Summary
Vi viser en metode til nekropsy og dissektion af mus prostatacancer modeller, med fokus på prostata tumor dissektion. En trin-for-trin protokol til generering af mus prostata tumor organoider er også præsenteret.
Abstract
Metoder baseret på homologe rekombination til at ændre gener har væsentligt fremmet biologisk forskning. Gensplejsede musemodeller (Gemm'er) er en stringent metode til at studere mammalan udvikling og sygdom. Vores laboratorium har udviklet flere gemmer af prostatacancer (PCa), der mangler udtryk for en eller flere tumor suppressor gener ved hjælp af den site-specifikke CRE-loxP rekombinase system og en prostata-specifik promotor. I denne artikel beskriver vi vores metode til nekropsy af disse PCa GEMMs, primært med fokus på dissektion af mus prostata tumorer. Nye metoder udviklet i løbet af de sidste ti år har lettet kulturen af epiteliale-afledte celler til model orgel systemer in vitro i tre dimensioner. Vi også detaljer en 3D cellekultur metode til at generere tumor organoider fra mus PCa GEMMs. Præklinisk kræftforskning har været domineret af 2D cellekultur og celle line-afledte eller patient-afledte xenograft modeller. Disse metoder mangler tumor mikromiljø, en begrænsning af brugen af disse teknikker i præ-kliniske undersøgelser. Gemmer er mere fysiologisk relevante for forståelsen af tumor og cancer progression. Tumor organoid kultur er en in vitro model system, der rekapitulerer tumor arkitektur og celle Lineage egenskaber. Desuden, 3D cellekultur metoder giver mulighed for vækst af normale celler til sammenligning med tumor cellekulturer, sjældent muligt ved hjælp af 2D cellekultur teknikker. I kombination, brug af gemmer og 3D cellekultur i præ-kliniske undersøgelser har potentiale til at forbedre vores forståelse af kræft biologi.
Introduction
Siden slutningen af 1980 ' erne, evnen til at ændre gener ved homologe rekombination har i høj grad fremskreden studiet af biologiske systemer1. Inducerbare, vævs-eller celle specifikke promotor-systemer og site-specifikke rekombinaser, såsom CRE-loxp, har avancerede genetiske undersøgelser ved at lette kontrollen med genetiske modifikationer både timeligt og rumligt2,3, 4. Kombinationen af disse genetiske strategier har skabt en bred vifte af eksperimentelle modelsystemer5,6,7.
Genetisk modificerede musemodeller (Gemm'er) er et integreret redskab til at vurdere, hvordan individuelle gener eller grupper af gener påvirker pattedyrs udvikling og sygdom. I præ-klinisk kræftforskning, GEMMs er den mest fysiologisk-relevant og stringent metode til at studere kræft udvikling, progression, og behandling8. Vores laboratorium har specialiseret sig i at generere og karakterisere kræft GEMMs.
Den mest højt diagnosticerede ikke-kutane kræft blandt mænd i USA er prostatacancer (PCa). Størstedelen af patienterne med PCa har lav-risiko sygdom og høj sandsynlighed for overlevelse, men overlevelsesraten falder drastisk, når sygdommen diagnosticeres på avancerede stadier, eller hvis målrettet hormonel terapi inducerer progression til aggressive, ikke-helbredelig PCa undertyper9,10. Vores laboratorium har udviklet gemmer, der udnytter floxed alleler af en eller flere tumor suppressor gener. Rekombination og tab af tumor suppressor genekspression forekommer specifikt i prostata, fordi vi har introduceret et Trans gen med CRE rekombinase nedstrøms for probasin promotoren aktiveret kun i prostata epiteliale celler11, 12. vi har også opdrættet vores gemmer til at indeholde en CRE reporter transgen kaldet MT/mG, som inducerer tomat fluorescerende protein udtryk i celler, der mangler CRE og grønt fluorescerende protein (gfp) udtryk i celler med CRE13. Mens præsentationen af denne metode og vores repræsentative resultater viser GEMMs vi studere i vores laboratorium, denne protokol kan bruges til at generere prostatacancer organoider fra enhver musemodel. Men, som diskuteret i detaljer i vores repræsentative resultater sektion, vi har observeret, at visse tumorkarakteristika er optimale for prostatacancer organoid generation.
I det sidste årti har nye metoder til dyrkning af celler fra væv af epitelial oprindelse ført til betydelige fremskridt i vores evne til at modellere orgel systemer in vitro14,15. Udtrykket "3D-cellekultur" er blevet tilskrevet de teknikker, der er involveret i etablering og vedligeholdelse af organoider, som generelt kan defineres som strukturer, der består af celler, som samler sekundær arkitektur drevet af organspecifik cellelinje Karakteristik16. Disse nye metoder adskiller sig fra klassisk 2D-cellekultur i, at cellerne ikke kræver transformation eller immortalization for langsigtet vækst; således kan 3D-kulturer af normale celler sammenlignes med syge celler. Dette er især værdifuldt i kræftforskning, hvor normale celle kontrol kulturer har typisk ikke været tilgængelige. Desuden danner organoider spontant sekundære vævs arkitekturer med passende differentierede celletyper, hvilket gør dem til et bedre model system til at forstå kræft in vitro end 2D cellelinjer17. Vores laboratorium har skabt 3D organoid linjer fra tumor problem isoleret fra vores PCa GEMMs at supplere vores in vivo data og udføre eksperimenter, som ikke ville være muligt i GEMMs.
I denne artikel præsenterer vi skriftlige og visuelle protokoller for den komplette nekropsy af PCa GEMMs, herunder dissektion af forskellige mus prostata lapper og metastatiske læsioner. Vi beskriver og viser en trin-for-trin metode til generering af organoider fra mus prostata tumorer baseret på en protokol, der tidligere blev offentliggjort af Drost et al. for at udlede organoider fra normal mus prostata epitelial væv18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dyre procedurer, der er beskrevet her, blev udført med godkendelse af Udvalget for institutionel dyrepleje og-anvendelse (IACUC) på Institut for Laboratoriedyrs ressourcer, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, New York.
Bemærk: Mandlige mus, der skal dissekeres for at isolere prostater eller prostata tumorer til generation af organoider bør have mindst nået en alder af seksuel modenhed — omkring 8-10 uger af alder. Specifikke aldre af mus kan variere blandt undersøgelser. Nogle faktorer at overveje, når du vælger alder omfatter aldersafhængige ændringer i prostata cellepopulationer, alder-afhængige udtryk for specifikke promotor-drevne CRE transgener, og hastigheden af prostata tumorprogression i en bestemt GEMM.
1. dissektion og billeddannelse af musens ProstateTumor og metastatiske tumorer
- Præparater
- Få de nødvendige sterile dissektion-værktøjer. Stage dissektion område på ren steril overflade med en 15 cm lineal, præcision balance, analytisk balance, sprayflaske med 70% ethanol, phospho-Buffered saltvand (PBS), og papirhåndklæder.
-
Fremstilling af fiksativ opløsninger til viscerale organer og knogler, der ikke skal anvendes til organoid generering
- For visceral organer: Forbered 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS. For én mus skal 20 mL 4% PFA, alikvot i 2 15 mL koniske rør og opbevares ved stuetemperatur indtil brug.
- For lange knogler: aliquot 10 mL pre-made 10% neutral Buffered formalin (NBF) i 1 15 mL konisk slange og opbevares ved stuetemperatur indtil brug.
- Få ubehandlede 10 cm retter og fyld med ikke-sterile PBS-disse vil tjene som midlertidige beholdere til organer under fine dissektion ved hjælp af en dissektion mikroskop.
Bemærk: Sterile værktøjer anvendes til dissekere væv til generering af organoider. Ikke-sterile værktøjer anvendes til den indledende indsnit og dissektion af bagbenene.
- Eutanasi og indledende indsnit
- Euthanize musen ved CO2 kvælning ved hjælp af en 2,0 L/min flowhastighed for 5 min. Fjern musen fra buret og udføre livmoderhals dislokation. Brug præcisions balancen til at måle musens legemsvægt og Optag.
- Placer musen oven på et papirhåndklæde og orientere på dissektion overflade ventrale side op med musens hoved vendt væk fra investigator. Fastgør musen til brættet ved at strække sine lemmer og piercing hver af de forpoterne og bagpoter med en engangs nål.
- Ved hjælp af en sprayflaske, slukke musens pels med 70% ethanol. Brug ikke-sterile dissektion saks og lige pincet, Knib lige over musens penis og lav et lille snit gennem pelsen alene.
- Fortsæt indsnit midterlinjen op til musens hals gennem pels kun. Lav bilaterale indsnit fra punktet af den oprindelige indsnit gennem musens ventrale plan gennem pelsen kun.
- Tag fat i pelsen og træk den forsigtigt væk fra huden på musen. PIN ned pels til brættet for at give adgang til både abdominal og thorax hulrum.
- Udvinding af mandlige urogenitale system en bloc
- Brug steril dissektion saks og lige tang, omhyggeligt skåret gennem huden omkring 0,75 cm over endetarmen. Fortsæt incisionmidlinien op til ribburet uden at forstyrre nogen organer i bughulen. Træk forsigtigt huden væk og fastgør den til brættet for at udsætte hele bughulen.
Bemærk: Lad ikke disse instrumenter røre ved yderfladen af musen eller nogen overflade i det midlertidige område, da disse væv vil blive brugt til at generere organoider. - Dissekere det urogenitale system og andre organer i henhold til diagrammet i figur 1A, med tal, der angiver rækkefølgen organerne vil blive fjernet fra musen.
- Find blæren, derefter gribe fat pad til enten venstre eller højre og trække opad for at udsætte testiklen. Forsigtigt dissekere væk testikel fra resten af den urogenitale region og lægge til side. Gør den samme procedure på den anden side.
Bemærk: Opnåelse af optimal vævs kvalitet og detaljeret tumor karakterisering af prostata tumorer kræver, at hele urogenitale regionen fjernes fra musen en bloc19. Det anbefales, at det urogenitale område fjernes først (figur 1A). - Tag fat i blæren og træk forsigtigt op, så den urogenitale region løfter sammen og udsætter urinrøret nedenunder. Mens du holder blæren, orientere saksen, så de er mod undersiden af rygtet prostata og skære urinrøret. Hele urogenitale regionen vil derefter frigive fra bughulen.
- Sæt den urogenitale region i en 10 cm skål fyldt med PBS. Hvis stadig fyldt med urin, dræne blæren ved at lave et lille snit. Ved hjælp af den analytiske balance, afveje det urogenitale system og rekord.
- Brug steril dissektion saks og lige tang, omhyggeligt skåret gennem huden omkring 0,75 cm over endetarmen. Fortsæt incisionmidlinien op til ribburet uden at forstyrre nogen organer i bughulen. Træk forsigtigt huden væk og fastgør den til brættet for at udsætte hele bughulen.
- Ekstraktion af bækken lymfeknuder, milt, lever, nyrer, lunge, skinneben og femur
- Fjernelse af det urogenitale system udsætter bækken lymfeknuder, placeret lige bag det urogenitale system (figur 1A) og på hver side af rygsøjlen. Lymfeknuderne vil kun være synlige, hvis de indeholder metastatiske læsioner, eller hvis der er lokal inflammation. Orienter de lige pincet under lymfe knudepunktet, og træk op for at fjerne lymfeknuderne. Gør den samme procedure på den anden side.
- Tag fat i endetarmen med de lige tang og skær. Træk på endetarmen for at udrede hele tyktarmen og tarmene, på udkig efter metastatiske læsioner i mesenteriske lymfeknuder. Når hele ileum er fjernet, fortsætte med at trække på duodenum at udsætte maven. Skær spiserøret til helt at fjerne maven og kassere. Hvis der observeres metastatiske læsioner i lymfeknuderne, forsigtigt dissekere væk fra tarmen og opbevares i en 10 cm fad af PBS.
- Udsætter og fjerner maven vil trække milten fra Rygsiden af maven (figur 1A). Fjern milten og Placer i 4% PFA. Milten fungerer som en farvnings kontrol for hemotoxylin, da det er meget cellulært.
Bemærk: Visceral væv ikke skal anvendes til organoid generation vil blive fast natten i 4% PFA, vaskes med PBS, og derefter placeret i 70% ethanol. - Fjern leveren i den øvre del af maven (figur 1A). Baseret på den metastatiske belastning i leveren kan individuelle lapper dissekteres, eller hele leveren kan fjernes ved omhyggeligt at skære langs membranen. (Må ikke skæres gennem mellem gulvet på dette tidspunkt). Placer leveren i en 10 cm fad af PBS.
- Fjernelse af leveren vil fuldt ud udsætte nyrerne på hver side af rygsøjlen (figur 1A). Fjern nyrerne — sammen med de renale lymfeknuder, hvis knudepunkter har metastatiske læsioner — ved at placere de lige pincet under nyrerne og trække op. Gør den samme procedure for den anden side.
- For at udsætte brysthulen skal du forsigtigt klippe mellem gulvet langs ribburet. Piercing mellem gulvet vil frigive det negative tryk i brysthulen og udsætte hjertet og lungerne (figur 1A).
- Tag fat i brystbenet, og træk op for at åbne brysthulen yderligere. Overhold brysthulens ventrale ansigt langs ribburet for metastatiske læsioner i thorax lymfeknuder og dissekere, hvis de findes.
- Mens du stadig holder brystbenet, skæres det ventrale rib bur væk for at få adgang til hjertet og lungerne. Tag fat i hjertet, træk op og skær ind under lungerne. For helt at fjerne hjertet og lungerne en bloc, skæres alle forreste blodkar og luftrøret. Placer vævet i PBS og fjern forsigtigt hjertet uden at beskadige lungevæv eller lunge metastaserende læsioner.
- Tag de ikke-sterile lige tang og dissekere saks og skær bagbenet på hovedet af femur. Grib forsigtigt femur og fjern bagbenet fra pels.
- Placer bagbenet på et papirhåndklæde og tag fat i bagpoten. Brug den enkelt kant barberkniv til at skrotte/klippe alle muskler og bindevæv fra skinneben og femur væk. Fjern femur fra skinneben ved at skære posterior til patella og fjerne skinneben ved at fjerne bagpoten. Placer skinneben og femur i 10% NBF. Gør den samme procedure på den anden side.
Bemærk: Med henblik på at undersøge de lange knogler af musen for metastatiske læsioner, fibula behøver ikke at være intakt. De lange knogler vil blive fastsat i 10% NBF i en uge og derefter afkaldet ved hjælp af neutral EDTA-løsning20. Efter tre uger vil knoglerne blive overført til 70% ethanol. - Efter fjernelse af bagbenene, tage en øre eller hale skæring til fremtidig genotypebestemmelse. Kassér musens slagtekrop og alt væv, der ikke skal fastgøres eller anvendes til organoid generation.
- Dissektion af prostata tumor
Bemærk: Dissektion af mus prostata lapper kan kun opnås ved hjælp af en dissekere mikroskop19. Men prostata tumor belastningen kan være så høj, at individuelle lapper ikke kan skelnes, og dissektion kan udføres uden et mikroskop. Ikke desto mindre er den fulde protokol for dissektion af individuelle prostata lapper beskrevet nedenfor.- Placer den urogenitale region i en 10 cm fad af PBS under en dissekere mikroskop og orientere den ventrale side op med blæren og skelsættende vesikler vender væk fra investigator. Al manipulation af den urogenitale region bør ske ved hjælp af sterile instrumenter.
- Vurder den generelle fænotype af prostata tumor-sandsynligvis vil enten en væskefyldt eller solid tumor blive observeret i PCa GEMMs (figur 2a, B).
Bemærk: Væskefyldte tumorer er ofte placeret i den forreste prostata region (figur 2A). Væskefyldte tumorer består af primært bindevæv med ringe epitel komponenter-således disse tumorer er ikke optimale til organoid generation på grund af det lave antal tumor epiteliale celler, som vil blive drøftet i de repræsentative resultater Afsnit. - Hvis væskefyldte tumorer er til stede, stikke et lille hul i tumoren. Placer den urogenitale region i en ny 10 cm fad af PBS.
- Tag et par lige Tang i den ikke-dominerende hånd og buede pincet i den dominerende hånd. Vend den urogenitale region til sit rygansigt. Kig efter den proximale prostata region (figur 1B), som kan identificeres ved den lyserøde/røde farve af urinrøret. Grib urinrøret og hold fast så at manipulere det urogenitale væv med de buede pincet.
Bemærk: Under prostata dissektion, altid notere blære placering, da dette er den enkleste måde at finde de enkelte prostata lapper (figur 1B).
- Fjernelse af ikke-prostata væv fra det urogenitale område
- Mens stadig på rygtet ansigt af den urogenitale region, finde bunden af skelsættende vesicle. Fjern forsigtigt Sædblærer og kassér. Udfør den samme procedure på den modsatte side.
Bemærk: Undgå punktering af Sædblærer, da det vil frigive klæbrig og uigennemsigtig sekretorisk væske, der forstyrrer prostata dissektion. Hvis den Sædblærer er punkteret, overføre den resterende urogenitale region til nye 10 cm skål med friske PBS. - Fjern og kassér VAS sædlederen og så meget fedt og bindevæv som muligt ved hjælp af den buede side af pincet.
- Mens du stadig holder fast i urinrøret/proksimal prostata regionen, skal du bruge et par fine, spidde Sakse til at fjerne blæren fra urinrøret.
- Mens stadig på rygtet ansigt af den urogenitale region, finde bunden af skelsættende vesicle. Fjern forsigtigt Sædblærer og kassér. Udfør den samme procedure på den modsatte side.
- Isolering af individuelle prostata lapper
- Find den forreste prostata (figur 1B). Sørg for at fastholde den proksimale prostata region/urinrøret med de lige pincet. Fjern den forreste prostata region ved direkte at gribe vævet med den buede side af pincet og fast trække det væk fra blæren og resten af prostata. Placer vævet i PBS.
Bemærk: For alle prostata regioner, kan dissekere saks være nødvendigt at fjerne vævet, afhængigt af størrelsen af tumoren. - Find den ventrale prostata region (figur 1B). Fjern den ventrale prostata region på samme måde som i trin 1.5.7.
- På dette tidspunkt i dissektion, kun de laterale og dorsale prostata regioner bør være til stede, mens den proximale prostata region er stadig ved at blive grebet af straight tang. Vurder de laterale og dorsale prostata områder (figur 1B). Hvis den laterale region kan skelnes fra den dorsale region, fjerne den laterale prostata region som beskrevet i trin 1.5.7. Gør den samme procedure på den modsatte side.
- Fjern den dorsale prostata region som beskrevet i trin 1.5.7. Placer den proximale prostata region i 4% PFA, som dens struktur i muskelvæv i urinrøret gør det uegnet til organoid generation.
- Find den forreste prostata (figur 1B). Sørg for at fastholde den proksimale prostata region/urinrøret med de lige pincet. Fjern den forreste prostata region ved direkte at gribe vævet med den buede side af pincet og fast trække det væk fra blæren og resten af prostata. Placer vævet i PBS.
2. generation af 3D-Organoider fra prostata tumor væv
Bemærk: Figur 3 viser en billedlig beskrivelse af proceduren for generering af tumor organoider.
- Under forberedelse
- Forbered mus prostata organoid medier i henhold til Drost et al.18 med følgende ændringer. Brug konditioneret medium i stedet for rekombinante proteiner til Noggin og R-Spondin og brug en endelig koncentration på 1% (v/v), i stedet for 10%, for både Noggin-og R-Spondin-konditioneret medium.
Bemærk: HEK293 celler, der er stabilt transfteret med HA-Mouse Noggin-FC eller HA-Mouse Rspo1-FC bruges til at producere Noggin-eller R-Spondin-konditioneret medium, hhv. Disse cellelinjer var en gave fra Calvin Kuo Laboratory på Stanford University. - Fordøjelses opløsningen fremstilles i et 15 ml rør ved fortynding af 20 mg/ml kollagenase II med avancerede DMEM/F12 (+ + +)-medier til en endelig koncentration på 5 mg/ml. Der tilsættes Y-27632-klippe hæmmer til kollagenase II-opløsningen i en endelig koncentration på 10 μM.
Bemærk: Forholdet mellem fordøjelses buffer til væv er 1 mL til 50 mg, som vi bruger i henhold til Drost et al.18.
- Forbered mus prostata organoid medier i henhold til Drost et al.18 med følgende ændringer. Brug konditioneret medium i stedet for rekombinante proteiner til Noggin og R-Spondin og brug en endelig koncentration på 1% (v/v), i stedet for 10%, for både Noggin-og R-Spondin-konditioneret medium.
- Hakning og fordøjelse af tumor væv
- I cellen kultur hætte, sted prostata tumor væv i en steril 10 cm kultur skål, dissekere og kassere nekrotisk væv.
- Hakker den resterende prostata tumor væv i 1 mm3 kuber ved at holde vævet stykker med de sterile buede pincet og skæring med dissektion saks.
- Placer de hakkede tumor stykker i 15 ml røret med fordøjelses bufferen ved at øse dem op med den buede side af pincet. Fordøje tumorvævet ved 37 °C med rystelser for 1,5 til 2 h. Kontroller fordøjelsen fremskridt hver 20 min.
Bemærk: På dette tidspunkt skal du tage mindst 2 mL matrix fra-20 °C opbevaring og tø på is. 1 mL aliquoter af matrix vil tage ca. 3 h at tø. - Efter vævs fordøjelsen centrifugeres røret ved 175 x g i 5 minutter ved 4 °c for at danne en celle pellet.
- Fjern supernatanten, svip røret for at løsne celle pellet, og resuspension celle pellet i 1 mL præ-varmet trypsin suppleret med 10 μM Y-27632 rock inhibitor. Sæt røret i et 37 °C vandbad i 5 min.
- Efter inkubation, pipette op og ned 5 gange med en standard P1000 spids. Returner røret til 37 °C vandbad i yderligere 5 minutter og Gentag trin 2.2.6.
Bemærk: På dette tidspunkt i proceduren, varm en steril 6-brønden cellekultur parabol ved at sætte det i en 55 °C inkubator.
- Tælle celler og opslæmning i matrix
- Cellerne vaskes ved tilsætning af 9 mL kold AdDMEM/F12 (+ + +), og røret centrifugeres ved 175 x g i 5 minutter ved 4 °c.
- Efter centrifugering, Fjern supernatanten, svip røret for at løsne pellet, og vask cellerne igen ved at tilføje 10 mL kold AdDMEM/F12 (+ + +). Centrifugeglasset centrifugeres ved 175 x g i 5 minutter ved 4 °c.
- Efter centrifugering, Fjern supernatanten, svip røret for at løsne pellet, resuspendere cellerne i 1 mL AdDMEM/F12 (+ + +), og tælle antallet af celler ved hjælp af et hemocytometer i henhold til standardprocedure.
- Syv-til-otte kupler passer i en brønd af en 6 brønd skål, når organoider er belagt i matrix via en drop-Wise mode. Ca. 200 μL matrix vil producere 7-8 kupler. Beslut hvor mange brønde af organoider er nødvendige for fremtidige eksperimentelle formål og beregne mængden af matrix kræves. Derefter beregnes mængden af celle-holdige opløsning, der er nødvendig for at have en endelig koncentration på 1,0 x 106 celler/ml matrix.
- Efter tælling af celler centrifugeres ved 175 x g i 5 minutter ved 4 °c. Fjern supernatanten, svip røret for at løsne pellet, og resuspension cellerne i volumen matrix beregnet i trin 2.3.4.
Bemærk: Matrix forbliver i flydende form kun ved 4 °C; Opbevar matrix-Stam slanger og matrix-celle løsninger på is på alle tidspunkter.
- Plating matrix kupler og anvendelse af medier
- Bland matrix-celle løsning med en P200 pipet til jævnt distribuere cellerne uden at indføre bobler. Fjern 6-brønd kulturskålen fra 55 °C-inkubator.
- Pipetten forsigtigt 200 μL matrixcelle opløsning, og slip hurtigt opløsningen i en brønd for at skabe kupler.
- Gentag trin 2.4.2. indtil mængden af matrix-celle opløsning er brugt. Lad kupler størkne ved stuetemperatur i 2 min.
- Vend den 6-brønden skål på hovedet og Sæt skålen i en 37 °C inkubator for at fortsætte størkning i 20 min.
- Efter inkubation tilsættes 2 mL muse-prostata organoid-medier til hver brønd. Tilsæt syntetisk androgen R1881 til hver brønd for en endelig koncentration af 1 nM og Y-27632 rock inhibitor til en endelig koncentration på 10 μM. Bland forsigtigt og Placer pladen i en 37 °C inkubator til dyrkning.
Bemærk: Organoid kultur medier skal suppleres med 10 μM Y-27632 rock hæmmer for kun 1 uge efter organoid generation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative nekropsy billeder af en mus med en stor væskefyldt primær prostata tumor i den forreste prostata region er vist i figur 2a. I modsætning hertil, figur 2B, viser repræsentative nekropsy billeder af en mus med en stor solid primær prostata tumor, som individuelle prostata regioner er umulig at skelne. Fluorescerende dissektion billeder viser den samme solide prostata tumor fra figur 2B , der udtrykker gfp, hvilket indikerer, at tumorer celler Express CRE (figur 2C). Væv, der ikke udtrykker probasin, såsom blæren, Ekspres tomat og dermed ikke udtrykker CRE (figur 2C). Leveren og lungerne fra musen fra figur 2B har METASTATISKE tumorer udtrykker gfp, viser, at de stammer fra den primære prostata tumor, og er omgivet af normalt væv, der udtrykker tomat (figur 2C ). Endelig udtrykker bækken lymfeknude fra denne mus GFP og ikke tomat, hvilket indikerer, at denne metastatiske tumor har overhalet dette organ og intet normalt væv tilbage (figur 2C).
Vi viser billeder i figur 4 af organoider vi har genereret fra en solid prostata tumor. På dag 1 dannes små organoider, som det ses i de repræsentative fasekontrast billeder. Fluorescerende billeder på dag 1 viser, at både tomat og GFP udtrykker celler er til stede i tumor organoid kultur (pile). Men ved dag 7, når prostata tumor organoider har fuldt dannet, disse organoider udtrykker GFP og ikke tomat. Disse data tyder på, at disse organoider stammer fra tumorceller, der udtrykte CRE og ikke fra normale epiteliale celler. Disse tumor organoider fortsætter med at være kun GFP-positive, da vi udvider vores kultur til passage 1 og 2.
I figur 5viser vi billeder af organoider, som vi har genereret fra en væskefyldt prostata tumor. På dag 1 dannes små organoider, og fluorescerende billeder viser, at både tomat-og GFP-ekspederende celler er til stede i den organoide kultur-svarende til vores observation på dag 1 for organoider genereret fra en solid prostata tumor (figur 4). Men, organoider fra en væskefyldt prostata tumor udtrykker enten GFP eller tomat på dag 7 — hvilket indikerer, at organoider er dannet af celler, der ikke udtrykker CRE. Dette mønster fortsætter ved passage 1 og passage 2, hvor kulturen har både tomat-og GFP-udtrykker organoider. Yderligere analyse af disse organoider er stærkt begrænset, fordi linjen er en blanding af normale epiteliale organoider og tumor organoider. Vi mener, at væskefyldte prostata tumorer er suboptimale i at generere tumor organoider simpelthen fordi der er en større procentdel af normale prostata epiteliale celler. Da både normale prostata epiteliale celler og prostatacancer celler danner organoider, er linjerne genereret fra væskefyldte prostata tumorer en blanding af normale og kræft organoider. Vi får rene tumor organoid linjer fra væskefyldte prostata tumorer ved flow sortering for GFP-positive celler og genererer organoider fra denne population af celler. Massive prostata tumorer består primært af tumorceller, derfor organiske oider genereret fra disse tumorer er en mere ren population af kræft organoider uden forudgående sortering for GFP.
Figur 1 : Vores anbefalede dissektion Order for prostatacancer (PCa) genmanipulerede musemodeller (gemms) og anatomi af muse prostata. (A) den rækkefølge, vi anbefaler i vores protokol for dissekere de store organer fra en PCa gemm. 1. urogenital region. 2. bækken lymfeknuder. 3. milt. 4. leveren. 5. nyrer. 6. lunger. 7. skinneben og femur. (B) kort over musen urogenitale region og prostata anatomi. Fluorescerende dissektion billeder af en 12 ugers gammel mus, der udtrykker probasin-CRE og MT/mG CRE reporter transgene. Blære (bl), skelsættende vesikler (SV), forreste prostata (AP), ventrale prostata (VP), lateral prostata (LP), dorsale prostata (DP), og proksimal prostata (PP). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentative dissektions billeder af prostatacancer (PCa) genmanipulerede musemodeller (Gemm'er). A) bughulen før fjernelse af det urogenitale område og det urogenitale område med en væskefyldt prostata tumor. B) bughulen før fjernelse af det urogenitale område og urogenitale regionen med en solid prostata tumor. C) repræsentativ tomat og gfp fluorescerende billeder af en solid prostata tumor, lever, lunge, og bækken lymfeknude fra en PCA gemm, der udvikler metastatiske læsioner. Scale bar = 5 mm. blære (bl), forreste prostata (AP), og dorsale prostata (DP). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Flow chart af protokollen til generering af prostata tumor organoider. Efter dissekere prostata tumor, hakte vævet i 1 mm stykker. Fordøje tumor brikkerne i collagenase, indsamle cellerne, og fordøje i trypsin for at opnå en enkelt cellesuspension. Efter optælling celler, resuspension i volumen af matrix kræves for en 1,0 x 106 celle/ml celle koncentration. Plade kupler i fad ved hjælp af en drop-Wise metode. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Repræsentative billeder fra generation af mus prostata tumor organoider fra en solid prostata tumor. Repræsentativ fasekontrast, tomat, og GFP fluorescerende billeder fra dag 1, dag 7, passage 1, og passage 2 af organoider genereret fra en solid mus prostata tumor. Scale bar = 100 μm. pile indikerer individuelle celler i fluorescerende billeder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Repræsentative billeder fra generation af mus prostata tumor organoider fra en væskefyldt tumor. Repræsentativ fasekontrast, tomat og GFP fluorescerende billeder fra dag 1, dag 7, passage 1, og passage 2 af organoider genereret fra en væskefyldt mus prostata tumor. Scale bar = 100 μm. pile indikerer individuelle celler i fluorescerende billeder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i protokollen for prostata tumor dissektion og organoid generation
Fjernelse af ikke-prostata væv og fine dissektion af musen prostata tumor er afgørende for den optimale generation af kræft organoider, da både ikke-prostata epiteliale celler og normale prostata epitelceller vil generere organoider. For solide prostata tumorer specifikt, det er afgørende at isolere områder af levedygtig tumor til at fjerne forurening med nekrotisk væv, der ville reducere antallet af levedygtige celler. Under organoid generation, væv fordøjelsen med kollagenase bør omhyggeligt overvåges, som langvarig udsættelse for kollagenase vil begrænse cellernes levedygtighed. Med organoider afledt af Cancer GEMMs, det er afgørende for fuldt genotype hver linje for at sikre, at alle transgener og modificerede alleler, der blev konstrueret i musen er til stede i organoider. Gentagelse af genotypebestemmelse efter længerevarende passaging er også nødvendig for at sikre, at genetiske modifikationer bevares.
Modifikationer og fejlfinding af prostata tumor dissektion og organoid generation
Vi har observeret mus til mus variabilitet i prostata tumor egenskaber, selv blandt dyr med samme genotype. Derfor kan specifikke modifikationer af prostata dissektion-protokollen, der er beskrevet her, være nødvendige for hver mus. Hertil kommer, at tilpasningsevne er nødvendig, når dissekerende metastatiske tumorer, da det er vanskeligt at forudsige sværhedsgraden af disse læsioner forud for start af dissektion.
Ved nogle få lejligheder har vi observeret overskydende forurening af vores celle pellet med hvad der synes at være bindevæv, selv efter fordøjelsen med både kollagenase og trypsin. Når dette sker, resuspenderer vi pellet i mindst 2 mL AdDMEM F12 (+ + +) og bruger en 40 μm cellefilter til at fjerne bindevæv. Da der er masse-til-parti variabilitet i størknings hastigheden af matrixen, kan det være nødvendigt at øge eller mindske tiden for kuppel størkning før påføring af organoid-medier.
Begrænsninger i brugen af GEMMs
Mens GEMMs er den mest stringente metode til prækliniske kræft undersøgelser, denne tilgang kræver betydelig tid, udgifter, og uddannelse. Desuden kan mus til mus variabilitet, som i studiet af mennesker, komplicere fortolkningen af data.
Begrænsninger i brugen af 3D-cellekultur
Sammenlignet med 2D cellekultur, generere og vedligeholde organoid linjer kræver øget tid og omkostninger. For eksempel, vores tumor organoid linjer er urerne hver 2-3 uger, mens cellelinjer kan urerne hver 2-3 dage. Denne langsommere vækstrate af organoider øger den tid, der kræves for at fuldføre eksperimenter betydeligt. Organoid Culture Media indeholder flere specialiserede vækstfaktorer og reagenser, som kan være dyrt afhængigt af kilden, og dermed generere og vedligeholde organoider er dyrere end traditionelle 2D cellelinjer. Endelig har vores laboratorium og andre observeret meget at masse forskelle i matrix og andre reagenser-hvilket skaber en udfordring for at opretholde konsistens i organoid vækst for langsigtede eksperimenter.
Betydning i brugen af 3D-cellekultur med hensyn til eksisterende/alternative metoder
Præklinisk kræftforskning har været domineret af 2D cellekultur og celle line-afledte xenograft modeller. Cellevækst i 2D kræver transformation/immortalization-således både in vitro og xenograft undersøgelser ved hjælp af 2D kulturer typisk ikke har uændrede normale cellelinjer til at fungere som ikke-kræftkontrol. Det sidste årti af forskning i 3D organoid kultur af normale epitel-afledte væv har nu tilladt for væksten af ikke-cancerous epitel væv, der kan bruges til at sammenligne med analoge organoider afledt af Cancer væv. Kræft organoider kan også bruges til at etablere xenografter til yderligere at forstå tumor udvikling. Desuden kan ikke-Cancer organoider bruges til at generere kontrol xenografter-hvilket ikke var muligt før 3D cellekultur metoder blev udviklet16.
Betydning i at bruge 3D cellekultur i prostatacancer forskning
I nylige undersøgelser, organoider er blevet brugt til at rekapitulere GEMM prostata tumor egenskaber. Dardenne et al. viser, at organoider genereret ved hjælp af prostata tumorer fra gemmer, der samtidig mangler tumor suppressor pten og overekspression af mycn onkogen havde større vækstpotentiale end organoider genereret ved hjælp af prostata fra kontrol GEMMs. Derudover viste både sekvensering og immunhistokemi, at tumor organoider opsummerede udtryks profilerne for prostata tumorer, der begge manglede Pten og Overudtrykte mycn21. Blattner et al. viser, at samtidig prostata overekspression af en onkogen mutant af speckle type BtB/POZ protein (spop) og sletning af pten øger hastigheden af tumor i gemms. Når prostata organoider blev genereret til overekspression mutant Spop, deres spredning blev øget i forhold til kontrol prostata organoider og Lineage markør udtryk rekapituleret oprindelige prostata tumorer22. Sammen, disse undersøgelser viser, at organoider er en optimal model for yderligere undersøgelse af prostata tumor egenskaber i GEMMS.
Organoid kultur er også blevet brugt som et redskab til at vurdere individuelle subpopulationer af prostata tumorceller. Ved hjælp af GEMM tumorer, der mangler Pten og både Pten og Trp53 tumor suppressorer i prostata Epiteliale celler, Agarwal et al. fraktionerede celler til basal og luminale progenitorer, formeret disse subpopulationer som organoider, og yderligere karakteriserede deres specifikke fænotyper23. Derved bruger 3D cellekultur, er det muligt at karakterisere subpopulationer af tumorceller, som kan være begrænset i overflod inden prostata tumorer selv.
Som beskrevet ovenfor, 3D cellekultur teknikker tillader vækst af normale epiteliale celler. Derved giver prostata organoider genereret fra gemmer, der mangler en CRE-driver, en unik model for realtidsovervågning af tumor ved induktion af CRE rekombinase in vitro. Faktisk, Dardenne et al. vurderet, hvordan NMYC overekspression påvirker vækstpotentiale i forbindelse med pten tab over tid ved ectopically udtrykker ERT2-CRE og behandle med Tamoxifen21. Desuden blev virkningen af NMYC overekspression på Androgen receptor (AR), det største mål for behandling af prostatacancer, vurderet efter induktion af CRE rekombinase i organoider genereret fra gemms21. Det samme inducerbare CRE-system blev brugt af Blattner et al. i prostata organoider til at måle, hvordan over ekspression af mutant Spop påvirker prostatacancer celle spredning og ar-ekspression22. Især eksperimenter, der inducerer CRE-ekspression in vitro, har en indbygget ikke-Cancer kontrol med køretøjs behandlede organoider.
Specifikke begrænsninger i brugen af 3D-cellekultur i prostatacancer forskning
Mens organoid vækst af normale epiteliale celler er en fordel ved at bruge 3D cellekultur teknikker, kapacitet til at vokse normale organoider har også præsenteret en udfordring i prostatacancer forskningsundersøgelser. Som vist i vores repræsentative resultater sektion, vi har observeret udvækst af normale prostata organoider i linjer genereret fra prostata tumorer, som er mindre aggressive (figur 5). En måde at løse dette fænomen er at generere organoider fra gemmer, der udtrykker en CRE reporter transgene, såsom MT/mG. Fluorescerende mikroskopi kan anvendes til at vurdere den relative ratio af normale til tumor organoider ved at observere ekspression af tomat og GFP. Desuden kan GFP udtryk bruges til at flyde sortere organoide celler til at generere ren prostata tumor organoid linjer. Agarwal et al. vis en sorteringsmetode til adskillelse af normale epiteliale celler og kræftceller fra GEMM prostata tumorer uden en CRE reporter. De viser, at epiteliale celle vedhæftnings molekyle (EpCAM)-positive celler fra prostata tumorer ikke adskilte sig i delpopulationer, når de blev sorteret ved hjælp af enten CD24 eller SCA-1 celleoverflade markører23 — således kunne disse markører anvendes til at udelukke normale prostata epiteliale celler fra GEMM prostata tumorer før organoid generation. Vores laboratorium og andre har observeret, at de betingelser, hvorunder prostatacancer celler danner organoider synes at enten vælge for eller fremme Lineage specifikke genekspression programmer karakteristisk for prostata basal epiteliale celler. Dette er en betydelig udfordring, fordi prostata tumorer i både mus og mennesker er primært luminale i naturen, udtrykker AR, CK8, og andre luminale markører, og sjældent udtrykke basal Lineage markører såsom p63 eller CK5. Selv om dette fænomen endnu ikke er offentliggjort i detaljer, viser immunhistokemisk analyse, at ar er faldet i ptenf/+ organoider sammenlignet med ptenf/+ prostata21. Den udvækst af basal epiteliale celler i prostatacancer organoider sætter spørgsmålstegn ved, om disse linjer er virkelig en nøjagtig præklinisk model af prostatakræft.
Mens prostatacancer organoider er blevet dokumenteret for at modellere tumoren, hvorfra de er afledt bedre end traditionel 2D-kultur, er der potentiale for, at organoider undergår genetiske ændringer i kulturen, især efter flere passager. I øjeblikket er vi ikke bekendt med nogen offentliggjorte undersøgelser, der har dokumenteret spontane genetiske mutationer, genetiske gevinster eller tab, eller epigenetiske ændringer, der er fælles efter langvarig passaging af prostatacancer organoider. For at begrænse variabiliteten som følge af genetiske eller epigenetiske forandringer, der kan opstå på grund af længerevarende passaging, bør eksperimenter udføres i tidlige organoider fra tidlige passager (< 10) så ofte som muligt.
Fremtidige anvendelser af 3D cellekultur
Selv om det er umuligt at forudsige alle fremtidige applikationer, der vil blive udviklet ved hjælp af 3D cellekultur i kræftforskning, der er flere muligheder, der synes at have det største potentiale. Som med 2D cellelinjer, udfører in vitro genetisk modifikation relativt ligetil i organoider. Ændring af specifikke gener i enten normale eller kræft organoider åbner mange muligheder i studiet af mekanismerne for tumorigenesis, kræft progression, og behandling-især når genetisk modificerede organoider bruges til at generere organoid xenografter. Genetisk modifikation af organoider er meget fordelagtig, når GEMMs ikke eksisterer for et bestemt gen eller oprettelse af en ny GEMM er uden for rammerne af en bestemt undersøgelse.
Kræft organoid kultur har også mange potentielle anvendelser for klinisk forskning. Et bibliotek med relevante tumor-undertyper inden for hvert organsystem fra både patienter og dyremodeller kan bruges til hurtigt at vurdere effekten af et nyt lægemiddel eller en ny kombination af eksisterende lægemidler. Da 3D-cellekulturen bliver mainstream og øger effektiviteten, har generering af patient afledte organoider med henblik på personlig medicin potentiale til at hjælpe med at skræddersy behandlingen for hver kræftpatient ved at teste alle tilgængelige lægemidler og kombinationer af lægemidler ved hjælp af hans eller hendes individuelle organoid linje16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke finansielle relationer til at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Calvin Kuo Laboratory på Stanford University for at levere HEK293 celler stabilt transficeret med enten ha-Mouse Noggin-FC eller ha-Mouse Rspo1-FC. Vi vil også gerne takke Dr. Dean tang for at give os adgang til fluorescerende dissektion mikroskop i hans laboratorium. Dette arbejde blev støttet af CA179907 til D.W.G. fra National Cancer Institute. Delte ressourcer på Roswell Park Comprehensive Cancer Center blev støttet af nationale institutter for Health Cancer Center support Grant CA016056.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
| 1 1/4 inch, 23 G, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| 32% paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
| Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
| EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
| HEPES (1 M) | Sigma | 25-060 | |
| human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
| N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
| Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
| Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
| Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
| Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
| Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |
References
- Capecchi, M. R. Altering the genome by homologous recombination. Science. 244 (4910), 1288-1292 (1989).
- Furth, P. A., et al. Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (20), 9302-9306 (1994).
- Aranda, M., et al. Altered directionality in the Cre-LoxP site-specific recombination pathway. Journal of Molecular Biology. 311 (3), 453-459 (2001).
- Schwenk, F., Kuhn, R., Angrand, P. O., Rajewsky, K., Stewart, A. F. Temporally and spatially regulated somatic mutagenesis in mice. Nucleic Acids Research. 26 (6), 1427-1432 (1998).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K.
- Goodrich, M. M., Talhouk, R., Zhang, X., Goodrich, D. W. An approach for controlling the timing and order of engineered mutations in mice. Genesis. 56 (8), 23242 (2018).
- Brocard, J., et al. Spatio-temporally controlled site-specific somatic mutagenesis in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14559-14563 (1997).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Bluemn, E. G., et al. Androgen Receptor Pathway-Independent Prostate Cancer Is Sustained through FGF Signaling. Cancer Cell. 32 (4), 474-489 (2017).
- Zhou, Z., et al. Synergy of p53 and Rb deficiency in a conditional mouse model for metastatic prostate cancer. Cancer Research. 66 (16), 7889-7898 (2006).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Oliveira, D. S., et al. The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).
- Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of Bone: Literature Review and Practical Study of Various Decalcifying Agents, Methods, and Their Effects on Bone Histology. The Journal of Histotechnology. (21), 49-58 (1998).
- Dardenne, E., et al. N-Myc Induces an EZH2-Mediated Transcriptional Program Driving Neuroendocrine Prostate Cancer. Cancer Cell. 30 (4), 563-577 (2016).
- Blattner, M., et al. SPOP Mutation Drives Prostate Tumorigenesis In Vivo through Coordinate Regulation of PI3K/mTOR and AR Signaling. Cancer Cell. 31 (3), 436-451 (2017).
- Agarwal, S., et al. Identification of Different Classes of Luminal Progenitor Cells within Prostate Tumors. Cell Reports. 13 (10), 2147-2158 (2015).
