Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

דור של תאי גזע עצביים מתוך היקפי תאים מונמונומנט ובידול לכיוון תא העצב הפראמינרגיים ללימודי השתלות

Published: July 11, 2019 doi: 10.3791/59690
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Cell Therapy Center, Beijing Institute of Geriatrics, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, and Key Laboratory of Neurodegeneration, Ministry of Education, 2Center of Neural Injury and Repair, Beijing Institute for Brain Disorders

Summary

הפרוטוקול מציג את התיכנות מראש של תאים היקפיים דם מונפקוף כדי לגרום לתאי גזע עצביים על ידי זיהום וירוס סנדאי, הבידול של iNSCs לתוך הנוירונים הפראים, השתלת ה-DA מקדים לתוך מגירסה חד צדדית מחלת פרקינסון מודלים העכבר, והערכה של הבטיחות והיעילות של הקדם-הלאומית של התובע המחוזי עבור טיפול PD.

Abstract

מחלת פרקינסון (PD) נגרמת על ידי התנוונות של הנוירונים הדוגיים (DA) של הספסטיה הכושי pars (SNpc) ב mesencephalon הגחוני (VM). טיפול החלפת תאים מבטיח הבטחה גדולה לטיפול במשטרה. לאחרונה, המושרה תאי גזע עצביים (iNSCs) התפתחה כמועמד פוטנציאלי לטיפול החלפת תאים בשל הסיכון מופחת של היווצרות הגידול הפלסטיות כדי להצמיח אזור מסוים נוירונים ו גליה. iNSCs ניתן לתכנתו ממקורות סלולריים באופן אוטוולוגי, כגון פיברותקיעות, תאי דם היקפיים (PBMNCs) וסוגים שונים של תאים. בהשוואה לסוגים אחרים של תאים סומטיים, PBMNCs הם סוג של תא starter מושך בשל הקלות לגישה ולהתרחב בתרבות. וירוס סנדאי (צב), וירוס RNA non-אינטגרטיבי, קידוד גורמים מתכנות כולל האדם OCT3/4, SOX2, KLF4 ו c-myc, יש הגיון שלילי, יחיד תקועים, הגנום הלא מקוטע שאינו משתלב לתוך גנום מארח, אבל רק משכפל את הציטופלסמה של תאים נגועים, המציע רכב יעיל ובטוח לתיכנות מראש. במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול שבו iNSCs מתקבלים על ידי מתיכנות מחודש PBMNCs, והבדיל לתוך הנוירונים מיוחדים VM DA על ידי שיטה דו-שלבית. ואז DA-סמנים מושתלים לתוך באופן חד-צדדי 6-הידרודופאמין (6-OHDA)-לגירסה מודלים עכבר המשטרה כדי להעריך את הבטיחות והיעילות לטיפול במשטרה. שיטה זו מספקת פלטפורמה לחקור את הפונקציות וההשפעות הטיפוליות של תאי העצבים הספציפיים של החולה, בתוך מבחנה ובvivo.

Introduction

מחלת פרקינסון (PD) היא הפרעה ניווניות הנפוצה, הנגרמת על ידי ניוון של דואמנרכולינרגיות (DA) נוירונים ב-compacta הכושי pars (SNpc) בבית mesencephalon (VM), עם שכיחות של יותר מ 1% באוכלוסיה על 60 שנים של גיל מיכל בן , 2. בעשור האחרון, טיפול בתאים, מכוון או מחליף את התאים ניווניות או פגומים, או הזנה מיקרואקולוגיה סביב הנוירונים המתנוונת, הראו פוטנציאל לטיפול של PD3. בינתיים, טכנולוגיה התיכנות מחודש עשה התקדמות משמעותית4, אשר מספק מקור הסלולר מבטיח טיפול חלופי. האדם המושרה pluripotent תאי גזע (iPSCs) ותאי גזע עובריים (ESCs) הוכחו להיות מסוגלים להבדיל לתאי העצבים של DA, אשר יכול לשרוד, מורעד, ולשפר את הפונקציות מנוע כאשר מושתל לתוך החולדה ומודלים שאינם אנושיים משטרת הפרימטים5 ,6,7,8. iPSCs מייצגים אבן דרך בטכנולוגיות תכנות הסלולר יש פוטנציאל גדול השתלת תא; עם זאת, יש עדיין חשש לגבי הסיכון של היווצרות הגידול מן התאים הבדיל לחלוטין. מקור הסלולר חלופה עבור השתלת תא היא השושלת מחויבת תאי גזע מבוגרים שהתקבלו באמצעות תכנות ישיר, כגון תאי גזע עצביים המושרה (iNSCs), אשר ניתן נגזר מintermediates לא יציב, עוקף את pluripotency . שלב9,10,11

ניתן לiPSCs גם ממקורות סלולריים באופן אוטוולוגי, כגון פיברותקיעות, תאי דם היקפיים (pbmncs) וסוגים שונים של תאים12,13,14, ובכך להקטין את ה חיסוני של תאים מושתלים במידה רבה. יתר על כן, לעומת iPSCs, iNSCs הם הטבועה בסיכון של היווצרות הגידול השושלת מחויבת פלסטיות, רק מסוגל להבדיל לנוירונים ו glia11. במחקרים הראשוניים, האדם או העכבר iPSCs ו iNSCs נוצרו מפיברופיצוצים שהתקבלו ביופסיה העור, שהוא הליך פולשני14,15. עם כבוד זה, PBMNCs הם מקור מושך התא המתנע בגלל תהליך הדגימה פחות פולשנית, ואת הקלות להשיג מספר גדול של תאים בתוך תקופה קצרה של זמן ההרחבה16. מחקרים ראשוניים התחלתיים מועסקים מערכות מסירה אינטגרטיבית, כגון וקטורים לנטינגיי או retroviral יעיל, אשר יעילים וקל ליישם בסוגים רבים של תאים17; עם זאת, מערכות משלוח אלה עלול לגרום מוטציות וההפעלה מראש של שיורית טרנסגנים, אשר מציגים בעיות בטיחות למטרות טיפוליות קליני12. וירוס סנדאי (צב) הוא וירוס בלתי אינטגרטיבי RNA עם תחושה שלילית, יחיד תקוע הגנום שאינו משתלב לתוך הגנום המארח, אבל רק משכפל את הציטופלסמה של תאים נגועים, המציע רכב יעיל ובטוח עבור תכנות מחודש18 ,19. וקטורים רקומביננטי צב זמינים המכילים גורמים הניתנים לתיכנות כולל האדם OCT3/4, SOX2, KLF4 ו -c-myc במסגרות הקריאה פתוח שלהם. בנוסף, ניתן לשפר היתר וקטורים ויראליים על-ידי החדרת מוטציות רגישות לטמפרטורה, כך שניתן יהיה להסירו במהירות כאשר טמפרטורת התרבות מורמת ל-39 ° c20. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול כדי לתכנת מיתכנת PBMNCs לiNSCs באמצעות מערכת צב.

מחקרים רבים דיווחו על הנגזרת של הנוירונים DA של האדם escs או iPSCs באמצעות שיטות שונות6,8,21. עם זאת, יש מחסור של פרוטוקולים המתארים את הבידול של הנוירונים DA מ iNSCs בפרטים. בפרוטוקול זה, נתאר את הדור היעיל של נוירונים DA מ iNSCs באמצעות שיטה דו-שלבית. הסמנים העצביים של DA יכולים להיות מושתלים לתוך הסטריאטום של מודלים של עכבר PD עבור הערכות בטיחות ויעילות. מאמר זה יציג פרוטוקול מפורט המכסה שלבים שונים מדור של תאי גזע עצביים המושרה על ידי וירוס סנדאי, הבידול של iNSCs לתוך הנוירונים DA, הקמת מודלים של משטרת העכבר, להשתלה של הקדם-סמנים של DA לתוך הסטריאטום של דגמי המשטרה. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן ליצור iNSCs מפני חולים ותורמים בריאים ולהפיק הנוירונים DA כי הם בטוחים, standardizable, מדרגי והומוגנית עבור מטרות השתלת תאים, או עבור מידול המשטרה בצלחת וחקירה של המנגנונים התפתחות המחלה הבסיסית ופיתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

על כל ההליכים לפעול לפי ההנחיות של ועדת האתיקה של המחקר האנושי המוסדי. הסכמה מושכלת חייבת להתקבל מחולים או מתנדבים בריאים לפני איסוף הדם. פרוטוקול זה אושר על ידי ועדת האתיקה של המחקר האנושי של המוסד ובוצע על פי הנחיות המוסד לטיפול ולשימוש בבעלי חיים.

1. איסוף, בידוד והתרחבות מסכת PBMNCs

  1. אוסף PBMNCs
    1. איסוף 10-20 מ ל של דם ורידי היקפי של התורם על ידי אמת עם בקבוקון משמר הפארין נתרן.
      הערה: יש לאחסן או לשלוח דגימות דם בטמפרטורת החדר (RT). . לעבד את דגימות הדם בתוך 24 שעות
  2. הכנת מדיום לתרבות
    1. הכנת סרום בינוני חופשי (SFM) על-ידי שילוב הרכיבים הבאים: 245 mL של המדיום של החברה הישנה של מדינת בינקוב (IMDM), 240 mL של ה-F-12 של Ham, 5 מ ל של אינסולין-transferrin-(ה-X), 5 מ ל של פתרון מניות גלוטמין של 100x חומרים), 5 מ ל של תרכיז כימית המוגדרים ליפיד, 2.5 g של סרום של שור עוברי, 0.025 g של חומצה אסקורבית 9 μL של 1-thioglycerol. סנן את המדיום ואחסן אותו ב-4 ° c.
      התראה: חומצה אסקורבית ו-1-תאיוגלינול רעילים באמצעות מגע ואינהלציה של העור.
    2. כדי להכין תא מונחדרור (mnc) מדיום, תוספת בינונית sfm עם 10 ng/ml האדם אינטרלויקין 3 (IL-3), 2 U/ml אריתרופויאטין (אריתרופואיטין), 100 ng/ml תא גזע האדם גורם (scf), 40 ng/ml מקדם האדם אינסולין כמו פקטור 1 (IGF-1), 100 μg/ml-transferrin-מועבר 1 . זה בסדר. סנן את המדיום ואחסן אותו ב-4 ° c.
      הערה: הכן את המדיום מיד לפני השימוש.
  3. בידוד של PBMNCs
    1. אולטרה סגול-לחטא ספסל נקי לפני השימוש. לחטא את כל המשטחים והציוד עם 75% אלכוהול. לחטא את כל הטיפים באמצעות החיטוי.
    2. העבר את דם היקפי (PB) לתוך שפופרת חרוט 50 mL ולדלל את PB עם נפח שווה של תמיסת מלח מוזרמת פוספט באגירה של דולקבקו (D-PBS).
    3. הכינו 15 מ ל של מעבר בינוני בצפיפות (שולחנות חומרים) ב-50 ml אחר.
      הערה: שמור על מעבר הדחיסות הבינוני ו-PB ב-RT כדי לאפשר בידוד טוב יותר של PBMNCs.
    4. הטה את צינור החרוט המכיל את המדיום מעבר הצבע בזווית 45 °, ולאחר מכן לאט ובזהירות להניח 30 מ ל של PB מדולל על מעבר בינוני הצפיפות.
      הערה: שמור על עצמך והרשה ל-PB לרוץ באיטיות לצד הצינורית החרות אל השכבה הבינונית של מעבר הדחיסות. תאי דם אדומים. מתפקדות בתחתית הצינור הטה את השפופרת בזהירות כדי למזער את השיבוש של ממשק השכבה.
    5. צנטריפוגה את הצינורות ב 800 x g עבור 15 דקות ב-RT עם בלם צנטריפוגה להגדיר ב "off" מיקום. מנושף את שכבת הפלזמה הצהובה ומתעלם ממנה. לאחר מכן להעביר את שכבת הסרט הלבן מעונן דק המכיל MNCs עם הצינור 10 מ ל החדש 50 mL חרוט.
      הערה: החלפת הבלמים של הצנטריפוגה חשובה לבידוד של MNCs.
    6. הוסף 30 מ ל של D-PBS לצינור עם MNCs ו צנטריפוגה ב 600 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. מחק את הסופרנטאנט ולאחר מכן הוסף 45 mL של D-PBS כדי להשעות מחדש את התאים. צנטריפוגה ב 400 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
      הערה: על בלם הצנטריפוגה להיות מופעל עבור הצעדים הצנטריפוגה הבאים. כמו כדורי התא צפוף, להוסיף 1-2 mL של D-PBS כדי להשעות בעדינות מחדש את כדורי, ולאחר מכן להוסיף D-PBS כדי 45 mL.
    7. השמט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את התאים עם 5 מ ל של D-PBS וספור את התאים החיים בשיטת ההדרה הכחולה.
    8. לאחר הגדרת הכיוון של MNCs לצורך הרחבה, הקפא התאים הנותרים לשימוש עתידי.
      הערה: לפחות 5 x 106 mncs יכול להיות קפוא בבקבוקון אחד עם 1 מ ל של הקפאה בינונית (טבלת חומרים). הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.
  4. התפשטות מחשבי MNCs
    1. ביום 14, זרעים MNCs בצפיפות של 2-3 x 106 תאים למילי ליטר בבאר אחת של שש-טוב צלחות עם 1.5 mL של טרום מחומם (37 ° c) mnc בינונית. מודטה ב 37 ° c, 5% CO2 עבור 2 ימים.
    2. ביום -11, לאסוף את התאים בינונית עם הצינורות העקרים ולהעביר לצינור חדש 15 מ ל חרוט. צנטריפוגה את התאים ב 250 x g עבור 5 דקות ב-RT. להיפטר הסופרנטנט ולהשעות מחדש את התאים ב 1 מ ל של מחומם מראש (37 ° c) mnc בינונית.
    3. . תספור את התאים הפעילים עם טריכאז כחול הזרע MNCs בצפיפות של 1 x 106 תאים למילי ליטר בינוני מחומם מראש mnc ו דגירה ב 37 ° c, 5% CO2 עבור 3 ימים.
      הערה: מומלץ להקטין את המספר הכולל של התאים ביום -11.
    4. ביום 8, חזור על שלבים 1.4.2-1.4.3 ותרבות התאים במשך 3 ימים.
    5. ביום 4, חזור על שלבים 1.4.2-1.4.3 ותרבות התאים במשך 3 ימים.
      הערה: לאחר 14 ימי תרבות, על מספר שווה או גדול יותר של MNCs להישאר בתרבות.

2. תכנות משני של PBMNCs ל iNSCs על ידי מדבקת צב

  1. הכנת מדיום לתמיסה ולתרבות
    1. להכין פתרון מניות פולי-D-ליזין (PDL) על ידי המסת 100 מ"ג של PDL עם 100 mL של H2O כדי ריכוז של 1 מ"ג/ml. החנות ב-20 ° c ב 1 mL.
    2. להכין פתרון מלאי אינסולין על ידי המסת 100 מ"ג של אינסולין 20 מ ל של 0.01 N HCl לריכוז של 5 מ"ג/mL. החנות ב-20 ° c ב 1 mL.
    3. כדי להכין 200 mL של iNSC בסיס בסיסי, לשלב 96 mL של DMEM-F12 ו 96 mL של בינונית בסיסית (טבלה של חומרים) עם 2 מ ל של פתרון מניות גלוטמין 100x, 2 מ ל של חומצת אמינו לא הכרחי (neaa), 2 מ ל N2 תוספת ו 2 מ ל של תוספת B27. הוסף 10 ng/mL רקומביננטי האדם גורם לוקמיה מעכבות, 3 μM CHIR99021 ו-2 μM SB431542 לפני השימוש. סנן את המדיום ואחסן אותו ב-4 ° c.
      הערה: השתמש במדיום בתוך שבועיים. להוסיף רקומביננטי גורם לוקמיה האדם מעכבות, CHIR99021 ו SB431542 מיד לפני השימוש.
  2. תיכנות מראש של PBMNCs ל iNSCs על-ידי דלקת צב
    1. אולטרה סגול-לחטא ספסל נקי לפני השימוש. לחטא את כל המשטחים והציוד עם 75% אלכוהול. לחטא את כל הטיפים באמצעות החיטוי.
    2. ביום 0, לאסוף את התאים בינונית MNC ולהעביר ל 15 מ"ל צינור חרוט. צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 5 דקות. ומכה את סופרנטאנט ולהשעות מחדש את התאים עם 1 מ ל של בינוני מחומם מראש mnc.
    3. . תספור את התאים הפעילים עם טריכאז כחול להשעות מחדש את התאים עם טרום מחומם (37 ° צ') בינונית MNC לריכוז של 2 x 105 תאים לכל טוב בצלחות 24-טוב.
    4. לאחר הסרת צינורות צב מ-80 מעלות צלזיוס, הפשרת הצינורות המכילים את צב ב 37 מרחץ המים של ° c עבור 5-10 s, ולאחר מכן לאפשר להם להפשיר ב RT. . ברגע שהוא הופקר, הניחו אותם בקרח מיד
    5. הוסף את הקידוד צב האדם Klf4, Oct3/4, SOX2 ו-c-MyC לבארות, בריבוי של זיהום (משרד הבית) של 10. תאים צנטריפוגה עם צלחות ב 1,000 x g עבור 30 דקות כדי להקל על הקובץ המצורף של תאים. תשאיר את התאים. והסופר-על בצלחות מניחים את הצלחות בחממה ב 37 ° c, 5% CO2.
      התראה: כל ההליכים הכרוכים ב-צב חייבים להתבצע בארון בטיחות, וכל העצות והצינורות צריכים להיות מטופלים באתנול או אקונומיקה לפני הסילוק.
    6. ביום הראשון, העבירו את המדיום ואת התאים לשפופרת צנטריפוגה של 15 מ ל. לשטוף את הבאר עם 1 מ ל של מדיום MNC. צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 200 x g עבור 5 דקות. ומצח את supernatant ולהשעות מחדש את התאים עם 500 μl של טריים מחומם מראש mnc בינוני בצלחות 24-טוב.
      הערה: השתמש בלוח מצורף נמוך 24-צלחת כדי למנוע החזקה של כל התאים לפני הציפוי PDL/למינציה.
    7. ביום 2, לדלל 1 mL של 1 מ"ג/mL PDL עם 19 מ ל של D-PBS לריכוז של 50 μg/mL. מעיל 6-טוב צלחות עם 50 μg/mL PDL עבור לפחות 2 h ב RT.
    8. לדלל 200 μL של 0.5 mg/mL למינציה עם 20 מ ל של D-PBS לריכוז של 5 μg/mL. מרוקן PDL בצלחות 6-היטב, ויבש על הספסל נקי אנכי.
    9. מעיל 6-צלחת צלחות עם 5 μg/mL למינציה ו-דגירה עבור 4-6 h ב 37 ° c. לשטוף עם D-PBS לפני השימוש.
    10. ביום 3, צלחת התאים המשתמרה שהתקבלו בשלב 2.2.6 במדיום iNSC על PDL/מצופה למינציה 6-צלחות.
      הערה: העבר את הלוחות בעדינות אם יש צורך לאחר שהתאים ממוקמים בלוחות מצופים PDL/למינציה, מנסה לא להפריע להחזקה של התאים.
    11. ביום 5, להוסיף 1 מ ל של טרום מחומם (37 ° c) iNSC בינונית בכל באר 6-היטב צלחות בעדינות.
      הערה: צפוי כי התאים יעברו מוות דרסטי (> 60%).
    12. ביום 7, להוסיף 1 מ ל של טרום מחומם (37 ° c) iNSC בינונית בכל באר 6-היטב צלחות בעדינות.
    13. מיום 9 עד יום 28, החלפת בינונית בילה עם טריים מחומם מראש (37 ° c) iNSC בינונית מדי יום. לעקוב אחר הופעתה של המושבות iNSC. לאסוף ולהעביר שיבוטים iNSC להרחבת כ 2-3 שבועות. לאסוף מושבות עם מורפולוגיה המתאים באמצעות פיפטות זכוכית צרוב, למעט כל התאים מזהם אולי, ו מרפה את המושבות עם 200 μL טיפים.
      הערה: iNSCs מאופיין יכול להיות קפוא לשימוש עתידי עם 2-5 מושבות בבקבוקון אחד. בינונית קופא כולל סרום בינוני חינם בסיס (לוח חומרים) ו diמתיל סולפוקסיד מעורבב ביחס של 9:1, אשר צריך להיות מוכן מיד לפני השימוש. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.

3. הבידול iNSCs לנוירונים

  1. הכנת מדיום לתמיסה ולתרבות
    1. הכינו 200 mL של iNSC בינוני בסיס בינונית על ידי שילוב 192 mL של DMEM F12 עם 2 מ ל של פתרון מניות גלוטמין 100x, 2 מ ל NEAA, 2 מ ל של N2 תוספת 2 מ ל של תוספת B27.
      הערה: השתמש במדיום בתוך שבועיים.
    2. הכנת iNSC בידול שלב אני מדיום על ידי להשלים את הבידול iNSC בינונית בסיס עם 1 μM SAG1 ו 100 ng/mL FGF8b.
      הערה: השתמש במדיום בתוך שבועיים.
    3. להכין iNSC בידול שלב II בינוני על ידי להשלים את בינוני iNSC הבסיס עם 0.5 mM אדנוזין מחזורי monophosphate (מחנה), 0.2 חומצה אסקורבית מ"מ, 10 μM DAPT, 10 ng/mL המוח נגזר neurotrophic פקטור (BDNF), 10 ng/mL הנגזרת מקדם מנוונת (GDNF) ו-1 ng/mL הפיכת גורם הצמיחה βIII (TGF-βIII).
      הערה: השתמש במדיום בתוך שבועיים.
  2. ציפוי מנות התרבות
    1. אולטרה סגול-לחטא ספסל נקי לפני השימוש. לחטא את כל המשטחים והציוד עם 75% אלכוהול. לחטא את כל הטיפים באמצעות החיטוי.
    2. לציפוי PDL, לפחות יום אחד לפני הציפוי מחדש של התאים, לדלל 1 mL של 1 מ"ג/mL PDL עם 19 מ ל של D-PBS לריכוז של 50 μg/mL. מעיל 12 מ"מ שמיכות זכוכית שעברו עיקור עם 75% אלכוהול בצלחות 24-היטב עם 50 μg/mL PDL ב RT עבור לפחות 2 h.
    3. עבור ציפוי למינציה, לדלל 200 μL של 0.5 mg/mL למינציה עם 20 מ ל של D-PBS לריכוז של 5 μg/mL. ומייבשים את הבארות. בספסל הנקי מעיל שמיכות 12 מ"מ עם 5 μg/mL למינציה ו-דגירה עבור 4-6 h ב 37 ° c. לשטוף עם D-PBS לפני השימוש.
  3. תאי מעבר לבידול
    1. כאשר המפגש של iNSCs תרבותי מגיע 70-90%, מחלק בינוני מלוחית התרבות, ולהוסיף 1 מ ל של D-PBS לשטוף את התאים. הוסף 1 מ ל של טרום מחומם (37 ° c) מגיב לדיסוציאציה של תא (טבלת חומרים) לטוב ו-הדגירה ב 37 ° צ' עבור 3 דקות כדי לנתק את התאים.
    2. לאחר דגירה עבור 3 דקות, התאים הפכו למחצה צף; להוסיף 3 מ ל של טרום מחומם (37 ° c) DMEM-F12 בינונית לכל טוב, ו פיפטה תאים למעלה ולמטה כדי לנתק את כדורי התא לתוך תאים בודדים.
    3. העבר תאים לתוך שפופרת של 15 מ"ל, ו צנטריפוגה ב 250 x g עבור 3 דקות. ומכה את supernatant, להשעות מחדש את התאים עם נפח מתאים של טרום מחומם (37 ° c) insc בינונית על פי מספר התאים.
    4. ספור את התאים תוך שימוש בשיטת ההדרה הכחולה. צלחת 5 x 103 תאים לכל 12 מ"מ כיסוי זכוכית ב 24-טוב צלחות ו-דגירה ב 37 ° c, 5% CO2.
  4. להבדיל iNSCs לתוך הנוירונים הדוגיים.
    1. התחל בידול 24 שעות לאחר ציפוי מחדש של התאים על כיסוי PDL/למינציה מצופה. התרבות בינונית, לשטוף את התאים פעם אחת עם D-PBS, ולאחר מכן להוסיף 600 μL של הבמה טרום מחומם הבמה אני בינונית לבאר 24-ובכן לוחיות ו דגירה ב 37 ° צ', 5% CO2.
    2. שנה בינונית מדי יום מיום 1 עד יום 10 בשלב הראשון של בידול.
    3. ביום 10, מנושף את המדיום התרבותי, ושוטף תאים פעם אחת עם D-PBS. הוסף 600 μL של טרום מחומם (37 ° c) בידול שלב II בינונית לכל טוב ב 24-טוב לוחיות ו דגירה ב 37 ° c, 5% CO2.
    4. שנה בינונית מדי יום מיום 11 עד יום 25 בשלב השני של בידול. התאים הבדיל ניתן לתקן על ידי פאראפורמלדהיד בנקודות זמן שונות לניתוח.
    5. עבור מודלי כתמים, לשטוף את התאים עם D-PBS שלוש פעמים בעדינות בנקודות הזמן שנבחרו בתוך היום 11 עד 25.
    6. פיפטה 300 μL של החומר הגולש (טבלת חומרים) לתוך 100 ML של pbs כדי לבצע 0.3% Nonionic מטריסטנט ב-pbs.
      התראה: הגולש הניוניוני רעיל במגע העור ובאינהלציה.
    7. תקן את התאים עם 4% פאראמפורמלדהיד עבור 10 דקות ב RT. ואז לשטוף עם 0.3% ב PBS 3 פעמים.
      התראה: פאראפורמלדהיד רעיל על ידי מגע העור ואינהלציה.
    8. לחסום את התאים על ידי 3% בסרום חמור עבור 2 h ב RT.
    9. לדלל את הנוגדן העיקרי ב 1% בסרום החמור בריכוז המתאים בעדינות קצוצות לערבב. הוסף 300 μL של פתרון הנוגדן העיקרי לכל טוב של צלחת 24. מודפה את התאים ב -4 ° c בלילה. שטוף את התאים עם 0.3% nonionic מסורסטנט ב PBS שלוש פעמים.
    10. לדלל את הנוגדן המשני ב 1% בסרום החמור בריכוז המתאים בעדינות קצוצות לערבב. הוסף 300 μL של פתרון הנוגדן המשני לכל טוב של צלחת 24. דגירה את התאים ב-RT עבור 2 h, מוגן מפני אור.
    11. שטוף את התאים עם 0.3% nonionic מסורסטנט ב PBS שלוש פעמים. לדלל 4, 6-diamidino-2-פנייילידול (DAPI) עם PBS עם 1:500 דילול. מודלת את התאים בכל הבאר של הצלחת 24-באר עם 300 μL של DAPI מדולל עבור 15 דקות ב RT, מוגן מפני אור. שטוף את התאים עם 0.3% nonionic מסורסטנט ב PBS שלוש פעמים.
    12. בעדינות להוציא את הכיסויים של הבארות של צלחות עם מלקחיים. יבש בחושך בן לילה בשעה RT. הר תחת מיקרוסקופ זריחה.

4. הקמת 6-הידרודופאמין חד צדדי (6-OHDA)-לגירסה מודלים של עכבר משטרה

  1. כדי ליצור מודלים העכבר PD עבור השתלת תא, להשתמש בוגרים זכר SCID-בז ' במשקל 20-25 g עבור הזרקת 6-OHDA.
  2. הכנת תרופות לניתוח
    1. הכנת פתרון חומצה אסקורבית 0.2% על ידי המסת 0.2 g של חומצה אסקורבית לתוך 100 mL של תמיסת מלח מעוקר (0.9%) ולאחסן ב-80 ° צ' עד השימוש. ביום הניתוח, לדלל 0.2% חומצה אסקורבית פתרון על ידי 10 פעמים כדי לקבל 0.02% חומצה אסקורבית פתרון.
      הערה: חומצה אסקורבית נוספת כדי למנוע חמצון של 6-OHDA לצורה לא פעילה.
    2. כדי להכין פתרון 6-OHDA, לשקול כמות מתאימה של 6-OHDA לתוך צינור מעוקר 1 mL, ולאחר מכן להוסיף קצת נפח של 0.02% חומצה אסקורבית לעשות 5 μg/μL 6-OHDA פתרון. מערבולת התערובת עד התפרקה. הניחו את השישה על הקרח עד השימוש.
      הערה: 6-OHDA הוא טמפרטורה ורגיש באור. להיזהר להגן על הפתרון מפני אור ולשמור אותו על הקרח לפני השימוש.
  3. להכין ציוד כירורגי עקר על ידי אוטוקלינג לפני הניתוח. נקו את כל הציוד ושטחי המשטח בעזרת אתנול בעת הגדרת המסגרת הסטריאוטקאית. הגדר כלוב שחזור עכבר תחת מנורת חימום.
  4. היערכו ניתוח להקמת דגמי עכברים.
    1. שוקלים כל עכבר, להקליט את המשקל ולחשב את כמות התרופה צריך להיות מנוהל. כל עכבר מקבל 0.5 מ"ג/ק"ג אטרופין 20 דקות לפני התפעול. לכשלו את העכבר עם 80 mg/ק"ג ו 10 מ"ג/ק"ג xylazine.
    2. ניהול 0.5 מ"ג/ק"ג אטרופין על-ידי הזרקת הצפק.
    3. מורדם העכבר עם 80 mg/ק"ג ו 10 מ"ג/ק"ג xylazine על-ידי הזרקת תוך הצפק 20 דקות לאחר הממשל של אטרופין.
    4. . שים את העכבר בתא סגור לאחר 3-5 דקות, העכבר יהיה מורדם עמוקות ללא תגובה צביטה הרגל האחוריות.
      הערה: צפוי שהעכבר שקיבל הרדמה יחוו תקופת עירור.
    5. לגלח את הראש של העכבר ולהחיל משחה העין אריתרומיצין על העיניים של העכבר על הגנה מפני פיתוח כיבים הקרנית.
    6. הניחו את העכבר על המנגנון הסטרטקאני. לתקן את העכבר עם חותכת בארים ראשית. הכנס את כוסות האוזן בצורה נכונה כדי להפוך את ראש העכבר למצב שטוח ומאובטח.
    7. לחטא את ראשו של העכבר עם יוד povidone ואלכוהול איזופרופיל. חותכים חתך משונן (~ 1.5 ס מ) על העור בראש עם להב אזמל, ולחשוף את הגולגולת. התאימו את החותכת bar ופסי האוזן כדי להקטין את ההפרש בין ברז לבין למדא לפחות מ-0.1 מ"מ.
      הערה: ברגמה של העכבר ממוקם בהצטלבות של התפרים ילתית ו משונן, ו למדא היא בהצטלבות של למדואיד והתפרים משונן.
    8. הזיזו לאט והורידו את קצה המחט לכיוון ברזיגמה והתייחסו לברגמה כנקודת אפס. הזז את העצה למיקום עם הקואורדינטות של A/P + 0.5 מ"מ, M/L-2.1 מ"מ יחסית לברגמה. למשוך את הקצה ולסמן את הנקודה. . בחור קטן בתוך הגולגולת
    9. לחלץ 2 μL של 5 μg/μL 6-OHDA פתרון לתוך המיקרו מזרק (טבלת חומרים). להחזיר את המחט לנקודה מסומנת, ולהכניס את המחט D/V-3.2 מ"מ.
    10. הכנס 2 μL של 5 μg/μL 6-OHDA פתרון (10 μg סה כ) בקצב של 1 μL/min. לאחר ההזרקה של 6-OHDA הושלמה, להשאיר את המחט במקום עוד 5 דקות. ואז למשוך את המחט הזריקה לאט.
    11. סגור את החתך עם תפרים ולהחיל משחה העין אריתרומיצין על העיניים של העכבר. לספק 0.5 mL תת-עורי מלוחים כדי למנוע התייבשות, ולהחיל משחה אנטיביוטית ישירות על העור ה.
    12. להסיר את העכבר ממנגנון סטריאוטקמית ולשים אותו בכלוב ההתאוששות. לשים את העכבר בחזרה ולאפשר גישה למזון ולמים עד שהוא חוזר להכרה. לטפל בעכבר עם כאבים במים שתייה יומית לאחר הניתוח עבור 2-3 ימים, ואת המינון המומלץ של איבופרופן הוא 0.03 מ"ג/g של משקל הגוף ליום.
    13. בדוק את העכבר היומי שלאחר הניתוח.

5. הערכה התנהגותית לאחר 6-ממדים חד צדדית

  1. שניים עד שלושה שבועות לאחר הניתוח, לבצע הערכה התנהגותית להערכת סימפטומים PD. שוקלים כל עכבר, להקליט את המשקל שלהם ולחשב את כמות התרופה צריך להיות מנוהל (0.5 מ"ג/ק"ג apomorphine לפני הערכה).
  2. ניהול 0.5 מ"ג/ק"ג apomorphine על ידי הזרקה תת-עורית לפני הערכת ומניחים את העכבר בצילינדר זכוכית.
  3. לאחר 5 דקות הרגלה התקופה, לספור את מספר סבבים וכלי צלעות ביחס לצד הנגע לדקה ולהקליט את פעילותם עם מצלמת וידאו.
  4. עכברים עם שולי צלעות מינוס סיבובים לשעה > 7 סל ד/מינימום נחשבים בהצלחה לגירסה ונבחרו כמועמדים לניסויים בהשתלת תאים. החזר את העכברים לכלובים המגורים לאחר מנוחה של 30 דקות.
    הערה: אם העכבר בוצע בהצלחה, 6-ohda מוזרק העכבר יראה הטיה גדולה יותר בפנותו לכיוון הצד המעיק מאז אגוניסט התובע מפעיל את הstriervated הרגיש מאוד של הצד למעלה בעיקר.
  5. לנהל את ההערכה התנהגותית שבוע לפני ו 2, 4, 6, 8, 12, 16 שבועות לאחר השתלת התאים.

6. השתלת תאים של DA-סמנים

  1. . הכן תא השעיה להשתלה עבור בתאום תא, להשעות 2 x 105 DA הקדם-סמנים מעורב על ידי D10 ו D13 DA מראש ביחס של 1:7 ב 4 μl של 5 g-1 גלוקוז בתמיסה מלח מאוזנת (טבלת חומרים) של מאגר השתלת.
  2. לבצע ניתוח השתלת תא בעקבות ההליכים המתוארים בסעיף 4.4, למעט כי 6-OHDA מוחלף על ידי ההשעיה התא הקודמי או מאגר.
  3. בצע את ההערכה ההתנהגותית 2, 4, 6, 8, 12, 16 שבועות לאחר השתלת התאים של ה-DA-סמנים בעקבות ההליכים המתוארים בסעיף 5. לספור את מספר סיבובים המושרה של apomorphine ביחס לחלק הנגע לדקה ולהקליט את פעילותם עם מצלמת וידאו.
    הערה: לאחר השתלת, שיעור מופחת של סיבובים בעלי צלעות מציע פונקציה משופרת מנוע.
  4. ב 4, 8, 12, ו 16 שבועות לאחר השתלת תא, מבשם העכבר תחת הרדמה עמוקה עם 4% פאראפורמלדהיד עד הגוף של העכבר הופך נוקשה הכבד של העכבר הופך חיוור.
  5. להפריד את המוח של העכבר בעדינות לשים את המוח ב 4% פאראפורמלדהיד ב 4 ° c בלילה.
  6. ביום השני, הכניסו את המוח ל -30% סוכרוז להתייבשות עד שהמוח שוקע למטה.
  7. פורסים את המוח בעובי 40 יקרומטר באמצעות מיקרוטומה הקפאה.
  8. בצע כתמים חיסוני כפי שמתואר בעבר בשלבים 3.4.5-3.4.12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול המכסה בשלבים שונים של טיפול בתאי iNSC-DA לטיפול במודלים PD. ראשית, PBMNCs היו מבודדים והתרחבו, ו מתוכנת מתכנתו לתוך iNSCs על ידי זיהום צב. ייצוג סכמטי של ההליכים עם הרחבת PBMNC ואינדוקציה iNSC מוצג באיור 1. ביום 14, PBMNCs היו מבודדים באמצעות צפיפות מעבר צבע בינונית (טבלה של חומרים). לפני צנטריפוגה, דם מדולל עם ה-PBS ואת מעבר הצבע בינוני בצפיפות הופרדו לשתי שכבות. לאחר צנטריפוגה, ארבע שכבות הדרגתי הופיעו (מלמטה למעלה): השכבה התחתונה הכיל גרנולוציטים ו אריתרופוציטים; השכבה השניה הכילה בינונית מעבר צבע; PBMNCs השלישי הכיל (חץ אדום); השכבה העליונה הכילה פלזמה עשיר טסיות (איור 2א). לאחר 14 ימים של התרחבות, PBMNCs נדבקו צב כיום 0. ביום 1, בינוני עם צב הוסר (איור 2ב'). כפי שמודגם באיור 2ב', צפוי כי מספר התאים הופחת בהדרגה. תאים עברו מוות דרסטי (> 60%) עד יום 5 (איור 2ב'). המושבות iNSC הופיעו ביום 12 בכל המוקדם (איור 2ב). לאחר איסוף והעברת שיבוטים iNSC להרחבת מספר מעברים, המבנה של תאים מוצג באיור 2ג. The iNSCs הראה מורפולוגיה טובה והיה יכול לחדש את עצמו באופן עצמאי במדיום iNSC, או בצורה מונאולייר או כדורים (איור 2ג).

iNSCs יכול להצמיח נוירונים DA באמצעות שיטה דו-שלבית (איור 1). במהלך שלב אחד שנמשך 10 ימים, iNSCs טופלו עם SAG1 ו FGF8b כדי לגרום למפרט של תאים לוחית הרצפה VM עם פוטנציאל נוירוגניים. לאחר מכן טופלו התאים עם חומצה אסקורבית, BDNF, GDNF, מחנה, DAPT, TGF-βIII בשלב השני (איור 1). עם שיטה דו-שלבית זו, ניתן להשיג את מקדם-סמנים של DA לקראת סוף השלב הראשון, ובוגרים יותר הנוירונים DA יכול להיווצר בסוף השלב השני. לאחר 24 ימים של בידול, iNSCs יכול להיות מצוין ביעילות לנוירונים DA כרוב בהם הביע forkhead box A2 (FOXA2), תא העצב-מחלקה ספציפית III β-טובולין (TUJ1) ו טירולי הידרוקסילז (ה) (איור 3).

שלושה שבועות לאחר הקמתה של מודלים חד-צדדיים של משטרת העכבר 6-OHDA-lesioned הערכה התנהגותית נערכה כדי להעריך את הסימפטומים PD (איור 4א). ואז שבוע לאחר מכן, מקדים הדוגיים היו מושתלים מודלים עכבר המשטרה (איור 4א). הערכה התנהגותית בוצעה שבוע לפני ו 2, 4, 6, 8, 12 שבועות לאחר השתלת תא (איור 4א). העכברים שקיבלו השתלת תאים הראו שיפור משמעותי בתפקוד המנוע (איור 4ב). במידה של 6-OHDA-המושרה יכול להיות מאומת על ידי לאחר מנתיחה לאחר המוות החיסונית לאחר הניתוח בתוך הסטריאטום, צרור המוח המדיאלי (MFB) ו SNpc (איור 4ג). האותות ה-חיוביים בעכברים מנופה התגלו מאוד בסטריאטום שבו התאים הושתל והתאושש במקצת ב SNpc (איור 4ג). שלושה חודשים לאחר ההשתלה, כ 13.84% היו TH+ DA נוירונים בקרב תאים ששרדו (איור 4D, E). כ 91.72% ו 86.76% של TH+ תאים הביעו קולטן גרעינית יתום (NURR1) ו FOXA2, בהתאמה (איור 4ד, E). כ 98.77% של התאים TH+ היו מסומנים עם G-חלבון-בשילוב מיישר האשלגן (GIRK2) (איור 4ד, E).

Figure 1
איור 1 : ייצוג סכמטי של הליכים בנוגע להרחבת PBMNC, אינדוקציה iNSC והבידול של iNSCs לתוך מקדים. PBMNCs היו מבודדים והורחב בינונית MNC במשך 14 ימים, ולאחר מכן נגוע צב SOX2 האדם קידוד , OCT3/4, c-MYC ו KLF4. מושבות iNSC התפתחה כבר 12 ימים לאחר הידבקות צב. לאחר 3-4 שבועות, המושבות iNSC נאספו והובלו לתוך מקדם הסמנים של DA על ידי שיטה דו-שלבית. מערכות: דם היקפי תאים מונפאליים; MNC: תאים מונחדרורים; iNSCs: המושרה תאי גזע עצביים; צב: וירוס סנדאי; התובע המחוזי; PDL: פולי-D-ליזין; BDNF: המוח נגזר neurotrophic פקטור; GDNF: קו התאים גלאל-נגזר neurotrophic פקטור; AA: חומצה אסקורבית; מחנה: dibutyryladenosine מחזורי monophosphate; TGF: שינוי גורם הגדילה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : Pbmncs מבודדים ומורחבים, ולאחר מכן מתוכנת לתוך iNSCs על ידי זיהום צב. (א) דוגמה של PBMNCs לפני ואחרי הדרגתי צנטריפוגה. לפני שצנטריפוגה, דגימות דם מדולל ובינוני מעבר הצבע הופרדו לשתי שכבות. לאחר צנטריפוגה, ארבע שכבות הדרגתי צפיפות שנוצרו מלמטה למעלה: השכבה התחתונה הכיל גרנולוציטים ו אריתרופוציטים; השכבה השנייה הכילה את המדיום מעבר הצבע; השכבה השלישית הכילה PBMNCs (חץ אדום); השכבה העליונה הכילה פלזמה עשיר טסיות. (ב) תמונות של מורפולוגיה טיפוסית של תאים לאחר PBMNCs נדבקו צב בימים 1, 2, 5, ו 12. לאחר PBMNCs נדבקו צב, כמה תאים מתו ואת מספר התאים הופחת בהדרגה. מספר קטן של תאים נותר ביום 5. , ביום 12. הiNSCs המושבות הופיעו סרגל בקנה מידה, 100 μm. (ג) מורפולוגיה טיפוסית של iNSCs מעבר מספר 20 בתרבות המונאולייר והספירה. סרגל בקנה מידה, 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : הבידול של iNSCs לנוירונים הדוגיים. Immunofluorescent כתמים עבור FOXA2, TH, TUJ1, DAPI ותמונות ממוזגות ביום 24 על תאים הבדיל מ-iNSCs. סרגל בקנה מידה, 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : השתלת של iNSC הבדיל DA-סמנים לתוך מודלים חד-צדדיים של משטרת העכבר 6-OHDA-. (א) ציר זמן להשתלה תא ובדיקות התנהגותיות. (ב) תוצאות בדיקות התנהגותיות בנקודות זמן שונות מן הקבוצה 6-ohda + תאים (n = 10), 6-ohda + קבוצת מאגר (n = 8) וקבוצת בקרה (n = 3). נתונים מוצגים כממוצע שגיאה בתקן ± של הממוצע (SEM). p < 0.001 על-ידי ניתוח דו-כיוון של סטיה (ANOVA) עם בדיקת ההשוואה הכפולה של Dunnett. (ג) מורתמים לאחר לאחר המוות לאחר הספירה בסטריאטום, צרור המוח המדיאלי (mfb) והטריטיה הכושי (SN) של 6-ohda-לייבל, 6-ohda + כדוריות האמצע וקבוצת הבקרה. סרגלי קנה מידה, 100 μm. (ד) אחוזי הFOXA2/TH, NURR1/תאנון, GIRK2/TH, תאנון/חנה ב-מנופה של עכברים 3 חודשים לאחר ההשתלה. חנה: נוגדן גרעיני אנושי. נתונים מוצגים כממוצע ± SEM. (E) אימונוofor, כתמים עבור FOXA2, NURR1, GIRK2, TH ו-חנה על פרוסות המוח מעכברים PD 12 שבועות לאחר השתלת תא. חנה: נוגדן גרעיני אנושי. דמות זו שונתה מיואן ואח '11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן הצגנו פרוטוקול שכיסה בשלבים שונים של טיפול בתאי iNSC-DA עבור דגמי PD. היבטים קריטיים של פרוטוקול זה כוללים: (1) בידוד והתרחבות של PBMNCs ותכנות משנה של PBMNCs לתוך iNSCs על-ידי זיהום צב, (2) הבחנה של iNSCs כדי הנוירונים DA, (3) הקמתה של 6-OHDA-לישה מודל העכבר מודלים התנהגותיים הערכה, ו (4) השתלת תאים של הערכה מראש והערכת התנהגותית.

בפרוטוקול זה, החלק הראשון כרוך באיסוף והרחבה של PBMNCs במדיום ללא סרום (MNC medium), אשר מעדיף להרחיב את האריטבלסטומה ואינו תומך בהתפשטות לימפוציט. במחקרים קודמים, מספר סוגי תאים סומאטיים התכנתו לiPSCs או iNSCs12,13,14. בהשוואה לסוגים אחרים של תאים סומטיים, PBMNCs בעלי מספר יתרונות. היתרון המשמעותי ביותר הוא ביטוי גנים נוחים שלהם דפוסי הפרופילים אפיגנטיים. PBMNCs הם קצרי חיים ב vivo ו מתחדש לעתים קרובות מופעל בתאי גזע מופעלים, והוא עשוי לצבור פחות מוטציות מאשר העור פיברותקיעות לעשות. כמו כן, הדרך לדגום pbmncs היא פחות פולשנית מאשר לפיברותקיעות, וזה לוקח תקופה קצרה יותר של זמן כדי להרחיב pbmncs (בערך 14 ימים) לעומת פיברובולים (סביב 28 ימים)16,22. לאחר צנטריפוגה באמצעות בינוני מעבר צבע צפיפות, ארבעה מעברי צפיפות ייווצר מלמטה למעלה; השכבה התחתונה מכיל גרנולוציטים ו אריתרופוציטים, השכבה התחתונה השנייה מכיל את הצפיפות מעבר הצבע בינוני, השכבה השלישית מכילה MNCs, ואת השכבה העליונה מכיל פלזמה. התשואה של PBMNCs בדרך כלל משתנה בין אנשים, במיוחד אלה של גילאים שונים. בדרך כלל, אנשים צעירים נוטים להיות בעלי מספר רב יותר של PBMNCs מאשר אנשים מבוגרים. עם הפרוטוקול המתואר, כ 1.8-3.4 x 107 pbmncs יכול להיות מבודד מ 15 מ ל של PB. בין PBMNCs, CD34+ תאי גזע המטפאות נוטים יחסית לתכנות מחודש, ובינוני mnc עשוי להעשיר CD34+ תאי גזע המטפאות במידה מסוימת. הוא צפוי כי מספר שווה או גדול יותר של התאים הגלויים מתורבתים עם בינוני MNC להישאר לאחר 14 ימים של התרחבות. צב, וירוס לא אינטגרטיבי של RNA, יש תחושה שלילית, יחיד תקוע, הגנום לא מקוטע שאינו משתלב לתוך הגנום המארח, אבל רק משכפל את הציטופלסמה של תאים נגועים18,19. רקומביננטי סב קידוד גורמים מתיכנות מחודש OCT3/4, SOX2, KLF4 ו -c-myc, ניתן ליצור כמו מוטציה בטמפרטורה רגישה, אשר ניתן להסירו בקלות ב 39 ° c20. עם פרוטוקול זה, אנו הנגזרים 8-20 iNSC מושבות על ידי תכנות מחודש PBMNCs אחד מתנדב בריא או חולה באמצעות 15 מ ל של PB. לאחר מכן החוקרים יכולים לבחור מושבות עם מורפולוגיות טוב עבור המשך העבר והקמת קו. בדוח שפורסם, iNSCs של מספר מעבר 10, 20, ו 30 הראו שיעורי התפשטות דומים, והוא יכול להיות בעבר יותר מ 50 פעמים, מראה התחדשות עצמית טובה וקיבולת מתרבים11. iNSCs יכול להיות מאופיין על-ידי בידול וכתמים עבור סמנים תא גזע עצביים SOX2, PAX6, NESTIN ו OLIG2, ואת סמן מתרבים Ki67. iNSCs צריך לבטא אותם סמנים תא גזע עצביים בעלי יכולת בידול להיותTUJ1 +, MAP2+ נוירונים (אחרי 6 שבועות), gfap+ אסטרוציטים (אחרי 6 שבועות) OLIG2+, O1+ oligodendrocytes הפוך (אחרי 7-8 שבועות)11. עם זאת, מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא כי בינוני MNC הוא מעדיף באופן מותאם להרחבת אריטרוביאחרון, אשר עשוי להפוך אותו לא מתאים ליצירת iNSCs מחולים שאינם חסרים בפיתוח אריתירוביאחרון. חוץ מזה, היעילות של התיכנות מראש של PBMNCs לiNSCs אינה גבוהה. ניתן לשפר את יעילות התכנות מחודש באמצעות מולקולות קטנות מסוימות או להגדיל את התשואה על ידי שימוש ביותר PBMNCs23.

השיטה לגבי הבידול של iNSCs לתוך נוירונים DA המתואר כאן בונה על מספר רב של פרוטוקולים בידול עצבי. כמו PD נגרמת בעיקר על ידי ניוון של דה נוירונים ממוקם באמצע המוח1,2, מטרת הפרוטוקולים מתמקדת בנגזרת של נוירונים מיוחדים VM DA, אשר נובעים תאים צלחת הרצפה במהלך פיתוח24. אינדוקציה של תאים לוחית הרצפה VM עם פוטנציאל נוירוגניים תלוי בשני מפתח מורגנים, ששש ו FGF8b6,25,26. ששש הוא מורטרגן מורפוגן, המופרש על ידי נוטוקורד26,27. כאן החלפנו ששש עם המולקולה הקטנה SAG1, אגוניסט מסלול ששש, כי הוא חסכוני יותר ששש. כמו כן, בסיסי תרבות עצבית בסיסית ותוספת (טבלת חומרים) חשובים להישרדות ובידול עצבי. עם הפרוטוקול הזה, הקדם-סמנים של DA הושגו לקראת סוף השלב הראשון, ובוגרים יותר הנוירונים האלה נוצרו בסוף השלב השני. הגדלת תקופת הזמן של השלב השני עד 40-55 ימים יכול עוד יותר לשפר את היחס של הנוירונים הבוגרים DA בתרבות. כלול בינוני בשלב השני הם חומצה retinoic, BDNF, GDNF, TGF-βIII, DAPT ומחנה, אשר כבר הפגינו כדי להיות מסוגל לקדם את ההבשלה והישרדות של תא העצב. כדי לבדוק את היעילות של iNSCs בידול לתוך נוירונים DA, התאים הבדיל נבדקו לביטוי של סמנים NURR1, FOXA2, GIRK2 ו TH. במחקר קודם, בסוף שלב I (יום 10), 87.76% ו 65.33% תאים הביעו NURR1 ו FOXA2, בהתאמה11. בסוף שלב II (יום 24), אחוז NURR1+ תאים הגיעו 95.58% והיחס של FOXA2+ תאים הגיעו 77.33%11. בשלב זה, 57.23% ו 28.55% תאים היו חיוביים עבור TH ו GIRK2, בהתאמה11. בדומה למה שנצפה עבור הבדלה iPSC לקראת הנוירונים DA, אצווה על אצווה/קו וריאציה קו לבידול iNSC גם קיים, אשר מושפע על ידי גורמים כגון המדינה התא, הפעילות של מולקולות קטנות בשימוש, ואת הפלסטיות של תאי גזע מאנשים שונים. זה גם ראוי לציין כי דטרמיננטה מפתח של יעילות הבידול היא צפיפות התא. צפיפות הזריעה של 5 x 103 תאים לכל 12 מ"מ שמיכות זכוכית ב 24-טוב צלחות מומלץ. למעשה, iNSCs מוצג שיעור מתרבים טוב במהלך הבדלה בשלב I. INSCs שנזרע בבאר אחת של הצלחת 24-באר יהיה לעלות על מספר מספיק של המאה העשרים הקדם על ידי בידול יום 10-13 על השתלת לתוך עכבר אחד (2 x 105 עבור כל עכבר).

פרוטוקול זה מציג שיטה להקמת מודלים של עכברים חד צדדיים מדגם 6-OHDA. היקף הנגע 6-OHDA יכול להיות מוערך על ידי הערכה התנהגותית המודד את הסיבובים המונכים לאחר ההזרקה של apomorphine. כמו כן, מידת הנגעים 6-OHDA המושרה ניתן לכמת על ידי לאחר מנתיחה לאחר המוות החיסונית עבור TH ב SNpc. סוג אחר של רעלן עצבי משמש מידול המשטרה הוא 1-מתיל-4-פניקסיל-1, 2, 3, 6-tertahydropyridine (MPTP), אשר גם משבש את המסלולים הדואמיריגיים. לעומת MPTP, 6-OHDA יכול להיות מנוהל חד או בקיעים. כמו כן, שיטת MPTP רגישה יותר לגיל החיות, למין ולמתח, ולכן עשויה להראות מידה גבוהה יותר של וריאציה בין בעלי החיים28. הגורמים הקריטיים כוללים בחירת עכברים בעלי משקל תואם, הזרקת הפתרון הטרי 6-OHDA וניתוח ביצוע במדויק ובמהירות.

ההליכים של השתלת תאים של DA מקדים לתוך הסטריאטום של עכברים לגירסה בעצם זהה להליכים עבור דור של מודלים של משטרת התנועה 6-OHDA-למשל, למעט כי 6-OHDA מוחלף על ידי הקדם-סמנים בשלב ההזרקה. הגורם העיקרי בחלק זה הוא חיפוש בחלון הזמן האופטימלי של בידול התא DA עבור השתלת. זה כבר הוכיח כי רמה גבוהה יותר של כוסות מתאים עם שיעור הישרדות גבוה יותר, אבל הפוטנציאל הנמוך של מפרט לתוך בוגרת נוירונים DA11. עם זאת, שלב בוגר יותר של תאים עצביים פגיעים יותר, ולהראות שיעור הישרדות נמוך לאחר השתלת11. לכן, למצוא חלון זמן מתאים המאזן את היכולת של התבגרות והישרדות הוא משמעותי. במחקר הקודם, אנו מושתלים תאים של בידול יום 10 ו -13 לתוך הסטריאטום של עכברים SCID-בז לקויה11. חודש לאחר שחרט את התוצאות, התוצאה המכתימה של מיכלי החיסונית התגלתה כי כ-88.63% ו 93.13% היו TUJ1-חיוביים ליום 10 ויום 13 קבוצות, בהתאמה, וכמה TH+ תאים (5.30%) זוהו מתוך יום 13 קבוצה אך מספר תאים בלבד מיום 10 הקבוצה. אף על פי כן, בהשוואה ליום 13 תאים, יום 10 התאים הוליד שיעור מעט גבוה יותר הישרדות כללית11. התוצאות התגלו כי היום 10 עד יום 13 הוא חלון זמן אופטימלי של תאים עבור העפיב11. בפרוטוקול זה, השתמשנו בתערובת של תאי ה-DA מיום הבידול 10 והיום ה -13 ביחס של 1:7 עבור העפילה, שהראה תוצאה טובה של הישרדות ובידול11. באמצעות תערובת של תאים מיום 10 ויום 13 התבססה על השערה כי תאים עצביים בוגרים בוגרת יחסית, כאשר מכניסים יחד, יכול לתמוך זה בזה, מזכיר את המצב vivo בעכברים שבו תאי גזע עצביים מוקפים נוירונים בוגרים.

פרוטוקול זה מציג את השיטה של יצירת iNSCs מ PBMNCs על-ידי זיהום צב, הבחנה iNSCs לתוך הנוירונים DA, ושתילת מראש של DA לתוך 6-OHDA-למעלה מודלים עכבר המשטרה. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן ליצור iNSCs עם פוטנציאל לא רק לטיפול במשטרה, אלא גם של מחלות ניווניות אחרות. מאז iNSCs מייצג בשלב פרימיטיבי המועצה לבטחון לאומי, הם יכולים להיות מצוינים לתוך האזור בתאי עצביים ספציפיים, כגון נוירונים בחוט השדרה או נוירונים מוטוריים, אשר עשוי להיות מבטיח השירות לטיפול בטרשת amyotrophic לרוחב או פציעה בחוט השדרה. חוץ מזה, iNSCs נגזר מחולי מחלה משפחתית להציע פלטפורמה לחקר מנגנונים הבסיסית התפתחות המחלה, ולבצע בדיקות הקרנת סמים.

יש יותר מדרך אחת להשיג תאים עצביים DA עבור לימודי השתלת. תאים DA יכול להיווצר גם מ iPSCs או על ידי המרה ישירה29. לעומת iPSCs, iNSCs הם הטבועות בסיכון מופחת של היווצרות הגידול, תקופה קצרה יותר של תכנות מחודש והקמת קו, ואת השושלת מחויבת פלסטיות-רק מסוגל להבדיל לנוירונים ולגליה11. בהשוואה המרה ישירה, הבחנה DA בשרי מ iNSCs נותן עלייה תשואה גבוהה יותר ויעילות30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

העבודה הייתה נתמכת על ידי המענקים הבאים: תא גזע ותרגום מפתח לאומי (2016YFA0101403), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81661130160, 81422014, 81561138004), הקרן העירונית למדעי הטבע של בייג (5142005), קרן הכשרונות של בייג (2017000021223TD03), פרויקט תמיכה של מורים ברמה גבוהה ב בייג האוניברסיטאות העירוניות בתקופה של חמש עשרה-שנה תוכנית (CIT & TCD20180333), בייג מערכת רפואית ברמה גבוהה פרס כישרון (2015-3-063), בייג המועצה העירונית לבריאות העירייה (pxm 2018_026283_ 000002), בייג 100, אלף, ו 10000 כשרונות קרן (2018a03), המינהל העירוני של בייג של בתי חולים לפיתוח רפואה קלינית של תמיכה במימון מיוחד (ZYLX201706), וה האגודה המלכותית-ניוטון (NA150482).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15-ml conical tube Corning 430052
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M6145 Toxic for inhalation and skin contact
24-well plate Corning 3337
50-ml conical tube  Corning 430828
6-OHDA Sigma-Aldrich H4381
6-well plate Corning 3516
Accutase Invitrogen A11105-01 Cell dissociation reagent
Apomorphine Sigma-Aldrich A4393
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A92902 Toxic with skin contact 
B27 supplement  Invitrogen 17504044
BDNF Peprotech 450-02 Brain derived neurotrophic factor
Blood collection tubes containing sodium heparin BD 367871
BSA yisheng 36106es60 Fetal bovine serum
cAMP Sigma-Aldrich D0627 Dibutyryladenosine cyclic monophosphate
CellBanker 2 ZENOAQ 100ml Used as freezing medium for PBMNCs
Chemically defined lipid concentrate Invitrogen 11905031
CHIR99021 Gene Operation 04-0004
Coverslip Fisher 25*25-2
DAPI Sigma-Aldrich D8417-10mg
DAPT Sigma-Aldrich D5942
Dexamethasone Sigma-Aldrich D2915-100MG
DMEM-F12 Gibco 11330
DMEM-F12 Gibco 11320
Donkey serum Jackson 017-000-121
EPO Peprotech 100-64-50UG Human Erythropoietin
FGF8b Peprotech 100-25
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-02 P=1.077, density gradient medium
GDNF Peprotech 450-10 Glial derived neurotrophic factor
GlutaMAX Invitrogen 21051024 100 × Glutamine stock solution
Ham's-F12 Gibco 11765-054
HBSS Invitrogen 14175079 Balanced salt solution
Human leukemia inhibitory factor Millpore LIF1010
Human recombinant SCF Peprotech 300-07-100UG
IGF-1 Peprotech 100-11-100UG Human insulin-like growth factor 
IL-3 Peprotech 200-03-10UG Human interleukin 3
IMDM Gibco 215056-023 Iscove's modified Dulbecco's medium
Insulin Roche  12585014
ITS-X Invitrogen 51500-056 Insulin-transferrin-selenium-X supplement
Knockout serum replacement Gibco 10828028 Serum free basal medium
Laminin Roche  11243217001
Microsyringe Hamilton 7653-01
N2 supplement  Invitrogen 17502048
NEAA Invitrogen 11140050 Non-essential amino acid
Neurobasal Gibco 10888 Basic medium
PDL Sigma-Aldrich P7280 Poly-D-lysine
SAG1 Enzo ALX-270-426-M01
SB431542 Gene Operation 04-0010-10mg Store from light at -20?
Sendai virus Life Technologies MAN0009378
Sucrose baiaoshengke
TGFβ? Peprotech 100-36E Transforming growth factor  β?
Transferrin R&D Systems 2914-HT-100G
Triton X 100 baiaoshengke Nonionic surfactant
Trypan blue Gibco T10282
Xylazine Sigma-Aldrich X1126

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams-Gray, C. H., et al. The distinct cognitive syndromes of Parkinson's disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort. Brain. 132, Pt 11 2958-2969 (2009).
  2. Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radical Biology and Medicine. 62, 132-144 (2013).
  3. Chen, Z. Cell Therapy for Parkinson's Disease: New Hope from Reprogramming Technologies. Aging and Disease. 6 (6), 499-503 (2015).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  5. Doi, D., et al. Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
  6. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
  7. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12543-12548 (2004).
  8. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  9. Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S. Progress in the reprogramming of somatic cells. Circulation Research. 112 (3), 562-574 (2013).
  10. Tang, X., et al. Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors. Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).
  11. Yuan, Y., et al. Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson's disease model. Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).
  12. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  13. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  14. Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  15. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  16. Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).
  17. Bazley, F. A., et al. Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells. Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).
  18. Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).
  19. Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method. Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).
  20. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).
  21. Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).
  22. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).
  23. Zhu, S., et al. Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds. Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).
  24. Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
  25. Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).
  26. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  27. Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).
  28. Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson's disease. Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).
  29. Sheng, C., et al. Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors. Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).
  30. Prasad, A., et al. A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation. Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).

Tags

ביולוגיה התפתחותית סוגיה 149 מדעי המוח המושרה תאי גזע עצביים מחלת פרקינסון תכנות מחודש בידול השתלת דם היקפיים תאים מונאואליים וירוס סנדאי 6-OHDA נוירונים הדוגיים
דור של תאי גזע עצביים מתוך היקפי תאים מונמונומנט ובידול לכיוון תא העצב הפראמינרגיים ללימודי השתלות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zheng, W., Chen, Z. Generation of… More

Zheng, W., Chen, Z. Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies. J. Vis. Exp. (149), e59690, doi:10.3791/59690 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter