Här presenterar vi flera enkla metoder för att utvärdera lönsamhet och död i 3D-cancer cell sfäroider, som efterliknar fysikalisk-kemiska gradienter av in vivo tumörer mycket bättre än 2D-kulturen. Den sfäroiden modell, därför, tillåter utvärdering av cancer drogen effekt med förbättrad översättning till in vivo villkor.
Tredimensionella sfäroider av cancer celler är viktiga verktyg för både cancer drog skärmar och för att få mekanistisk insikt i cancer cell bio Logi. Kraften i denna beredning ligger i dess förmåga att efterlikna många aspekter av in vivo förhållanden av tumörer samtidigt som snabb, billig och mångsidig nog att tillåta relativt hög genom strömning screening. Den sfäroiden kultur förhållanden kan upprepa de fysikalisk-kemiska gradienter i en tumör, inklusive den ökande extracellulär syra, ökad laktat, och minskar glukos och syre tillgänglighet, från sfäroid periferi till sin kärna. Också, de mekaniska egenskaperna och cell-cell interaktioner av in vivo tumörer är delvis härmade av denna modell. De specifika egenskaper och därmed den optimala odlings förhållanden, av 3D sfäroider, skiljer sig mycket mellan olika typer av cancer celler. Dessutom kräver bedömningen av cellernas livs kraft och död i 3D-sfäroider metoder som skiljer sig delvis från dem som används för 2D-kulturer. Här beskriver vi flera protokoll för att förbereda 3D sfäroider av cancer celler, och för att använda sådana kulturer för att bedöma cellernas livs kraft och död i samband med utvärdering av effekten av läkemedel mot cancer.
Användningen av multicellulära sfäroiderna modeller i cancer bio Logi är flera decennier gammal1,2, men har fått betydande driv kraft under de senaste åren. Till stor del återspeglar detta ökad medvetenhet om hur starkt fenotyp av cancer celler är beroende av deras mikromiljö och specifika tillväxt förhållanden. Mikromiljön i solida tumörer skiljer sig fundamentalt från den i motsvarande normala vävnader. Detta inkluderar fysikalisk-kemiska förhållanden såsom pH, syre spänning, samt interstitiell tryck, koncentrations gradienter av lösliga faktorer såsom näringsämnen, avfalls produkter, och utsöndras signalering föreningar (tillväxtfaktorer, cytokiner). Dessutom omfattar det organisationen av extracellulär matrix (ECM), cell-cell interaktioner och intercellulära signalering, och andra aspekter av den särskilda tredimensionella (3D) arkitektur av tumören3,4, 5,6. De specifika mikromiljömässiga förhållanden i vilka cancer celler existerar, djupt påverka deras gen uttrycks profil och funktionella egenskaper, och det är tydligt att, jämfört med den hos celler som odlas i 2D, den fenotyp av 3D sfäroider mycket mer imiterar det av in vivo-tumörer7,8,9,10,11. 2D-modeller, även om de använder hypoxi, sura pH, och höga laktat koncentrationer att efterlikna kända aspekter av tumörens mikromiljö, fortfarande inte fånga gradienter av fysikalisk-kemiska parametrar som uppstår inom tumörer, liksom deras 3D-tumör Arkitekturen. Å andra sidan, djur modeller är dyra, långsamma och etiskt problematiska, och i allmänhet, har också brister i deras förmåga att upprepa mänskliga tumör förhållanden. Följaktligen har 3D-sfäroider tillämpats som en intermediär komplexitets modell i studier av ett brett spektrum av egenskaper hos de flesta solida cancer former9,11,12,13, 14,15,16,17.
En allmänt anställd användning av 3D sfäroider är i screening analyser av cancer terapi effekt9,18,19,20. Behandlings svar är särskilt känsliga för tumörmikromiljö, vilket återspeglar både effekten av tortuositet, begränsad diffusion, hög interstitiell tryck, och sura miljömässiga pH på läkemedelstillförsel, och effekterna av hypoxi och andra aspekter av mikromiljö på celldöd svar9,17. Eftersom miljön inom 3D sfäroider naturligt utvecklar alla dessa egenskaper7,8,9,10,11, anställa 3D cell kulturer kan avsevärt förbättra översättningen av resultaten till in vivo-förhållanden, men samtidigt möjliggöra en effektiv och prisvärd screening av netto tillväxten. Emellertid, den stora majoriteten av studier på drogen svar av cancer celler är fortfarande utförs under 2D villkor. Detta återspeglar sannolikt att, medan vissa analyser relativt enkelt kan genomföras för 3D cell kulturer, många, såsom genomförbarhet analyser, Western blotting, och immunofluorescens analys, är mycket mer bekvämt gjort i 2D än i 3D.
Syftet med det nuvarande arbetet är att ge lätt mottaglig analyser och precisa protokoll för analyser av effekten av behandling med anti-cancer läkemedel på cancer cellernas livs kraft och överlevnad i en 3D-tumör härma inställning. Specifikt, vi tillhandahåller och jämför tre olika metoder för sfäroiden bildas, följt av metoder för kvalitativa och kvantitativa analyser av tillväxt, lönsamhet och drog svar.
Användningen av 3D cancer cell sfäroider har visat sig vara en värdefull och mångsidig verktyg inte bara för cancer läkemedel screening, men också för att få mekanistiska insikt i regleringen av cancer celldöd och livs kraft under förhållanden imitera dem i tumören mikromiljö. Detta är särskilt viktigt eftersom tillgängligheten, cellulära upptag, och intracellulära effekter av kemoterapeutiska läkemedel är djupt påverkad av de fysikalisk-kemiska förhållandena i tumören, inklusive pH, syre spänni…
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma mot Katrine Franklin mark och Annette Bartels för utmärkt teknisk assistans och Asbjørn Nøhr-Nielsen för att ha utfört experimenten i figur 1D. Detta arbete finansierades av Einar Willumsen Foundation, Novo Nordisk Foundation, och Fondation Juchum (alla till SFP).
2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | For staining nuclei |
5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Component in chemotherapeutic treatment |
5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inhibitor of NHE1 |
Antibody against PARP and cPARP | Cell signaling | #9542 | Used in western blotting |
Antibody against Ki-67 | Cell signaling | #9449 | Used for IHC |
Antibody against p53 | Cell Signaling | #2524 | Used for IHC |
Antibody against β-actin | Sigma | A5441 | Used in western blotting |
Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Used for agarose gel preparation |
Benchmark protein ladder | Invitrogen | #10747-012 | Used for SDS-PAGE |
Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Used for protein determination from lysates |
Bürker chamber | Marienfeld | 610311 | For cell counting |
BX63 epifluoresence microscope | Olympus | Used for fluorescent imaging | |
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Used for the cell viability assay |
Cisplatin | Sigma-Aldrich | #P4394 | Component in chemotherapeutic treatment |
Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom, Ultra-low attachment, With lid, Sterile | Corning | #4520 | Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point |
Corning 96 well, clear round bottom, Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile | Corning | #7007 | Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point |
Criterion TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Used for SDS-PAGE |
Doxorubicin | Abcam | #120629 | Component in chemotherapeutic treatment |
FLUOStar Optima Microplate reader | BMG Labtech | Used for recording luminescence | |
Formaldehyde | VWR Chemicals | #9713.1000 | Used for cell fixation |
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | #A1413202 | Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol. |
Heat-inactivated FBS | Sigma | #F9665 | Serum for growth media |
ImageJ | NIH | Scientific Image analysis | |
Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Used for storage of embedded spheroids |
Mini protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Used for lysis buffer preparation |
MZ16 microscope | Leica | Used for light microscopic images | |
NuPAGE LDS 4x Sample Buffer | Invitrogen | #NP0007 | Used for western blotting |
Pierce ECL Western blotting substrate | Thermo scientific | #32106 | Used for western blotting |
Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Used for protein band staining |
Prism 6.0 | Graphpad | Scientific graphing and statistical software | |
Propidium iodide (1mg/ml solution in water) | Invitrogen | P3566 | Light sensitive |
Sterile reservoirs, multichannel | SPL lifesciences | 21002 | Used for seeding cells for spheroid formation |
Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | Microscope glass slide used for embedding |
Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Used as chemotherapeutic treatment |
Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #170-4159 | Used for western blotting |
Tris/Glycine/SDS running buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Used for SDS-PAGE |
Trypsin-EDTA solution | Sigma | #T4174 | Cell dissociation enzyme |