 mg de PDL avec 100 mL de H2O à une concentration de 1 mg/mL. Conserver à -20 oC dans 1 ml d'aliquots.
- Préparer une solution de stock d'insuline en dissolvant 100 mg d'insuline dans 20 ml de 0,01 N HCl à une concentration de 5 mg/mL. Conserver à -20 oC dans 1 ml d'aliquots.
- Pour préparer 200 ml de milieu basal iNSC, combiner 96 ml de DMEM-F12 et 96 ml de milieu de base (Tableau des matériaux) avec 2 ml de solution de stock de glutamine 100x, 2 mL d'acide aminé non essentiel (NEAA), 2 ml de supplément N2 et 2 ml de supplément B27. Ajouter 10 ng/mL recombinant facteur inhibiteur de la leucémie humaine, 3 M CHIR99021 et 2 M SB431542 avant l'utilisation. Filtrer le milieu et le conserver à 4 oC.
REMARQUE : Utilisez le milieu dans les 2 semaines. Ajouter le facteur inhibiteur de la leucémie humaine recombinant, CHIR99021 et SB431542 immédiatement avant utilisation.
- Reprogrammation des PBMNC aux iNSC par infection à seV
- Stériliser les ultraviolets sur un banc propre avant de l'utiliser. Stériliser toutes les surfaces et l'équipement avec 75% d'alcool. Stériliser tous les pourboires à l'aide d'un autoclave.
- Le jour 0, recueillir les cellules dans le milieu MNC et le transférer dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min. Aspirer le supernatant et re-suspendre les cellules avec 1 ml de milieu MNC pré-chauffé.
- Comptez les cellules viables avec le bleu trypan. Re-suspendre les cellules avec un milieu MNC pré-chauffé (37 oC) à une concentration de 2 x 105 cellules par puits dans des plaques de 24 puits.
- Après avoir retiré les tubes SeV de -80 oC de stockage, décongeler les tubes contenant seV dans un bain d'eau de 37 oC pour 5-10 s, puis les laisser décongeler à RT. Une fois décongelés, placez-les immédiatement sur la glace.
- Ajouter le SeV encodage humain Klf4, Oct3/4, SOX2 et c-MyC aux puits, à une multiplicité d'infection (MOI) de 10. Centrifugeuses cellules avec plaques à 1000 x g pendant 30 min pour faciliter l'attachement des cellules. Laissez les cellules et le supernatant dans les assiettes. Placer les plaques dans l'incubateur à 37 oC, 5 % de CO2.
CAUTION: Toutes les procédures impliquant SeV doivent être effectuées dans une armoire de sécurité, et tous les bouts et les tubes doivent être traités avec de l'éthanol ou de l'eau de Javel avant l'élimination. - Le jour 1, transférer le milieu et les cellules dans un tube centrifugeuse de 15 ml. Rincer le puits avec 1 ml de milieu MNC. Centrifugelant la suspension cellulaire à 200 x g pendant 5 min. Aspirez le supernatant et suspendez les cellules à l'aide de 500 ll de milieu MNC frais et réchauffé dans des assiettes de 24 puits.
REMARQUE : Utilisez une plaque à faible attachement de 24 puits pour empêcher l'attachement de toutes les cellules avant de placage sur PDL/lamininin. - Le jour 2, diluer 1 ml de 1 mg/mL de PDL avec 19 ml de D-PBS à une concentration de 50 g/mL. Enrober les plaques de 6 puits de 50 g/mL pDL pendant au moins 2 h à RT.
- Diluer 200 oL de laminine de 0,5 mg/mL avec 20 ml de D-PBS à une concentration de 5 g/mL. Aspirez PDL dans les plaques de 6 puits, et séchez sur le banc vertical propre.
- Enrober les assiettes de 6 puits de laminine de 5 g/mL et incuber de 4 à 6 h à 37 oC. Laver avec D-PBS avant utilisation.
- Le jour 3, plaquez les cellules transducées obtenues à l'étape 2.2.6 dans le milieu iNSC sur des plaques de 6 puits enduites de PDL/laminin.
REMARQUE : Déplacez les plaques doucement si nécessaire après que les cellules sont placées sur des plaques enduites de PDL/laminin, en essayant de ne pas perturber l'attachement des cellules. - Le jour 5, ajouter 1 ml de milieu iNSC pré-chauffé (37 oC) dans chaque puits dans des assiettes de 6 puits en douceur.
REMARQUE: On s'attend à ce que les cellules subiront la mort drastique (-gt;60%). - Le jour 7, ajouter 1 ml de milieu iNSC pré-chauffé (37 oC) dans chaque puits dans des assiettes de 6 puits en douceur.
- Du jour 9 au 28e jour, remplacez le milieu usé par un iNSC frais et préréchauffé (37 oC) tous les jours. Surveiller l'émergence des colonies iNSC. Choisissez et transférez les clones iNSC pour l'expansion dans environ 2-3 semaines. Ramassez les colonies avec une morphologie appropriée à l'aide de pipettes en verre brûlée, à l'exclusion de toute cellule contaminante possible, et aspirez les colonies avec des pointes de 200 L.
REMARQUE : Les ciseaux caractérisés peuvent être congelés pour une utilisation future avec 2-5 colonies dans une fiole. Le milieu de congélation comprend le milieu basal sans sérum (Tableau des matériaux) et le sulfoxure de diméthyle mélangé à un rapport de 9:1, qui doit être préparé immédiatement avant l'utilisation. Le protocole peut être mis en pause ici.
3. Différenciation des iNSC aux neurones dopaminergiques
- Préparation de la solution et du milieu de culture
- Préparer 200 mL de milieu basique de différenciation iNSC en combinant 192 ml de DMEM-F12 avec 2 ml de 100x solution de stock de glutamine, 2 mL de NEAA, 2 mL de supplément N2 et 2 ml de supplément B27.
REMARQUE : Utilisez le milieu dans les 2 semaines. - Préparer l'étape de différenciation iNSC I moyen en complétant le milieu basique de différenciation iNSC avec 1 M SAG1 et 100 ng /mL FGF8b.
REMARQUE : Utilisez le milieu dans les 2 semaines. - Préparer le milieu de l'étape II de différenciation iNSC en complétant le milieu basal de différenciation iNSC avec 0,5 mM de monophosphate d'adénosine cyclique (cAMP), 0,2 mM d'acide ascorbique, 10 M DAPT, 10 ng/mL facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF), 10 ng/mL glial dérivé facteur neutrophique (GDNF) et 1 ng/mL transformant le facteur de croissance III (TGF-III).
REMARQUE : Utilisez le milieu dans les 2 semaines.
- Préparer 200 mL de milieu basique de différenciation iNSC en combinant 192 ml de DMEM-F12 avec 2 ml de 100x solution de stock de glutamine, 2 mL de NEAA, 2 mL de supplément N2 et 2 ml de supplément B27.
- Enrober les plats de culture
- Stériliser les ultraviolets sur un banc propre avant de l'utiliser. Stériliser toutes les surfaces et l'équipement avec 75% d'alcool. Stériliser tous les pourboires à l'aide d'un autoclave.
- Pour le revêtement PDL, au moins un jour avant de re-placage les cellules, diluer 1 ml de 1 mg/mL de PDL avec 19 ml de D-PBS à une concentration de 50 g/mL. Enrober les couvercles en verre de 12 mm qui ont été stérilisés avec 75 % d'alcool dans les assiettes de 24 puits avec 50 g/mL de PDL à RT pendant au moins 2 h.
- Pour le revêtement de lamininin, diluer 200 'L de laminine de 0,5 mg/mL avec 20 ml de D-PBS à une concentration de 5 'g/mL. Aspirez PDL et séchez les puits sur le banc propre. Enrober les couvercles de 12 mm de laminine de 5 g/mL et incuber de 4 à 6 h à 37 oC. Laver avec D-PBS avant utilisation.
- Cellules de passage pour la différenciation.
- Lorsque la confluence des iNSC cultivés atteint 70-90%, aspirent le milieu de la plaque de culture, et ajouter 1 ml de D-PBS pour laver les cellules. Ajouter 1 ml de résociation cellulaire préréchauffée (37 oC) (tableaudes matériaux)par puits et incuber à 37 oC pendant 3 min pour dissocier les cellules.
- Après l'incubation pendant 3 min, les cellules sont devenues semi-flottantes; ajouter 3 mL de dissocié (37 oC) de milieu DMEM-F12 par puits, et des cellules de pipette de haut en bas pour dissocier les granulés de cellules en cellules individuelles.
- Transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml et centrifuger à 250 x g pendant 3 min. Aspirez le supernatant, suspendez à nouveau les cellules avec un volume approprié de milieu iNSC pré-chauffé (37 oC) selon le nombre de cellules.
- Comptez les cellules à l'aide de la méthode d'exclusion bleue trypan. Plaque 5 x 103 cellules par couvercle en verre de 12 mm dans des plaques de 24 puits et incuber à 37 oC, 5 % CO2.
- Différencier les iNSC en neurones dopaminergiques.
- Commencez la différenciation 24 h après avoir re-placage les cellules sur PDL/laminin-coated coverslips. Aspirer le milieu de culture, laver les cellules une fois avec D-PBS, puis ajouter 600 L de stade de différenciation pré-chauffée I moyen par puits dans des plaques de 24 puits et incuber à 37 oC, 5% CO2.
- Changer de moyen tous les jours du jour 1 au jour 10 au cours de la première étape de différenciation.
- Le jour 10, aspirer le milieu de culture, et laver les cellules une fois avec D-PBS. Ajouter 600 ll de stade de différenciation préréchauffé (37 oC) moyen II par puits dans des assiettes de 24 puits et incuber à 37 oC, 5 % CO2.
- Changer de moyen tous les deux jours du jour 11 au jour 25 au cours de la deuxième étape de différenciation. Les cellules différenciées peuvent être fixées par paraformaldéhyde à différents moments pour l'analyse.
- Pour la coloration immunofluorescente, lavez les cellules avec D-PBS trois fois doucement aux points de temps choisis dans le jour de différenciation 11 à 25.
- Pipette 300 l de surfactant nonionic (Table of Materials) en 100 ml de PBS pour faire un surfactant nonionic de 0,3% en PBS.
CAUTION : Le surfactant nonionique est toxique par contact de peau et inhalation. - Fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde pendant 10 min à RT. Ensuite, laver avec 0,3% en PBS trois fois.
CAUTION : Le paraformaldéhyde est toxique par contact cutané et par inhalation. - Bloquer les cellules par 3% sérum d'âne pendant 2 h à RT.
- Diluer l'anticorps primaire dans 1% de sérum d'âne à une concentration appropriée et triturate doucement pour mélanger. Ajouter 300 L de la solution d'anticorps primaire à chaque puits de la plaque de 24 puits. Incuber les cellules à 4 oC pendant la nuit. Laver les cellules avec 0,3% de surfactant nonionic en PBS trois fois.
- Diluer l'anticorps secondaire dans 1% de sérum d'âne à une concentration appropriée et triturate doucement pour mélanger. Ajouter 300 L de la solution d'anticorps secondaire à chaque puits de la plaque de 24 puits. Incuber les cellules à RT pendant 2 h, à l'abri de la lumière.
- Laver les cellules avec 0,3% de surfactant nonionic en PBS trois fois. Diluer 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) avec PBS avec 1:500 dilution. Incuber les cellules dans chaque puits de la plaque de 24 puits avec 300 L de DAPI dilué pendant 15 min à RT, à l'abri de la lumière. Laver les cellules avec 0,3% de surfactant nonionic en PBS trois fois.
- Sortez délicatement les couvertures des puits de plaques avec des forceps. Sécher dans l'obscurité pendant la nuit à RT. Mount sous un microscope à fluorescence.
4. Établissement de modèles unilatéraux de souris à lésinsde de 6-hyroxydopamine (6-OHDA)
- Pour générer des modèles de souris pour la transplantation cellulaire, utilisez des souris mâles adultes SCID-beige pesant 20-25 g pour l'injection de 6-OHDA.
- Préparation des médicaments pour la chirurgie
- Préparer une solution d'acide ascorbique de 0,2 % en dissolvant 0,2 g d'acide ascorbique en 100 ml de salin stérilisé (0,9 %) et conserver à -80 oC jusqu'à utilisation. Le jour de la chirurgie, diluer 0,2% de solution d'acide ascorbique par 10 fois pour obtenir une solution d'acide ascorbique de 0,02%.
REMARQUE : L'acide ascorbique est ajouté pour empêcher l'oxydation de 6-OHDA à une forme inactive. - Pour préparer une solution 6-OHDA, peser la quantité appropriée de 6-OHDA dans un tube stérilisé de 1 ml, puis ajouter un certain volume d'acide ascorbique de 0,02 % pour faire une solution de 5 g/L 6-OHDA. Vortex le mélange jusqu'à ce qu'il soit dissous. Placer le 6-OHDA sur la glace jusqu'à l'utilisation.
REMARQUE : 6-OHDA est sensible à la température et à la lumière. Veillez à protéger la solution de la lumière et à la garder sur la glace avant de l'utiliser.
- Préparer une solution d'acide ascorbique de 0,2 % en dissolvant 0,2 g d'acide ascorbique en 100 ml de salin stérilisé (0,9 %) et conserver à -80 oC jusqu'à utilisation. Le jour de la chirurgie, diluer 0,2% de solution d'acide ascorbique par 10 fois pour obtenir une solution d'acide ascorbique de 0,02%.
- Préparer l'équipement chirurgical stérilisé en autoclantavant avant la chirurgie. Nettoyez tous les équipements et surfaces avec de l'éthanol lors de la mise en place du cadre stéréotaxique. Installez une cage de récupération de souris sous une lampe chauffante.
- Effectuer la chirurgie pour établir des modèles de souris unilatérals 6-OHDA-lesioned.
- Pesez chaque souris, enregistrez le poids et calculez la quantité de médicament qui doit être administrée. Chaque souris reçoit 0,5 mg/kg d'atropine 20 min avant les opérations. Anesthésiez la souris avec 80 mg/kg de kétamine et 10 mg/kg de xylazine.
- Administrer 0,5 mg/kg d'atropine par injection intrapéritonéale.
- Anesthésiez la souris avec 80 mg/kg de kétamine et 10 mg/kg de xylazine par injection intrapéritonéale 20 min après administration d'atropine.
- Mettez la souris dans une chambre fermée. Après 3-5 min, la souris sera profondément anesthésié sans réponse à la pince de la jambe arrière.
REMARQUE : On s'attend à ce que la souris qui a reçu l'anesthésie connaîtrait une période d'excitation. - Raser la tête de la souris et appliquer onduleur oculaire érythromycine sur les yeux de la souris pour la protection contre le développement des ulcères cornéens.
- Placez la souris sur l'appareil stéréotaxique. Fixer la souris avec des barres d'inciseur tout d'abord. Insérez correctement les oreillettes pour que la tête de la souris soit en position plate et sécurisée.
- Stériliser la tête de la souris avec de l'iode de povidone et de l'alcool isopropyl. Couper une incision sagittale (1,5 cm) sur la peau de la tête avec une lame de scalpel, et exposer le crâne. Ajuster la barre d'inciseur et les barres d'oreilles pour réduire la différence de hauteur entre le bregma et le lambda à moins de 0,1 mm.
REMARQUE: Le bregma de souris est situé à l'intersection des sutures coronales et sagittales, et lambda est à l'intersection des sutures lambdoid et sagittale. - Déplacez lentement et abaissez la pointe de l'aiguille vers bregma et traitez le bregma comme un point zéro. Déplacez la pointe vers une position avec des coordonnées de A/P 0,5 mm, M/L -2,1 mm par rapport à bregma. Retirez la pointe et marquez le point. Burr un petit trou dans le crâne.
- Extrait de 2 l de 5 'g/L 6-OHDA solution dans la microsyringe (Tableau des matériaux). Remettre l'aiguille au point marqué et insérer l'aiguille sur D/V -3,2 mm.
- Injecter 2 'L de 5 'g/L 6-OHDA solution (10 'g au total) à un taux de 1 'L/min. Une fois l'injection de 6-OHDA terminée, laissez l'aiguille en place pendant 5 min. Puis rétractez l'aiguille d'injection lentement.
- Fermez l'incision avec des sutures et appliquez l'onpomation d'oeil d'érythromycine sur les yeux de la souris. Fournir 0,5 mL de saline sous-cutanée pour prévenir la déshydratation, et appliquer une pommade antibiotique directement sur la peau suture.
- Retirez la souris de l'appareil stéréotaxique et mettez-la dans la cage de récupération. Remettez la souris en arrière et laissez accès à la nourriture et à l'eau jusqu'à ce qu'elle retrouve conscience. Traiter la souris avec un analgésique dans l'eau potable quotidienne après la chirurgie pendant 2-3 jours, et une dose recommandée d'ibuprofène est de 0,03 mg/g de poids corporel par jour.
- Inspecter la souris tous les jours après la chirurgie.
5. Évaluation comportementale après une lésion unilatérale 6-OHDA
- Deux à trois semaines après chirurgie, mener l'évaluation comportementale pour estimer des symptômes de. Pesez chaque souris, enregistrez leur poids et calculez la quantité de médicament qui doit être administrée (0,5 mg/kg d'apomorphine avant l'évaluation).
- Administrer 0,5 mg/kg d'apomorphine par injection sous-cutanée avant l'évaluation et placer la souris dans un cylindre de verre.
- Après une période d'accoutumance de 5 minutes, comptez le nombre de rotations contralatérales et ipsilatérales par rapport au côté des lésions par minute et enregistrez leur activité à l'intérieur d'une caméra vidéo.
- Les souris avec des rotations contralatérales moins ipsilateral 'gt;7 rpm/min sont considérées avec succès lésions et sélectionnées comme candidats pour des expériences de transplantation cellulaire. Remettre les souris dans les cages d'habitation après un repos de 30 min.
REMARQUE : Si la souris a été avec succès lésionnée, la souris injectée 6-OHDA montrera un plus grand biais en tournant vers le côté contralatéral puisque l'agoniste de DA active le striatum dénervated supersensible du côté lescionné principalement. - Effectuer l'évaluation comportementale une semaine avant et 2, 4, 6, 8, 12, 16 semaines après la transplantation cellulaire.
6. Transplantation cellulaire de précurseurs DA
- Préparer la suspension cellulaire pour la transplantation. Pour l'engraftment cellulaire, suspendre 2 x 105 précurseurs DA mélangés par des précurseurs D10 et D13 DA à un rapport de 1:7 dans 4 'L de 5 g L-1 glucose dans la solution équilibrée de sel (Tableau des matériaux) de tampon de transplantation.
- Effectuer la chirurgie de transplantation cellulaire suivant les procédures décrites dans la section 4.4, sauf que 6-OHDA est remplacé par la suspension ou tampon de cellules précurseurs d'AD.
- Effectuer l'évaluation comportementale 2, 4, 6, 8, 12, 16 semaines après la transplantation cellulaire des précurseurs d'AD suivant les procédures décrites dans la section 5. Comptez le nombre de rotations contralatérales induites par l'apomorphine par rapport au côté lésion par minute et enregistrez leur activité à l'aide d'une caméra vidéo.
REMARQUE : Après la transplantation, un taux réduit de rotations contralatérales suggère une fonction motrice améliorée. - À 4, 8 ,12, et 16 semaines après la transplantation cellulaire, perfuser la souris sous anesthésie profonde avec 4% de paraformaldéhyde jusqu'à ce que le corps de la souris devient raide et le foie de la souris devient pâle.
- Séparez doucement le cerveau de la souris et mettez le cerveau dans 4 % de paraformaldéhyde à 4 oC pendant la nuit.
- Le deuxième jour, mettre le cerveau dans 30% de saccharose pour la déshydratation jusqu'à ce que le cerveau s'enfonce au fond.
- Trancher le cerveau à 40 m d'épaisseur à l'aide d'un microtome de congélation.
- Effectuer l'immunostaining comme précédemment décrit dans les étapes 3.4.5-3.4.12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ici, nous rapportons un protocole qui couvre différentes étapes de la thérapie cellulaire iNSC-DA pour traiter les modèles de. Tout d'abord, les PBMNC ont été isolés et élargis, et reprogrammés en iNSCs par infection à SeV. Une représentation schématique des procédures avec l'expansion de PBMNC et l'induction d'iNSC est montrée dans la figure 1. Le jour -14, les PBMNC ont été isolés à l'aide d'un milieu de gradient de densité (Tableaudes matériaux). Avant la centrifugation, le sang dilué avec PBS et le milieu de gradient de densité ont été séparés en deux couches. Après la centrifugation, quatre couches de gradient sont apparues (de bas en haut) : la couche inférieure contenait des granulocytes et des érythrocytes; la deuxième couche contenait le milieu de gradient de densité; le troisième contenait des PBMNC (flèche rouge); la couche supérieure contenait du plasma riche en plaquettes (Figure 2A). Après 14 jours d'expansion, les PBMNC ont été infectés par le SeV comme jour 0. Le jour 1, le milieu avec SeV a été enlevé (Figure 2B). Comme l'illustre la figure 2B, on s'attend à ce que le nombre de cellules soit réduit graduellement. Les cellules ont subi une mort drastique (-60 %) jusqu'au jour 5 (Figure 2B). Les colonies iNSC sont apparues le jour 12 au plus tôt (figure 2B). Après avoir choisi et transféré des clones iNSC pour l'expansion d'un certain nombre de passages, la morphologie des cellules est montrée dans la figure 2C. Les iNSC ont montré une bonne morphologie et pouvaient s'auto-renouveler de façon stable dans le milieu iNSC, soit sous forme de monocouche, soit sous forme de sphères (Figure 2C).
iNSCs pourrait donner lieu à des neurones DA en utilisant une méthode en deux étapes (Figure 1). Pendant l'étape un qui a duré 10 jours, les iNSCont ont été traités avec SAG1 et FGF8b pour induire la spécification des cellules de plaque de plancher de VM avec des potentiels neurogènes. Ensuite, les cellules ont été traitées avec de l'acide ascorbique, BDNF, GDNF, cAMP, DAPT, TGF-III dans la deuxième étape (Figure 1). Avec cette méthode en deux étapes, des précurseurs DA pourraient être obtenus vers la fin de la première étape, et des neurones DA plus matures pourraient être générés à la fin de la deuxième étape. Après 24 jours de différenciation, les iNSC pourraient être spécifiés efficacement aux neurones DA car la majorité d'entre eux ont exprimé la boîte de tête de fourche A2 (FOXA2), la classe III de neurone spécifique à la tubuline (TUJ1) et l'hydroxylase de tyrosine (TH) (figure3).
Trois semaines après l'établissement de modèles de souris unilatéral 6-OHDA-lesioned, l'évaluation comportementale a été menée pour estimer des symptômes de (figure 4A). Puis une semaine plus tard, des précurseurs dopaminergiques ont été transplantés sur les modèles de souris (Figure 4A). L'évaluation comportementale a été effectuée une semaine avant et 2, 4, 6, 8, 12 semaines après la transplantation cellulaire (Figure 4A). Les souris qui avaient reçu la transplantation cellulaire ont montré l'amélioration significative de la fonction motrice (figure 4B). L'étendue de la lésion induite par 6-OHDA peut être vérifiée par coloration immunofluorescente post-mortem pour TH au striatum, faisceau médial de cerveau avant (MFB) et SNpc (figure 4C). Les signaux TH-positifs chez les souris greffées ont été grandement récupérés dans le striatum où les cellules ont été implantées et légèrement récupérées à SNpc (Figure 4C). Trois mois après la transplantation, environ 13,84 % étaient des neurones THet DA parmi les cellules survivantes (figure4D,E). Environ 91,72 % et 86,76 % des cellules THont été exprimées, respectivement, les récepteurs nucléaires orphelins (NURR1) et FOXA2 (figure4D,E). Environ 98,77 % des cellules THont été co-étiquetées avec du potassium rectifier à l'intérieur couplé à la protéine G (GIRK2) (figure4D,E).
Figure 1 : Représentation schématique des procédures concernant l'expansion de PBMNC, l'induction iNSC et la différenciation des iNSC en précurseurs DA. Les PBMNC ont été isolés et élargis dans le milieu mNC pendant plus de 14 jours, puis infectés par le SeV codant les SOX2, OCT3/4, c-MYC et KLF4. Les colonies d'iNSC sont apparues dès 12 jours après l'infection de SeV. Après 3-4 semaines, les colonies iNSC ont été cueillies et différenciées en précurseurs DA par une méthode en deux étapes. PBMNCs : cellules mononucléaires périphériques de sang ; MNC: cellules mononucléaires; iNSCs : cellules souches neurales induites ; SeV: Virus Sendai; DA: dopaminergique; PDL: poly-D-lysine; BDNF : facteur neurotrophique dérivé du cerveau ; GDNF : facteur neurotrophique de ligne de cellules gliales-dérivé ; AA: acide ascorbique; cAMP: monophosphate cyclique de dibutyryladenosine; TGF : facteur de croissance transformateur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Les PBMNC sont isolés et étendus, puis reprogrammés en iNSC s'ils sont infectés par le SeV. (A) Exemple de PBMNCavant avant et après la centrifugation de gradient. Avant la centrifugation, les échantillons de sang dilués et le milieu de gradient de densité ont été séparés en deux couches. Après centrifugation, quatre couches de gradient de densité se sont formées de bas en haut : la couche inférieure contenait des granulocytes et des érythrocytes; la deuxième couche contenait le milieu de gradient de densité; la troisième couche contenait des PBMNC (flèche rouge); la couche supérieure contenait du plasma riche en plaquettes. (B) Images de la morphologie typique des cellules après que les PBMNC ont été infectés par le SeV les jours 1, 2, 5 et 12. Après que les PBMNC ont été infectés par le SeV, certaines des cellules sont mortes et le nombre de cellules a été réduit graduellement. Un petit nombre de cellules sont restées le jour 5. Le jour 12, des colonies d'iNSC ont émergé. Barre à l'échelle, 100 m. (C) La morphologie typique des iNSC du passage numéro 20 dans la monocouche et la culture de sphère. Barre à l'échelle, 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Différenciation des iNSC aux neurones dopaminergiques. Coloration immunofluorescente pour FOXA2, TH, TUJ1, DAPI et images fusionnées le jour 24 sur des cellules différenciées des iNSC. Barre d'échelle, 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Transplantation de précurseurs DA différenciés par iNSC en modèles de souris unilatéral 6-OHDA-lesioned. (A) Chronologie pour la transplantation cellulaire et les tests comportementaux. (B) Les résultats des tests comportementaux à différents moments du groupe 6-OHDA-cellules (n ' 10), 6-OHDA-buffer groupe (n ' 8) et le groupe témoin (n - 3). Les données sont présentées comme une erreur moyenne et standard de la moyenne (SEM). p lt; 0,001 par analyse bidirectionnelle de la variance (ANOVA) avec le test de comparaison multiple de Dunnett. (C) Coloration immunofluorescente post-mortem pour TH au striatum, faisceau médial de cerveau avant (MFB) et nigra de substantia (SN) de l'hémisphère 6-OHDA-leisioned, 6-OHDA-cellules hémisphère, et groupe témoin. Barres d'échelle, 100 m. (D) Pourcentages de FOXA2/TH, NURR1/TH, GIRK2/TH, TH/HNA chez les souris greffées 3 mois après la transplantation. HNA: anticorps noyaux humains. Les données sont présentées comme étant moyennes - SEM. (E) Colorant immunofluorescent pour FOXA2, NURR1, GIRK2, TH et HNA sur des tranches de cerveau de souris de 12 semaines après la transplantation cellulaire. HNA: anticorps noyaux humains. Ce chiffre a été modifié à partir de Yuan et coll.11. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ici nous avons présenté un protocole qui a couvert différentes étapes de la thérapie cellulaire iNSC-DA pour des modèles de. Les aspects critiques de ce protocole comprennent : (1) l'isolement et l'expansion des PBMNC et la reprogrammation des PBMNC en iNSC par infection à SeV, (2) la différenciation des iNSC aux neurones DA, (3) l'établissement de modèles de souris à lésion 6-OHDA unilatérales et comportementaux l'évaluation, et (4) la transplantation cellulaire des précurseurs de DA et l'évaluation comportementale.
Dans ce protocole, la première partie consiste à collecter et à étendre les PBMNC dans un milieu sans sérum (milieu MNC), qui élargit préférentiellement les érythroblastes et ne supporte pas la prolifération des lymphocytes. Dans des études antérieures, plusieurs types de cellules somatiques ont été reprogrammés en iPSC ou iNSCs12,13,14. En comparaison avec d'autres types de cellules somatiques, les PBMNC possèdent plusieurs avantages. L'avantage le plus significatif est leurs modèles favorables d'expression de gène et profils épigénétiques. Les PBMNC sont de courte durée in vivo et réapprovisionnés fréquemment à partir de cellules souches hématopoïétiques activées, et peuvent accumuler moins de mutations que les fibroblastes de la peau. En outre, la façon d'échantillonner les PBMNC est moins invasive que celle des fibroblastes, et il faut moins de temps pour étendre les PBMNC (environ 14 jours) par rapport aux fibroblastes (environ 28 jours)16,22. Après centrifugation à l'aide d'un milieu de gradient de densité, quatre gradients de densité seront formés de bas en haut; la couche inférieure contient des granulocytes et des érythrocytes, la deuxième couche inférieure contient le milieu de gradient de densité, la troisième couche contient des MNC, et la couche supérieure contient du plasma. Le rendement des PBMNC varie normalement d'une personne à l'autre, en particulier de ceux d'âges différents. En général, les jeunes ont tendance à avoir un plus grand nombre de PNLQues que les personnes âgées. Avec le protocole décrit, environ 1,8 à 3,4 x 107 PBMNC s'est isolé à partir de 15 ml de PB. Parmi les PBMNC, les cellules souches cD34et hématopoïétiques sont relativement sujettes à la reprogrammation, et le milieu mNC peut enrichir dans une certaine mesure les cellules souches cD34et hématopoïétiques. On s'attend à ce qu'un nombre égal ou supérieur de cellules visibles cultivées avec le milieu de MNC restent après 14 jours d'expansion. SeV, un virus non intégrateur d'ARN, a un sens négatif, un seul brin, génome non segmenté qui ne s'intègre pas dans le génome de l'hôte, mais ne se reproduit que dans le cytoplasme des cellules infectées18,19. Recombinant SeV encodage des facteurs de reprogrammation OCT3/4, SOX2, KLF4 et c-MYC, peut être généré comme un mutant sensible à la température, qui pourrait être enlevé facilement à 39 oC20. Avec ce protocole, nous avons dérivé 8-20 colonies d'iNSC en reprogrammant des PBMNC d'un volontaire ou d'un patient en bonne santé utilisant 15 ml de PB. Ensuite, les chercheurs ont pu sélectionner des colonies avec de bonnes morphologies pour le passage et l'établissement de ligne. Dans le rapport publié, les CISN des numéros de passage 10, 20 et 30 présentaient des taux de prolifération similaires, et pouvaient être adoptés plus de 50 fois, montrant une bonne auto-renouvellement et une capacité proliférante11. iNSCs pourrait être caractérisé par des essais de différenciation et immunostaining pour les marqueurs de cellules souches neurales SOX2, PAX6, NESTIN et OLIG2, et le marqueur proliférant Ki67. iNSCs devrait exprimer ces marqueurs de cellules souches neurales et posséder une capacité de différenciation pour devenir TUJ1,MAP2- neurones (après 6 semaines), GFAP- astrocytes (après 6 semaines) et OLIG2 , O1 oligodendrocytes (après 7-8 semaines)11. Cependant, une limitation de ce protocole est que le milieu de MNC est préférentiellement favorable à l'expansion d'érythroblast, qui peut le rendre ne convient pas pour produire des iNSCdes des patients qui sont déficients dans le développement d'érythroblast. En outre, l'efficacité de la reprogrammation des PBMNC aux iNSC n'est pas élevée. On peut améliorer l'efficacité de la reprogrammation en utilisant certaines petites molécules ou en augmentant le rendement en utilisant plus de PBMNCs de départ23.
La méthode sur la différenciation des iNSCs dans les neurones DA décrit ici s'appuie sur un grand nombre de protocoles pour la différenciation neuronale. Comme la DP est principalement causée par la dégénérescence des neurones DA situés dans le midbrain1,2, le but des protocoles est axé sur la dérivation de neurones vM DA spécialisés, qui proviennent de cellules plaque de plancher au cours du développement24. L'induction des cellules de plaque de plancher de VM avec des potentiels neurogènes dépend de deux morphogènes principaux, SHH et FGF8b6,25,26. SHH est un morphogène ventralisant, sécrété par notochord26,27. Ici, nous avons remplacé SHH par la petite molécule SAG1, un agoniste de la voie SHH qui est plus économique que SHH. En outre, le milieu et le supplément de culture neurale de base (tableau des matériaux) sont importants pour la survie neuronale et la différenciation. Avec ce protocole, des précurseurs de DA ont été obtenus vers la fin de la première étape, et des neurones DA plus mûrs ont été générés à la fin de la deuxième étape. L'augmentation de la période de temps de la deuxième étape à 40-55 jours pourrait encore augmenter la proportion de neurones MatureD DA dans la culture. Inclus dans le milieu de deuxième étape sont l'acide rétinoïque, BDNF, GDNF, TGF-III, DAPT et cAMP, qui ont été démontrés pour être en mesure de promouvoir la maturation et la survie des neurones DA. Pour tester l'efficacité des iNSC dans la différenciation en neurones DA, les cellules différenciées ont été examinées pour l'expression des marqueurs NURR1, FOXA2, GIRK2 et TH. Dans une étude précédente, à la fin de l'étape I (jour 10), 87,76% et 65,33% des cellules exprimées NURR1 et FOXA2, respectivement11. À la fin de l'étape II (jour 24), le pourcentage de cellules NURR1a atteint 95,58 % et la proportion de cellules FOXA2a atteint 77,33 %11. À ce moment-là, 57,23% et 28,55% des cellules étaient positives pour TH et GIRK2, respectivement11. Semblable à ce qui a été observé pour la différenciation iPSC vers les neurones DA, un lot à la variation de lot/ligne à ligne pour la différenciation iNSC existe également, qui est influencé par des facteurs tels que l'état cellulaire, l'activité des petites molécules utilisées, et la plasticité de cellules souches de différentes personnes. Il est également à noter qu'un déterminant clé de l'efficacité de différenciation est la densité cellulaire. Une densité d'ensemencement de 5 x 103 cellules par bordereau de verre de 12 mm dans des plaques de 24 puits est recommandée. En fait, les iNSC présentent un bon taux de prolifération au cours de l'étape de différenciation I. Les iNSC ensemant dans un puits d'une plaque de 24 puits donneraient lieu à un nombre suffisant de précurseurs DA par jour de différenciation 10-13 pour la transplantation en une souris (2 x 105 pour chaque souris).
Ce protocole présente une méthode pour l'établissement des modèles de souris de reproductibles et stables de 6-OHDA-lesioned de souris. L'étendue de la lésion de 6-OHDA peut être estimée par l'évaluation comportementale qui mesure les rotations contralatérales après injection de l'apomorphine. En outre, le degré de lésion 6-OHDA-induite peut être quantifié par la coloration immunofluorescente post-mortem pour TH dans le SNpc. Un autre type de neurotoxine utilisée dans la modélisation de est 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tertahydropyridine (MPTP), qui perturbe également des voies dopaminergiques. Par rapport au MPTP, 6-OHDA pourrait être administré uni- ou bilatéralement. En outre, la méthode MPTP est plus sensible à l'âge, au sexe et à la souche des animaux et peut donc montrer un degré plus élevé de variation entre les animaux28. Les facteurs critiques incluent la sélection de souris avec le poids correspondant, l'injection fraîchement préparée 6-OHDA solution et effectuer la chirurgie avec précision et rapidement.
Les procédures de transplantation cellulaire des précurseurs de DA dans le striatum des souris lesioned sont fondamentalement les mêmes que les procédures pour la génération des modèles de souris de 6-OHDA-lesioned, excepté que 6-OHDA est remplacé par des précurseurs de DA à l'étape d'injection. Le facteur clé dans cette partie est la recherche de la fenêtre de temps optimale de la différenciation des cellules DA pour la transplantation. Il a été démontré qu'un degré plus élevé de stemness est en corrélation avec un taux de survie plus élevé, mais un potentiel plus faible de spécifications dans les neurones MatureD11. Cependant, un stade plus mature des cellules neurales sont plus vulnérables, et montrent un taux de survie plus faible après la transplantation11. Par conséquent, trouver une fenêtre de temps appropriée qui équilibre la capacité de maturation et de survie est d'importance. Dans une étude précédente, nous avons transplanté des cellules de jour de différenciation 10 et 13 dans le striatum des souris immunodéficientes SCID-beige11. Un mois après l'engraftment, les résultats de coloration immunofluorescentont ont indiqué qu'environ 88.63% et 93.13% étaient TUJ1-positifs pour le jour 10 et jour 13 groupes, respectivement, et quelques cellules de TH (5.30%) ont été détectés à partir du groupe du jour 13, mais peu de cellules THet de 10 jours. Néanmoins, par rapport aux cellules du jour 13, les cellules de jour 10 ont donné lieu à un taux de survie global légèrement plus élevé11. Les résultats ont révélé que le jour 10 au jour 13 est une fenêtre de temps optimale des cellules pour l'engraftment11. Dans ce protocole, nous avons utilisé un mélange de cellules DA du jour de différenciation 10 et jour 13 à un rapport de 1:7 pour l'engraftment, qui a montré un bon résultat de survie et de différenciation11. L'utilisation d'un mélange de cellules du jour 10 et du jour 13 a été basée sur une hypothèse que les cellules neurales relativement immatures et mûres, une fois rassemblées, peuvent soutenir l'un l'autre, rappelant la situation in vivo chez les souris où les cellules souches neurales sont entourées par des neurones mûrs.
Ce protocole présente la méthode de génération d'iNSCs à partir de PBMNCs par infection de SeV, différenciant iNSCs dans des neurones dA, et transplantant des précurseurs de DA dans les modèles de souris de 6-OHDA-lesioned. En utilisant ce protocole, on peut générer des iNSC avec des potentiels non seulement pour le traitement de la maladie d'Alzheimer, mais aussi d'autres maladies neurodégénératives. Puisque les iNSC représentent un stade primitif de NSC, ils peuvent être spécifiés dans différentes cellules neurales région-spécifiques, telles que des neurones de moelle épinière ou des neurones moteurs, qui peuvent être d'utilité prometteuse pour le traitement de la sclérose latérale amyotrophique ou des dommages de moelle épinière. En outre, les iNSC dérivés des patients de maladie familiale offrent une plate-forme pour étudier des mécanismes sous-jacents à l'origine et au développement de la maladie, et pour mener des essais de criblage de drogue.
Il y a plus d'une façon d'obtenir des cellules neurales DA pour des études de transplantation. Les cellules DA peuvent également être générées à partir d'iPSC ou par conversion directe29. Comparé aux iPSCs, les iNSC sont inhérents au risque réduit de formation de tumeur, à une période plus courte de reprogrammation et d'établissement de ligne, et à la plasticité lignée-engagée - seulement capable de différencier en neurones et glia11. Par rapport à la conversion directe, la différenciation des précurseurs DA des iNSC donne lieu à un rendement et une efficacité plus élevés30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les travaux ont été soutenus par les subventions suivantes : Stem Cell and Translation National Key Project (2016YFA0101403), National Natural Science Foundation of China (81661130160, 81422014, 8156138004), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Talents Foundation (2017000021223TD03), Projet de soutien des enseignants de haut niveau dans les universités municipales de Beijing dans la période du 13e plan quinquennal (CIT et TCD2018033), Beijing Medical System High Level Talent Award (2015-3-063), Beijing Fonds de la Commission municipale de la santé (PXM 2018-026283-000002), Beijing Cent, Mille et Dix Mille Talents (2018A03), Beijing Municipal Administration of Hospitals Clinical Medicine Development of Special Funding Support (ZYLX201706), et le Bourse avancée Royal Society-Newton (NA150482).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15-ml conical tube | Corning | 430052 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic for inhalation and skin contact |
| 24-well plate | Corning | 3337 | |
| 50-ml conical tube | Corning | 430828 | |
| 6-OHDA | Sigma-Aldrich | H4381 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Cell dissociation reagent |
| Apomorphine | Sigma-Aldrich | A4393 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A92902 | Toxic with skin contact |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | Brain derived neurotrophic factor |
| Blood collection tubes containing sodium heparin | BD | 367871 | |
| BSA | yisheng | 36106es60 | Fetal bovine serum |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dibutyryladenosine cyclic monophosphate |
| CellBanker 2 | ZENOAQ | 100ml | Used as freezing medium for PBMNCs |
| Chemically defined lipid concentrate | Invitrogen | 11905031 | |
| CHIR99021 | Gene Operation | 04-0004 | |
| Coverslip | Fisher | 25*25-2 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417-10mg | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915-100MG | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11330 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320 | |
| Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
| EPO | Peprotech | 100-64-50UG | Human Erythropoietin |
| FGF8b | Peprotech | 100-25 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | P=1.077, density gradient medium |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | Glial derived neurotrophic factor |
| GlutaMAX | Invitrogen | 21051024 | 100 × Glutamine stock solution |
| Ham's-F12 | Gibco | 11765-054 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175079 | Balanced salt solution |
| Human leukemia inhibitory factor | Millpore | LIF1010 | |
| Human recombinant SCF | Peprotech | 300-07-100UG | |
| IGF-1 | Peprotech | 100-11-100UG | Human insulin-like growth factor |
| IL-3 | Peprotech | 200-03-10UG | Human interleukin 3 |
| IMDM | Gibco | 215056-023 | Iscove's modified Dulbecco's medium |
| Insulin | Roche | 12585014 | |
| ITS-X | Invitrogen | 51500-056 | Insulin-transferrin-selenium-X supplement |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | Serum free basal medium |
| Laminin | Roche | 11243217001 | |
| Microsyringe | Hamilton | 7653-01 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| NEAA | Invitrogen | 11140050 | Non-essential amino acid |
| Neurobasal | Gibco | 10888 | Basic medium |
| PDL | Sigma-Aldrich | P7280 | Poly-D-lysine |
| SAG1 | Enzo | ALX-270-426-M01 | |
| SB431542 | Gene Operation | 04-0010-10mg | Store from light at -20? |
| Sendai virus | Life Technologies | MAN0009378 | |
| Sucrose | baiaoshengke | ||
| TGFβ? | Peprotech | 100-36E | Transforming growth factor β? |
| Transferrin | R&D Systems | 2914-HT-100G | |
| Triton X 100 | baiaoshengke | Nonionic surfactant | |
| Trypan blue | Gibco | T10282 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 |
References
- Williams-Gray, C. H., et al. The distinct cognitive syndromes of Parkinson's disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort. Brain. 132, Pt 11 2958-2969 (2009).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radical Biology and Medicine. 62, 132-144 (2013).
- Chen, Z. Cell Therapy for Parkinson's Disease: New Hope from Reprogramming Technologies. Aging and Disease. 6 (6), 499-503 (2015).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Doi, D., et al. Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12543-12548 (2004).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S.
- Tang, X., et al. Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors. Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).
- Yuan, Y., et al. Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson's disease model. Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).
- Bazley, F. A., et al. Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells. Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).
- Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method. Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).
- Zhu, S., et al. Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds. Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).
- Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).
- Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson's disease. Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).
- Sheng, C., et al. Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors. Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).
- Prasad, A., et al. A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation. Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).
