Summary
El protocolo presenta la reprogramación de células mononucleares de sangre periférica para inducir células madre neurales por infección por el virus Sendai, diferenciación de iNSCs en neuronas dopaminérgicas, trasplante de precursores de DA en el unilateralmente-lesioned Modelos de ratón de la enfermedad de Parkinson, y evaluación de la seguridad y eficacia de los precursores de DA derivados de iNSC para el tratamiento de la DP.
Abstract
La enfermedad de Parkinson (PD) es causada por la degeneración de las neuronas dopaminérgicas (DA) en la sustancia nigra pars compacta (SNpc) en el mesencéfalo ventral (VM). La terapia de reemplazo celular tiene una gran promesa para el tratamiento de la DP. Recientemente, las células madre neurales inducidas (iNSC) han surgido como un candidato potencial para la terapia de reemplazo celular debido al menor riesgo de formación de tumores y la plasticidad para dar lugar a neuronas y glia específicas de la región. los iNSC se pueden reprogramar a partir de fuentes celulares somáticas autólogas, como fibroblastos, células mononucleares de sangre periférica (PMF) y varios otros tipos de células. En comparación con otros tipos de células somáticas, los PBMNAC son un tipo de celda de inicio atractivo debido a la facilidad de acceso y expansión en cultivo. El virus Sendai (SeV), un virus no integrador de ARN, que codifica factores de reprogramación como OCT3/4humano, SOX2, KLF4 y c-MYC, tiene un genoma no segmentado, de un solo cadena y de sentido negativo que no se integra en gento del huésped, pero sólo se replica en el citoplasma de las células infectadas, ofreciendo un vehículo eficiente y seguro para la reprogramación. En este estudio, describimos un protocolo en el que los iNSC se obtienen reprogramando PBX y diferenciados en neuronas DA de VM especializadas mediante un método de dos etapas. A continuación, los precursores de DA se trasplantan en modelos unilaterales de ratón PD de 6-hyroxydopamine (6-OHDA) para evaluar la seguridad y eficacia para el tratamiento de la DP. Este método proporciona una plataforma para investigar las funciones y efectos terapéuticos de las células neuronales DA específicas del paciente in vitro e in vivo.
Introduction
La enfermedad de Parkinson (PD) es un trastorno neurodegenerativo común, causado por la degeneración de las neuronas dopaminérgicas (DA) en la sustancia nigra pars compacta (SNpc) en el mesencéfalo ventral (VM), con una prevalencia de más del 1% en la población mayor de 60 años de edad 1 , 2. Durante la última década, la terapia celular, dirigida a sustituir las células degenerativas o dañadas, o nutrir el microambiente alrededor de las neuronas degenerativas, ha demostrado potencial en el tratamiento de la DP3. Mientras tanto, la tecnología de reprogramación ha hecho progresos significativos4, que proporciona una fuente celular prometedora para la terapia de reemplazo. Se ha demostrado que las células madre pluripotentes inducidas por el hombre (iPSC) y las células madre embrionarias (ESC) son capaces de diferenciarse en células neuronales DA, que podrían sobrevivir, madurar y mejorar las funciones motoras cuando se injertan en modelos de DP de rata y primate no humano5 ,6,7,8. los iPSC representan un hito en las tecnologías de reprogramación celular y tienen un gran potencial en el trasplante de células; sin embargo, todavía existe una preocupación sobre el riesgo de formación de tumores de las células incompletamente diferenciadas. Una fuente celular alternativa para el trasplante de células es la que las células madre adultas cometidas por linajes se obtienen a través de la reprogramación directa, como las células madre neurales inducidas (iNSC), que pueden derivarse de los intermediarios inestables, evitando la pluripotencia etapa9,10,11.
Tanto los ISPC como los iNSC pueden reprogramarse a partir de fuentes celulares autólogas, como fibroblastos, células mononucleares de sangre periférica (PBMNC) y varios otros tipos de células12,13,14,reduciendo así la inmunogenicidad de las células trasplantadas en gran medida. Además, en comparación con los iPSC, los iNSC son inherentes a la reducción del riesgo de formación de tumores y la plasticidad comprometida con el linaje, sólo capaces de diferenciarse en neuronas y glia11. En los estudios iniciales, se generaron iPSCs humanos o ratón e iNSC a partir de fibroblastos obtenidos a partir de biopsias cutáneas, que es un procedimiento invasivo14,15. Con este respecto, los PBMNC sson una fuente de células de inicio atractiva debido al proceso de muestreo menos invasivo, y la facilidad para obtener un gran número de células dentro de un corto período de tiempo de expansión16. Los estudios iniciales de reprogramación emplearon sistemas de administración integrador, como vectores lentivirales o retrovirales, que son eficientes y fáciles de implementar en muchos tipos de células17; sin embargo, estos sistemas de administración pueden causar mutaciones y reactivación de transgenes residuales, que presentan problemas de seguridad con fines terapéuticos clínicos12. El virus DeSendai (SeV) es un virus de ARN no integrador con un genoma de una sola cadena de sentido negativo que no se integra en el genoma del huésped, sino que sólo se replica en el citoplasma de las células infectadas, ofreciendo un vehículo eficiente y seguro para la reprogramación18 ,19. Hay disponibles vectores SeV recombinantes que contienen factores de reprogramación, incluidos los modelos humanos OCT3/4, SOX2, KLF4 y c-MYC en sus marcos de lectura abiertos. Además, los vectores virales SeV pueden mejorarse aún más mediante la introducción de mutaciones sensibles a la temperatura, de modo que podrían eliminarse rápidamente cuando la temperatura de cultivo se eleva a 39 oC20. En este artículo, se describe un protocolo para reprogramar PBX a iNSCs mediante el sistema SeV.
Muchos estudios han reportado derivación de neuronas DA de ESCs humanas o iPSC utilizando varios métodos6,8,21. Sin embargo, hay una escasez de protocolos que describen la diferenciación de las neuronas DA de iNSCs en detalle. En este protocolo, describiremos la generación eficiente de neuronas DA a partir de iNSCs utilizando un método de dos etapas. Los precursores neuronales DA se pueden trasplantar al estriado de los modelos de ratón PD para evaluaciones de seguridad y eficacia. Este artículo presentará un protocolo detallado que cubre varias etapas desde la generación de células madre neurales inducidas por el virus Sendai, diferenciación de iNSCs en neuronas DA, establecimiento de modelos de PD de ratón, al trasplante de precursores de DA en el estriado de los modelos de PD. Usando este protocolo, uno puede generar iNSCs de pacientes y donantes sanos y derivar neuronas DA que sean seguras, estandarizadas, escalables y homogéneas para fines de trasplante celular, o para modelar PD en un plato e investigar los mecanismos enfermedad subyacente y desarrollo.
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Protocol
Todos los procedimientos deben seguir las directrices del comité institucional de ética de la investigación humana. El consentimiento informado debe obtenerse de pacientes o voluntarios sanos antes de la recolección de sangre. Este protocolo fue aprobado por el comité de ética de la investigación humana de la institución y se realizó de acuerdo con las directrices de la institución para el cuidado y uso de animales.
1. Recogida, aislamiento y expansión de los PBMN
- Colección de PBMNCs
- Recoger 10-20 ml de sangre venosa periférica del donante por venopunción con un vial conservante de heparina sódica.
NOTA: Las muestras de sangre deben almacenarse o enviarse a temperatura ambiente (RT). Procesar las muestras de sangre en un plazo de 24 h.
- Recoger 10-20 ml de sangre venosa periférica del donante por venopunción con un vial conservante de heparina sódica.
- Preparación del medio de cultivo
- Preparar el medio libre de suero (SFM) combinando los siguientes componentes: 245 ml del medio Dulbecco modificado de Iscove (IMDM), 240 ml de F-12 de Ham, 5 ml de suplemento de insulina-transferrina-selenio-X (ITS-X), 5 ml de solución de material de glutamina 100x (Tablade Materiales),5 ml de concentrado lipídico definido químicamente, 2,5 g de suero bovino fetal, 0,025 g de ácido ascórbico y 9 ml de 1-tioglicerol. Filtrar el medio y guardarlo a 4oC.
ADVERTENCIA: El ácido ascórbico y el 1-tioglicerol son tóxicos por contacto con la piel e inhalación. - Para preparar el medio de célula mononuclear (MNC), complementar el medio SFM con 10 ng/ml de interleucina humana 3 (IL-3), 2 U/ml de eritropoyetina (EPO), factor de células madre humanas de 100 ng/ml (SCF), factor de crecimiento insulina humana de 40 ng/ml 1 (IGF-1), 100 g/ml holo-transferina y 1 Dexametasona M. Filtrar el medio y guardarlo a 4oC.
NOTA: Prepare el medio inmediatamente antes de usarlo.
- Preparar el medio libre de suero (SFM) combinando los siguientes componentes: 245 ml del medio Dulbecco modificado de Iscove (IMDM), 240 ml de F-12 de Ham, 5 ml de suplemento de insulina-transferrina-selenio-X (ITS-X), 5 ml de solución de material de glutamina 100x (Tablade Materiales),5 ml de concentrado lipídico definido químicamente, 2,5 g de suero bovino fetal, 0,025 g de ácido ascórbico y 9 ml de 1-tioglicerol. Filtrar el medio y guardarlo a 4oC.
- Aislamiento de PBMNCs
- Esterilizar con ultravioleta un banco limpio antes de su uso. Esterilice todas las superficies y equipos con un 75% de alcohol. Esterilice todas las puntas mediante el uso de un autoclave.
- Transfiera la sangre periférica (PB) a un tubo cónico de 50 ml y diluya el PB con un volumen igual de solución salina estéril de Dulbecco con búfer de fosfato (D-PBS).
- Preparar 15 ml de medio de gradiente de densidad esterilizado(Tablas de Materiales)en otro tubo cónico de 50 ml.
NOTA: Mantenga el medio de gradiente de densidad y PB en RT para permitir un mejor aislamiento de PBX. - Incline el tubo cónico que contiene el medio de gradiente de densidad en un ángulo de 45o, y luego coloque lenta y cuidadosamente 30 ml de PB diluido en el medio de gradiente de densidad.
NOTA: Tenga cuidado y permita que el PB corra lentamente por el lado del tubo cónico sobre la capa media de gradiente de densidad. Los glóbulos rojos se depositarán en la parte inferior del tubo. Incline el tubo con cuidado para minimizar la interrupción de la interfaz de capa. - Centrifugar los tubos a 800 x g durante 15 minutos en RT con el freno centrífugo en posición "apagado". Aspira la capa de plasma superior amarilla y deséchala. A continuación, transfiera la capa de película delgada nublada blanca que contiene MNCs con una pipeta de 10 ml a un nuevo tubo cónico de 50 ml.
NOTA: La desactivación del freno de centrífuga es importante para el aislamiento de las MNC. - Añadir 30 ml de D-PBS al tubo con MNCs y centrifugar a 600 x g durante 10 min a 4oC. Deseche el sobrenadante y, a continuación, agregue 45 ml de D-PBS para volver a suspender las celdas. Centrífuga a 400 x g durante 10 min a 4oC.
NOTA: El freno de centrífuga debe estar encendido para este y los siguientes pasos de centrifugación. Como los pellets celulares son densos, agregue 1-2 ml de D-PBS para volver a suspender suavemente los pellets, y luego agregue D-PBS a 45 mL. - Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las celdas con 5 ml de D-PBS y cuente las celdas vivas con el método de exclusión azul trypan.
- Después de dejar a un lado los MNC necesarios para la expansión, congele las celdas restantes para su uso futuro.
NOTA: Se pueden congelar al menos 5 x 106 MNC en un vial con 1 ml de medio de congelación (Tablade materiales). El protocolo se puede pausar aquí.
- Expansión de las MNC
- En el día -14, las semillas de MNC a una densidad de 2-3 x 106 células por mililitro en un pozo de placas de seis pocillos con 1,5 ml de medio MNC precalentado (37 oC). Incubar a 37oC, 5% CO2 durante 2 días.
- En el día -11, recoger las células y el medio con una pipeta esterilizada y transferir a un nuevo tubo cónico de 15 ml. Centrifugar las células a 250 x g durante 5 min en RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 ml de medio MNC precalentado (37 oC).
- Cuente las celdas viables con trippan azul. Sembrar los MNC a una densidad de 1 x 106 células por mililitro en medio MNC precalentado e incubar a 37 oC, 5% CO2 durante 3 días.
NOTA: Se espera que el número total de celdas puede disminuir en el día -11. - En el día -8, repita los pasos 1.4.2-1.4.3 y el cultivo de las celdas durante 3 días.
- En el día -4, repita los pasos 1.4.2-1.4.3 y el cultivo de las celdas durante 3 días.
NOTA: Después de 14 días de cultivo, un número igual o mayor de MNCs debe permanecer en la cultura.
2. Reprogramación de PBMNCs a iNSCs por infección SeV
- Preparación del medio de solución y cultura
- Preparar una solución de stock de poli-d-lisina (PDL) disolviendo 100 mg de PDL con 100 ml de H2O a una concentración de 1 mg/ml. Conservar a -20oC en alícuotas de 1 ml.
- Preparar una solución de insulina en sumos mediante la disolución de 100 mg de insulina en 20 ml de 0,01 N HCl a una concentración de 5 mg/ml. Conservar a -20oC en alícuotas de 1 ml.
- Para preparar 200 ml de medio basal iNSC, combinar 96 ml de DMEM-F12 y 96 ml de medio básico (Tablade Materiales)con 2 ml de solución de glutamina de 100x, 2 ml de aminoácido no esencial (NEAA), 2 ml de suplemento N2 y 2 ml de suplemento de B27. Añadir 10 ng/ml de factor inhibitorio de leucemia humana recombinante, 3 m chir99021 y 2 m SB431542 antes de su uso. Filtrar el medio y guardarlo a 4oC.
NOTA: Utilice el medio en un plazo de 2 semanas. Añadir factor inhibitorio de leucemia humana recombinante, CHIR99021 y SB431542 inmediatamente antes de su uso.
- Reprogramación de PBX a iNSCs por infección Por SeV
- Esterilizar con ultravioleta un banco limpio antes de su uso. Esterilice todas las superficies y equipos con un 75% de alcohol. Esterilice todos los consejos usando un autoclave.
- En el día 0, recoger las células en el medio MNC y transferir a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células con 1 ml de medio MNC precalentado.
- Cuente las celdas viables con trippan azul. Vuelva a suspender las células con medio MNC precalentado (37 oC) a una concentración de 2 x 105 células por poca en placas de 24 pocillos.
- Después de retirar los tubos SeV de un almacenamiento de -80 oC, descongelar los tubos que contienen SeV en un baño de agua de 37 oC durante 5-10 s, y luego permitir que se descongelen en RT. Una vez desconwemadas, colóquelas en hielo inmediatamente.
- Añadir el Humano de codificación SeV Klf4, Oct3/4, SOX2 y c-MyC a los pozos, a una multiplicidad de infección (MOI) de 10. Células centrífugas con placas a 1.000 x g durante 30 min para facilitar la unión de las células. Deje las células y el sobrenadante en las placas. Colocar las placas en la incubadora a 37oC, 5%CO2.
ADVERTENCIA: Todos los procedimientos relacionados con SeV deben realizarse en un armario de seguridad, y todas las puntas y tubos deben tratarse con etanol o lejía antes de su eliminación. - En el día 1, transfiera el medio y las células a un tubo centrífugo de 15 ml. Enjuagar el pozo con 1 ml de medio MNC. Centrifugar la suspensión celular a 200 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células con 500 s l de medio Fresco de MNC precalentado en placas de 24 pocillos.
NOTA: Utilice una placa de 24 pocillos de fijación baja para evitar la fijación de cualquier celda antes de enchapar en PDL/laminin. - En el día 2, diluir 1 ml de 1 mg/ml de PDL con 19 ml de D-PBS a una concentración de 50 g/ml. Cubra placas de 6 pocillos con 50 g/ml PDL durante al menos 2 h a RT.
- Diluir 200 l de 0,5 mg/ml de laminin a 20 ml de D-PBS a una concentración de 5 g/ml. Aspirar PDL en las placas de 6 pocillos, y secar en el banco vertical limpio.
- Recubrir placas de 6 pocillos con 5 g/ml de laminina e incubar durante 4-6 h a 37oC. Lavar con D-PBS antes de usar.
- En el día 3, placa las células transducidas obtenidas en el paso 2.2.6 en el medio iNSC en placas de 6 pocillos recubiertas de PDL/laminin.
NOTA: Mueva las placas suavemente si es necesario después de colocar las células en placas recubiertas de PDL/laminina, tratando de no perturbar la unión de las células. - En el día 5, añadir 1 ml de medio iNSC precalentado (37 oC) en cada pocal en placas de 6 pocillos con suavidad.
NOTA: Se espera que las células se sometan a una muerte drástica (>60%). - En el día 7, añadir 1 ml de medio iNSC precalentado (37 oC) en cada pocal en placas de 6 pocillos con suavidad.
- Desde el día 9 hasta el día 28, sustituya el medio gastado por un medio iNSC fresco precalentado (37 oC) todos los días. Monitorear la aparición de las colonias de iNSC. Elija y transfiera clones de iNSC para su expansión en aproximadamente 2-3 semanas. Recoger colonias con morfología apropiada utilizando pipetas de vidrio quemado, excluyendo cualquier célula posiblemente contaminante, y aspirar a las colonias con puntas de 200 l.
NOTA: Los iNSC caracterizados se pueden congelar para su uso futuro con 2-5 colonias en un vial. El medio de congelación incluye medio basal libre de suero (Tabla de materiales) y dimetilsulfóxido mezclado en una proporción de 9:1, que debe prepararse inmediatamente antes de su uso. El protocolo se puede pausar aquí.
3. Diferenciación de iNSCs a neuronas dopaminérgicas
- Preparación del medio de solución y cultura
- Preparar 200 ml de medio basal de diferenciación iNSC combinando 192 ml de DMEM-F12 con 2 ml de solución de stock de glutamina 100x, 2 ml de NEAA, 2 mL de suplemento N2 y 2 ml de suplemento B27.
NOTA: Utilice el medio en un plazo de 2 semanas. - Preparar el medio de diferenciación iNSC I complementando el medio basal de diferenciación iNSC con 1 M SAG1 y 100 ng /mL FGF8b.
NOTA: Utilice el medio en un plazo de 2 semanas. - Preparar el medio de la etapa II de diferenciación iNSC complementando el medio basal de diferenciación iNSC con 0,5 mM de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), ácido ascórbico de 0,2 mM, 10 M DAPT, factor neurotrófico derivado del cerebro de 10 ng/ml (BDNF), derivado del glial de 10 ng/ml factor neutrofés (GDNF) y 1 ng/ml de factor de crecimiento transformador -III (TGF-III).
NOTA: Utilice el medio en un plazo de 2 semanas.
- Preparar 200 ml de medio basal de diferenciación iNSC combinando 192 ml de DMEM-F12 con 2 ml de solución de stock de glutamina 100x, 2 ml de NEAA, 2 mL de suplemento N2 y 2 ml de suplemento B27.
- Recubrimiento de los platos de la cultura
- Esterilizar con ultravioleta un banco limpio antes de su uso. Esterilice todas las superficies y equipos con un 75% de alcohol. Esterilice todos los consejos usando un autoclave.
- Para el recubrimiento PDL, al menos un día antes de volver a chapar las células, diluir 1 ml de 1 mg/ml de PDL con 19 ml de D-PBS a una concentración de 50 g/ml. Recubrir los revestimientos de vidrio de 12 mm que han sido esterilizados con 75% de alcohol en las placas de 24 pocillos con 50 g/ml PDL a RT durante al menos 2 h.
- Para el recubrimiento de laminina, diluir 200 ml de 0,5 mg/ml de laminin a 20 ml de D-PBS a una concentración de 5 g/ml. Aspirar PDL y secar los pozos en el banco limpio. Recubrir los labios de las cubiertas de 12 mm con 5 g/ml de laminina e incubar durante 4-6 h a 37 oC. Lavar con D-PBS antes de usar.
- Células de paso para diferenciación.
- Cuando la confluencia de iNSCs cultivados alcanza el 70-90%, aspirar el medio de la placa de cultivo, y añadir 1 mL de D-PBS para lavar las células. Añadir 1 mL de reactivo de disociación celular precalentado (37 oC) (Tablade materiales)por pozo e incubar a 37 oC durante 3 min para disociar las células.
- Después de la incubación durante 3 minutos, las células se han vuelto semiflotantes; añadir 3 ml de medio DMEM-F12 precalentado (37 oC) por pocido, y pipetear las células hacia arriba y hacia abajo para disociar los gránulos celulares en células individuales.
- Transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml y centrífuga a 250 x g durante 3 min. Aspirar el sobrenadante, vuelva a suspender las células con el volumen adecuado de medio iNSC precalentado (37 oC) según el número de células.
- Cuente las celdas mediante el método de exclusión azul trypan. Placa 5 x 103 células por encubrimiento de vidrio de 12 mm en placas de 24 pocillos e incubar a 37oC, 5% CO2.
- Diferenciar iNSCs en neuronas dopaminérgicas.
- Iniciar la diferenciación 24 h después de volver a enchapar las células en los cubredes recubiertos con PDL/laminina. Aspirar el medio de cultivo, lavar las células una vez con D-PBS, y luego añadir 600 éL de medio de diferenciación precalentado Etapa I por pozo en placas de 24 pocillos e incubar a 37 oC, 5% CO2.
- Cambiar el medio todos los días desde el día 1 hasta el día 10 durante la primera etapa de diferenciación.
- En el día 10, aspirar el medio de cultivo y lavar las células una vez con D-PBS. Añadir 600 ml de medio de diferenciación precalentado (37 oC) II por pocido en placas de 24 pocillos e incubar a 37oC, 5% CO2.
- Cambiar el medio cada dos días desde el día 11 hasta el día 25 durante la segunda etapa de diferenciación. Las celdas diferenciadas se pueden fijar mediante paraformaldehído en diferentes puntos de tiempo para el análisis.
- Para la tinción inmunofluorescente, lave las células con D-PBS tres veces suavemente en los momentos elegidos dentro del día de diferenciación 11 a 25.
- Pipetear 300 l de tensioactivo no iónico (Tablade materiales)en 100 ml de PBS para hacer un tensioactivo no iónico al 0,3% en PBS.
ADVERTENCIA: El tensioactivo no iónico es tóxico por contacto con la piel e inhalación. - Fijar las celdas con 4% de paraformaldehído durante 10 min en RT. Luego lave con 0.3% en PBS tres veces.
ADVERTENCIA: Paraformaldehído es tóxico por contacto con la piel e inhalación. - Bloquee las células en un 3% de suero de burro durante 2 h en RT.
- Diluir el anticuerpo primario en un 1% de suero de burro a una concentración adecuada y triturar suavemente para mezclar. Añadir 300 l de la solución de anticuerpos primarios a cada pocal de la placa de 24 pocillos. Incubar las células a 4oC durante la noche. Lave las células con un tensioactivo no iónico al 0,3% en PBS tres veces.
- Diluir el anticuerpo secundario en un 1% de suero de burro a una concentración adecuada y triturar suavemente para mezclar. Añadir 300 l de la solución de anticuerpos secundarias a cada pocal de la placa de 24 pocillos. Incubar las células a RT durante 2 h, protegidas de la luz.
- Lave las células con un tensioactivo no iónico al 0,3% en PBS tres veces. Diluir 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) con PBS con 1:500 dilución. Incubar las células en cada pocal de la placa de 24 pocillos con 300 ml de DAPI diluido durante 15 minutos a RT, protegido de la luz. Lave las células con un tensioactivo no iónico al 0,3% en PBS tres veces.
- Saque suavemente los labios de las cubiertas de los pozos de las placas con fórceps. Secar en la oscuridad durante la noche en RT. Montar bajo un microscopio de fluorescencia.
4. Establecimiento de modelos unilaterales de ratón PD de 6-hiroxidopamina (6-OHDA)
- Para generar modelos de ratón PD para trasplante de células, utilice ratones machos adultos SCID-beige que pesen 20-25 g para la inyección de 6-OHDA.
- Preparación de medicamentos para la cirugía
- Preparar una solución de ácido ascórbico al 0,2% disolviendo 0,2 g de ácido ascórbico en 100 ml de solución salina esterilizada (0,9%) y almacenar a -80 oC hasta su uso. El día de la cirugía, diluir 0.2% solución de ácido ascórbico por 10 veces para obtener una solución de ácido ascórbico 0.02%.
NOTA: Se añade ácido ascórbico para evitar la oxidación de 6-OHDA a una forma inactiva. - Para preparar una solución de 6-OHDA, pese la cantidad adecuada de 6-OHDA en un tubo esterilizado de 1 ml, y luego agregue un poco de volumen de ácido ascórbico al 0,02% para hacer una solución de 5 g/L 6-OHDA. Vórtice la mezcla hasta que se disuelva. Coloque el 6-OHDA sobre hielo hasta su uso.
NOTA: 6-OHDA es sensible a la temperatura y a la luz. Tenga cuidado de proteger la solución de la luz y mantenerla en hielo antes de su uso.
- Preparar una solución de ácido ascórbico al 0,2% disolviendo 0,2 g de ácido ascórbico en 100 ml de solución salina esterilizada (0,9%) y almacenar a -80 oC hasta su uso. El día de la cirugía, diluir 0.2% solución de ácido ascórbico por 10 veces para obtener una solución de ácido ascórbico 0.02%.
- Preparar el equipo quirúrgico esterilizado mediante autoclave antes de la cirugía. Limpie todas las áreas de equipos y superficies con etanol al configurar el marco estereotaxico. Configure una jaula de recuperación del ratón debajo de una lámpara de calefacción.
- Llevar a cabo la cirugía para establecer modelos unilaterales de ratón 6-OHDA-lesioned.
- Pesar cada ratón, registrar el peso y calcular la cantidad de medicamento que necesita ser administrado. Cada ratón recibe 0,5 mg/kg de atropina 20 minutos antes de las operaciones. Anestetizar el ratón con 80 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina.
- Administrar 0,5 mg/kg de atropina mediante inyección intraperitoneal.
- Anestetizar el ratón con 80 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina por inyección intraperitoneal 20 min después de la administración de atropina.
- Ponga el ratón en una cámara cerrada. Después de 3-5 minutos, el ratón será profundamente anestesiado sin respuesta al pellizco de la pata trasera.
NOTA: Se espera que el ratón que ha recibido anestesia experimente un período de excitación. - Afeitar la cabeza del ratón y aplicar un gesto ocular de eritromicina en los ojos del ratón para protegerse del desarrollo de úlceras corneales.
- Coloque el ratón sobre el aparato estereotaxico. Fije el ratón con barras incisivas en primer lugar. Inserte los auriculares correctamente para hacer que la cabeza del ratón esté en una posición plana y segura.
- Esterilice la cabeza del ratón con yodo de povidona y alcohol isopropílico. Corta una incisión sagital (1,5 cm) en la piel de la cabeza con una cuchilla de bisturí, y expone el cráneo. Ajuste la barra incisiva y las barras de los oídos para reducir la diferencia de altura entre bregma y lambda a menos de 0,1 mm.
NOTA: El bregma de ratón se encuentra en la intersección de suturas coronales y sagitales, y lambda está en la intersección de suturas lambdoidas y sagitales. - Mueva lentamente y baje la punta de la aguja hacia bregma y trate el bregma como un punto cero. Mueva la punta a una posición con coordenadas de A/P +0,5 mm, M/L -2,1 mm en relación con bregma. Retirar la punta y marcar el punto. Encaja un pequeño agujero en el cráneo.
- Extraer 2 solución de 5 g/L 6-OHDA en la microjeringa (Tablade materiales). Vuelva a colocar la aguja en el punto marcado e inserte la aguja en D/V -3,2 mm.
- Inyectar 2 sL de 5 g/L 6-OHDA solución (10 g en total) a una velocidad de 1 l/min. Después de la inyección de 6-OHDA se ha completado, dejar la aguja en su lugar durante otros 5 minutos. A continuación, retraiga lentamente la aguja de inyección.
- Cierre la incisión con suturas y aplique un ungón ocular de eritromicina en los ojos del ratón. Entregar 0,5 ml de salina por vía subcutánea para prevenir la deshidratación, y aplicar un ung ánta antibiótico directamente sobre la piel suturada.
- Retire el ratón del aparato estereofómico y colóquelo en la jaula de recuperación. Vuelva a colocar el ratón y permita el acceso a la comida y al agua hasta que recupere la conciencia. Tratar el ratón con analgésico en agua potable diaria post-cirugía durante 2-3 días, y una dosis recomendada de ibuprofeno es 0.03 mg/g de peso corporal por día.
- Inspeccione el ratón diariamente después de la cirugía.
5. Evaluación del comportamiento después de lesiones unilaterales 6-OHDA
- De dos a tres semanas después de la cirugía, realice una evaluación del comportamiento para estimar los síntomas de la DP. Pesar cada ratón, registrar su peso y calcular la cantidad de medicamento que se debe administrar (0,5 mg/kg de apomorfina antes de la evaluación).
- Administrar 0,5 mg/kg de apomorfina mediante inyección subcutánea antes de la evaluación y colocar el ratón en un cilindro de vidrio.
- Después de un período de habituación de 5 minutos, cuente el número de rotaciones contralaterales e ipsilaterales en relación con el lado de la lesión por minuto y registre su actividad con una cámara de video.
- Los ratones con rotaciones contralaterales menos ipsilaterales >7 rpm/min se consideran lesionados con éxito y seleccionados como candidatos para experimentos de trasplante de células. Devuelva a los ratones a las jaulas de la vivienda después de un descanso de 30 minutos.
NOTA: Si el ratón se lesionó con éxito, el ratón inyectado 6-OHDA mostrará un mayor sesgo en girar hacia el lado contralateral ya que el agonista DA activa el estriado denervado supersensible del lado lesionado predominantemente. - Realizar la evaluación del comportamiento una semana antes y 2, 4, 6, 8, 12, 16 semanas después del trasplante de células.
6. Trasplante celular de precursores de DA
- Preparar la suspensión celular para el trasplante. Para el injerto celular, suspenda 2 x 105 precursores DA mezclados por precursores D10 y D13 DA en una proporción de 1:7 en 4 s l de 5 g L-1 glucosa en solución salina equilibrada (Tablade materiales)de tampón de trasplante.
- Realizar cirugía de trasplante celular siguiendo los procedimientos descritos en la sección 4.4, excepto que 6-OHDA es reemplazado por la suspensión o tampón de células precursor del DA.
- Realizar la evaluación del comportamiento 2, 4, 6, 8, 12, 16 semanas después del trasplante de células de precursores de DA siguiendo los procedimientos descritos en la sección 5. Cuente el número de rotaciones contralaterales inducidas por apomorfina en relación con el lado de la lesión por minuto y registre su actividad con una cámara de video.
NOTA: Después del trasplante, una tasa reducida de rotaciones contralaterales sugiere una función motora mejorada. - A las 4, 8 ,12 y 16 semanas después del trasplante celular, perfumar el ratón bajo anestesia profunda con 4% de paraformaldehído hasta que el cuerpo del ratón se vuelve rígido y el hígado del ratón se vuelve pálido.
- Separa suavemente el cerebro del ratón y coloca el cerebro en un 4% de paraformaldehído a 4oC durante la noche.
- En el segundo día, poner el cerebro en 30% sacarosa para la deshidratación hasta que el cerebro se hunde hasta el fondo.
- Corta el cerebro a 40 m de espesor usando un microtome de congelación.
- Realice la inmunomancha como se describió anteriormente en los pasos 3.4.5-3.4.12.
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Representative Results
Aquí, informamos de un protocolo que cubre diferentes etapas de la terapia celular iNSC-DA para tratar modelos de DP. En primer lugar, los PBMNAC fueron aislados y ampliados, y reprogramados en iNSCs por infección por SeV. En la Figura 1se muestra una representación esquemática de los procedimientos con expansión PBMNC e inducción de iNSC. El día -14, los PBMNAC se aislaron utilizando un medio de gradiente de densidad (Tablade materiales). Antes de la centrifugación, la sangre diluida con PBS y el medio de gradiente de densidad se separaron en dos capas. Después de la centrifugación, aparecieron cuatro capas de gradiente (de abajo a arriba): la capa inferior contenía granulocitos y eritrocitos; la segunda capa contenía un medio de gradiente de densidad; el tercero contenía PBMNCs (flecha roja); la capa superior contenía plasma rico en plaquetas (Figura2A). Después de 14 días de expansión, los PBMNAC se infectaron con SeV como el día 0. El día 1, se eliminó el medio con SeV (Figura2B). Como se ilustra en la Figura 2B,se espera que el número de celdas se reduzca gradualmente. Células sometidas a una muerte drástica (>60%) hasta el día 5 (Figura2B). las colonias del iNSC surgieron el día 12 como muy pronto (Figura2B). Después de seleccionar y transferir clones de iNSC para expansión para una serie de pasajes, la morfología de las células se muestra en la Figura 2C. Los iNSC mostraron una buena morfología y podían renovarse establemente en el medio iNSC, ya sea en forma monocapa o como esferas (Figura2C).
iNSC podría dar lugar a neuronas DA utilizando un método de dos etapas (Figura 1). Durante la primera etapa que duró 10 días, los iNSC fueron tratados con SAG1 y FGF8b para inducir la especificación de células de placa de suelo de VM con potencial neurogénicos. A continuación, las células fueron tratadas con ácido ascórbico, BDNF, GDNF, campo, DAPT, TGF-III en la segunda etapa (Figura1). Con este método de dos etapas, los precursores de DA podrían obtenerse hacia el final de la primera etapa, y las neuronas DA más maduras podrían generarse al final de la segunda etapa. Después de 24 días de diferenciación, los iNSC podrían especificarse eficientemente a las neuronas DA como la mayoría de ellas expresada sin tenedor caja A2 (FOXA2), neurona específica clase III -tubulina (TUJ1) y tirosina hidroxilasa (TH) (Figura3).
Tres semanas después del establecimiento de modelos unilaterales de ratón PD 6-OHDA-lesioned, se llevó a cabo una evaluación del comportamiento para estimar los síntomas de la DP (Figura4A). Una semana más tarde, los precursores dopaminérgicos fueron trasplantados a los modelos de ratón PD (Figura4A). La evaluación del comportamiento se realizó una semana antes y 2, 4, 6, 8, 12 semanas después del trasplante de células (Figura4A). Los ratones que habían recibido trasplante de células mostraron una mejora significativa en la función motora (Figura4B). La extensión de la lesión inducida por 6-OHDA puede verificarse mediante la tinción inmunofluorescente post mortem para TH en el estriado, el haz de antecebra medial (MFB) y el SNpc (Figura4C). Las señales TH positivas en ratones injertados se recuperaron en gran medida en el estriado donde las células fueron implantadas y se recuperaron levemente en SNpc (Figura4C). Tres meses después del trasplante, alrededor del 13,84% fueron neuronas TH+ DA entre las células supervivientes (Figura4D,E). Alrededor del 91,72% y el 86,76% de las células TH+ se expresaron receptor nuclear huérfano (NURR1) y FOXA2, respectivamente (Figura4D,E). Alrededor del 98,77% de las células TH+ fueron coetiquetadas con potasio rectificador interno acoplado a proteínaG (GIRK2) (Figura4D,E).
Figura 1 : Una representación esquemática de los procedimientos relacionados con la expansión de PBMNC, la inducción del iNSC y la diferenciación de iNSC en precursores de DA. Los PBMNC se aislaron y ampliaron en medio MNC durante más de 14 días, y luego se infectaron con SeV que codifica batuclas sox2, OCT3/4, c-MYC y KLF4. Las colonias de iNSC surgieron tan pronto como 12 días después de la infección por SeV. Después de 3-4 semanas, las colonias de iNSC fueron escogidas y diferenciadas en precursores de DA por un método de dos etapas. PBMNCs: células mononucleares de sangre periférica; MNC: células mononucleares; iNSCs: células madre neurales inducidas; SeV: virus Sendai; DA: dopaminérgico; PDL: poli-D-lisina; BDNF: factor neurotrófico derivado del cerebro; GDNF: factor neurotrófico derivado de la línea celular glial; AA: ácido ascórbico; CAMP: dibutyryladenosine monofosfato cíclico; TGF: factor de crecimiento transformador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Los PBMNAC se aíslan y se expanden, y luego se reprograman en iNSCs por infección por SeV. (A) Un ejemplo de PBMNCs antes y después de la centrifugación de gradiente. Antes de la centrifugación, las muestras de sangre diluidas y el medio de gradiente de densidad se separaron en dos capas. Después de la centrifugación, cuatro capas de gradiente de densidad formadas de abajo a arriba: la capa inferior contenía granulocitos y eritrocitos; la segunda capa contenía el medio de gradiente de densidad; la tercera capa contenía PBMNCs (flecha roja); la capa superior contenía plasma rico en plaquetas. (B) Imágenes de la morfología típica de las células después de que los PBMN se infectaron con SeV en los días 1, 2, 5 y 12. Después de que los PBMN se infectaron con SeV, algunas de las células murieron y el número de células se redujo gradualmente. Un pequeño número de células permanecieron en el día 5. El día 12 surgieron las colonias de iNSCs. Barra de escala, 100 m. (C) La morfología típica de los iNSC del pasaje número 20 en el cultivo monocapa y esfera. Barra de escala, 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Diferenciación de iNSCs a neuronas dopaminérgicas. Tinción inmunofluorescente para FOXA2, TH, TUJ1, DAPI e imágenes combinadas el día 24 en células diferenciadas de los iNSC. Barra de escala, 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Trasplante de precursores da diferenciados por iNSC en modelos unilaterales de ratón PD de 6-OHDA-lesioned. (A) Cronología para trasplante de células y pruebas de comportamiento. (B) Los resultados de las pruebas de comportamiento en diferentes puntos de tiempo del grupo 6-OHDA+células (n a 10), del grupo 6-OHDA+buffer (n a 8) y del grupo de control (n a 3). Los datos se presentan como media - error estándar de la media (SEM). p < 0.001 por análisis bidireccional de varianza (ANOVA) con la prueba de comparación múltiple de Dunnett. (C) Tinción inmunofluorescente post mortem para TH en el estriado, haz de anteceleo medial (MFB) y sustancia nigra (SN) del hemisferio 6-OHDA-leisioned, 6-OHDA+células hemisferio, y grupo de control. Barras de escala, 100 m. (D) Porcentajes de FOXA2/TH, NURR1/TH, GIRK2/TH, TH/HNA en ratones injertados 3 meses después del trasplante. HNA: anticuerpo de núcleos humanos. Los datos se presentan como medias de SEM. (E) Tinción inmunofluorescente para FOXA2, NURR1, GIRK2, TH y HNA en rodajas cerebrales de ratones PD 12 semanas después del trasplante de células. HNA: anticuerpo de núcleos humanos. Esta cifra ha sido modificada de Yuan et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí presentamos un protocolo que cubrió diferentes etapas de la terapia celular iNSC-DA para modelos de DP. Los aspectos críticos de este protocolo incluyen: (1) aislamiento y expansión de PBMNCs y reprogramación de PBMNCs en iNSCs por infección SeV, (2) diferenciación de iNSCs a las neuronas DA, (3) establecimiento de modelos unilaterales de ratón PD 6-OHDA-lesioned y comportamiento evaluación, y (4) trasplante de células de precursores de la DA y evaluación del comportamiento.
En este protocolo, la primera parte consiste en recolectar y ampliar los PBMNC en un medio libre de suero (medio MNC), que expande preferentemente los eritroblastos y no apoya la proliferación de linfocitos. En estudios anteriores, se han reprogramado varios tipos de células somáticas a iPSCs o iNSCs12,13,14. En comparación con otros tipos de células somáticas, los PBMN poseen varias ventajas. La ventaja más significativa son sus patrones favorables de expresión génica y perfiles epigenéticos. Los PBMNAC son in vivo de corta duración y se reponen con frecuencia a partir de células madre hematopoyéticas activadas, y pueden acumular menos mutaciones que los fibroblastos de la piel. Además, la forma de muestrear PBMNCs es menos invasiva que la de los fibroblastos, y se tarda un período de tiempo más corto para expandir los PBMNC (alrededor de 14 días) frente a los fibroblastos (alrededor de 28 días)16,22. Después de la centrifugación usando un medio de gradiente de densidad, se formarán cuatro gradientes de densidad de abajo a arriba; la capa inferior contiene granulocitos y eritrocitos, la segunda capa inferior contiene el medio de gradiente de densidad, la tercera capa contiene MNCs, y la capa superior contiene plasma. El rendimiento de los PBMN normalmente varía entre individuos, particularmente aquellos de diferentes edades. Generalmente, las personas más jóvenes tienden a tener un mayor número de PBMN Que las personas mayores. Con el protocolo descrito, alrededor de 1.8 x 3.4 x 107 PBX podrían aislarse de 15 mL de PB. Entre los PBMNC, las células madre CD34+ hematopoyéticas son relativamente propensas a la reprogramación, y el medio MNC puede enriquecer las células madre CD34+ hematopoyéticas hasta cierto punto. Se espera que un número igual o mayor de células visibles cultivadas con medio MNC permanezcan después de 14 días de expansión. SeV, un virus no integrador de ARN, tiene un genoma no segmentado, de un solo varado y de sentido negativo que no se integra en el genoma del huésped, sino que sólo se replica en el citoplasma de las células infectadas18,19. Los factores recombinantes de reprogramación de codificación SeV OCT3/4, SOX2, KLF4 y c-MYC,se pueden generar como un mutante sensible a la temperatura, que podría eliminarse fácilmente a 39 oC20. Con este protocolo, derivamos 8-20 colonias iNSC reprogramando PBMNCs de un voluntario o paciente sano usando 15 mL de PB. Entonces los investigadores podrían seleccionar colonias con buenas morfologías para el paso y el establecimiento de líneas. En el informe publicado, los iNSC de los números de pasaje 10, 20 y 30 mostraron tasas de proliferación similares, y podrían ser repasados más de 50 veces, mostrando una buena auto-renovación y capacidad proliferativa11. los iNSC podrían caracterizarse por ensayos de diferenciación e inmunostaining para los marcadores de células madre neurales SOX2, PAX6, NESTIN y OLIG2, y el marcador proliferativo Ki67. iNSCs deben expresar esos marcadores de células madre neurales y poseer una capacidad de diferenciación para convertirse en TUJ1+, MAP2+ neuronas (después de 6 semanas), GFAP+ astrocitos (después de 6 semanas) y OLIG2+, O1+ oligodendrocitos (después de 7-8 semanas)11. Sin embargo, una limitación de este protocolo es que el medio MNC es preferentemente favorable a la expansión del eritroblosto, lo que puede hacer que no sea adecuado para generar iNSC de pacientes que son deficientes en el desarrollo de eritroblostos. Además, la eficiencia de reprogramar PBX a iNSCs no es alta. Uno puede mejorar la eficiencia de reprogramación mediante el uso de ciertas moléculas pequeñas o aumentar el rendimiento mediante el uso de más PBMNCs iniciales23.
El método sobre la diferenciación de iNSCs en neuronas DA descritos aquí se basa en un gran número de protocolos para la diferenciación neuronal. Como la DP es causada principalmente por la degeneración de las neuronas DA ubicadas en el cerebro medio1,2, el objetivo de los protocolos se centra en la derivación de neuronas VM DA especializadas, que surgen de las células de la placa de suelo durante el desarrollo24. La inducción de células de placa de suelo de VM con potencial neurogénicodepende de dos morfogens clave, SHH y FGF8b6,25,26. SHH es un morfogen ventralizante, secretado por notochord26,27. Aquí reemplazamos SHH con la pequeña molécula SAG1, un agonista de la vía SHH que es más económico que SHH. Además, medio de cultivo neural básico y suplemento (Tablade materiales)son importantes para la supervivencia neuronal y la diferenciación. Con este protocolo, se obtuvieron precursores de DA hacia el final de la primera etapa, y se generaron neuronas DA más maduras al final de la segunda etapa. Aumentar el período de tiempo de la segunda etapa a 40-55 días podría mejorar aún más la proporción de neuronas DA maduras en el cultivo. En la segunda etapa se incluyen el ácido retinoico, BDNF, GDNF, TGF--III, DAPT y campo, que se han demostrado para ser capaz de promover la maduración y supervivencia de la neurona DA. Para probar la eficiencia de los iNSC en la diferenciación en las neuronas DA, se examinaron las células diferenciadas para la expresión de los marcadores NURR1, FOXA2, GIRK2 y TH. En un estudio anterior, al final de la etapa I (día 10), 87,76% y 65,33% células expresaron NUTR1 y FOXA2, respectivamente11. Al final de la etapa II (día 24), el porcentaje de células NURR1+ alcanzó el 95,58% y la proporción de células FOXA2+ alcanzó 77,33%11. En este momento, el 57,23% y el 28,55% de las células fueron positivas para TH y GIRK2, respectivamente11. Al igual que lo que se ha observado para la diferenciación de iPSC hacia las neuronas DA, también existe un lote a la variación de lote/línea a línea para la diferenciación iNSC, que está influenciada por factores como el estado celular, la actividad de las moléculas pequeñas utilizadas y la plasticidad de células madre de diferentes personas. También es digno de mención que un determinante clave de la eficiencia de diferenciación es la densidad celular. Se recomienda una densidad de sembrado de 5 x 103 células por encubridor de vidrio de 12 mm en placas de 24 pocillos. De hecho, los iNSC exhiben una buena tasa proliferativa durante la etapa de diferenciación I. Los iNSC sembrados en un pozo de una placa de 24 pocillos darían lugar a un número suficiente de precursores de DA por diferenciación día 10-13 para el trasplante en un ratón (2 x 105 para cada ratón).
Este protocolo presenta un método para el establecimiento de modelos de ratón PD unilaterales 6-OHDA-lesioned reproducibles y estables. La extensión de la lesión 6-OHDA se puede estimar mediante una evaluación del comportamiento que mide las rotaciones contralaterales después de la inyección de apomorfina. Además, el grado de lesión inducida por 6-OHDA se puede cuantificar mediante la tinción inmunofluorescente post mortem para TH en el SNpc. Otro tipo de neurotoxina utilizada en el modelado de DP es 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tertahydropyridine (MPTP), que también interrumpe las vías dopaminérgicas. En comparación con el MPTP, 6-OHDA podría administrarse de forma uni- o bilateral. Además, el método MPTP es más sensible a la edad animal, el sexo y la cepa y por lo tanto puede mostrar un mayor grado de variación entre los animales28. Los factores críticos incluyen la selección de ratones con peso a juego, la inyección de la solución de 6-OHDA recién preparada y la realización de la cirugía con precisión y rapidez.
Los procedimientos de trasplante celular de precursores de DA en el estriado de ratones lesionados son básicamente los mismos que los procedimientos para la generación de 6-OHDA-lesione-d PD modelos de ratón, excepto que 6-OHDA es reemplazado por precursores DA en el paso de inyección. El factor clave en esta parte es buscar la ventana de tiempo óptima de diferenciación celular DA para el trasplante. Se ha demostrado que un mayor grado de tallo se correlaciona con una mayor tasa de supervivencia, pero un menor potencial de especificación en las neuronas DA maduras11. Sin embargo, una etapa más madura de las células neurales son más vulnerables, y muestran una menor tasa de supervivencia después del trasplante11. Por lo tanto, encontrar un período de tiempo adecuado que equilibre la capacidad de maduración y supervivencia es de importancia. En un estudio anterior, trasplantamos células de diferenciación los días 10 y 13 en el estriado de ratones inmunodeficientes SCID-beige11. Un mes después del injerto, los resultados de tinción inmunofluorescente revelaron que alrededor del 88,63% y el 93,13% fueron TUJ1 positivos para los grupos del día 10 y del día 13, respectivamente, y algunas células TH+ (5,30%) se detectaron desde el grupo del día 13, pero pocas células TH+ del grupo del día 10. Sin embargo, en comparación con el día 13 células, día 10 células dieron lugar a una tasa de supervivencia global ligeramente más alta11. Los resultados revelaron que el día 10 al día 13 es una ventana de tiempo óptima de las células para el injerto11. En este protocolo, utilizamos una mezcla de células DA del día de diferenciación 10 y 13 en una proporción de 1:7 para el injerto, que mostró un buen resultado de la supervivencia y diferenciación11. El uso de una mezcla de células desde el día 10 y el día 13 se basó en una hipótesis de que las células neuronales relativamente inmaduras y maduras, cuando se juntan, pueden apoyarse entre sí, lo que recuerda a la situación in vivo en ratones donde las células madre neurales están rodeadas de neuronas maduras.
Este protocolo presenta el método de generación de iNSCs a partir de PBMNCs por infección SeV, diferenciando iNSCs en neuronas DA, y trasplantando precursores da en modelos de ratón PD 6-OHDA-lesioned. Usando este protocolo, se pueden generar iNSCs con potencial no sólo para el tratamiento de la DP, sino también de otras enfermedades neurodegenerativas. Dado que los ISNc representan una etapa primitiva de NSC, se pueden especificar en diferentes células neuronales específicas de la región, como las neuronas de la médula espinal o las neuronas motoras, que pueden ser de utilidad prometedora para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica o lesión de la médula espinal. Además, los iNSC derivados de pacientes con enfermedades familiares ofrecen una plataforma para estudiar los mecanismos subyacentes al inicio y desarrollo de la enfermedad, y para llevar a cabo pruebas de detección de drogas.
Hay más de una manera de obtener células neuronales de DA para estudios de trasplante. Las celdas DA también se pueden generar a partir de iPSC s o mediante conversión directa29. En comparación con los ISC, los iNSC son inherentes al menor riesgo de formación de tumores, un período más corto de reprogramación y establecimiento de líneas, y la plasticidad comprometida con el linaje - sólo es capaz de diferenciarse en neuronas y glia11. En comparación con la conversión directa, la diferenciación de los precursores de DA de iNSCs da lugar a un mayor rendimiento y eficiencia30.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones: Stem Cell and Translation National Key Project (2016YFA0101403), National Natural Science Foundation of China (81661130160, 81422014, 81561138004), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Beijing Municipal Natural Beijing Talents Foundation (2017000021223TD03), Proyecto de Apoyo a Profesores de Alto Nivel en las Universidades Municipales de Beijing en el Período de 13o Plan Quinquenal (CIT & TCD20180333), Beijing Medical System High Level Talent Award (2015-3-063), Beijing Beijing Fondo Municipal de la Comisión de Salud (PXM 2018_026283_000002), Beijing Cien, Mil y Diez Mil Talentos (2018A03), Beijing Municipal Administration of Hospitals Clinical Medicine Development of Special Funding Support (ZYLX201706), y el Royal Society-Newton Advanced Fellowship (NA150482).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15-ml conical tube | Corning | 430052 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic for inhalation and skin contact |
| 24-well plate | Corning | 3337 | |
| 50-ml conical tube | Corning | 430828 | |
| 6-OHDA | Sigma-Aldrich | H4381 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Cell dissociation reagent |
| Apomorphine | Sigma-Aldrich | A4393 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A92902 | Toxic with skin contact |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | Brain derived neurotrophic factor |
| Blood collection tubes containing sodium heparin | BD | 367871 | |
| BSA | yisheng | 36106es60 | Fetal bovine serum |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dibutyryladenosine cyclic monophosphate |
| CellBanker 2 | ZENOAQ | 100ml | Used as freezing medium for PBMNCs |
| Chemically defined lipid concentrate | Invitrogen | 11905031 | |
| CHIR99021 | Gene Operation | 04-0004 | |
| Coverslip | Fisher | 25*25-2 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417-10mg | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915-100MG | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11330 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320 | |
| Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
| EPO | Peprotech | 100-64-50UG | Human Erythropoietin |
| FGF8b | Peprotech | 100-25 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | P=1.077, density gradient medium |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | Glial derived neurotrophic factor |
| GlutaMAX | Invitrogen | 21051024 | 100 × Glutamine stock solution |
| Ham's-F12 | Gibco | 11765-054 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175079 | Balanced salt solution |
| Human leukemia inhibitory factor | Millpore | LIF1010 | |
| Human recombinant SCF | Peprotech | 300-07-100UG | |
| IGF-1 | Peprotech | 100-11-100UG | Human insulin-like growth factor |
| IL-3 | Peprotech | 200-03-10UG | Human interleukin 3 |
| IMDM | Gibco | 215056-023 | Iscove's modified Dulbecco's medium |
| Insulin | Roche | 12585014 | |
| ITS-X | Invitrogen | 51500-056 | Insulin-transferrin-selenium-X supplement |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | Serum free basal medium |
| Laminin | Roche | 11243217001 | |
| Microsyringe | Hamilton | 7653-01 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| NEAA | Invitrogen | 11140050 | Non-essential amino acid |
| Neurobasal | Gibco | 10888 | Basic medium |
| PDL | Sigma-Aldrich | P7280 | Poly-D-lysine |
| SAG1 | Enzo | ALX-270-426-M01 | |
| SB431542 | Gene Operation | 04-0010-10mg | Store from light at -20? |
| Sendai virus | Life Technologies | MAN0009378 | |
| Sucrose | baiaoshengke | ||
| TGFβ? | Peprotech | 100-36E | Transforming growth factor β? |
| Transferrin | R&D Systems | 2914-HT-100G | |
| Triton X 100 | baiaoshengke | Nonionic surfactant | |
| Trypan blue | Gibco | T10282 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 |
References
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