Summary
I protokollet presenteras omprogrammering av perifera mononukleära blodceller för att inducera neurala stamceller av Sendai virusinfektion, differentiering av iNSCs i dopaminerga neuroner, transplantation av DA-prekursorer till den ensidigt-lesioned Musmodeller för Parkinsons sjukdom och utvärdering av säkerheten och effekten av de iNSC-härledda DA-prekursorer för PD-behandling.
Abstract
Parkinsons sjukdom (PD) orsakas av degeneration av dopaminerga (DA) nervceller vid substantia nigra pars compacta (SNpc) i den ventrala mesencephalon (VM). Cell substitutionsterapi har ett stort löfte för behandling av PD. nyligen har inducerad neurala stamceller (iNSCs) vuxit fram som en potentiell kandidat för cell substitutionsterapi på grund av minskad risk för tumör bildning och plasticitet att ge upphov till regionspecifika nervceller och glia. iNSCs kan omprogrammeras från autolodiga somatiska cellulära källor, såsom fibroblaster, perifera mononukleära blodceller (PBMNCs) och olika andra typer av celler. Jämfört med andra typer av somatiska celler, PBMNCs är en tilltalande förrätt celltyp på grund av den lätthet att komma åt och expandera i kulturen. Sendai virus (SeV), en RNA icke-integrativ virus, kodning omprogrammering faktorer inklusive Human OCT3/4, SOX2, KLF4 och c-MYC, har en negativ känsla, enkelsträngad, icke-segmenterade genomet som inte integreras i värd arvsmassa, men bara replikat i cytoplasman hos infekterade celler, som erbjuder ett effektivt och säkert fordon för omprogrammering. I den här studien beskriver vi ett protokoll där iNSCs erhålls genom omprogrammering av PBMNCs, och differentieras till specialiserade VM DA-neuroner genom en tvåstegs metod. Sedan DA prekursorer transplanteras in ensidigt 6-hyroxydopamin (6-OHDA)-lesioned PD musmodeller för att utvärdera säkerhet och effekt för behandling av PD. Denna metod ger en plattform för att undersöka de funktioner och terapeutiska effekterna av patientspecifika DA neurala celler in vitro-och in vivo.
Introduction
Parkinsons sjukdom (PD) är en vanlig neurodegenerativ sjukdom, orsakad av degeneration av dopaminerga (DA) nervceller vid substantia nigra pars compacta (SNpc) i ventrala mesencephalon (VM), med en prevalens av mer än 1% i befolkningen över 60 års ålder 1 , 2. under det senaste decenniet, cellterapi, som syftar till att antingen ersätta de degenerativa eller skadade celler, eller näring mikromiljön runt degenererade neuroner, har visat potential i behandling av PD3. Samtidigt har omprogrammeringsteknik gjort betydande framsteg4, vilket ger en lovande cellulär källa för substitutionsterapi. Humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) och embryonala stamceller (ESCs) har visat sig kunna differentiera till DA neurala celler, som kan överleva, mognad, och förbättra motoriska funktioner när ympas till råtta och icke-mänskliga primater PD-modeller5 ,6,7,8. iPSCs utgör en milstolpe i cellulära omprogrammeringstekniker och har en stor potential vid celltransplantation. emellertid, det finns fortfarande en oro över risken för tumör bildning från ofullständigt differentierade celler. En alternativ cellulär källa för celltransplantation är härstamning-engagerade adulta stamceller erhållna genom direkt omprogrammering, såsom inducerade neurala stamceller (iNSCs), som kan härledas från de instabila intermediaterna, som förbigår pluripotensen etapp9,10,11.
Både iPSCs och inscs kan omprogrammeras från autolodiga cellulära källor, såsom fibroblaster, perifera mononukleära blodceller (pbmncs) och olika andra typer av celler12,13,14, vilket minskar Immunogenicitet av transplanterade celler i hög grad. Dessutom, jämfört med iPSCs, iNSCs är inneboende med minskad risk för tumör bildning och härstamning-engagerade plasticitet, endast kunna differentiera till nervceller och glia11. I de första studierna, mänskliga eller mus iPSCs och inscs genererades från fibroblaster erhållits från hudbiopsier, vilket är ett invasivt förfarande14,15. Med detta avseende, PBMNCs är en tilltalande förrätt cell källa på grund av den mindre invasiva provtagning processen, och lätt att få ett stort antal celler inom en kort period av expansionstid16. Inledande omprogrammering studier anställda integrativ leveranssystem, såsom lentivirala eller retrovirala vektorer, som är effektiva och lätta att genomföra i många typer av celler17; dessa leveranssystem kan dock orsaka mutationer och reaktivering av kvarvarande transgener, som utgör säkerhetsfrågor för kliniska terapeutiska ändamål12. Sendai virus (SeV) är en icke-integrativ RNA-virus med en negativ känsla, enkelsträngad arvsmassa som inte integreras i värd arvsmassan, men bara replikat i cytoplasman hos infekterade celler, som erbjuder ett effektivt och säkert fordon för omprogrammering18 ,19. Rekombinanta SeV vektorer finns tillgängliga som innehåller omprogrammering faktorer inklusive Human OCT3/4, SOX2, KLF4 och c-MYC i sina öppna Läs ramar. Dessutom kan SeV virusvektorer förbättras ytterligare genom att införa temperaturkänsliga mutationer, så att de snabbt kan avlägsnas när odlings temperaturen höjs till 39 ° c20. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll för att programmera PBMNCs till iNSCs med hjälp av SeV-systemet.
Många studier har rapporterat härledning av da neuroner från mänskliga ESCs eller iPSCs med hjälp av olika metoder6,8,21. Emellertid, det finns en brist på protokoll som beskriver differentiering av DA neuroner från iNSCs i detaljer. I detta protokoll kommer vi att beskriva den effektiva generationen av DA-neuroner från iNSCs med hjälp av en tvåstegs metod. DA neuronala prekursorer kan transplanteras in i striatum av PD musmodeller för säkerhet och effekt utvärderingar. Denna artikel kommer att presentera ett detaljerat protokoll som täcker olika stadier från generering av inducerad neurala stamceller av Sendai virus, differentiering av iNSCs i DA neuroner, inrättande av mus PD-modeller, till transplantation av DA prekursorer i striatum av PD-modellerna. Med hjälp av detta protokoll kan man generera iNSCs från patienter och friska donatorer och härleda DA neuroner som är säkra, standardiserade, skalbara och homogena för celltransplantation ändamål, eller för modellering PD i en maträtt och utredning av mekanismerna bakomliggande sjukdomsdebut och utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden måste följa riktlinjerna från den institutionella mänskliga forskningsetiska kommittén. Informerat samtycke måste erhållas från patienter eller friska frivilliga före blod insamling. Detta protokoll godkändes av institutionens etikkommitté för mänskliga forskningsfrågor och utfördes i enlighet med institutionens riktlinjer för skötsel och användning av djur.
1. insamling, isolering och expansion av PBMNCs
- Samling av PBMNCs
- Samla 10-20 mL av givarens perifera venöst blod genom venipunktering med en natriumheparin konserveringsmedel injektionsflaska.
Anmärkning: blodprov ska förvaras eller transporteras i rumstemperatur (RT). Bearbeta blodproven inom 24 timmar.
- Samla 10-20 mL av givarens perifera venöst blod genom venipunktering med en natriumheparin konserveringsmedel injektionsflaska.
- Beredning av odlingssubstrat
- Förbered serumfritt medium (SFM) genom att kombinera följande komponenter: 245 mL av Iscoves modifierade Dulbecco-medium (IMDM), 240 mL skinka F-12,5 mL insulin-transferrin-selen-X-tillägg (ITS-X), 5 mL 100x glutamin stamlösning (tabell över Material), 5 ml kemiskt definierat lipidkoncentrat, 2,5 g fetalt bovint serum, 0,025 g askorbinsyra och 9 μl 1-tioglycerol. Filtrera mediet och förvara det vid 4 ° c.
FÖRSIKTIGHET: askorbinsyra och 1-tioglycerol är giftiga vid hudkontakt och inandning. - Att förbereda mononukleära celler (MNC) medium, komplettera SFM-mediet med 10 ng/mL humant interleukin 3 (IL-3), 2 U/mL erytropoietin (EPO), 100 ng/mL Human stamcells faktor (SCF), 40 ng/mL humant insulin-liknande tillväxtfaktor 1 (IGF-1), 100 μg/mL Holo-transferrin och 1 μM dexametason. Filtrera mediet och förvara det vid 4 ° c.
Anmärkning: Förbered mediet omedelbart före användning.
- Förbered serumfritt medium (SFM) genom att kombinera följande komponenter: 245 mL av Iscoves modifierade Dulbecco-medium (IMDM), 240 mL skinka F-12,5 mL insulin-transferrin-selen-X-tillägg (ITS-X), 5 mL 100x glutamin stamlösning (tabell över Material), 5 ml kemiskt definierat lipidkoncentrat, 2,5 g fetalt bovint serum, 0,025 g askorbinsyra och 9 μl 1-tioglycerol. Filtrera mediet och förvara det vid 4 ° c.
- Isolering av PBMNCs
- Ultraviolett-sterilisera en ren bänk före användning. Sterilisera alla ytor och utrustning med 75% alkohol. Sterilisera alla tips med hjälp av en autoklav.
- Överför det perifera blodet (PB) till ett 50 mL koniskt rör och späd ut PB med en lika mängd steril Dulbecco fosfat-buffrad saltlösning (D-PBS).
- Förbered 15 mL steriliserad densitet gradient medium (tabeller av material) i en annan 50 ml koniskt rör.
Obs: Håll densitetsgradienten medium och PB vid RT för att möjliggöra bättre isolering av PBMNCs. - Luta det koniska röret som innehåller densitetsgradienten i en vinkel på 45 ° och sedan långsamt och försiktigt lägga 30 mL utspädd PB på densitetsgradientmediet.
Obs: var försiktig och låt PB sakta köra ner på sidan av det koniska röret till densitetsgradienten medium skiktet. Röda blodkroppar kommer att sätta in till botten av röret. Luta röret försiktigt för att minimera störningar i lager gränssnittet. - Centrifugera rören vid 800 x g i 15 min vid RT med centrifugbromsen inställd på "off" läge. Aspirera det gula, övre plasma skiktet och kassera det. Överför sedan det vita grumliga tunna film skiktet som innehåller MNCs med en 10 mL pipett till ett nytt 50 mL koniskt rör.
Anmärkning: byte av centrifug broms är viktigt för isolering av mnk. - Tillsätt 30 mL D-PBS till röret med MNCs och centrifugera vid 600 x g i 10 min vid 4 ° c. Kassera supernatanten och tillsätt sedan 45 mL D-PBS för att Återsuspendera cellerna. Centrifugera vid 400 x g i 10 min vid 4 ° c.
Centrifugbromsen skall slås på för detta och följande centrifugeringssteg. Som cell pellets är täta, tillsätt 1-2 mL D-PBS att försiktigt åter avbryta pellets, och sedan lägga till D-PBS till 45 mL. - Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna med 5 mL D-PBS och räkna de levande cellerna med den blå undantags metoden trypan.
- Efter att avsätta MNCs behövs för expansion, frysa de återstående cellerna för framtida användning.
Obs: minst 5 x 106 mncs kan frysas i en injektionsflaska med 1 ml frys medium (tabell över material). Protokollet kan pausas här.
- Expansion av MNCs
- På dag-14, Seed MNCs på en densitet av 2-3 x 106 celler per milliliter i en brunn av sex-well tallrikar med 1,5 ml förvärmda (37 ° c) MNC medium. Inkubera vid 37 ° c, 5% CO2 för 2 dagar.
- På dag-11, samla in cellerna och mediet med en steriliserad pipett och överför till ett nytt 15 mL koniskt rör. Centrifugera cellerna vid 250 x g i 5 minuter vid RT. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 1 ml förvärmt (37 ° c) MNC-medium.
- Räkna de livskraftiga cellerna med trypan blå. Seed MNCs på en densitet av 1 x 106 celler per milliliter i FÖRVÄRMDA MNC medium och inkubera vid 37 ° c, 5% Co2 för 3 dagar.
Observera: det förväntas att det totala antalet celler kan minska på dag-11. - På dag-8, upprepa steg 1.4.2-1.4.3 och odla cellerna i 3 dagar.
- På dag-4, upprepa steg 1.4.2-1.4.3 och odla cellerna i 3 dagar.
Obs: efter 14 dagar av kultur, bör ett lika eller större antal multinationella företag kvar i kulturen.
2. omprogrammering av PBMNCs till iNSCs av SeV-infektion
- Beredning av lösning och odlingssubstrat
- Förbered en Poly-D-lysin (PDL) stamlösning genom upplösning 100 mg PDL med 100 mL H2O till en koncentration av 1 mg/ml. Förvara vid-20 ° c i 1 mL-aliquots.
- Bered en insulin stamlösning genom att lösa upp 100 mg insulin i 20 mL 0,01 N HCl till en koncentration av 5 mg/mL. Förvara vid-20 ° c i 1 mL-aliquots.
- För att förbereda 200 mL av iNSC basal medium, kombinera 96 mL av DMEM-F12 och 96 mL av bas mediet (tabell över material) med 2 ml 100x glutamin stamlösning, 2 ml icke essentiell aminosyra (neaa), 2 ml av N2 tillägg och 2 ml B27 tillägg. Tillsätt 10 ng/mL rekombinant human leukemi inhibitorisk faktor, 3 μM CHIR99021 och 2 μM SB431542 före användning. Filtrera mediet och förvara det vid 4 ° c.
Obs: Använd mediet inom 2 veckor. Tillsätt rekombinant human leukemi inhibitorisk faktor, CHIR99021 och SB431542 omedelbart före användning.
- Omprogrammering av PBMNCs till iNSCs av SeV-infektion
- Ultraviolett-sterilisera en ren bänk före användning. Sterilisera alla ytor och utrustning med 75% alkohol. Sterilisera alla tips med en autoklav.
- På dag 0, samla in cellerna i MNC medium och överför till ett 15 mL koniskt rör. Centrifugera cellerna vid 200 x g i 5 min. aspirera på supernatanten och återsuspendera cellerna med 1 ml förvärmt MNC-medium.
- Räkna de livskraftiga cellerna med trypan blå. Re-suspendera cellerna med förvärmda (37 ° c) MNC medium till en koncentration av 2 x 105 celler per brunn i 24-well tallrikar.
- Efter avlägsnande av SeV rören från-80 ° c lagring, Tina rören som innehåller SeV i 37 ° c vattenbad för 5-10 s, och sedan låta dem Tina vid RT. När tinat, placera dem på isen omedelbart.
- Lägg till SeV kodning Human Klf4, Oct3/4, SOX2 och c-MYC till brunnarna, på en multiplicity av infektion (Moi) av 10. Centrifugera celler med plattor på 1 000 x g i 30 min för att underlätta fastsättning av celler. Lämna cellerna och supernatanten i plattorna. Placera plattorna i inkubatorn vid 37 ° c, 5% CO2.
FÖRSIKTIGHET: alla procedurer som involverar SeV måste utföras i ett säkerhetsskåp, och alla spetsar och rör bör behandlas med etanol eller blekmedel före bortskaffande. - På dag 1, överför mediet och cellerna till ett 15 mL centrifugeringsrör. Skölj väl med 1 mL MNC-medium. Centrifugera cellsuspensionen vid 200 x g i 5 min. aspirera på supernatanten och återsuspendera cellerna med 500 μl färskt förvärmt MNC-medium i 24-brunn-plattor.
Obs: Använd en låg fäste 24-brunn plattan för att förhindra fastsättning av några celler före plätering på PDL/laminin. - Späd 1 mL 1 mg/mL PDL med 19 mL D-PBS till en koncentration på 50 μg/mL på dag 2. Coat 6-well plattor med 50 μg/mL PDL för minst 2 h vid RT.
- Späd 200 μL av 0,5 mg/mL laminin med 20 mL D-PBS till en koncentration av 5 μg/mL. Aspirera PDL i 6-brunnen tallrikar, och torka på vertikal ren bänk.
- Coat 6-well tallrikar med 5 μg/mL laminin och inkubera för 4-6 h vid 37 ° c. Tvätta med D-PBS före användning.
- På dag 3, platta de omvandade cellerna erhållna i steg 2.2.6 i iNSC medium på PDL/laminin-belagda 6-well plattor.
Anmärkning: flytta plattorna försiktigt om det behövs efter det att cellerna är placerade på PDL/laminin-belagda plattor, försöker att inte störa fastsättning av cellerna. - På dag 5, tillsätt 1 mL förvärmda (37 ° c) iNSC medium i varje brunn i 6-bra plattor försiktigt.
Anmärkning: det förväntas att cellerna kommer att genomgå drastisk död (> 60%). - På dag 7, tillsätt 1 mL förvärmda (37 ° c) iNSC medium i varje brunn i 6-bra plattor försiktigt.
- Från dag 9 till dag 28, Ersätt använt medium med färskt förvärmda (37 ° c) iNSC medium varje dag. Övervaka uppkomsten av iNSC-kolonier. Plocka och överföra iNSC kloner för expansion i ca 2-3 veckor. Plocka upp kolonier med lämplig morfologi med brända glaspipetter, exklusive eventuellt kontaminerande celler, och aspirera kolonierna med 200 μL spetsar.
Anmärkning: den karakteriserade iNSCs kan frysas för framtida bruk med 2-5 kolonier i en injektionsflaska. Frys mediet inkluderar serumfritt basmedium (tabell över material) och dimetylsulfoxid blandat med ett förhållande på 9:1, som bör beredas omedelbart före användning. Protokollet kan pausas här.
3. differentiering av iNSCs till dopaminerga neuroner
- Beredning av lösning och odlingssubstrat
- Förbered 200 mL av iNSC differentiering basal medium genom att kombinera 192 mL av DMEM-F12 med 2 mL 100x glutamin stamlösning, 2 mL NEAA, 2 mL N2 tillägg och 2 mL B27 tillägg.
Obs: Använd mediet inom 2 veckor. - Förbered iNSC differentiering skede I medium genom att komplettera iNSC differentiering basal medium med 1 μM SAG1 och 100 ng/ml FGF8b.
Obs: Använd mediet inom 2 veckor. - Förbered iNSC differentiering steg II medium genom att komplettera iNSC differentiering basal medium med 0,5 mM cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP), 0,2 mM askorbinsyra, 10 μM DAPT, 10 ng/mL Brain härledd neurotrofa faktor (BDNF), 10 ng/mL gliaceller härrör neutrofa faktorn (GDNF) och 1 ng/mL omvandla tillväxtfaktor βIII (TGF-βIII).
Obs: Använd mediet inom 2 veckor.
- Förbered 200 mL av iNSC differentiering basal medium genom att kombinera 192 mL av DMEM-F12 med 2 mL 100x glutamin stamlösning, 2 mL NEAA, 2 mL N2 tillägg och 2 mL B27 tillägg.
- Beläggning av kultur rätter
- Ultraviolett-sterilisera en ren bänk före användning. Sterilisera alla ytor och utrustning med 75% alkohol. Sterilisera alla tips med en autoklav.
- För PDL-beläggning, minst en dag före omplätering av cellerna, späd 1 mL 1 mg/mL PDL med 19 mL D-PBS till en koncentration av 50 μg/mL. Coat 12 mm glas täckplåtar som har steriliserats med 75% alkohol i 24-brunnen plattor med 50 μg/mL PDL vid RT för minst 2 h.
- För laminin-beläggning, späd 200 μL av 0,5 mg/mL laminin med 20 mL D-PBS till en koncentration av 5 μg/mL. Aspirera PDL och torka brunnarna i den rena bänken. Täck 12 mm täckglas med 5 μg/mL laminin och inkubera för 4-6 h vid 37 ° c. Tvätta med D-PBS före användning.
- Passage celler för differentiering.
- När sammanflödet av odlade iNSCs når 70-90%, aspirera medium från odlingsplattan, och tillsätt 1 mL D-PBS för att tvätta cellerna. Tillsätt 1 mL förvärmda (37 ° c) cell dissociationsreagens (tabell över material) per brunn och inkubera vid 37 ° c i 3 minuter för att separera cellerna.
- Efter inkubering i 3 min, cellerna har blivit semi-flytande; Tillsätt 3 mL förvärmd (37 ° c) DMEM-F12 medium per brunn, och Pipettera celler upp och ner för att separera cell pellets till enstaka celler.
- Överför celler till ett 15 mL koniskt rör, och centrifugera vid 250 x g i 3 min. Aspirera supernatanten, Återsuspendera cellerna med lämplig volym förvärmda (37 ° c) INSC-medium enligt antalet celler.
- Räkna cellerna med hjälp av den blå undantags metoden trypan. Tallrik 5 x 103 celler per 12 mm glas täckslip i 24-väl plattor och inkubera vid 37 ° c, 5% Co2.
- Differentiera iNSCs till dopaminerga neuroner.
- Starta differentiering 24 h efter omplätering cellerna på PDL/laminin-belagda täckglas. Aspirera odlingssubstrat, tvätta celler en gång med D-PBS, och tillsätt sedan 600 μL förvärmd differentierings fas i medium per brunn i 24-brunn tallrikar och inkubera vid 37 ° c, 5% CO2.
- Byt medium varje dag från dag 1 till dag 10 under den första fasen av differentiering.
- På dag 10, aspirera på odlingsmediet och tvätta celler en gång med D-PBS. Tillsätt 600 μL förvärmda (37 ° c) differentiering steg II medium per brunn i 24-brunn tallrikar och inkubera vid 37 ° c, 5% CO2.
- Byt medium varannan dag från dag 11 till dag 25 under den andra etappen av differentiering. De differentierade cellerna kan fastställas genom PARAFORMALDEHYD vid olika tidpunkter för analys.
- För immunofluorescensfärgning, tvätta cellerna med D-PBS tre gånger försiktigt vid valda tidpunkter inom differentierings dag 11 till 25.
- Pipettera över 300 μl nonioniskt ytaktivt ämne (tabell över material) i 100 ml PBS för att göra en 0,3% icke-jonaktivt tensid i PBS.
FÖRSIKTIGHET: Nonioniskt ytaktivt ämne är giftigt vid hudkontakt och inandning. - Fixera cellerna med 4% PARAFORMALDEHYD i 10 minuter vid RT. Tvätta sedan med 0,3% i PBS tre gånger.
FÖRSIKTIGHET: PARAFORMALDEHYD är giftig vid hudkontakt och inandning. - Blockera cellerna med 3% Donkey serum för 2 h vid RT.
- Späd den primära antikroppen i 1% Donkey serum vid en lämplig koncentration och försiktigt hackad att blanda. Tillsätt 300 μL av den primära antikroppslösningen till varje brunn på 24-brunnen plattan. Inkubera cellerna vid 4 ° c över natten. Tvätta cellerna med 0,3% nonioniskt ytaktivt ämne i PBS tre gånger.
- Späd den sekundära antikroppen i 1% Donkey serum vid en lämplig koncentration och försiktigt hackad att blanda. Tillsätt 300 μL av den sekundära antikroppslösningen till varje brunn på den 24-välta plattan. Inkubera cellerna vid RT för 2 h, skyddas från ljus.
- Tvätta cellerna med 0,3% nonioniskt ytaktivt ämne i PBS tre gånger. Späd 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) med PBS med 1:500 utspädning. Inkubera cellerna i varje brunn av 24-brunn plattan med 300 μL av utspädd DAPI för 15 min vid RT, skyddas från ljus. Tvätta cellerna med 0,3% nonioniskt ytaktivt ämne i PBS tre gånger.
- Ta försiktigt ut täckglas från brunnar av plattor med tång. Torka i mörker över natten vid RT. Montera under ett fluorescensmikroskop.
4. inrättande av ensidiga 6-hyroxydopamin (6-OHDA)-lesioned PD musmodeller
- För att generera PD-musmodeller för celltransplantation, Använd vuxna manliga SCID-beige möss som väger 20-25 g för 6-OHDA injektion.
- Beredning av läkemedel för kirurgi
- Bered en 0,2% askorbinsyra lösning genom att lösa upp 0,2 g askorbinsyra i 100 mL steriliserad saltlösning (0,9%) och förvara vid-80 ° c fram till användning. På operationsdagen, späd 0,2% askorbinsyra lösning med 10 gånger för att få en 0,02% askorbinsyra lösning.
Anmärkning: askorbinsyra tillsätts för att förhindra oxidation av 6-OHDA till en inaktiv form. - För att förbereda en 6-OHDA lösning, väga lämplig mängd 6-OHDA i en steriliserad 1 mL rör, och tillsätt sedan någon volym av 0,02% askorbinsyra att göra en 5 μg/μL 6-OHDA lösning. Vortexblanda blandningen tills den är upplöst. Placera 6-OHDA på is tills användning.
Anmärkning: 6-OHDA är temperatur och ljuskänslig. Var noga med att skydda lösningen från ljus och hålla den på is innan användning.
- Bered en 0,2% askorbinsyra lösning genom att lösa upp 0,2 g askorbinsyra i 100 mL steriliserad saltlösning (0,9%) och förvara vid-80 ° c fram till användning. På operationsdagen, späd 0,2% askorbinsyra lösning med 10 gånger för att få en 0,02% askorbinsyra lösning.
- Förbered steriliserad kirurgisk utrustning genom autoklav före operationen. Rengör all utrustning och alla ytor med etanol när du ställer in Stereo taxic-ramen. Ställ in en mus återställnings bur under en värmelampa.
- Genomföra kirurgi för att etablera ensidiga 6-OHDA-lesioned musmodeller.
- Väg varje mus, registrera vikten och beräkna mängden läkemedel som behöver administreras. Varje mus får 0,5 mg/kg atropin 20 min före operation. Anesthetize musen med 80 mg/kg ketamin och 10 mg/kg xylazin.
- Administrera 0,5 mg/kg atropin genom intraperitoneal injektion.
- Anesthetize musen med 80 mg/kg ketamin och 10 mg/kg xylazin genom intraperitoneal injektion 20 min efter administrering av atropin.
- Placera musen i en sluten kammare. Efter 3-5 min, musen kommer att vara djupt sövda utan svar på Hind benet nypa.
Obs: det förväntas att musen som har fått anestesi skulle uppleva en excitation period. - Raka huvudet av musen och tillämpa erytromycin ögonsalva på ögonen på musen för skydd från att utveckla korneal sår.
- Placera musen på stereotaxic apparaten. Fixa musen med framtand barer först. Sätt i öronkuddarna korrekt för att göra mus huvudet i en platt och säker position.
- Sterilisera huvudet av musen med povidon jod och isopropylalkohol. Skär en sagittal snitt (~ 1,5 cm) på huvudet huden med en skalpell blad, och exponera skallen. Justera framtand bar och öron stänger för att minska höjdskillnaden mellan bregma och lambda till mindre än 0,1 mm.
Obs: musen bregma ligger i skärningspunkten mellan koronala och sagittal suturer, och lambda är i skärningspunkten mellan lambdoid och sagittal suturer. - Sakta flytta och sänka spetsen på nålen mot bregma och behandla bregma som en nollpunkt. Flytta spetsen till en position med koordinaterna för A/P + 0,5 mm, M/L-2,1 mm i förhållande till bregma. Dra tillbaka spetsen och markera punkten. Burr ett litet hål i skallen.
- Extrahera 2 μL av 5 μg/μL 6-OHDA-lösning i mikrosprutan (tabell över material). Returnera nålen till den punkt som är markerad och sätt in nålen på D/V-3,2 mm.
- Injicera 2 μL 5 μg/μL 6-OHDA-lösning (10 μg totalt) med en hastighet av 1 μL/min. Efter injektion av 6-OHDA är avslutad, lämna nålen på plats för ytterligare 5 min. Dra sedan tillbaka injektionsnålen långsamt.
- Stäng snittet med suturer och tillämpa erytromycin ögonsalva på ögonen på musen. Leverera 0,5 ml saltlösning subkutant för att förhindra uttorkning, och applicera en antibiotisk salva direkt på sys hud.
- Ta bort musen från stereotaxic apparat och Lägg den i återvinnings bur. Sätt tillbaka musen och ge tillgång till mat och vatten tills det återfår medvetandet. Behandla musen med smärtstillande medel i dricksvatten dagligen efter operationen för 2-3 dagar, och en rekommenderad dosering av ibuprofen är 0,03 mg/g kroppsvikt per dag.
- Inspektera musen dagligen efter operationen.
5. beteendemässig bedömning efter ensidig 6-OHDA lesioning
- Två till tre veckor efter operationen, beteende bedömning att uppskatta PD symtom. Väga varje mus, registrera sin vikt och beräkna mängden läkemedel som ska administreras (0,5 mg/kg apomorfin före bedömning).
- Administrera 0,5 mg/kg apomorfin genom subkutan injektion före bedömning och Placera musen i en glascylinder.
- Efter en 5 min tillvänjning period, räkna antalet kontralaterala och ipsilaterala rotationer i förhållande till lesion sida per minut och spela in sin verksamhet med en videokamera.
- Möss med kontralaterala minus ipsilaterala rotationer > 7 rpm/min anses framgångsrikt bort och väljas som kandidater för celltransplantation experiment. Returnera mössen till hus burarna efter 30 minuters vila.
Obs: om musen framgångsrikt bort, 6-ohda injiceras mus kommer att visa en större bias i att vända mot kontralaterala sidan eftersom da-agonist aktiverar jätte känslig denervated striatum av den bort sidan övervägande. - Genomför beteende bedömningen en vecka före och 2, 4, 6, 8, 12, 16 veckor efter celltransplantation.
6. cell transplantation av DA-prekursorer
- Förbered cellsuspensionen för transplantation. För cellengrafation, avbryta 2 x 105 da prekursorer blandat med D10 och D13 da prekursorer vid ett förhållande av 1:7 i 4 μl av 5 g L-1 glukos i balanserad saltlösning (tabell över material) av transplantation buffert.
- Utför cell transplantationskirurgi enligt de procedurer som beskrivs i avsnitt 4,4, förutom att 6-OHDA ersätts med DA prekursor cellsuspension eller buffert.
- Utför beteende bedömningen 2, 4, 6, 8, 12, 16 veckor efter celltransplantation av DA-prekursorer enligt de förfaranden som beskrivs i avsnitt 5. Räkna antalet apomorfin-inducerad kontralaterala rotationer i förhållande till lesionsiden per minut och registrera sin aktivitet med en videokamera.
Anmärkning: efter transplantation, en reducerad hastighet av kontralaterala rotationer tyder på en förbättrad motorisk funktion. - Vid 4, 8, 12, och 16 veckor efter celltransplantation, BEGJUTA musen under djup anestesi med 4% PARAFORMALDEHYD tills kroppen av musen blir stel och levern av musen blir blek.
- Separera hjärnan av mus försiktigt och sätta hjärnan i 4% PARAFORMALDEHYD vid 4 ° c över natten.
- På den andra dagen, sätta hjärnan i 30% sackaros för uttorkning tills hjärnan sjunker till botten.
- Skiva hjärnor på 40 μm tjocklek med hjälp av en frys mikrotom.
- Utför immunofärgning som tidigare beskrivits i steg 3.4.5-3.4.12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här rapporterar vi ett protokoll som täcker olika stadier av iNSC-DA cellterapi för att behandla PD-modeller. För det första var PBMNCs isolerade och expanderade, och omprogrammeras till iNSCs av SeV infektion. En schematisk representation av procedurerna med PBMNC-expansion och iNSC-induktion visas i figur 1. På dag-14, PBMNCs isolerades med hjälp av en densitet gradient medium (tabell över material). Före centrifugering separerades blod som späddes med PBS och densitetsgradienten mellan två skikt. Efter centrifugering dök fyra gradientskikt upp (nerifrån och upp): bottenskiktet innehöll granulocyter och erytrocyter; understödja lagrar innehöll täthetlutning medlet; den tredje innehöll PBMNCs (röd pil); det översta skiktet innehöll trombocyt-rika plasma (figur 2a). Efter 14 dagars expansion, var PBMNCs smittade med SeV som dag 0. På dag 1 togs medel med SeV bort (figur 2B). Som illustreras i figur 2B, det förväntas att antalet celler reducerades gradvis. Celler genomgick en drastisk död (> 60%) till dag 5 (figur 2B). iNSC-kolonierna uppstod tidigast dag 12 (figur 2B). Efter plockning och överföring av iNSC kloner för expansion för ett antal passager, morfologin av celler visas i figur 2C. Den inscs visade en god morfologi och kunde själv förnya stabilt i INSC medium, antingen i en enskiktslager form eller som sfärer (figur 2C).
iNSCs kan ge upphov till DA neuroner med hjälp av en tvåstegsmetod (figur 1). Under etapp ett som varade i 10 dagar, iNSCs behandlades med SAG1 och FGF8b att inducera specifikation av VM golvplattan celler med neurogena potentialer. Därefter behandlades cellerna med askorbinsyra, BDNF, GDNF, cAMP, DAPT, TGF-βIII i den andra etappen (figur 1). Med denna tvåstegsmetod, DA prekursorer kan erhållas mot slutet av den första etappen, och mer mogna DA neuroner kan genereras i slutet av den andra etappen. Efter 24 dagars differentiering, kunde iNSCs effektivt specificeras till DA neuroner som en majoritet av dem uttryckte forkhead Box a2 (FOXA2), neuron-specifika klass III β-tubulin (TUJ1) och tyrosin hydroxylas (TH) (figur 3).
Tre veckor efter etableringen av unilaterala 6-OHDA-lesioned PD musmodeller genomfördes beteendemässig bedömning för att uppskatta PD-symtomen (figur 4a). En vecka senare transplanterades dopaminerga prekursorer till PD-musmodellerna (figur 4A). Beteende bedömningen utfördes en vecka före och 2, 4, 6, 8, 12 veckor efter celltransplantation (figur 4a). De möss som genomgått celltransplantation uppvisade signifikant förbättring av motorisk funktion (figur 4B). Omfattningen av 6-ohda-inducerad lesioning kan verifieras genom obduktion Immunofluorescerande färgning för TH på striatum, mediala framhjärnan Bundle (MFB) och SNPC (figur 4C). De TH-positiva signalerna i inympade möss återfanns kraftigt i striatum där celler implanterades och lindrigt återfanns vid SNpc (figur 4C). Tre månader efter transplantation, cirka 13,84% var TH+ da neuroner bland överlevande celler (figur 4D, E). Omkring 91,72% och 86,76% av de TH+ cellerna var uttryckta Orphan nukleär receptor (NURR1) och FOXA2, respektive (figur 4D, E). Omkring 98,77% av TH+ -cellerna var medmärkta med G-proteinkopplad aktiv likriktare kalium (GIRK2) (figur 4D, E).
Figur 1 : En schematisk representation av procedurer avseende PBMNC-expansion, iNSC-induktion och differentiering av inscs i da-prekursorer. PBMNCs isolerades och expanderade i MNC medium i över 14 dagar, och sedan infekterade med SeV kodning Human SOX2, OCT3/4, c-MYC och KLF4. iNSC kolonier dök upp så tidigt som 12 dagar efter SeV infektion. Efter 3-4 veckor, iNSC kolonier plockades och differentierades till DA prekursorer av en tvåstegsmetod. PBMNCs: perifera mononukleära blodceller; MNC: mononukleära celler; iNSCs: inducerad neurala stamceller; SeV: Sendai virus; DA: dopaminerga; PDL: Poly-D-lysin; BDNF: Brain-härledda neurotrofiska faktorn; GDNF: gliaceller cell line-derived neurotrofa faktor; AA: askorbinsyra; Läger: dibutyryladenosine cykliskt monofosfat; TGF: omvandla tillväxtfaktor. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Pbmncs isoleras och utvidgas, och sedan omprogrammeras till iNSCs av SeV infektion. Aett exempel på PBMNCs före och efter gradientcentrifugering. Innan centrifugering, utspätt blodprov och densitet gradient medium var separerade i två skikt. Efter centrifugering, fyra densitet gradientskikt bildas från botten till toppen: bottenskiktet innehöll granulocyter och erytrocyter; det andra skiktet innehöll densitetsgradienten medium; det tredje skiktet innehöll PBMNCs (röd pil); det översta skiktet innehöll trombocyt-rika plasma. (B) bilder av den typiska morfologin av celler efter PBMNCs var infekterade med SeV på dag 1, 2, 5 och 12. Efter PBMNCs var infekterade med SeV, några av cellerna dog och antalet celler reducerades gradvis. Ett litet antal celler återstod på dag 5. På dag 12 uppstod iNSCs kolonier. Skalbar, 100 μm. Cden typiska morfologin av inscs av passage nummer 20 i enskiktslager och sfär kultur. Skalbar, 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Differentiering av iNSCs till dopaminerga neuroner. Immunofluorescerande färgning för FOXA2, TH, TUJ1, DAPI och sammanslagna bilder på dag 24 på celler åtskilda från iNSCs. Skalbar, 50 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Transplantation av iNSC-differentierade da-prekursorer till ensidiga 6-OHDA-lesioned PD musmodeller. (A) tidslinje för celltransplantation och beteendemässiga tester. B) resultaten av beteendemässiga tester vid olika tidpunkter från gruppen med 6-ohda +-celler (n = 10), 6-ohda +-buffertgrupp (n = 8) och kontrollgrupp (n = 3). Data presenteras som medelvärde ± standardfel av medelvärdet (SEM). p < 0,001 genom tvåvägsanalys av varians (ANOVA) med Dunnetts multipla jämförelse test. (C) obduktion Immunofluorescerande färgning för TH på striatum, mediala framhjärnan bunt (MFB) och substantia nigra (SN) av 6-ohda-leisioned halvklotet, 6-ohda + celler halvklotet, och kontrollgrupp. Skalstreck, 100 μm. (D) procentandelar av FOXA2/th, NURR1/th, GIRK2/TH, Th/HNA i entransplanterade möss 3 månader efter transplantation. HNA: Human kärnor-antikropp. Data presenteras som medelvärdet ± SEM. (E) immunofluorescensfärgning för FOXA2, NURR1, GIRK2, Th och HNA på hjärn skivor från PD-möss 12 veckor efter celltransplantation. HNA: Human kärnor-antikropp. Denna siffra har modifierats från Yuan et al.11. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterade vi ett protokoll som täckte olika stadier av iNSC-DA cellterapi för PD-modeller. Kritiska aspekter av detta protokoll inkluderar: (1) isolering och expansion av PBMNCs och omprogrammering av PBMNCs till iNSCs av SeV infektion, (2) differentiering av iNSCs till DA neuroner, (3) inrättande av ensidiga 6-OHDA-lesioned PD musmodeller och beteendemässiga bedömning och (4) celltransplantation av DA-prekursorer och beteendemässig bedömning.
I detta protokoll, den första delen innebär att samla in och expandera PBMNCs i ett serumfritt medium (MNC medium), som företrädesvis expanderar erytroblaster och inte stöder lymfocytproliferation. I tidigare studier har flera somatiska celltyper omprogrammerats till iPSCs eller inscs12,13,14. I jämförelse med andra typer av somatiska celler, PBMNCs besitter flera fördelar. Den mest betydelsefulla fördelen är deras gynnsamma gen uttrycksmönster och epigenetiska profiler. PBMNCs är kortlivade in vivo och fylls på ofta från aktiverade hematopoietiska stamceller, och kan ackumuleras färre mutationer än hud fibroblaster göra. Också, sättet att provet pbmncs är mindre invasiv än för fibroblaster, och det tar en kortare tid att expandera pbmncs (cirka 14 dagar) kontra fibroblaster (cirka 28 dagar)16,22. Efter centrifugering med ett densitetsgradientmedium kommer fyra densitetsgradienter att bildas från botten till toppen. bottenskiktet innehåller granulocyter och erytrocyter, det andra nedre skiktet innehåller densitetsgradienten medium, det tredje skiktet innehåller MNCs, och det översta lagret innehåller plasma. Avkastningen av PBMNCs varierar normalt mellan individer, särskilt de i olika åldrar. Generellt, yngre människor tenderar att ha ett större antal PBMNCs än äldre människor. Med det beskrivna protokollet kan ca 1,8 − 3,4 x 107 pbmncs isoleras från 15 ml PB. Bland PBMNCs, CD34+ hematopoietiska stamceller är relativt benägna att omprogrammering, och MNC medium kan berika CD34+ hematopoietiska stamceller i viss utsträckning. Det förväntas att ett lika eller större antal synliga celler odlade med MNC medium kvar efter 14 dagars expansion. SeV, ett RNA icke-integrativt virus, har en negativ känsla, enkelsträngad, icke-segmenterad genomet som inte integreras i värd arvsmassan, utan endast replikerar i cytoplasman hos infekterade celler18,19. Rekombinant SeV kodning omprogrammering faktorer OCT3/4, SOX2, KLF4 och c-MYC, kan genereras som en temperaturkänsliga mutant, som kan tas bort lätt vid 39 ° c20. Med detta protokoll, vi härledda 8-20 iNSC kolonier genom omprogrammering PBMNCs från en frisk volontär eller patient med 15 mL PB. Sedan kunde forskarna välja kolonier med goda morfologier för ytterligare passaging och linje etablering. I den publicerade rapporten, inscs av passage nummer 10, 20 och 30 visade liknande spridning priser, och kan vara blint mer än 50 gånger, visar en god självförnyelse och proliferativ kapacitet11. iNSCs skulle kunna kännetecknas av differentiering analyser och immunofärgning för neurala stamceller markörer SOX2, PAX6, NESTIN och OLIG2, och proliferativa markör Ki67. iNSCs bör uttrycka de neurala stamcells markörer och besitter en differentiering förmåga att bliTUJ1 +, MAP2+ neuroner (efter 6 veckor), gfap+ astrocyter (efter 6 veckor) och OLIG2+, O1+ oligodendrocyter (efter 7-8 veckor)11. Emellertid, en begränsning av detta protokoll är att MNC medium är företrädesvis gynnsam för erytroblastexpansion, vilket kan göra det inte lämpar sig för att generera iNSCs från patienter som har brist på erytroblastutveckling. Dessutom är effektiviteten i omprogrammering PBMNCs till iNSCs inte hög. Man kan förbättra omprogrammering effektivitet genom att använda vissa små molekyler eller öka avkastningen genom att använda mer start PBMNCs23.
Metoden om differentiering av iNSCs i DA nervceller som beskrivs här bygger på ett stort antal protokoll för neurala differentiering. Som PD orsakas främst av degeneration av da neuroner ligger imellanhjärnan1,2, syftet med protokollen är inriktad på härledning av specialiserade VM da neuroner, som uppstår från golvplattan celler under utveckling24. Induktion av VM golvplattan celler med neurogena potentialer beror på två viktiga morfogener, SHH och FGF8b6,25,26. SHH är en ventraliserande morfogen, utsöndras av notochord26,27. Här ersatte vi SHH med den lilla molekylen SAG1, en SHH-utbildningagonist som är mer ekonomisk än SHH. Också, grundläggande neurala kultur medium och tillägg (tabell över material) är viktiga för neuronala överlevnad och differentiering. Med detta protokoll, DA prekursorer erhölls mot slutet av den första etappen, och mer mogna DA neuroner genererades i slutet av den andra etappen. Öka tiden för den andra etappen till 40-55 dagar kan ytterligare öka andelen mogna DA neuroner i kulturen. Ingår i den andra etappen mediet är retinoinsyra syra, BDNF, GDNF, TGF-βiii, dapt och Camp, som har visat sig kunna främja da neuron mognad och överlevnad. För att testa effektiviteten av iNSCs i differentiering till DA neuroner, de differentierade cellerna undersöktes för uttryck av markörer NURR1, FOXA2, GIRK2 och TH. I en tidigare studie, i slutet av fas I (dag 10), 87,76% och 65,33% celler uttryckte NURR1 och FOXA2, respektive11. I slutet av etapp II (dag 24) nådde procentandelen NURR1+ celler 95,58% och andelen FOXA2+ celler nådde 77,33%11. Vid denna tidpunkt var 57,23% och 28,55% celler positiva för TH och GIRK2, respektive11. I likhet med vad som har observerats för iPSC differentiering mot DA neuroner, en sats till sats/linje till rad variation för iNSC differentiering finns också, som påverkas av faktorer som cell tillstånd, aktiviteten hos små molekyler som används, och plasticitet av stamceller från olika personer. Det är också anmärkningsvärt att en viktig faktor för differentiering effektivitet är celltäthet. En sådd täthet på 5 x 103 celler per 12 mm glas täckslip i 24-brunn plattor rekommenderas. I själva verket uppvisar iNSCs en bra proliferativ takt under differentiering skede I. INSCs seedade i en brunn av en 24-bra tallrik skulle ge upphov till ett tillräckligt antal DA prekursorer genom differentiering dag 10 − 13 för transplantation till en mus (2 x 105 för varje mus).
Detta protokoll presenterar en metod för att upprätta reproducerbara och stabila ensidiga 6-OHDA-lesioned PD-musmodeller. Omfattningen av 6-OHDA lesion kan uppskattas genom beteendemässig bedömning som mäter kontralaterala rotationer efter injektion av apomorfin. Också, graden av 6-OHDA-inducerad lesion kan kvantifieras genom post-mortem Immunofluorescerande färgning för TH i SNpc. En annan typ av nervgift som används i PD-modellering är 1-metyl-4-fenyl-1, 2, 3, 6-tertahydropyridin (MPTP), som också stör dopaminerga vägar. Jämfört med MPTP kunde 6-OHDA administreras UNI-eller bilateralt. Dessutom är MPTP-metoden känsligare för djurens ålder, kön och stam och kan därför uppvisa en högre grad av variation mellan djuren28. De kritiska faktorerna inkluderar att välja möss med matchande vikt, injicera nyberedd 6-OHDA lösning och utföra kirurgi exakt och snabbt.
Förfarandena för celltransplantation av da-prekursorer till striatum av bort möss är i princip desamma som förfarandena för generering av 6-ohda-bort PD musmodeller, förutom att 6-ohda ersätts av da prekursorer vid injektion steg. Den viktigaste faktorn i denna del är att söka den optimala tiden fönstret för DA celldifferentiering för transplantation. Det har visats att en högre grad av stemness korrelerar med en högre överlevnadsgrad men en lägre potential för specifikation till mogna DA neuroner11. Emellertid, en mer mogen skede av neurala celler är mer sårbara, och visar en lägre överlevnadsfrekvens efter transplantation11. Därför, att hitta en lämplig tid fönster som balanserar mognadens förmåga och överlevnad är av betydelse. I en tidigare studie, transplanterade vi celler av differentiering dag 10 och 13 i striatum av immunobristfällig SCID-beige möss11. En månad efter inympningen visade Immunofluorescerande infärgningsresultat att omkring 88,63% och 93,13% var TUJ1-positiva för dag 10 och dag 13 grupper, respektive, och några TH+ celler (5,30%) upptäcktes från dag 13 gruppen men några TH+ celler från dag 10 grupp. Ändå, jämfört med dag 13 celler, dag 10 celler gav upphov till en något högre total överlevnad11. Resultaten visade att dag 10 till dag 13 är en optimal tid fönster av celler för engrafharm11. I detta protokoll använde vi en blandning av DA-celler från differentiering dag 10 och dag 13 vid ett förhållande på 1:7 för engrafation, som visade ett bra resultat av överlevnad och differentiering11. Med hjälp av en blandning av celler från dag 10 och dag 13 baserades på en hypotes som relativt omogen och mogna neurala celler, när de sätts ihop, kan stödja varandra, som påminner om in vivo situationen i möss där neurala stamceller är omgivna av mogna nervceller.
Detta protokoll presenterar metoden för att generera iNSCs från PBMNCs av SeV infektion, differentiera iNSCs till DA neuroner, och transplantation DA prekursorer till 6-OHDA-lesioned PD musmodeller. Med hjälp av detta protokoll kan man generera iNSCs med potentialer inte bara för behandling av PD, men också av andra neurodegenerativa sjukdomar. Eftersom iNSCs representerar en primitiv NSC skede, de kan specificeras i olika regionspecifika neurala celler, såsom ryggmärgen nervceller eller motoriska nervceller, som kan vara lovande verktyg för behandling av amyotrofisk lateral skleros eller ryggmärgsskada. Förutom, iNSCs härrör från familjär sjukdom patienter erbjuder en plattform för att studera mekanismer bakom sjukdomsdebut och utveckling, och att genomföra Drug screening tester.
Det finns mer än ett sätt att få DA neurala celler för transplantations studier. DA-celler kan också genereras från iPSCs eller genom direkt konvertering29. Jämfört med iPSCs, iNSCs är inneboende med minskad risk för tumör bildning, en kortare period av omprogrammering och linje etablering, och härstamning-engagerade plasticitet-bara kunna differentiera till nervceller och glia11. Jämfört med direkt konvertering ger differentierande DA-prekursorer från iNSCs upphov till en högre avkastning och effektivitet30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Arbetet stöddes av följande bidrag: stamcells-och översättnings nationella nyckelprojekt (2016YFA0101403), Kinas National Natural Science Foundation (81661130160, 81422014, 81561138004), Beijing Municipal Natural Science Foundation (5142005), Peking Talents Foundation (2017000021223TD03), stödprojekt av hög nivå lärare i Peking kommunala universitet under perioden 13: e fem års plan (CIT & TCD20180333), Peking Medical system hög nivå Talent Award (2015-3-063), Peking Kommunal Health Commission Fund (PXM 2018_026283_000002), Peking 100, Thousand, och 10000 talanger Fund (2018A03), Beijing kommunal administration av sjukhus klinisk medicin utveckling av särskilda finansieringsstöd (ZYLX201706), och Royal Society-Newton avancerad gemenskap (NA150482).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15-ml conical tube | Corning | 430052 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic for inhalation and skin contact |
| 24-well plate | Corning | 3337 | |
| 50-ml conical tube | Corning | 430828 | |
| 6-OHDA | Sigma-Aldrich | H4381 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Cell dissociation reagent |
| Apomorphine | Sigma-Aldrich | A4393 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A92902 | Toxic with skin contact |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | Brain derived neurotrophic factor |
| Blood collection tubes containing sodium heparin | BD | 367871 | |
| BSA | yisheng | 36106es60 | Fetal bovine serum |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Dibutyryladenosine cyclic monophosphate |
| CellBanker 2 | ZENOAQ | 100ml | Used as freezing medium for PBMNCs |
| Chemically defined lipid concentrate | Invitrogen | 11905031 | |
| CHIR99021 | Gene Operation | 04-0004 | |
| Coverslip | Fisher | 25*25-2 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417-10mg | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915-100MG | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11330 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320 | |
| Donkey serum | Jackson | 017-000-121 | |
| EPO | Peprotech | 100-64-50UG | Human Erythropoietin |
| FGF8b | Peprotech | 100-25 | |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | P=1.077, density gradient medium |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | Glial derived neurotrophic factor |
| GlutaMAX | Invitrogen | 21051024 | 100 × Glutamine stock solution |
| Ham's-F12 | Gibco | 11765-054 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175079 | Balanced salt solution |
| Human leukemia inhibitory factor | Millpore | LIF1010 | |
| Human recombinant SCF | Peprotech | 300-07-100UG | |
| IGF-1 | Peprotech | 100-11-100UG | Human insulin-like growth factor |
| IL-3 | Peprotech | 200-03-10UG | Human interleukin 3 |
| IMDM | Gibco | 215056-023 | Iscove's modified Dulbecco's medium |
| Insulin | Roche | 12585014 | |
| ITS-X | Invitrogen | 51500-056 | Insulin-transferrin-selenium-X supplement |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | Serum free basal medium |
| Laminin | Roche | 11243217001 | |
| Microsyringe | Hamilton | 7653-01 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| NEAA | Invitrogen | 11140050 | Non-essential amino acid |
| Neurobasal | Gibco | 10888 | Basic medium |
| PDL | Sigma-Aldrich | P7280 | Poly-D-lysine |
| SAG1 | Enzo | ALX-270-426-M01 | |
| SB431542 | Gene Operation | 04-0010-10mg | Store from light at -20? |
| Sendai virus | Life Technologies | MAN0009378 | |
| Sucrose | baiaoshengke | ||
| TGFβ? | Peprotech | 100-36E | Transforming growth factor β? |
| Transferrin | R&D Systems | 2914-HT-100G | |
| Triton X 100 | baiaoshengke | Nonionic surfactant | |
| Trypan blue | Gibco | T10282 | |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 |
References
- Williams-Gray, C. H., et al. The distinct cognitive syndromes of Parkinson's disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort. Brain. 132, Pt 11 2958-2969 (2009).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radical Biology and Medicine. 62, 132-144 (2013).
- Chen, Z. Cell Therapy for Parkinson's Disease: New Hope from Reprogramming Technologies. Aging and Disease. 6 (6), 499-503 (2015).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Doi, D., et al. Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12543-12548 (2004).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S.
- Tang, X., et al. Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors. Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).
- Yuan, Y., et al. Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson's disease model. Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).
- Bazley, F. A., et al. Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells. Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).
- Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method. Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).
- Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).
- Zhu, S., et al. Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds. Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).
- Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
- Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).
- Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson's disease. Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).
- Sheng, C., et al. Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors. Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).
- Prasad, A., et al. A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation. Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).
