هنا، نقدم العديد من الطرق البسيطة لتقييم الجدوى والموت في كروية الخلايا السرطانية ثلاثية الأبعاد، والتي تحاكي التدرجات الفيزيائية الكيميائية للأورام الحية أفضل بكثير من الثقافة 2D. نموذج كروي, وبالتالي, يسمح تقييم فعالية المخدرات السرطان مع تحسين الترجمة إلى في ظروف الجسم الحي.
الكرويات ثلاثية الأبعاد من الخلايا السرطانية هي أدوات هامة لكل من شاشات المخدرات السرطان واكتساب البصيرة الميكانيكية في بيولوجيا الخلايا السرطانية. قوة هذا الإعداد يكمن في قدرتهعلى تقليد العديد من جوانب الظروف في الجسم الحي من الأورام في حين يجري سريعة ورخيصة، وتنوعا بما فيه الكفاية للسماح فحص عالية الإنتاجية نسبيا. يمكن أن تلخص ظروف الثقافة الكروية التدرجات الفيزيائية الكيميائية في الورم، بما في ذلك الحموضة خارج الخلايا المتزايدة، وزيادة اللاكتات، وتقليل توافر الجلوكوز والأكسجين، من محيط كروي إلى جوهره. أيضا، يتم تقليد الخصائص الميكانيكية والتفاعلات خلية الخلية من الأورام في الجسم الحي جزئيا من قبل هذا النموذج. خصائص محددة، وبالتالي ظروف النمو الأمثل، من كروية 3D، تختلف على نطاق واسع بين أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية. وعلاوة على ذلك، فإن تقييم صلاحية الخلايا والموت في الكرويات ثلاثية الأبعاد يتطلب أساليب تختلف جزئياً عن تلك المستخدمة في الثقافات ثلاثية الأبعاد. هنا نحن وصف عدة بروتوكولات لإعداد كروية 3D من الخلايا السرطانية، واستخدام هذه الثقافات لتقييم قدرة الخلايا على البقاء والموت في سياق تقييم فعالية الأدوية المضادة للسرطان.
استخدام نماذج متعددة الخلايا كروية في علم الأحياء السرطان هو عدة عقود من العمر1,2, ولكن اكتسبت زخما كبيرا في السنوات الأخيرة. وهذا يعكس إلى حد كبير زيادة الوعي بمدى قوة النمط الظاهري للخلايا السرطانية يعتمد على بيئتها الدقيقة وظروف نموها المحددة. البيئة الدقيقة في الأورام الصلبة تختلف اختلافا جوهريا عن تلك التي في الأنسجة العادية المقابلة. ويشمل ذلك الظروف الفيزيائية الكيميائية مثل درجة الألف الألف، وتوتر الأكسجين، وكذلك الضغط الخلالي، وتدرجات تركيز العوامل القابلة للذوبان مثل المواد الغذائية، ومنتجات النفايات، ومركبات الإشارات المفرزة (عوامل النمو، السيتوكينات). وعلاوة على ذلك، فإنه يشمل تنظيم المصفوفة خارج الخلية (ECM)، والتفاعلات الخلية الخلية والإشارات بين الخلايا، وجوانب أخرى من العمارة ثلاثية الأبعاد (3D) معينة للورم3،4، 5,6. الظروف البيئية الدقيقة المحددة التي توجد فيها الخلايا السرطانية، تؤثر بشكل عميق على ملامح التعبير الجيني والخصائص الوظيفية، ومن الواضح أنه، بالمقارنة مع تلك التي تنمو في الخلايا 2D، والنمط الظاهري من كروية 3D يحاكي عن كثب أن من الأورام في الجسم الحي7،8،9،10،11. نماذج 2D، حتى لو كانت تستخدم نقص الأكسجة، الحموضة الحمضية، والتركيزات اللاكتات عالية لتقليد الجوانب المعروفة من البيئة الدقيقة الورم، لا تزال تفشل في التقاط تدرجات المعلمات الفيزيائية الكيميائية الناشئة داخل الأورام، فضلا عن ورمها 3D الهندسه المعماريه. من ناحية أخرى، النماذج الحيوانية مكلفة، بطيئة، وإشكالية أخلاقيا، وعموما، لديها أيضا أوجه القصور في قدرتها على تلخيص ظروف الورم البشري. وبالتالي، تم تطبيق كرويات ثلاثية الأبعاد كنموذج تعقيد متوسط في دراسات مجموعة واسعة من خصائص معظم أنواع السرطان الصلبة9،11،12،13، 14,15,16,17.
استخدام المستخدمة على نطاق واسع من كروية 3D هو في فحص الاختبارات من فعالية العلاج بالسرطان9,18,19,20. الاستجابات العلاجية حساسة بشكل خاص للورم الميكروي، مما يعكس كل من تأثير التقصير، والانتشار المقيد، والضغط الخلالي العالي، ودرجة الحموضة البيئية الحمضية على تسليم الأدوية، وتأثير نقص الأكسجة وغيرها جوانب من البيئة الدقيقة على استجابة موت الخلية9,17. لأن البيئة داخل كروية 3D يتطور بطبيعتها كل هذه الخصائص7،8،9،10،11، يمكن توظيف الثقافات خلية 3D تحسين ترجمة النتائج إلى ظروف حية بشكل كبير، مع السماح بكفاءة وبأسعار معقولة عالية الإنتاجية الفرز من صافي النمو. ومع ذلك، لا تزال الغالبية العظمى من الدراسات على استجابة المخدرات من الخلايا السرطانية تجري في ظل ظروف 2D. وهذا يعكس على الأرجح أنه، في حين أن بعض الاختبارات يمكن تنفيذها بسهولة نسبيا لثقافات الخلايا 3D، وكثير، مثل اختبارات البقاء، والنشاف الغربية، وتحليل الفلور المناعي، يتم القيام به بشكل مريح أكثر بكثير في 2D مما كانت عليه في 3D.
والهدف من العمل الحالي هو توفير الفحوصات والبروتوكولات الدقيقة سهلة الملاءمة لتحليل تأثير العلاج بالأدوية المضادة للسرطان على قدرة الخلايا السرطانية على البقاء على قيد الحياة في بيئة محاكاة للورم ثلاثي الأبعاد. وعلى وجه التحديد، نقدم ونقارن ثلاث طرق مختلفة لتشكيل كروي، تليها طرق للتحليلات النوعية والكمية للنمو، والقدرة على البقاء، والاستجابة للمخدرات.
وقد ثبت استخدام كرويرويدال الخلايا السرطانية 3D أداة قيمة وتنوعا ليس فقط لفحص المخدرات المضادة للسرطان، ولكن أيضا للحصول على البصيرة الميكانيكية في تنظيم موت الخلايا السرطانية والقدرة على البقاء في ظل ظروف تحاكي تلك الموجودة في الورم الصغرى البيئة. وهذا أمر حاسم بشكل خاص حيث تتأثر تأثيرا…
The authors have nothing to disclose.
ونحن ممتنون لكاترين فرانكلين مارك وأنيت بارتلز للمساعدة التقنية الممتازة وأسبيورن نور-نيلسن لإجراء التجارب في الشكل 1D. تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة إينار ويلمسن، ومؤسسة نوفو نورديسك، ومؤسسة جوشوم (جميعها إلى SFP).
2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | For staining nuclei |
5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Component in chemotherapeutic treatment |
5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inhibitor of NHE1 |
Antibody against PARP and cPARP | Cell signaling | #9542 | Used in western blotting |
Antibody against Ki-67 | Cell signaling | #9449 | Used for IHC |
Antibody against p53 | Cell Signaling | #2524 | Used for IHC |
Antibody against β-actin | Sigma | A5441 | Used in western blotting |
Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Used for agarose gel preparation |
Benchmark protein ladder | Invitrogen | #10747-012 | Used for SDS-PAGE |
Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Used for protein determination from lysates |
Bürker chamber | Marienfeld | 610311 | For cell counting |
BX63 epifluoresence microscope | Olympus | Used for fluorescent imaging | |
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Used for the cell viability assay |
Cisplatin | Sigma-Aldrich | #P4394 | Component in chemotherapeutic treatment |
Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom, Ultra-low attachment, With lid, Sterile | Corning | #4520 | Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point |
Corning 96 well, clear round bottom, Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile | Corning | #7007 | Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point |
Criterion TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Used for SDS-PAGE |
Doxorubicin | Abcam | #120629 | Component in chemotherapeutic treatment |
FLUOStar Optima Microplate reader | BMG Labtech | Used for recording luminescence | |
Formaldehyde | VWR Chemicals | #9713.1000 | Used for cell fixation |
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | #A1413202 | Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol. |
Heat-inactivated FBS | Sigma | #F9665 | Serum for growth media |
ImageJ | NIH | Scientific Image analysis | |
Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Used for storage of embedded spheroids |
Mini protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Used for lysis buffer preparation |
MZ16 microscope | Leica | Used for light microscopic images | |
NuPAGE LDS 4x Sample Buffer | Invitrogen | #NP0007 | Used for western blotting |
Pierce ECL Western blotting substrate | Thermo scientific | #32106 | Used for western blotting |
Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Used for protein band staining |
Prism 6.0 | Graphpad | Scientific graphing and statistical software | |
Propidium iodide (1mg/ml solution in water) | Invitrogen | P3566 | Light sensitive |
Sterile reservoirs, multichannel | SPL lifesciences | 21002 | Used for seeding cells for spheroid formation |
Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | Microscope glass slide used for embedding |
Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Used as chemotherapeutic treatment |
Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #170-4159 | Used for western blotting |
Tris/Glycine/SDS running buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Used for SDS-PAGE |
Trypsin-EDTA solution | Sigma | #T4174 | Cell dissociation enzyme |