Summary
Wir zeigen eine Methode zur Nekropsie und Zerlegung von Prostatakrebsmodellen der Maus, die sich auf die Prostatatumorsektion konzentriert. Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Erzeugung von Maus-Prostatatumor-Organoiden wird ebenfalls vorgestellt.
Abstract
Methoden, die auf homologe Rekombination basieren, um Gene zu modifizieren, haben die biologische Forschung erheblich gefördert. Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) sind eine strenge Methode zur Untersuchung der Entwicklung und Krankheit von Säugetieren. Unser Labor hat mehrere GEMMs von Prostatakrebs (PCa) entwickelt, die keine Expression eines oder mehrerer Tumorsuppressorgene mit dem standortspezifischen Cre-loxP-Rekombinatosasesystem und einem Prostata-spezifischen Promotor haben. In diesem Artikel beschreiben wir unsere Methode zur Nekropsie dieser PCa GEMMs, die sich in erster Linie auf die Zerlegung von Prostatatumoren der Maus konzentriert. Neue Methoden, die in den letzten zehn Jahren entwickelt wurden, haben die Kultur epitheliaaler Zellen erleichtert, Organsysteme in vitro in drei Dimensionen zu modellieren. Wir beschreiben auch eine 3D-Zellkultur-Methode, um Tumor-Organoide aus Maus-PCa GEMMs zu generieren. Die präklinische Krebsforschung wurde von 2D-Zellkultur und zelllinienabgeleiteten oder vom Patienten abgeleiteten Xenograft-Modellen dominiert. Diese Methoden fehlen Tumor-Mikroumgebung, eine Einschränkung der Verwendung dieser Techniken in präklinischen Studien. GEMMs sind physiologisch relevanter für das Verständnis von Tumorgenese und Krebsprogression. Tumororganoidkultur ist ein In-vitro-Modellsystem, das Tumorarchitektur und Zelllinieneigenschaften rekapituliert. Darüber hinaus ermöglichen 3D-Zellkulturmethoden das Wachstum normaler Zellen zum Vergleich mit Tumorzellkulturen, die mit 2D-Zellkulturtechniken nur selten möglich sind. In Kombination hat die Verwendung von GEMMs und 3D-Zellkultur in präklinischen Studien das Potenzial, unser Verständnis der Krebsbiologie zu verbessern.
Introduction
Seit den späten 1980er Jahren hat die Fähigkeit, Gene durch homologe Rekombination zu verändern, die Untersuchung biologischer Systeme stark vorangebracht1. Induzible, gewebe- oder zellspezifische promotorische Systeme und standortspezifische Rekombinatore wie Cre-loxP haben fortgeschrittene genetische Studien, indem sie die Kontrolle über genetische Veränderungen sowohl zeitlich als auch räumlich erleichtern2,3, 4. Die Kombination dieser genetischen Strategien hat eine breite Palette von experimentellen Modellsystemen5,6,7geschaffen.
Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) sind ein integrales Werkzeug, um zu beurteilen, wie einzelne Gene oder Gengruppen die Entwicklung und Krankheit von Säugetieren beeinflussen. In der präklinischen Krebsforschung sind GEMMs die physiologisch relevanteste und strengste Methode zur Untersuchung der Krebsentwicklung, Progression und Behandlung8. Unser Labor ist spezialisiert auf die Erzeugung und Charakterisierung von Krebs-GEMMs.
Der am häufigsten diagnostizierte nicht-kutane Krebs bei Männern in den Vereinigten Staaten ist Prostatakrebs (PCa). Die Mehrheit der Patienten mit PCa haben eine Erkrankung mit geringem Risiko und eine hohe Überlebenswahrscheinlichkeit, aber die Überlebensraten sinken drastisch, wenn die Krankheit im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert wird oder wenn eine gezielte Hormontherapie das Fortschreiten zu einer aggressiven, nicht heilbaren PCa induziert. Subtypen9,10. Unser Labor hat GEMMs entwickelt, die Flockenallele eines oder mehrerer Tumorsuppressorgene verwenden. Rekombination und Verlust der Tumorsuppressor-Genexpression tritt speziell in der Prostata auf, da wir ein Transgen mit Cre-Rekombinantase flussabwärts des Probasinpromotors eingeführt haben, der nur in den Prostataepithelzellen aktiviert ist11, 12. Wir haben auch unsere GEMMs gezüchtet, um ein Cre-Reporter-Transgen namens mT/mG zu enthalten, das eine tomatenfluoreszierende Proteinexpression in Zellen ohne Cre- und grüne fluoreszierende Protein-Expression (GFP) in Zellen mit Cre13induziert. Während die Präsentation dieser Methode und unsere repräsentativen Ergebnisse GEMMs zeigen, die wir in unserem Labor untersuchen, kann dieses Protokoll verwendet werden, um Prostatakrebs-Organoide aus jedem Mausmodell zu erzeugen. Jedoch, wie im Detail in unserem repräsentativen Ergebnisabschnitt diskutiert, haben wir beobachtet, dass bestimmte Tumoreigenschaften für die Erzeugung von Prostatakrebs-Organoid optimal sind.
In den letzten zehn Jahren haben neue Methoden zur Kultivierung von Zellen aus Geweben epithelialen Ursprungs zu signifikanten Fortschritten in unserer Fähigkeit geführt, Organsysteme in vitro14,15zu modellieren. Der Begriff "3D-Zellkultur" wurde den Techniken bei der Herstellung und Aufrechterhaltung von Organoiden zugeschrieben, die im Allgemeinen als Strukturen definiert werden können, die aus Zellen bestehen, die sekundäre Architektur zusammenfügen, die durch organspezifische Zelllinien angetrieben wird. Merkmale16. Diese neuen Methoden unterscheiden sich von der klassischen 2D-Zellkultur dadurch, dass Zellen keine Transformation oder Verewigung für langfristiges Wachstum erfordern; So können 3D-Kulturen normaler Zellen mit erkrankten Zellen verglichen werden. Dies ist besonders wertvoll in der Krebsforschung, wo normale Zellkontrollkulturen in der Regel nicht verfügbar waren. Darüber hinaus bilden Organoide spontan sekundäre Gewebearchitekturen mit entsprechend differenzierten Zelltypen, was sie zu einem besseren Modellsystem macht, um Krebs in vitro zu verstehen als 2D-Zelllinien17. Unser Labor hat 3D-Organoidlinien aus Tumorproblem erstellt, die aus unseren PCa GEMMs isoliert wurden, um unsere In-vivo-Daten zu ergänzen und Experimente durchzuführen, die bei GEMMs nicht möglich wären.
In diesem Artikel stellen wir schriftliche und visuelle Protokolle für die komplette Nekropsie von PCa GEMMs vor, einschließlich der Zerlegung von verschiedenen Mausprostatalappen und metastasierenden Läsionen. Wir beschreiben und zeigen eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Erzeugung von Organoiden aus Maus-Prostatatumoren auf der Grundlage eines Protokolls, das zuvor von Drost et al. veröffentlicht wurde, um Organoide aus normalem Maus-Prostatagewebe abzuleiten18.
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Protocol
Die hier beschriebenen Tierprozeduren wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Department of Laboratory Animal Resources, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, New York durchgeführt.
HINWEIS: Männliche Mäuse, die seziert werden, um Prostata- oder Prostatatumoren für die Erzeugung von Organoiden zu isolieren, sollten mindestens das Alter der Geschlechtsreife erreicht haben – etwa 8-10 Wochen alt. Spezifische Spezifienalter von Mäusen können von Studien zu Studien variieren. Einige Faktoren, die bei der Wahl des Alters zu berücksichtigen sind, sind altersabhängige Veränderungen in Prostatazellpopulationen, altersabhängige Expression spezifischer promotorischer Cre-Transgene und die Rate der Prostatatumorprogression in einem bestimmten GEMM.
1. Dissektion und Bildgebung von Maus-Prostatatumor und metastasierenden Tumoren
- Vorbereitungen
- Erhalten Sie die notwendigen sterilen Sezierwerkzeuge. Bühnenrortungsfläche auf sauberer, steriler Oberfläche mit 15 cm Lineal, Präzisionsbalance, analytischem Gleichgewicht, Sprühflasche mit 70% Ethanol, phosphogepufferter Salzwäsche (PBS) und Papiertüchern.
-
Vorbereitung von fixativen Lösungen für viszerale Organe und Knochen, die nicht für die Organoiderzeugung verwendet werden dürfen
- Für viszerale Organe: Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS vor. Für eine Maus 20 ml von 4% PFA machen, aliquot in zwei 15 ml konische Rohre und halten bei Raumtemperatur bis zum Gebrauch.
- Für lange Knochen: Aliquot 10 ml vorgefertigtes 10% neutral gepuffertes Formalin (NBF) in einem 15 ml konischen Rohr und bei Raumtemperatur bis zum Gebrauch aufbewahren.
- Unbehandeltes 10 cm Geschirr erhalten und mit nicht sterilen PBS füllen – diese dienen als temporäre Behälter für Organe während der Feinsektion mit einem Seziermikroskop.
HINWEIS: Sterile Werkzeuge werden zum Sezieren von Geweben zur Erzeugung von Organoiden verwendet. Nicht-sterile Werkzeuge werden für den anfänglichen Einschnitt und die Zerlegung der Hinterbeine verwendet.
- Euthanasie und Ersterschnitt
- Euthanisieren Sie die Maus durch CO2-Erstickung mit einer Durchflussrate von 2,0 l/min für 5 min. Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig und führen Sie zervikale Dislokation durch. Verwenden Sie die Präzisionswaage, um das Körpergewicht und die Aufzeichnung der Maus zu messen.
- Legen Sie die Maus auf ein Papiertuch und orientieren Sie sich an der sezierenden Oberfläche ventrale Seite nach oben mit dem Kopf der Maus weg vom Ermittler. Befestigen Sie die Maus an der Tafel, indem Sie ihre Gliedmaßen ausstrecken und jede der Vorderpfoten und Hinterpfoten mit einer Einwegnadel durchbohren.
- Mit einer Sprühflasche das Fell der Maus mit 70% Ethanol dosieren. Mit nicht-sterilen Sezierschere und geradeZange, kneifen Sie nur über dem Penis der Maus und machen einen kleinen Schnitt durch das Fell nur.
- Setzen Sie den Schnitt Mittellinie bis zum Hals der Maus nur durch das Fell. Machen Sie bilaterale Einschnitte vom Punkt des anfänglichen Einschnitts durch die ventrale Ebene der Maus nur durch das Fell.
- Greifen Sie das Fell und ziehen Sie es vorsichtig weg von der Haut der Maus. Pin das Fell an das Brett, um den Zugang zu den Bauch- und Brusthöhlen zu ermöglichen.
- Extraktion des männlichen Urogenitalsystems en bloc
- Mit steriler Sezierschere und geraden Zangen vorsichtig durch die Haut ca. 0,75 cm über dem Rektum schneiden. Setzen Sie den Schnitt Mittellinie bis zum Brustkorb fort, ohne Organe in der Bauchhöhle zu stören. Ziehen Sie vorsichtig die Haut weg und heften Sie sich an das Brett, um die gesamte Bauchhöhle freizulegen.
HINWEIS: Lassen Sie diese Instrumente nicht die Außenseite der Maus oder eine Oberfläche im Staging-Bereich berühren, da diese Gewebe verwendet werden, um Organoide zu erzeugen. - Sezieren Sie das Urogenitalsystem und andere Organe gemäß dem Diagramm in Abbildung 1A, mit Zahlen, die die Reihenfolge angeben, in der die Organe von der Maus entfernt werden.
- Finden Sie die Blase, dann greifen Sie das Fettpolster nach links oder rechts und ziehen Sie nach oben, um den Hoden zu belichten. Sezieren Sie vorsichtig den Hoden vom Rest der Urogenitalregion und legen Sie ihn beiseite. Führen Sie das gleiche Verfahren auf der anderen Seite durch.
HINWEIS: Um die optimale Gewebequalität und die detaillierte Tumorcharakterisierung von Prostatatumoren zu erreichen, muss der gesamte Urogenitalbereich aus der Maus en bloc19entfernt werden. Es wird empfohlen, zuerst den Urogenitalbereich zu entfernen (Abbildung 1A). - Greifen Sie die Blase und ziehen Sie vorsichtig nach oben, so dass sich der Urogenitalbereich zusammenhebt und die Harnröhre darunter freilegt. Während Sie die Blase halten, orientieren Sie die Schere so, dass sie an der Unterseite der dorsalen Prostata sind und schneiden Sie die Harnröhre. Die gesamte Urogenitalregion wird dann aus der Bauchhöhle freigesetzt.
- Den Urogenitalbereich in eine 10 cm große Schale geben, die mit PBS gefüllt ist. Wenn noch mit Urin gefüllt, entleeren Sie die Blase, indem Sie einen kleinen Schnitt. Wiegen Sie mit der analytischen Waage das Urogenitalsystem und zeichnen Sie auf.
- Mit steriler Sezierschere und geraden Zangen vorsichtig durch die Haut ca. 0,75 cm über dem Rektum schneiden. Setzen Sie den Schnitt Mittellinie bis zum Brustkorb fort, ohne Organe in der Bauchhöhle zu stören. Ziehen Sie vorsichtig die Haut weg und heften Sie sich an das Brett, um die gesamte Bauchhöhle freizulegen.
- Extraktion von Beckenlymphknoten, Milz, Leber, Niere, Lunge, Tibia und Oberschenkelknochen
- Das Entfernen des Urogenitalsystems setzt die Beckenlymphknoten frei, die direkt hinter dem Urogenitalsystem (Abbildung 1A) und auf beiden Seiten der Wirbelsäule positioniert sind. Die Lymphknoten sind nur sichtbar, wenn sie metastasierende Läsionen enthalten oder wenn es eine lokale Entzündung gibt. Richten Sie die geraden Zangen unter dem Lymphknoten aus und ziehen Sie nach oben, um den Lymphknoten zu entfernen. Führen Sie das gleiche Verfahren auf der anderen Seite durch.
- Greifen Sie das Rektum mit den geraden Zangen und schneiden. Ziehen Sie auf dem Rektum, um den gesamten Dickdarm und Dünndarm zu entwirren, auf der Suche nach metastasierenden Läsionen in den mesenterischen Lymphknoten. Wenn das gesamte Ileum entfernt wird, ziehen Sie weiter auf dem Zwölffingerdarm, um den Magen zu entblößen. Schneiden Sie die Speiseröhre, um den Magen vollständig zu entfernen und zu entsorgen. Wenn metastasierende Läsionen in den Lymphknoten beobachtet werden, sezieren Sie vorsichtig weg vom Darm und lagern Sie in einer 10 cm Schale PBS.
- Das Aussetzen und Entfernen des Magens wird die Milz von der Rückenseite des Bauches ziehen (Abbildung 1A). Entfernen Sie die Milz und legen Sie sie in 4% PFA. Die Milz dient als Färbungskontrolle für Hemotoxylin, da es sehr zellulär ist.
HINWEIS: Viszerale Gewebe, die nicht für die Organoiderzeugung verwendet werden, werden über Nacht in 4% PFA fixiert, mit PBS gewaschen und dann in 70 % Ethanol gegeben. - Entfernen Sie die Leber im oberen Teil des Bauches (Abbildung 1A). Basierend auf der metastasierenden Belastung in der Leber können einzelne Lappen seziert oder die gesamte Leber durch vorsichtiges Schneiden entlang der Membran entfernt werden. (Schneiden Sie das Zwerchfell zu diesem Zeitpunkt nicht durch). Die Leber in eine 10 cm große Schale PBS geben.
- Die Entfernung der Leber wird die Nieren auf beiden Seiten der Wirbelsäule vollständig aussetzen (Abbildung 1A). Entfernen Sie die Nieren – zusammen mit den Nierenlymphknoten, wenn die Knoten metastasierende Läsionen haben – indem Sie die geradezange Zange unter die Niere legen und nach oben ziehen. Führen Sie das gleiche Verfahren für die andere Seite durch.
- Um die Brusthöhle freizulegen, schneiden Sie das Zwerchfell vorsichtig entlang des Brustkorbs. Durch das Durchbohren des Zwerchfells wird der Unterdruck in der Brusthöhle freigesetzt und Herz und Lunge freisetzen (Abbildung 1A).
- Greifen Sie das Brustbein und ziehen Sie nach oben, um die Brusthöhle weiter zu öffnen. Beobachten Sie die ventrale Fläche der Brusthöhle entlang des Rippenkäfigs auf metastasierende Läsionen in den brustbrustigen Lymphknoten und sezieren Sie, falls vorhanden.
- Während Sie das Brustbein noch halten, schneiden Sie den ventralen Rippenkäfig weg, um auf das Herz und die Lunge zuzugreifen. Greifen Sie das Herz, ziehen Sie nach oben und schneiden Sie unter der Lunge. Um Herz und Lunge en bloc vollständig zu entfernen, schneiden Sie alle vorderen Blutgefäße und die Luftröhre. Legen Sie das Gewebe in PBS und entfernen Sie vorsichtig das Herz, ohne das Lungengewebe oder die metastasatheischen Lungenläsionen zu schädigen.
- Nehmen Sie die nicht sterilen geraden Zangen und sezieren Schere und schneiden Sie das Hinterbein an der Spitze des Oberschenkelknochens. Greifen Sie vorsichtig den Oberschenkelknochen und entfernen Sie das Hinterbein aus dem Fell.
- Legen Sie das Hinterbein auf ein Papiertuch und greifen Sie die Hinterpfote. Verwenden Sie die einschneidige Rasierklinge, um alle Muskeln und Bindegewebe von der Tibia und Demfemur zu verschrotten / zu schneiden. Entfernen Sie den Oberschenkelknochen von der Tibia, indem Sie hinter der Patella die Patellasehne schneiden und entfernen Sie die Tibia, indem Sie die Hinterpfote entfernen. Platzieren Sie die Tibia und den Oberschenkelknochen in 10% NBF. Führen Sie das gleiche Verfahren auf der anderen Seite durch.
HINWEIS: Zur Untersuchung der langen Knochen der Maus auf metastasierende Läsionen muss die Fibel nicht intakt sein. Die langen Knochen werden in 10% NBF für eine Woche fixiert und dann mit neutraler EDTA-Lösung20entkalkt. Nach drei Wochen werden die Knochen auf 70% Ethanol übertragen. - Nach dem Entfernen der Hinterbeine, nehmen Sie ein Ohr oder Schwanz schneiden für zukünftige Genotypisierung. Entsorgen Sie den Mauskadaver und das gesamte Gewebe, das nicht fixiert oder für die Organoiderzeugung verwendet werden soll.
- Zerlegung des Prostatatumors
HINWEIS: Die Zerlegung von Mausprostatalappen kann nur mit einem Sezierendes Mikroskop erreicht werden19. Die Prostatatumorbelastung kann jedoch so hoch sein, dass einzelne Lappen nicht unterschieden werden können und die Zerlegung ohne Mikroskop durchgeführt werden kann. Dennoch wird das vollständige Protokoll zur Zerlegung einzelner Prostatalappen unten beschrieben.- Legen Sie den Urogenitalbereich in eine 10 cm große Schale PBS unter einem Sezierendes Mikroskop und richten Sie die ventrale Seite nach oben mit der Blase und den Samenbläschen, die vom Forscher weggerichtet sind. Alle Manipulationen der Urogenitalregion sollten mit sterilen Instrumenten erfolgen.
- Beurteilen Sie den allgemeinen Phänotyp des Prostatatumors - höchstwahrscheinlich wird entweder ein flüssigkeitsgefüllter oder ein solider Tumor in PCa GEMMs beobachtet (Abbildung 2A, B).
HINWEIS: Flüssigkeitsgefüllte Tumoren befinden sich oft im vorderen Prostatabereich (Abbildung 2A). Flüssigkeitsgefüllte Tumoren bestehen hauptsächlich aus Bindegewebe mit spärlichen Epithelkomponenten – daher sind diese Tumoren aufgrund der geringen Anzahl von Tumorepithelzellen nicht optimal für die Organoiderzeugung, wie in den repräsentativen Ergebnissen diskutiert wird. teil. - Wenn flüssigkeitsgefüllte Tumoren vorhanden sind, schlagen Sie ein kleines Loch in den Tumor. Legen Sie den Urogenitalbereich in eine neue 10 cm Schale PBS.
- Nehmen Sie ein Paar gerade Zangen in der nicht-dominanten Hand und gekrümmte Zange in der dominanten Hand. Drehen Sie die Urogenitalregion in ihr dorsales Gesicht. Suchen Sie nach dem proximalen Prostatabereich (Abbildung 1B), der durch die rosa/rote Farbe der Harnröhre identifiziert werden kann. Greifen Sie die Harnröhre und halten Sie fest, um das Urogenitalgewebe mit den gekrümmten Zangen zu manipulieren.
HINWEIS: Beachten Sie während der Prostatasektion immer die Lage der Blase, da dies der einfachste Weg ist, die einzelnen Prostatalappen zu lokalisieren (Abbildung 1B).
- Entfernung von Nicht-Prostatagewebe aus dem Urogenitalbereich
- Während sie noch auf dem dorsalen Gesicht der Urogenitalregion sind, finden Sie die Basis des Samenbläschens. Entfernen Sie vorsichtig das Samenbläschen und entsorgen Sie es. Führen Sie das gleiche Verfahren auf der gegenüberliegenden Seite aus.
HINWEIS: Vermeiden Sie das Sperma-Vesikel zu punktieren, da dies klebrige und undurchsichtige sekretorische Flüssigkeit freisetzt, die die Prostatadissektion stört. Wenn das Samenbläschen punktiert ist, übertragen Sie den verbleibenden Urogenitalbereich auf eine neue 10 cm Schale mit frischem PBS. - Entfernen und entsorgen Sie die Vas deferens und so viel Fett- und Bindegewebe wie möglich mit der gekrümmten Seite der Zange.
- Während Sie die Harnröhre/proximale Prostataregion noch fest halten, verwenden Sie eine feine, spitze Schere, um die Blase aus der Harnröhre zu entfernen.
- Während sie noch auf dem dorsalen Gesicht der Urogenitalregion sind, finden Sie die Basis des Samenbläschens. Entfernen Sie vorsichtig das Samenbläschen und entsorgen Sie es. Führen Sie das gleiche Verfahren auf der gegenüberliegenden Seite aus.
- Isolierung einzelner Prostatalappen
- Suchen Sie die vordere Prostata (Abbildung 1B). Achten Sie darauf, die proximale Prostataregion/Harnröhre mit den geraden Zangen fest zu halten. Entfernen Sie den vorderen Prostatabereich, indem Sie das Gewebe direkt mit der gekrümmten Seite der Zange erfassen und fest von der Blase und dem Rest der Prostata wegziehen. Legen Sie das Gewebe in PBS.
HINWEIS: Für alle Prostataregionen kann eine Schere entfernt werden, um das Gewebe zu entfernen, abhängig von der Größe des Tumors. - Suchen Sie den ventralen Prostatabereich (Abbildung 1B). Entfernen Sie den ventralen Prostatabereich auf die gleiche Weise wie in Schritt 1.5.7.
- An dieser Stelle in der Zerlegung sollten nur die seitlichen und dorsalen Prostataregionen vorhanden sein, während die proximale Prostataregion noch von den geraden Zangen erfasst wird. Bewerten Sie die lateralen und dorsalen Prostataregionen (Abbildung 1B). Wenn der laterale Bereich von der dorsalen Region unterschieden werden kann, entfernen Sie den seitlichen Prostatabereich, wie in Schritt 1.5.7 beschrieben. Führen Sie das gleiche Verfahren auf der gegenüberliegenden Seite.
- Entfernen Sie den dorsalen Prostatabereich, wie in Schritt 1.5.7 beschrieben. Platzieren Sie die proximale Prostataregion in 4% PFA, da ihre Struktur innerhalb des Muskelgewebes der Harnröhre es für die Organoiderzeugung ungeeignet macht.
- Suchen Sie die vordere Prostata (Abbildung 1B). Achten Sie darauf, die proximale Prostataregion/Harnröhre mit den geraden Zangen fest zu halten. Entfernen Sie den vorderen Prostatabereich, indem Sie das Gewebe direkt mit der gekrümmten Seite der Zange erfassen und fest von der Blase und dem Rest der Prostata wegziehen. Legen Sie das Gewebe in PBS.
2. Erzeugung von 3D-Organoiden aus Prostatatumorgewebe
HINWEIS: Abbildung 3 zeigt eine bildliche Beschreibung des Verfahrens zur Erzeugung von Tumororganoiden.
- vorbereitung
- Bereiten Sie Maus Prostata-Organoid-Medien nach Drost et al.18 mit den folgenden Änderungen. Verwenden Sie konditioniertes Medium anstelle von rekombinanten Proteinen für Noggin und R-Spondin und verwenden Sie eine Endkonzentration von 1% (v/v), statt 10%, für Noggin- und R-Spondin-konditioniertes Medium.
HINWEIS: HEK293-Zellen, die mit HA-Maus Noggin-Fc oder HA-Maus Rspo1-Fc stabil transfiziert werden, werden zur Herstellung von Noggin- bzw. R-Spondin-konditionierten Medien verwendet. Diese Zelllinien waren ein Geschenk des Calvin Kuo Laboratory an der Stanford University. - Bereiten Sie die Verdauungslösung in einem 15 ml-Rohr vor, indem Sie 20 mg/ml Kollagennase II mit Advanced DMEM/F12(+++) Medien auf eine Endkonzentration von 5 mg/ml verdünnen. Fügen Sie y-27632 Rock Inhibitor der Kollagenase-II-Lösung in einer Endkonzentration von 10 m hinzu.
HINWEIS: Das Verhältnis von Verdauungspuffer zu Gewebe beträgt 1 ml bis 50 mg, das wir nach Drost et al.18verwenden.
- Bereiten Sie Maus Prostata-Organoid-Medien nach Drost et al.18 mit den folgenden Änderungen. Verwenden Sie konditioniertes Medium anstelle von rekombinanten Proteinen für Noggin und R-Spondin und verwenden Sie eine Endkonzentration von 1% (v/v), statt 10%, für Noggin- und R-Spondin-konditioniertes Medium.
- Verarbeitung und Verdauung von Tumorgewebe
- In der Zellkulturhaube prostatatumorgewebe in eine sterile 10 cm Kulturschale legen, nekrotisches Gewebe sezieren und entsorgen.
- Schneiden Sie das verbleibende Prostatatumorgewebe in 1 mm3 Würfel, indem Sie die Gewebestücke mit den sterilen gekrümmten Zangen halten und mit einer Sezierschere schneiden.
- Legen Sie die gehackten Tumorstücke in das 15 ml-Rohr mit dem Verdauungspuffer, indem Sie sie mit der gekrümmten Seite der Zange aufschaufeln. Verdauen Sie das Tumorgewebe bei 37 °C mit Schütteln für 1,5 bis 2 h. Überprüfen Sie den Verdauungsfortschritt alle 20 min.
HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt mindestens 2 ml Matrix aus -20 °C Lagerung herausnehmen und auf Eis auftauen. 1 ml Aliquots der Matrix werden etwa 3 h zum Tauen brauchen. - Nach der Gewebeverdauung zentrifugieren Sie das Zentrifugenrohr bei 175 x g für 5 min bei 4 °C, um ein Zellpellet zu bilden.
- Entfernen Sie den Überstand, flicken Sie das Rohr, um das Zellpellet zu lösen, und setzen Sie das Zellpellet in 1 ml vorgewärmtem Trypsin wieder auf, ergänzt mit 10 'M Y-27632 Rock Inhibitor. Legen Sie das Rohr in ein 37 °C Wasserbad für 5 min.
- Nach der Inkubation, Pipette auf und ab 5 Mal mit einer Standard-P1000 Spitze. Geben Sie das Rohr für weitere 5 min auf 37 °C Wasserbad zurück und wiederholen Sie Schritt 2.2.6.
HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt im Verfahren, erwärmen Sie eine sterile 6-Well-Zell-Kulturschale, indem Sie es in einen 55 °C Inkubator.
- Zählen von Zellen und Resuspension in Matrix
- Waschen Sie die Zellen, indem Sie 9 ml kaltes AdDMEM/F12(+++) hinzufügen und das Rohr bei 175 x g bei 175 x g zentrifugieren, 5 min bei 4 °C.
- Nach der Zentrifugation den Überstand entfernen, das Rohr zum Lösen des Pellets ziehen und die Zellen erneut waschen, indem 10 ml kaltes AdDMEM/F12(+++) hinzugefügt werden. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 175 x g für 5 min bei 4 °C.
- Nach der Zentrifugation entfernen Sie den Überstand, ziehen Sie das Rohr, um das Pellet zu lösen, setzen Sie die Zellen in 1 ml AdDMEM/F12(+++) wieder auf und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer nach Standardverfahren.
- Sieben bis acht Kuppeln passen in einen Brunnen einer 6-Brunnen-Schale, wenn Organoide tropfenweise in Matrix plattiert werden. Etwa 200 l Matrix erzeugen 7-8 Dome. Entscheiden Sie, wie viele Brunnen von Organoiden für zukünftige experimentelle Zwecke benötigt werden, und berechnen Sie das benötigte Matrixvolumen. Berechnen Sie dann das Volumen der zellhaltigen Lösung, die für eine Endkonzentration von 1,0 x 106 Zellen/ml Matrix erforderlich ist.
- Nach dem Zählen der Zellen zentrifugieren Sie bei 175 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand, flicken Sie das Rohr, um das Pellet zu lösen, und suspendieren Sie die Zellen im Volumen der Matrix, berechnet in Schritt 2.3.4.
HINWEIS: Matrix bleibt in flüssiger Form nur bei 4 °C; Matrixstockröhren und Matrixzelllösungen jederzeit auf Eis halten.
- Beschichtung von Matrixkuppeln und Anwendung von Medien
- Mischen Sie Matrix-Zell-Lösung mit einer P200 Pipette, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, ohne Blasen einzuführen. Entfernen Sie das 6-Well-Kulturgericht aus dem 55 °C-Inkubator.
- Sorgfältig Pipetten 200 l Matrix-Zell-Lösung und schnell fallen die Lösung in einen Brunnen, um Kuppeln zu erstellen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.4.2. bis das Volumen der Matrix-Zell-Lösung verbraucht ist. Lassen Sie die Kuppeln bei Raumtemperatur für 2 min erstarren.
- Drehen Sie die 6-Well-Schale auf den Kopf und legen Sie die Schale in einen 37 °C-Inkubator, um die Erstarrung für 20 min fortzusetzen.
- Nach der Inkubation, fügen Sie 2 ml Maus Prostata-Organoid-Medien zu jedem Brunnen. Fügen Sie synthetisches Androgen R1881 zu jedem Brunnen für eine Endkonzentration von 1 nM und Y-27632 Rock Inhibitor zu einer Endkonzentration von 10 m hinzu. Sorgfältig mischen und die Platte in einen 37 °C-Inkubator für die Kultivierung legen.
HINWEIS: Organoide Kulturmedien müssen nur 1 Woche nach der Organoid-Generation mit 10 'M Y-27632 Rock Inhibitor ergänzt werden.
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Representative Results
Repräsentative Nekropsiebilder einer Maus mit einem großen flüssigkeitsgefüllten primären Prostatatumor im vorderen Prostatabereich sind in Abbildung 2Adargestellt. Im Gegensatz dazu zeigt Abbildung 2Brepräsentative Nekropsiebilder einer Maus mit einem großen festen primären Prostatatumor, für den einzelne Prostataregionen nicht zu unterscheiden sind. Fluoreszierende Dissektionsbilder zeigen den gleichen soliden Prostatatumor aus Abbildung 2 B, der GFP exprimiert, was darauf hinweist, dass die Tumorzellen Cre exprimieren (Abbildung 2C). Gewebe, das nicht Probasin ausdrückt, wie die Blase, Express Tomate und damit nicht Cre ausdrücken (Abbildung 2C). Leber und Lunge aus der Maus aus Abbildung 2B haben metastasierende Tumore, die GFP exdrücken, was zeigt, dass sie aus dem primären Prostatatumor stammen und von normalem Gewebe umgeben sind, das Tomaten ausdrückt (Abbildung 2C ). Schließlich drückt der Beckenlymphknoten von dieser Maus GFP und nicht Tomate aus, was darauf hindeutet, dass dieser metastasierende Tumor dieses Organ überholt hat und kein normales Gewebe übrig bleibt (Abbildung 2C).
Wir zeigen Bilder in Abbildung 4 von Organoiden, die wir aus einem soliden Prostatatumor erzeugt haben. An Tag 1 bilden sich kleine Organoide, wie in den repräsentativen Phasenkontrastbildern zu sehen ist. Fluoreszierende Bilder an Tag 1 zeigen, dass sowohl Tomaten- als auch GFP-exezierende Zellen in der Tumororganoidkultur (Pfeile) vorhanden sind. Jedoch, bis Tag 7, wenn Prostatatumor-Organoide vollständig gebildet haben, diese Organoide exdrücken GFP und nicht Tomate. Diese Daten deuten darauf hin, dass diese Organoide von Tumorzellen stammen, die Cre exexzessiderten und nicht von normalen Epithelzellen. Diese Tumororganoide sind weiterhin nur GFP-positiv, da wir unsere Kultur auf Durchgang 1 und 2 ausdehnen.
In Abbildung 5zeigen wir Bilder von Organoiden, die wir aus einem flüssigkeitsgefüllten Prostatatumor erzeugt haben. An Tag 1 bilden sich kleine Organoide, und fluoreszierende Bilder zeigen, dass sowohl Tomaten- als auch GFP-exezierende Zellen in der Organoidkultur vorhanden sind – ähnlich wie bei unserer Beobachtung an Tag 1 für Organoide, die aus einem soliden Prostatatumor stammen (Abbildung 4). Organoide aus einem flüssigkeitsgefüllten Prostatatumor drücken jedoch entweder GFP oder Tomate an Tag 7 aus – was darauf hindeutet, dass sich Organoide aus Zellen gebildet haben, die Cre nicht ausdrücken. Dieses Muster setzt sich in Durchgang 1 und Abschnitt 2 fort, wo die Kultur sowohl Tomaten- als auch GFP-expexiöse Organoide hat. Die weitere Analyse dieser Organoide ist stark eingeschränkt, da die Linie eine Mischung aus normalen epitheliale Organoiden und Tumororganoiden ist. Wir glauben, dass flüssigkeitsgefüllte Prostatatumoren suboptimal bei der Erzeugung von Tumororganoiden sind, einfach weil es einen größeren Prozentsatz an normalen Prostataepithelzellen gibt. Da sowohl normale Prostataepithelzellen als auch Prostatakrebszellen Organoide bilden, sind die Linien, die aus flüssigkeitsgefüllten Prostatatumoren entstehen, eine Mischung aus normalen und Krebsorganoiden. Wir erhalten reine Tumororganoidlinien aus flüssigkeitsgefüllten Prostatatumoren durch Durchflusssortierung für GFP-positive Zellen und Erzeugung von Organoiden aus dieser Zellpopulation. Solide Prostatatumoren bestehen in erster Linie aus Tumorzellen, daher sind Aus diesen Tumoren erzeugte Organoide eine reinere Population von Krebsorganoiden ohne vorherige Sortierung für GFP.
Abbildung 1 : Unsere empfohlene Sezierreihenfolge für Prostatakrebs (PCa) gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) und Anatomie der Mausprostata. (A) Die Reihenfolge, die wir in unserem Protokoll zur Sezieren der wichtigsten Organe aus einem PCa GEMM empfehlen. 1. Urogenitalregion. 2. Beckenlymphknoten. 3. Milz. 4. Leber. 5. Nieren. 6. Lunge. 7. Tibia und Femur. (B) Karte der Maus Urogenitalregion und Prostataanatomie. Fluoreszierende Sezierbilder einer 12 Wochen alten Maus, die Probasin-Cre und das mT/mG Cre-Reportertransgen ausdrückt. Blase (BL), Samenbläschen (SV), vordere Prostata (AP), ventrale Prostata (VP), laterale Prostata (LP), dorsale Prostata (DP) und proximale Prostata (PP). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Repräsentative Sezierbilder von Prostatakrebs (PCa) gentechnisch veränderten Mausmodellen (GEMMs). (A) Die Bauchhöhle vor der Entfernung der Urogenitalregion und der Urogenitalregion mit einem flüssigkeitsgefüllten Prostatatumor. (B) Die Bauchhöhle vor der Entfernung der Urogenitalregion und der Urogenitalregion mit einem soliden Prostatatumor. (C) Repräsentative Tomaten- und GFP-Fluoreszenzbilder eines soliden Prostatatumors, Leber-, Lungen- und Beckenlymphknotens aus einem PCa GEMM, der metastasierende Läsionen entwickelt. Schuppen = 5 mm. Blase (BL), vordere Prostata (AP) und Dorsalprostata (DP). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Flussdiagramm des Protokolls zur Erzeugung von Prostatatumororganoiden. Nach der Zerkleinerung des Prostatatumors das Gewebe in 1 mm Stücke zerkleinern. Verdauen Sie die Tumorstücke in Kollagennase, sammeln Sie die Zellen und verdauen Sie in Trypsin, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Nach dem Zählen von Zellen, Resuspend in Volumen der Matrix für eine 1,0 x 106 Zelle / ml Zellkonzentration erforderlich. Plattenkuppeln in der Schale mit einer tropfenweisen Methode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Repräsentative Bilder aus der Erzeugung von Maus-Prostatatumor-Organoiden aus einem soliden Prostatatumor. Repräsentativer Phasenkontrast, Tomaten- und GFP-Fluoreszenzbilder aus Tag 1, Tag 7, Passage 1 und Passage 2 von Organoiden, die aus einem soliden Maus-Prostatatumor erzeugt wurden. Skala bar = 100 m. Pfeile zeigen einzelne Zellen in fluoreszierenden Bildern an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5 : Repräsentative Bilder aus der Erzeugung von Maus-Prostatatumor-Organoiden aus einem flüssigkeitsgefüllten Tumor. Repräsentativer Phasenkontrast, Tomaten- und GFP-Fluoreszenzbilder aus Tag 1, Tag 7, Passage 1 und Passage 2 von Organoiden, die aus einem flüssigkeitsgefüllten Prostatatumor der Maus erzeugt wurden. Skala bar = 100 m. Pfeile zeigen einzelne Zellen in fluoreszierenden Bildern an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls zur Prostatatumorsektion und Organoiderzeugung
Die Entfernung von Nicht-Prostatagewebe und die feine Zerlegung des Prostatatumors der Maus ist entscheidend für die optimale Erzeugung von Krebsorganoiden, da sowohl Nicht-Prostata-Epithelzellen als auch normale Prostata-Epithelzellen Organoide erzeugen. Für solide Prostata-Tumoren speziell, Es ist wichtig, Bereiche des lebensfähigen Tumors zu isolieren, um Kontamination mit nekrotischem Gewebe zu entfernen, die die Anzahl der lebensfähigen Zellen reduzieren würde. Während der Organoid-Generierung sollte die Gewebeverdauung mit Kollagenase sorgfältig überwacht werden, da eine längere Exposition gegenüber Kollagenase die Zelllebensfähigkeit einschränkt. Bei Organoiden, die von Krebs-GEMMs abgeleitet wurden, ist es wichtig, jede Linie vollständig zu genotypisieren, um sicherzustellen, dass alle Transgene und modifizierten Allele, die in der Maus entwickelt wurden, in den Organoiden vorhanden sind. Eine Wiederholung der Genotypisierung nach längerer Passierung ist auch notwendig, um sicherzustellen, dass genetische Veränderungen erhalten bleiben.
Modifikationen und Fehlerbehebung bei Prostatatumorsektion und Organoiderzeugung
Wir haben Maus-zu-Maus-Variabilität in Prostatatumor-Eigenschaften beobachtet, auch bei Tieren mit dem gleichen Genotyp. Daher können spezifische Änderungen am hier beschriebenen Prostatadissektionsprotokoll für jede Maus erforderlich sein. Darüber hinaus ist Anpassungsfähigkeit bei der Sezieren von metastasierenden Tumoren notwendig, da es schwierig ist, den Schweregrad dieser Läsionen vorherzusagen, bevor die Zerlegung beginnt.
Bei einigen Gelegenheiten haben wir eine übermäßige Kontamination unseres Zellpellets mit dem scheinbaren Bindegewebe beobachtet, auch nach der Verdauung mit Kollagenase und Trypsin. In diesem Fall setzen wir das Pellet in mindestens 2 ml AdDMEM F12(+++) wieder aus und verwenden ein 40-m-Zellsieb, um das Bindegewebe zu entfernen. Da die Erstarrungsrate der Matrix stark variiert, kann es vor der Anwendung von organoiden Medien notwendig sein, die Zeit für die Verfestigung der Kuppel zu erhöhen oder zu verringern.
Einschränkungen bei der Verwendung von GEMMs
Während GEMMs die strengste Methode für präklinische Krebsstudien sind, erfordert dieser Ansatz erheblichen Zeit-, Kosten- und Schulungsaufwand. Darüber hinaus kann die Variabilität von Maus zu Maus, wie bei der Untersuchung des Menschen, die Interpretation von Daten erschweren.
Einschränkungen bei der Verwendung der 3D-Zellkultur
Im Vergleich zur 2D-Zellkultur erfordert das Generieren und Pflegen von Organoidlinien erhöhte Zeit und Kosten. Zum Beispiel werden unsere Tumororganoidlinien alle 2-3 Wochen durchgehen, während Zelllinien alle 2-3 Tage durchgehen können. Diese langsamere Wachstumsrate von Organoiden erhöht die Zeit, die benötigt wird, um Experimente abzuschließen erheblich. Organoide Kulturmedien enthalten mehrere spezialisierte Wachstumsfaktoren und Reagenzien, die je nach Quelle teuer sein können, so dass die Erzeugung und Aufrechterhaltung von Organoiden teurer ist als herkömmliche 2D-Zelllinien. Schließlich haben unser Labor und andere viele Unterschiede in Matrix und anderen Reagenzien beobachtet - was eine Herausforderung für die Aufrechterhaltung der Konsistenz im organoiden Wachstum für langfristige Experimente darstellt.
Bedeutung bei der Verwendung der 3D-Zellkultur in Bezug auf bestehende/alternative Methoden
Die präklinische Krebsforschung wurde von 2D-Zellkultur und zelllinienabgeleiteten Xenograft-Modellen dominiert. Zellwachstum in 2D erfordert Transformation/Verewigung – daher haben sowohl In-vitro- als auch Xenograft-Studien mit 2D-Kulturen in der Regel keine unveränderten normalen Zelllinien, um als Nicht-Krebs-Kontrollen zu dienen. Das letzte Jahrzehnt der Forschung in der 3D-Organoidkultur von normalen epitheliaalen Geweben hat nun das Wachstum von nicht-kanzerösen Epithelgeweben ermöglicht, die verwendet werden können, um mit analogen Organoiden aus Krebsgewebe zu vergleichen. Krebsorganoide können auch verwendet werden, um Xenografts zu etablieren, um die Tumorentwicklung weiter zu verstehen. Darüber hinaus können nicht-krebskranke Organoide verwendet werden, um Kontroll-Xenografts zu erzeugen — was nicht möglich war, bevor 3D-Zellkulturmethoden entwickelt wurden16.
Bedeutung bei der Verwendung von 3D-Zellkultur in der Prostatakrebsforschung
In neueren Studien, Organoide wurden verwendet, um GEMM Prostatatumor Eigenschaften zu rekapitulieren. Dardenne et al. zeigen, dass Organoide, die mit Prostatatumoren von GEMMs erzeugt wurden, denen gleichzeitig der Tumorsuppressor Pten fehlt und das MYCN-Onkogen überexpresst, ein größeres Wachstumspotenzial hatten als Organoide, die mit Prostata aus Steuerung gemMs. Darüber hinaus zeigten sowohl die Sequenzierung als auch die Immunhistochemie, dass Tumororganoide die Expressionsprofile von Prostatatumoren rekapitulierten, die sowohl Pten als auch MYCN21überexpressionierten. Blattner et al. zeigen, dass die gleichzeitige Prostataüberexpression eines onkogenen Mutanten vom Typ Speckle Typ BTB/POZ Protein (SPOP) und das Löschen von Pten die Rate der Tumorgenese bei GEMMs erhöht. Wenn Prostata-Organoide erzeugt wurden, um mutierte SPOPzu überexprimieren, wurde ihre Proliferation im Vergleich zu Kontroll-Prostata-Organoiden und Lineage-Marker-Expression rekapitulierte ursprüngliche Prostata-Tumorenerhöht 22. Zusammen zeigen diese Studien, dass Organoide ein optimales Modell für die weitere Untersuchung der Prostatatumor-Eigenschaften bei GEMMS sind.
Organoidkultur wurde auch als Werkzeug verwendet, um einzelne Subpopulationen von Prostatatumorzellen zu bewerten. Mit GEMM-Tumoren, denen Pten und sowohl Pten- als auch Trp53-Tumorsuppressoren in Prostataepithelzellen fehlen, vermehrten Agarwal et al. fraktionierte Zellen in Basal- und Luminalvorläufer, vermehrten diese Subpopulationen als Organoide und ihre spezifischen Phänotypen weiter charakterisiert23. Dabei ist es möglich, Subpopulationen von Tumorzellen zu charakterisieren, die in der Fülle innerhalb von Prostatatumoren selbst begrenzt sein können.
Wie oben beschrieben, ermöglichen 3D-Zellkulturtechniken das Wachstum normaler Epithelzellen. Dabei bieten Prostata-Organoide, die aus GEMMs ohne Cre-Treiber erzeugt werden, ein einzigartiges Modell für die Echtzeitüberwachung der Tumorgenese durch Induktion der Cre-Rekombination in vitro. Tatsächlich bewerteten Dardenne et al., wie sich die NMYC-Überexpression auf das Wachstumspotenzial im Zusammenhang mit Pten-Verlusten im Laufe der Zeit auswirkt, indem sie EKtopisch ERT2-Cre exemitten und mit Tamoxifen21behandelten. Zusätzlich wurde die Wirkung der NMYC-Überexpression auf den Androgenrezeptor (AR), das Hauptziel der Therapie bei Prostatakrebs, nach der Induktion der Cre-Rekombination in Organoiden, die aus GEMMs21erzeugt wurden, bewertet. Das gleiche induzierbare Cre-System wurde von Blattner et al. in Prostataorganoiden verwendet, um zu messen, wie sich die Überexpression mutierter SPOP auf die Proliferation von Prostatakrebszellen und die AR-Expression22auswirkt. Insbesondere Experimente, die cre Expression in vitro induzieren, haben eine eingebaute Nicht-Krebs-Kontrolle mit fahrzeugbehandelten Organoiden.
Spezifische Einschränkungen bei der Verwendung von 3D-Zellkultur in der Prostatakrebsforschung
Während das organoide Wachstum normaler Epithelzellen ein Vorteil der Verwendung von 3D-Zellkulturtechniken ist, stellt die Fähigkeit, normale Organoide zu züchten, auch eine Herausforderung in Prostatakrebs-Forschungsstudien dar. Wie in unserem repräsentativen Ergebnisabschnitt gezeigt, haben wir das Auswuchs normaler Prostata-Organoide in Linien beobachtet, die aus Prostatatumoren erzeugt werden, die weniger aggressiv sind (Abbildung 5). Eine Möglichkeit, dieses Phänomen anzugehen, besteht darin, Organoide aus GEMMs zu erzeugen, die ein Cre-Reporter-Transgen wie mT/mGausdrücken. Fluoreszierende Mikroskopie kann verwendet werden, um das relative Verhältnis von normalen zu Tumororganoiden zu bewerten, indem die Expression von Tomaten und GFP beobachtet wird. Darüber hinaus kann GFP-Expression verwendet werden, um sortierte organoide Zellen zu fließen, um reine Prostatatumor-Organoidlinien zu erzeugen. Agarwal et al. zeigen eine Sortiermethode zur Trennung von normalen Epithelzellen und Krebszellen von GEMM-Prostatatumoren ohne Cre-Reporter. Sie zeigen, dass epitheliale Zelladhäsionsmolekül (EpCAM)-positive Zellen aus Prostatatumoren sich nicht in Subpopulationen auflösten, wenn sie entweder mit CD24 oder Sca-1-Zelloberflächenmarkern23 sortiert wurden – daher könnten diese Marker verwendet werden, um normale Prostata-Epithelzellen aus GEMM-Prostatatumoren vor der Organoid-Generierung. Unser Labor und andere haben beobachtet, dass die Bedingungen, unter denen Prostatakrebszellen Organoide bilden, entweder für Linienspezifische Genexpressionsprogramme ausgewählt oder gefördert werden, die für Prostatabasexthelzellen charakteristisch sind. Dies ist eine bedeutende Herausforderung, da Prostatatumoren bei Mäusen und Menschen in erster Linie in der Natur korphäen, AR, CK8 und andere luminale Marker exprimieren und selten Basallinienmarker wie p63 oder CK5 ausdrücken. Während dieses Phänomen noch nicht im Detail veröffentlicht werden muss, zeigt die Immunhistochemie-Analyse, dass AR in Ptenf/+ Organoiden im Vergleich zu Ptenf/+ Prostata21verringert ist. Das Auswachsen von Basalepithelzellen in Prostatakrebsorganoiden stellt in Frage, ob diese Linien wirklich ein genaues präklinisches Modell von Prostatakrebs sind.
Während Prostatakrebs-Organoide dokumentiert wurden, um den Tumor zu modellieren, aus dem sie besser abgeleitet sind als die traditionelle 2D-Kultur, gibt es Potenzial für Organoide, genetische Veränderungen in der Kultur zu erfahren, vor allem nach mehreren Passagen. Derzeit sind uns keine veröffentlichten Studien bekannt, die spontane genetische Mutationen, genetische Gewinne oder Verluste oder epigenetische Veränderungen dokumentiert haben, die nach längerer Passage von Prostatakrebsorganoiden häufig sind. Um die Variabilität als Folge genetischer oder epigenetischer Veränderungen zu begrenzen, die durch längerePassierung auftreten können, sollten Experimente an frühen Organoiden aus frühen Passagen (<10) so oft wie möglich durchgeführt werden.
Zukünftige Anwendungen der 3D-Zellkultur
Während es unmöglich ist, alle zukünftigen Anwendungen vorherzusagen, die mit 3D-Zellkultur in der Krebsforschung entwickelt werden, gibt es mehrere Wege, die das größte Potenzial zu haben scheinen. Wie bei 2D-Zelllinien ist die Durchführung von In-vitro-Genveränderungen bei Organoiden relativ einfach. Die Veränderung spezifischer Gene in normalen oder Krebsorganoiden eröffnet viele Möglichkeiten bei der Untersuchung der Mechanismen zur Tumorenesse, Krebsprogression und Behandlung – insbesondere wenn genetisch veränderte Organoide zur Erzeugung von Organoiden verwendet werden. Xenografts. Die genetische Veränderung von Organoiden ist von großem Vorteil, wenn GEMMs für ein bestimmtes Gen nicht existieren oder die Etablierung eines neuen GEMM außerhalb des Geltungsbereichs einer bestimmten Studie liegt.
Krebsorganoidkultur hat auch viele potenzielle Anwendungen für die klinische Forschung. Eine Bibliothek relevanter Tumorsubtypen innerhalb jedes Organsystems sowohl von Patienten als auch von Tiermodellen könnte verwendet werden, um die Wirksamkeit eines neuen Medikaments oder einer neuen Kombination bestehender Medikamente schnell zu bewerten. Da die 3D-Zellkultur zum Mainstream wird und die Effizienz erhöht, hat die Erzeugung von patientenabgeleiteten Organoiden für die Zwecke der personalisierten Medizin das Potenzial, die Behandlung für jeden Krebspatienten zu schneidern, indem alle verfügbaren Medikamente und Kombinationen von Drogen mit seiner individuellen Organoidlinie16.
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Disclosures
Die Autoren haben keine finanziellen Beziehungen zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken dem Calvin Kuo Laboratory an der Stanford University für die Bereitstellung von HEK293-Zellen, die entweder mit HA-Maus Noggin-Fc oder HA-Maus Rspo1-Fc stabil transfiziert wurden. Wir möchten uns auch bei Dr. Dean Tang dafür bedanken, dass er uns den Zugang zum fluoreszierenden Seziermikroskop in seinem Labor ermöglicht hat. Diese Arbeit wurde von CA179907 an D.W.G. vom National Cancer Institute unterstützt. Gemeinsame Ressourcen im Roswell Park Comprehensive Cancer Center wurden von National Institutes of Health Cancer Center Support Grant CA016056 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin+2.21 mM EDTA | Sigma | 25-053 | |
| 1 1/4 inch, 23 G, disposable syringe needles | Becton Dickinson | Z192430 | |
| 10% neutral buffered formalin | Sigma | HT501128 | |
| 32% paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15714 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432 | |
| Advanced DMEM/F12+++ | Gibco | 12634 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | 30216623 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504044 | |
| Collagenase II | Gibco | 17101015 | |
| Dissecting Board | Thermo-Fisher | 36-1 | |
| EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10 | Manufactured by Trevigen | Requistitioned from the National Cancer Institute at the Frederick National Laboratory | Holder of grants from the National Cancer Institute can request matrix |
| HEPES (1 M) | Sigma | 25-060 | |
| human recombinant Epidermal growth factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 | |
| L-glutamine (200 mM) | Sigma | 25-005 | |
| N-Acetyl-L-Cysteine | Sigma | A9165 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Precision balance | Mettler Toledo | 30216561 | |
| Scalpel #23 | World Precision Instruments | 504176 | |
| Scalpel Handle #7, 16 cm | World Precision Instruments | 500238 | |
| Single-edge carbon razor blade | Fisherbrand | 12-640 | |
| Stainless steel dissecting scissors, 10 cm, straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Stainless steel Iris forceps, 10 cm, curved tip, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Stainless steel Nugent utility forceps, straight tip, serrated | World Precision Instruments | 504489 | |
| Y-276632 (Rock Inhibitor) | APExBIO | A3008 |
References
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