Summary
Her præsenterer vi flere enkle metoder til at evaluere levedygtighed og død i 3D cancer celle sfæroider, som efterligner de fysisk-kemiske gradienter af in vivo tumorer meget bedre end 2D-kulturen. Den sfæide model giver derfor mulighed for evaluering af kræft stof effektivitet med forbedret oversættelse til in vivo betingelser.
Abstract
Tre-dimensionelle sfæroider af kræftceller er vigtige redskaber til både kræft stof skærme og for at få mekanistisk indsigt i kræft cellebiologi. Kraften i denne forberedelse ligger i dens evne til at efterligne mange aspekter af in vivo betingelser for tumorer, mens de er hurtige, billige, og alsidig nok til at tillade relativt høj-gennemløb screening. De sfæide dyrkningsbetingelser kan rekapitulere de fysisk-kemiske gradienter i en tumor, herunder den stigende ekstracellulære surhedsgrad, øget lactat og faldende glukose-og ilttilgængelighed fra den sfæide periferi til dens kerne. Også, de mekaniske egenskaber og celle-celle interaktioner af in vivo tumorer er til dels efterlignes med denne model. De specifikke egenskaber og dermed de optimale vækstbetingelser, af 3D sfæroider, varierer meget mellem forskellige typer af kræftceller. Desuden kræver vurderingen af cellernes levedygtighed og død i 3D sfæroider metoder, der delvis adskiller sig fra dem, der anvendes til 2D-kulturer. Her beskriver vi flere protokoller til forberedelse af 3D sfæroider af kræftceller, og for at bruge sådanne kulturer til at vurdere cellernes levedygtighed og død i forbindelse med evaluering af effekten af anticancermedicin.
Introduction
Brugen af flercellede sfæide modeller i kræft biologi er flere årtier gamle1,2, men har fået betydelig momentum i de seneste år. I vid del, dette afspejler øget bevidsthed om, hvor stærkt fænotype kræftceller er afhængig af deres mikromiljø og specifikke vækstbetingelser. Mikromiljøet i solide tumorer er fundamentalt forskellig fra det i tilsvarende normale væv. Dette omfatter fysisk-kemiske forhold såsom pH, oxygen spændinger, samt interstitiel tryk, koncentrations gradienter af opløselige faktorer såsom næringsstoffer, affaldsprodukter, og udskilles signalering forbindelser (vækstfaktorer, cytokiner). Endvidere, det omfatter tilrettelæggelse af ekstracellulære matrix (ECM), celle-celle interaktioner og intercellulære signalering, og andre aspekter af den særlige tredimensionelle (3D) arkitektur af tumor3,4, 5,6. De specifikke mikromiljømæssige forhold, hvor kræftceller findes, påvirker i høj grad deres genekspression profil og funktionelle egenskaber, og det er klart, at sammenlignet med celler dyrket i 2D, Fænotypen af 3D sfæroider meget tættere efterligner af in vivo-tumorer7,8,9,10,11. 2D-modeller, selv om de beskæftiger hypoxi, sure pH, og høje lactat koncentrationer til at efterligne kendte aspekter af Tumorens mikromiljø, stadig undlader at indfange gradienter af fysisk-kemiske parametre, der opstår i tumorer, samt deres 3D tumor Arkitektur. På den anden side, dyremodeller er dyrt, langsom, og etisk problematisk, og generelt har også mangler i deres evne til at rekapitulere menneskelige tumor betingelser. Derfor er 3D sfæroider blevet anvendt som en mellemliggende kompleksitet model i undersøgelser af en bred vifte af egenskaber af de fleste solide kræftformer9,11,12,13, 14,15,16,17.
En almindeligt anvendt brug af 3D sfæroider er i screening analyser af anticancer terapi effekt9,18,19,20. Behandling reaktioner er særligt følsomme over for tumor mikromiljø, der afspejler både virkningen af den tortuøsitet, begrænset diffusion, høj interstitiel tryk, og sure miljømæssige pH på medicin levering, og virkningen af hypoxi og andre aspekter af mikromiljøet på celledød svar9,17. Fordi miljøet i 3D sfæroider i sagens natur udvikler alle disse egenskaber7,8,9,10,11, beskæftiger 3D cellekulturer kan væsentligt forbedre oversættelsen af resultater til in vivo-forhold, men giver mulighed for en effektiv og økonomisk overkommelig screening af nettovæksten i høj produktion. Men det store flertal af undersøgelser af lægemiddel respons af kræftceller er stadig udført under 2D betingelser. Dette afspejler sandsynligvis, at mens nogle analyser relativt let kan implementeres for 3D cellekulturer, mange, såsom levedygtighed analyser, Western blotting, og immunofluorescens analyse, er meget mere bekvemt gjort i 2D end i 3D.
Formålet med det nuværende arbejde er at give let genstand analyser og præcise protokoller for analyser af effekten af behandling med anti-cancer medicin på kræftcellernes levedygtighed og overlevelse i en 3D tumor efterligner indstilling. Konkret leverer og sammenligner vi tre forskellige metoder til sfæoide dannelse, efterfulgt af metoder til kvalitative og kvantitative analyser af vækst, levedygtighed og narkotika respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dannelse af Sfæroider
- Klargøring af celle suspensioner til sfæide dannelse
Bemærk: forskellige cellelinjer har meget forskellige vedhæftningsegenskaber, og den mest velegnede sfæoide dannelses protokol skal fastlægges i hvert enkelt tilfælde. Vi har konstateret, at MCF-7 og bxpc-3 celler er velegnede til spontan sfæroide formation, mens MDA-MB-231, skbr-3, Panc-1 og miapaca kræver tilsætning af rekonstitueret kælder membran for at danne sfæroider. Kun MDA-MB-231 og BxPC-3-celler er blevet anvendt til hængende drop-protokollen, men andre cellelinjer er helt sikkert anvende bare.- Vokse celler som enkeltlags indtil 70-80% confluency.
- Vask celler med fosfatbuffer (1x PBS, 5 mL i en 25 cm2 eller 10 ml for en 75 cm2 kolbe), tilsæt celle dissociations enzymet (0,5 ml for en 25 cm2 eller 1 ml for en 75 cm2 kolbe) og inkuber cellerne i 2-5 min ved 37 °c i 5% CO2 og 95% fugtighed.
- Cellen adskilles under et mikroskop, og celle dissociations enzymet neutraliseres ved tilsætning af vækstmedium (6-10% serum afhængigt af celle linjen) til et samlet rumfang på 5 mL i en 25 cm2 eller 10 ml for en 75 cm2 kolbe.
- Brug en Bürker kammer til at tælle celler og tælle 8 firkanter i kammeret per celle forberedelse for at opnå en høj reproducerbarhed af størrelsen af sfæroider.
Bemærk: Nedenfor beskrives tre protokoller, der hver især beskriver en anden metode til sfæoide dannelse. Protokol 1,2 og 1,3 kan anvendes til alle de efterfølgende analytiske protokoller, hvorimod protokol 1,4 er bedst egnet til indlejring og lysforberedelse. Afhængigt af celle linjen tager sfæroide dannelsen 2-4 dage, uanset hvilken metode der anvendes.
- Spontan sfæoide dannelse
- Udfør trin 1.1.1-1.1.4.
- Cellesuspensionen fortyndes i et 15 mL rør for at opnå 0,5-2 x 104 celler/ml (den optimale celletæthed skal bestemmes for hver cellelinje) (figur 1a (II)).
- Fyld den ydre ring af brønde med 1x PBS eller vækstmedium for at reducere fordampningen fra de resterende brønde. Cellesuspensionen overføres til et sterilt reservoir, og ved hjælp af en multikanalpipette dispenseres 200 μL/brønd til ultra-lav fastgørelse 96-brønd runde Bundplader (figur 1a (III)).
- Pladen inkueres i en inkubator ved 37 °C med 5% CO2, 95% fugtighed.
- Hver 2-3 dage erhverve lys mikroskopiske billeder af sfæroider.
Bemærk: Billederne i dette papir er taget på 11,5 x forstørrelse, hvilket er passende for de fleste sfæroider tilberedt ved hjælp af disse protokoller. - Hver 2-3 dage (efter erhvervelse af billeder) erstatter 100 μL medium (Fjern 100 μL af det brugte medium og Erstat med 100 μL frisk medium.
Bemærk: For at undgå at fjerne sfæroider ved udskiftning af medium anbefales det at vippe pladen lidt, mens mediet langsomt fjernes, og det Aspirér medium inspiceres i spidserne for synlige sfæroider, før det kasseres.
- Rekonstitueret kælder membran-medieret sfæoide dannelse.
Bemærk: laktose dehydrogenase eleverende virus (LDEV)-fri reduceret vækstfaktor rekonstitueret kælder membran (rBM) blev anvendt. ringmekanismer er temperaturfølsomme og bør altid opbevares på is, da den vil størkne, hvis den når 15 °C. Ring rBM på is enten natten over ved 4 °C eller 2-4 h ved stuetemperatur (RT) før plating.- Optøning af rBM på is (Se tabel over materialer).
- Opbevar pladerne og reservoirerne (hvis de er pakket enkeltvis) på is før brug.
- Udfør trin 1.1.1-1.1.4.
- Fyld den ydre ring af brønde med 1x PBS eller vækstmedium for at reducere fordampningen fra de resterende brønde. Cellesuspensionen fortyndes i et 15 mL rør for at opnå 0,5-2 x 104 celler/ml (den optimale celletæthed skal bestemmes for hver cellelinje) (figur 1a (II)).
- 15 mL-røret anbringes med fortyndet cellesuspension på is (f. eks. i bægerglas) (figur 1a (IIA)).
- Overfør de afkølede plader og reservoirer til hætten. Skyl plastik beholderne, Fyld dem med is, og overfør dem til hætten, så pladerne og reservoirerne kan anbringes på is under hele proceduren.
- Resuspender forsigtigt rBM for at sikre en homogen gel.
- Der tilsættes 1-2% rBM (den optimale koncentration skal bestemmes for hver cellelinje) til nedkølede celle suspensioner (figur 1a (IIb)).
- Vend 15 mL-røret for at sikre korrekt blanding af ringmekanismer og cellesuspension, inden suspensionen dispenteres i pladen.
- Overfør den rBM-holdige cellesuspension til et sterilt reservoir, og dispenserer 200 μL/brønd i kølede, ultra-lave fastgørings 96-brønd plader ved hjælp af en multikanalpipette (figur 1a (III)).
Bemærk: Hvis du arbejder med flere celle suspensioner (f. eks. mere end én cellelinje), er det vigtigt at dispensere hver cellesuspension umiddelbart efter ring til rBM for at forhindre for tidlig gelling. - Pladen centrifugeres i 15 minutter ved 750 x g ved hjælp af "blød anstændig"/ingen bremsning (hvis det er muligt, centrifugeres ved 4 °c for at holde RBM-væsken længere, men ikke et krav om vellykket sfæoide dannelse) for at sikre, at cellerne samles sammen, når ringmekanismen hærder, hvilket letter dannelsen af en enkelt sfæide.
- Du inkuberer pladen i en inkubator (37 °C, 5% CO2, 95% fugtighed).
- Hver 2-3 dage erhverve lys mikroskopiske billeder til vurdering af sfæroide vækst.
- Hver 2-3 dage erstatter 100 μL medium (Fjern 100 μL og Erstat med 100 μL frisk medium).
- Hængende drop sfæroider.
- Udfør trin 1.1.1-1.1.4.
- Fortynder cellerne for at opnå en passende fortynding. En praktisk fortynding er 50.000 celler/mL.
- Fjern låget på en 10 cm2 cellekultur skål og Placer det, så det vender opad. Der tilsættes 6 mL 1x PBS til skålen (figur 1B (i)).
- Hæld cellesuspensionen i et sterilt reservoir, og Anbring forsigtigt op til 30 dråber 40 μL af cellesuspensionen på låget på cellekultur skålen ved hjælp af en multikanalpipette (figur 1B (II)), hvilket resulterer i en koncentration på 2.000 celler/dråbe. Undgå at placere dråberne for tæt på kanten af låget, da disse dråber er mere tilbøjelige til at miste overfladespændingen, når du inverterer låget i det følgende trin.
- Vend låget i en hurtig, men kontrolleret bevægelse, og Anbring det oven på den 1x PBS-holdige cellekultur skål (figur 1B (III)).
- Skålen anbringes i en inkubator ved 37 °C med 5% CO2 og 95% fugtighed uden at forstyrre dråberne og lade dem vokse i 4-6 dage.
- Hvis det skal bruges til protein lysater eller indlejring, pulje sfæroider ved at fjerne låget og vippe det, for at vaske ned dråberne med 1 mL opvarmet medium. Overfør det resulterende medium indeholdende sfæroider til et 1,5 mL rør og lad dem slå sig ned til bunden af røret. Fortsæt som beskrevet i 4,4 og 6.2.2 for henholdsvis protein lysater og indlejring.
2. Drug behandling af spheroids
Bemærk: Langvarig narkotikabehandling kan anvendes på sfæroider for at screene for virkningerne af et lægemiddel af interesse. Før påbegyndelse af lægemidlet behandling, det er tilrådeligt at udføre et dosisrespons eksperiment af lægemidlet (r), for at finde en passende dosis til den eksperimentelle behandling. Doserne skal baseres på den bestemte IC50/K i af lægemidlet og spænder fra omkring 0,2 x-10x af denne værdi.
- Indstil 6-12 sfæroider i henhold til den ønskede tilstand som beskrevet i 1,2 eller 1,3 og Anbring i inkubator (37 °C, 5% CO2, 95% fugtighed) i 2 dage.
- På dag 2 skal du tage lette mikroskopiske billeder af sfæroider.
- Forbered de førstebehandlings doser (efter erhvervelse af billeder).
Bemærk: Den førstebehandlings koncentration skal være dobbelt så stor som den ønskede slutkoncentration, da opløsningen vil blive fortyndet 1:2 ved tilsætning til det godt indeholdende 100 μL medium. Anbefalede behandlingsintervaller (afhænger af halveringstiden for lægemidlet): dag 2, 4 og 7. - Brug en multikanalpipette til forsigtigt at fjerne 100 μL medium og erstatte det med 100 μL stof indeholdende medium.
- Anbring 96-brønd pladen tilbage i inkubatoren ved 37 °C med 5% CO2 og 95% fugtighed og Gentag 2,3 og 2,4 på de valgte behandlingsdage, men nu uden at fordoble dosis for at få den korrekte endelige dosis.
- På den sidste dag i protokollen/behandlingsplanen, kan en eller flere af følgende analyser udføres.
3. cellelevedygtighed analyse for spheroids
- Indstil 4-6 sfæroider i henhold til den ønskede tilstand som beskrevet i 1,2 eller 1,3 og Anbring i inkubatoren ved 37 °C med 5% CO2 og 95% fugtighed.
Bemærk: I dette tilfælde blev celle levedygtigheds analysen udført på dag 7 eller 9, efter at have overvåget sfæoid vækst hver 2-3 dage ved let mikroskopi som beskrevet ovenfor (punkt 1.2.5 og 1.3.13). - Test testen af levedygtigheden (Se tabel over materialer), og lad den ækvilibrere til rt før brug.
- Bland forsigtigt ved at invertere for at opnå en homogen opløsning.
- Før analysen udføres, fjernes 50% af dyrkningsmediet fra sfæroider (100 μL).
- Tilsæt cellelevedygtighed reagens til hver brønd på et 1:3 forhold til mængden af medium til stede i brønden (figur 2a (i)) for en 96-brønd plade tilsættes 50 μL reagens til 100 μl medium.
- Indholdet blandes kraftigt i 5 minutter for at inducere celle lysis (figur 2A (II)).
- Der inkuieres i 25 min ved RT for at stabilisere det luminescerende signal (figur 2A (III)).
- Optag det luminescerende signal (figur 2A (IV)).
4. forberedelse protein Lysates for Western blotting fra 3D Sfæide kulturer
Bemærk: Ved opsamling af sfæroider er det tilrådeligt at bruge en P200 pipette og skære enden af spidsen for at tillade en større åbning og dermed en lettere opsamling af sfæroider uden at forstyrre deres struktur.
- For hver betingelse, pulje mindst 12, ideelt 18-24 sfæroider (afhængigt af sfæroide størrelse) i et 1,5 ml rør (undgå 2 ml rør, da de næste skridt vil blive vanskeligere på grund af deres mindre spidde bund).
Bemærk: Hvis mængden af medium overstiger 1,5 mL, før de har indsamlet alle sfæroider, skal de indsamlede sfæroider kunne slå sig ned i bunden (sker meget hurtigt, centrifugering ikke nødvendig) og kassere halvdelen af røret, før de fortsætter indsamlingen af resterende sfæroider. - Anbring rørene på is, og lad sfæroerne slå sig ned i bunden af 1,5 mL-røret.
- Flyt fra det sterile celle laboratorium til det almindelige laboratorium.
- Sfæroider vaskes to gange i 1 mL iskold 1x PBS. Lad sfæroider bosætte sig, før 1x PBS fjernes mellem hvert vaske trin.
- Aspirer så meget 1x PBS som muligt uden at forstyrre eller fjerne sfæroider.
- Der tilsættes 5 μl opvarmet lysis-buffer (lb) med fosfatase-og proteasehæmmere pr. sfæroide (f. eks. 10 sfæroider = 50 μl lb).
- Gentag intervaller af vortex efterfulgt af spin ned indtil sfæroider er opløst. Udfør en cyklus af vortexning i 30 s efterfulgt af centrifugering (en hurtig spin ved hjælp af en bordplade centrifuge er tilstrækkelig) for 10 s i ca. 5-10 min afhængigt af størrelsen og kompakthed af sfæroider.
Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her. Opbevar lysaterne ved-20 °C indtil der fortsættes med sonikering, homogenisering og protein bestemmelse som i en standard 2D protein lysat protokol, efterfulgt af vestlig blotting ved hjælp af standardprotokoller.
5. propidium iodide (PI) farvning af Sfæroider
- Indstil 3-6 sfæroider pr. ønsket tilstand som beskrevet i 1,2 eller 1,3 og Anbring i inkubatoren ved 37 °C med 5% CO2 og 95% fugtighed.
- I en steril cellekultur laboratorium, varme 1x PBS til 37 °C.
- Lav en PI-opløsning på 4 μM ved fortynding af stamopløsningen i 1x PBS: Fortynd en 1 mg/mL vandig bestand af PI 1:350 i 1x PBS.
Bemærk: Denne koncentration vil blive yderligere halveret ved tilsætning af opløsningen til brøndene, hvilket giver en slutkoncentration på 2 μM. 100 μL af denne opløsning er nødvendig for hver brønd, der indeholder en sfæide.
Forsigtig: Propidium Iodid (PI) skal håndteres i en stinkhætte og iført handsker. PI er lysfølsom. Beskyt mod lys ved håndtering. - Fjern 100 μL af mediet fra hver brønd i 96-brønd pladen uden at fjerne sfæroider.
- Det resterende medium udvaskes ved at tilsætte 100 μL opvarmet 1x PBS til alle brønde efterfulgt af fjernelse af 100 μL af væsken i brøndene. Gentag dette vaske trin 3 gange.
- Tilsæt 100 μL af PI-opløsningen til hver brønd, dæk pladen i aluminiumsfolie, og anbring den i en inkubator ved 37 °C med 5% CO2 og 95% fugtighed for 10-15 min.
- Gentag de 3 vaske trin, der er beskrevet i 4,5, for at udvaske PI-opløsningen for at mindske baggrunds signalet ved billeddannelse.
- Brug et epifluorescens mikroskop til at afbilde sfæroider. For at vurdere levedygtigheden af celler i sfæide kerne tage z-stakke for at få billeder med varierende dybder af sfæroide.
Bemærk: En trin størrelse omkring 18-35 μm mellem hvert udsnit afhængigt af sfæoid størrelse er tilrådeligt, hvilket giver ca 11-18 stakke per sfæide. Z-stakke kan behandles i ImageJ ved hjælp af z-projektion funktion, som kan kombinere alle z-stakke i et endeligt billede, der giver et overblik over farvning i hele sfæide (for yderligere retningslinjer for brugen af ImageJ til dette formål, se (https://imagej.net/Z-functions).
6. indlejring af 3D Sfæroider
-
Forbered den agopstået gel, som sfæroider er indlejret i (kun nødvendigt første gang at udføre protokollen).
- 1 g bactoagar blandes i 50 mL ddH2O.
- Opvarmes langsomt i mikrobølgeovnen, indtil bactoagar er opløst, og der dannes en homogen gel. Lad ikke gelen koge.
- Hold bactoagar varm i et vandbad ved 60 °C.
- Opbevares ved 4 °C mellem eksperimenter.
-
Integrering af sfæroider.
- På dag 1, for hver betingelse, pulje mindst 12 sfæroider i et 1,5 mL rør.
- Vask én gang med 1 mL iskold 1x PBS.
- For at fastgøre sfæroider tilsættes 1 mL 4% PARAFORMALDEHYD.
Bemærk: Behandling af PARAFORMALDEHYD bør udføres i en stinkhætte. - Lad dem inkuere i 24 timer ved RT.
- På dag 2 skal du varme den agede gel forsigtigt ved at anbringe den i et vand fyldt bægerglas i en mikrobølgeovn. Sørg for, at gelen ikke koger! Hold varmen i en bordplade, ved 60 °C indtil brug.
- Sfæroider vaskes to gange med 1 mL iskold 1x PBS.
- Aspirer det meste af 1x PBS (efterlader ca. 100 μL på dette tidspunkt er praktisk til håndtering af sfæroider).
- Tilbered en 20 μL pipette ved at skære pipettespidsen mod en hældning for at få en spids spidsen med et større hul (se illustrationen).
Bemærk: Den næste del skal gøres hurtigt for at sikre optimal sfæoide overførsel og for at undgå solidificering af gel dråbe. Hvis ingen varmeblok er tilgængelig, anbefales det at først fange sfæroider og derefter gøre agopstået dråbe (dvs. skifte rækkefølgen af punkter 6.2.9 og 6.2.10). - Lav en agopstået gel dråbe på et mikroskop slide. Anbring sliden på en varm varmeblok for at forhindre, at Agen bliver størkne.
- Brug den modificerede pipettespids (Se 6.2.8) til at fange så mange sfæroider som muligt i et volumen på 15-20 μL.
- Injicer forsigtigt den 15-20 μL sfæide-holdige 1x PBS ind i midten af agopstået gel dråbe uden at røre mikroskopet slide.
Bemærk: Det er et lidt vanskeligt punkt. Sfærooiderne går tabt, hvis pipettespidsen rører mikroskopet, når de injicerer sfæroider i geldråbe. Det er tilrådeligt at praktisere hele processen med at gøre agopstået dråbe og indsprøjtning af sfæroider ved at injicere en farvet væske ind i drop. Dette vil gøre det muligt visualisering af en potentiel penetration gennem drop, da den farvede væske vil lække ud på diaset. - Lad agrose-gel-dråbe hærde ved at inkuere i 5-10 min ved RT eller ved 4 °C. Når gel-faldet har størknet noget (men stadig er ret blødt), skubbes gelen forsigtigt ned fra mikroskopet til en plastik kassette med en skalpel.
- Dæk plast kassetterne i 70% ethanol.
Bemærk: På dette tidspunkt kan sfæroider anvendes direkte eller opbevares i månedsvis. - Integrer agopstået-indlejret sfæide i paraffin, sektion i 2-3 μm tykke lag slides og bejdsning med hematoxylinlegemer og eosin eller underlagt immuno-histologisk farvning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sfæroide vækst analyser baseret på den sfæide formation protokol skematisk illustreret i figur 1A og figur 1B, blev brugt som udgangspunkt for analyse af virkningerne af anti-cancer Drug behandlinger i en 3D tumor efterligne indstilling. Den lethed, hvormed sfæroider dannes er cellelinje specifik, og nogle cellelinjer kræver tilskud med ringmekanismer for at danne sammenhængende sfæroider22. Koncentrationen af ringmekanismer tilsættes kan dybt påvirke morfologien af sfæroider. Som det fremgår af figur 1C og figur 1D, ændrer koncentrationen af ringmekanismer mellem 0 og 4% til sfæroernes kompakthed og morfologi i en celletype afhængig måde. Figur 1 C demonstrerer, hvordan tilføjelsen af op til 2,5% ringmekanismer tillader sfæroide dannelse i skbr-3 brystkræft celler uden yderligere virkning ved koncentrationer over 2,5% ringmekanismer. I modsætning, BxPC3 pancreatisk duktalt adenokarcinom (pdac) celler, som udviser en epitelial morfologi, spontant danner små, kompakte sfæroider (figur 1D, øvre, venstre panel). I denne celletype, øge ringmekanismer koncentration til 1,5% eller derover fremkalder en tydelig morfologisk ændring fra sfæroide til mere indviklede strukturer med fremspring og invaderer, der minder om duktal rørformede struktur dannelse. Omvendt, tilsætning af ringmekanismer til to andre pdac cellelinjer, miapaca og Panc-1, som har en mere mesenkymale fænotype, giver de løse cellulære aggregater til at blive strammere og danne mere kompakt sfæroider (figur 1D, midterste og nedre og paneler). Disse resultater viser, at den nøjagtige mængde ringmekanismer, der resulterer i optimal sfæoide dannelse, skal titreres for hver cellelinje og tilstand.
En kvantitativ vurdering af cellernes levedygtighed inden for sfærooiderne ved behandling af stoffer var nødvendig for at vurdere virkningen af anti-cancer medicin behandlinger. Den analyse, der er beskrevet her, er en luciferin-luciferasebaseret analyse, som måler ATP frigivet fra levende celler inden for sfæroider. Analysens princip er illustreret i figur 2A. Det luminescerende signal, der genereres i denne analyse, registreres let af en plade læser (figur 2a) og korrelerer godt med levedygtighed målt ved andre metoder23. Det lineære forhold mellem ATP-koncentrationen og luminescens i det relevante koncentrationsområde er vist i figur 2B, mens figur 2C viser analysens evne til at vurdere celledød i 3D-sfæroider behandlet med anti-cancerbehandling. For yderligere at vurdere analysens linearitet i det relevante område blev der udført eksperimenter med at etablere standard kurver for det luminescerende signal som en funktion af antallet af celler (figur 2D og figur 2E ). Disse resultater indikerer, at analysen er egnet til estimering af cellernes levedygtighed i 3D-sfæoide kulturer, og at den er anvendelig til undersøgelse af lægemiddelinduceret tab af cellers levedygtighed.
En kombination af lette mikroskopiske billeder erhvervet hver anden til tre dage, i løbet af behandlingsperioden og en endelig kvantitativ vurdering af cellernes levedygtighed giver tæt overvågning af sfæroide vækst og morfologi samt vurdering af optimal behandling Dosis. Sidstnævnte er eksemplificeret i figur 3A og figur 3B, hvor der blev udført et dosis-respons eksperiment for at bestemme den dosis, der var nødvendig for 50% nedsat cellelevedygtighed i MDA-MB-231 sfæroider af brystkræft. Behandlingseffekterne på sfæroide morfologi er visualiseret i figur 3C og figur 3D for henholdsvis MDA-MB-231 og MCF-7 sfæroider. Under behandling med den valgte kemoterapeutiske cocktail øges kompakthed af MDA-MB-231 sfæroider, mens MCF-7 sfæroider under behandling med Tamoxifen bliver mere og mere flossede og ujævne. I begge tilfælde er et klart fald i cellernes levedygtighed synlig efter 7 (MDA-MB-231) eller 9 (MCF-7) dages behandling (figur 3E og figur 3F). Dette viser behovet for både en visuel og en kvantitativ vurdering af behandlings medierede virkninger på sfæroide cellers levedygtighed og morfologi, samt at disse parametre er meget celle-og behandlings specifikke.
Som et supplement til cellen levedygtighed assay, farvning af døde celler med PI, som ikke kan krydse membranen og derfor kun pletter nekrotiske eller sene apoptotiske celler med kompromitteret membran integritet, giver mulighed for en hurtig rumlig vurdering af døde celler i respons på behandling, uden den tidskrævende protokol om indlejring, skæring og IHC. Som illustreret i figur 4A den rumlige opstilling af døde celler efter en stigende koncentration af en inhibitor, i dette tilfælde, kan na+/h+ Exchanger 1 (NHE1)-hæmmeren 5-(n-ethyl-n-isopropyl)-amilorid (EIPA) Visualiseret. Som set viser kontrol sfæroider en begrænset nekrotisk/sen apoptotisk kerne, hvorimod de døde celler fordeles i hele sfæroide, efterhånden som koncentrationen af EIPA forøges.
For at kvantificere den relative induktion af apoptotisk stress efter forskellige behandlinger, blev sfæroider lyseret og udsat for SDS-PAGE gel elektroforese og Western blotting for fuld længde og kløvet poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). Repræsentative resultater fremgår af figur 4B og figur 4C. I dette eksperiment blev sfæroider fremstillet af MDA-MB-231 celler, hvor lactat-proton cotrans Porter MCT4 eller na+, HCO3- cotrans Porter NBCn1 blev slået ned ved hjælp af siRNA. Den Knockdown blev evalueret af Western blotting for MCT4 og NBCn1 (ikke-offentliggjorte data). Som set, den Knockdown af MCT4, men ikke af NBCn1, robust øger PARP spaltning, i overensstemmelse med vores tidligere demonstration, at stabile Knockdown af MCT4 i MDA-MB-231 celler nedsætter tumorvækst in vivo24.
For yderligere at analysere virkningerne af behandling og få oplysninger om de specifikke signalering-, vækst anholdelse, og død veje aktiveret, kan sfæroider ud over Western blot analyse integreres og udsættes for Immunhistokemi (IHC) analyse. IHC analyse af sfæide sektioner tillader anvendelse af specifikke antistoffer eller markører for celleproliferation, celle cyklus og programmeret celledød, og letter en visualisering af den rumlige arrangement af proliferativ og apoptotiske celler i sfæroide.
Et skematisk tal for indlejrings protokollen for IHC-analyse af sfæroider er præsenteret i figur 5A. Et repræsentativt lys mikroskopisk billede af en ca. 3 μm tyk mikrotomdel af en indlejret sfæroide er vist i figur 5B, og et immunofluorescens billede af en sfæide farvet til tumor suppressor protein P53 (kerner farvet ved hjælp af DAPI), vises som figur 5C. Eksempler på DMSO-og kemoterapi-behandlede sfæroider, der er farvede for celle sprednings markøren ki-67 eller for P53, er vist i henholdsvis figur 5D og figur 5E. I overensstemmelse med kemoterapi behandlingens antiproliferativ virkning er antallet af ki-67 positive celler større i DMSO-kontrol end i den kemoterapi behandlede sfæide (figur 5D). I modsætning hertil øges P53-udtrykket under forhold med celle stress, apoptose og vækst anholdelse, og derfor er antallet af P53-farvede celler væsentligt højere i de kemoterapi behandlede sfæroider sammenlignet med DMSO-kontrol (figur 5 E).
Disse resultater illustrerer eksempler på, hvordan rumligt løst (PI farvning, IHC) eller kvantitativ (vestlig blotting) oplysninger om narkotikabehandling effekter i 3D sfæroider kan opnås.
Figur 1 : Spontan og RBM-medieret sfæroide formation. (A) skematisk gengivelse af sfæoide dannelse ved hjælp af ultra-lav fastgørelse 96-godt rundt Bundplader, med valgfri brug af ringmekanismer. Enkelte trin, der er markeret med (i-III). B) skematisk gengivelse af sfæoide dannelse ved hjælp af den hængende dråbe metode. De enkelte trin er markeret med (i-III) (C) repræsentative billeder af RBM-medieret sfæroide-dannelse af skbr-3-celler. Cellerne blev seedet i ultra-lav fastgørelse 96-godt rundt Bundplader med stigende koncentrationer af ringmekanismer og dyrkes i 9 dage. Skala stang 100 μm. (n = 3). (D) repræsentative billeder af bxpc-3, MiaPaCa og Panc-1 celler seedet til sfæide dannelse i ultra-lav fastgørelse 96-godt rundt Bundplader med koncentrationer af ringmekanismer fra 0,5-2,5%. Sfæroider blev dyrket i 4 dage. Skala stang = 250 μm. (n = 3). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Princip og evaluering af celle levedygtigheds analysen. A) skematisk gengivelse af analysen af 3D-cellernes levedygtighed. Individuelle trin, der er angivet i (i-IV). (B) luminescerende signal som funktion af ATP-koncentrationen. Fortyndinger af ATP blev belagt i en 96-brønd plade og cellelevedygtighed reagens føjet til hver brønd. Luminescens blev registreret efter 30 minutter ved 405 nm. 1 n.c) levedygtighed, målt som luminescens, af kontrol og kemoterapi-behandlede MCF-7 sfæroider. MCF-7 celler blev seedet i ultra-lav fastgørelse runde-Bundplader og blev dyrket i 7 dage. Behandling med kemoterapi (5 μM Cisplatin, 5 μM doxorubicin og 30 nM 5-FU) blev anvendt på dag 2 og 4. Søjler repræsenterer middelværdier med SD. 1 n. (D) luminescerende signal som funktion af antallet af MCF-7-celler, der er seedet. MCF-7 celler blev seedet i 96-nå plader på det angivne celle nummer og lov til at vokse for 48 h, hvorefter cellernes levedygtighed blev målt. Fejllinjer repræsenterer SD. 1 n. (E) som beskrevet i D for MDA-MB-231-celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Virkninger af behandlingsregimer på sfæroide morfologi og cellers levedygtighed. A) repræsentative billeder af sfæroider af MDA-MB-231 på dag 2, 4 og 7. MDA-MB-231 celler blev seedet i ultra-lav fastgørelse runde bund 96-brønd plader. Behandling med stigende doser kemoterapi blev påbegyndt på dag 2, på hvilket tidspunkt alle sfæroider var af samme størrelse. Rækker viser sfæroider ved stigende doser af kemoterapi, og kolonnerne viser sfæroider repræsentative for størrelse på dag 2, 4 og 7 ved den angivne dosis. Den laveste dosis var 18,75 nM Cisplatin, 18,75 nM doxorubicin, 0,0625 nM 5-fluorouracil (5-FU), og denne dosis blev fordoblet for hvert viste billede, hvilket resulterede i en maksimal dosis på 0,3 μM Cisplatin, 0,3 μM doxorubicin og 2 nM 5-FU. Skala stang = 100 μm. (2 n). B) levedygtigheden af sfæroider af MDA-MB-231, målt som luminescens, efter 7 dages kemoterapeutisk behandling. Søjlerne repræsenterer middelværdier med SEM. 2 n. (c, D) repræsentative billeder af MDA-MB-231 (c) og MCF-7 sfæroider (D) på dag 2, 4, 7 og for MCF-7 sfæroider 9. Celler seedede som i (a) og behandlet med enten kemoterapi (chemo, 18,75 nm Cisplatin, 18,75 nm doxorubicin, 0,0625 nm 5-FU) på dag 2 og 4 (C) eller med 2 μM Tamoxifen (TAM) på dag 2, 4 og 7 (D). Skala stang = 100 μm. (4 n og 3 n). (E, F) Levedygtighed, målt som luminescens, på dag 7 og 9 for henholdsvis litraC) ogD). For at teste for statistisk signifikant forskel mellem betingelserne blev der udført en ikke-parret Students t-test. Angiver p < 0,0001. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Propidium Iodid farvning og Western blot analyse af sfæroider. A) repræsentative billeder af pi-farvede MCF-7 sfæroider efter 9 dages behandling. MCF-7 celler blev seedet i ultra-lav fastgørelse 96-Well plader dyrket i 9 dage og behandlet med stigende koncentrationer af EIPA på dag 2, 4 og 7. På dag 9 blev sfæroider plettet med PI og billeder blev erhvervet på et epifluorescens mikroskop. Skaleringsbar = 200 μm. (1 n.) (B) repræsentative vestlige klatter af MDA-MB-231-celler efter knockout/Knockdown af syre-base-transportører. NHE1 blev slået ud af crispr/Cas9 i MDA-MB-231 celler 12 og cellerne blev efterfølgende transitært transficeret med siRNA mod MCT4 eller NBCn1, og dyrket som sfæroider i 9 dage før de blev lyseret og udsat for vestlig blotting ved hjælp af et antistof anerkendelse af total og kløvet (c) PARP. C) kvantificering af forholdet mellem CPARP og PARP-Proteinniveau, normaliseret til belastnings kontrol (β-aktin). (1 n). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Fastsættelse, indlejring og Immunohistokemi analyse af sfæroider. A) skematisk gengivelse af protokollen til indlejring af sfæroider. De enkelte trin markeres som (i-VII). (B) billede af indlejret MDA-MB-231 spheroid. Skala stang: 50 μm. (C) repræsentativt billede af kemoterapi behandlet MDA-MB-231 sfæroide underkastes IHC-analyse med antistoffer mod p-53. Stiplede linjer viser omkredsen af sfæooid. Skala stang = 20 μm. (D, E) repræsentative billeder af DMSO-eller kemoterapi-behandlede (øvre og nedre paneler, henholdsvis) MDA-MB-231 sfæroider. MDA-MB-231 celler blev seedet i ultra-lav fastgørelse 96-brønd plader, dyrket i 7 dage og behandlet med kemoterapi på dag 2 og 4. På dag 7 blev sfæroider indlejret efterfulgt af analyse af IHC med primære antistoffer mod ki-67 (D) og P53 (E). Hvide bokse repræsenterer zoom billeder. Skala bjælken = 20 μm i begge forstørrelser, (n = 3). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brugen af 3D cancer celle sfæroider har vist sig at være et værdifuldt og alsidigt værktøj ikke kun for anticancer Drug screening, men også for at få mekanistisk indsigt i reguleringen af kræftcellernes død og levedygtighed under betingelser, der efterligner dem i tumoren mikromiljø. Dette er især afgørende, da tilgængelighed, cellulær optagelse, og intracellulære virkninger af kemoterapeutiske lægemidler er dybt påvirket af de fysisk-kemiske forhold i tumoren, herunder pH, oxygen spændinger, tortuøsitet, og fysiske og interaktioner med kemiske celle celler9,17. For eksempel, surhedsgraden af ekstracellulær pH, som kan nå værdier så lavt som 6-6,5 i mange solide tumorer25,26,27,28,29, forårsager svagt grundlæggende kemoterapeutika doxorubicin, Mitoxantron og zwitterion paclitaxel, der skal oplades. Dette reducerer deres optagelse i tumorcellerne og kan påvirke aktiviteten af multiresistens proteiner såsom p-glycoprotein30,31,32. Også celleproliferation, som er afgørende for effekten af de fleste kemoterapeutiske forbindelser, er generelt reduceret i 3D sammenlignet med 2D betingelser og dermed sandsynligvis bedre efterlignes i tumor sfæroider end i 2D cellekultur8,33 af34. Endelig, den tætte tumor mikromiljø er oprindelsen af talrige fysiske og opløselige signalering signaler dirigere intracellulære signalering veje regulerer cellevækst, overlevelse og død. Således, når man analyserer stof effektivitet, 3D-kultur systemer er et afgørende skridt, før de påbegynder in vivo modeller. En stor ulempe ved 3D-kulturen er imidlertid den øgede kompleksitet af analysen i forhold til 2D-kulturen. Vi har beskrevet her enkle og relativt billige teknikker til sfæroide formation ved hjælp af en række kræft celletyper. Vi har vist eksempler på, hvordan sfæroide formation skal optimeres for hver undersøgt celletype og har beskrevet, hvordan man opnår kvantitative data om cellers levedygtighed, celledød og tilknyttede signalerings veje i sådanne sfæroider. Der er ingen indlysende vækst-eller morfologiske forskelle mellem de tre modeller, der er beskrevet her. I vores hænder, variationen i morfologi kan være lidt større ved hjælp af hængende drop metode, men en fordel ved denne metode er, at ringmekanismer er ikke nødvendig. Vi har fokuseret her på sfæroider fremstillet af en enkelt kræft celletype. Den sfæide model er dog også underholdende at co-kultur, for eksempel af kræftceller med fibroblaster, monocytter/makrofager, endotel celler, og/eller adipocytter35,36,37. Andre avancerede anvendelser af denne model omfatter kombinationen med 3D trykte Fluidic enheder tillader dosering gennem en semi permeabel membran, efterfulgt af høst til kvantitativ proteomiske profilering38.
Mens, som nævnt ovenfor, Fænotypen af celler dyrket i 3D sfæroider generelt efterligner, at af in vivo tumorer meget bedre end gør celler dyrket i 2D, i hvilket omfang sådanne sfæroider er faktisk relevante modeller af de tilsvarende in vivo tumorer er afhængig af talrige faktorer og skal evalueres nøje. Parametre, som vil påvirke, hvor godt sådanne sfæroider efterligner in vivo-tilstanden, omfatter den cellulære sammensætning af tumoren og dens relative ECM-sammensætning. For eksempel, den ringmekanismer, som vi har ansat som ECM i protokollerne her er et godt valg for at efterligne tidlige stadier af epitelial kræft, omkring tidspunktet for at bryde kælderen membran, andre ECM kompositioner vil være mere relevant for visse tumor typer og-stadier. Desuden varierer kapaciteten for celle-celle vedhæftning meget mellem kræft cellelinjer, afhængigt af deres udtryk for celle celle-og cellematrix adhæsions proteiner såsom cadheriner og integrins22.
Som beskrevet her, kan sfæroide vækst og morfologi nemt og ikke-invasivt blive overvåget hver 2-3 dage ved hjælp af et let mikroskop med lav forstørrelse optik og et stort synsfelt. Men, fordi den cytotoksiske stress, såsom kemoterapi behandling, påvirker sfæroide morfologi meget forskelligt, og på en måde, afhængigt af celletype og behandling ordning, er det ikke nok at stole på morfologi og omkreds alene for at vurdere behandlingseffekt. For eksempel kan sfæroider blive løsere med behandling og begyndende celledød, eller alle dødsfald kan forekomme i den nekrotiske kerne, mens overfladen ikke er detektivere påvirket. I begge tilfælde kan resultatet være et fejlagtigt indtryk af, at antallet af levende celler i sfæroide ikke reduceres ved behandlingen. Kvantitative-og helsfæide teknikker er derfor afgørende for at vurdere behandlingseffekten. Til kvantitativ vurdering af celledød er den syre fosfataseanalyse, der som navnet antyder, at aktiviteten af cytosoliske-fosfatase er blevet anvendt21. Men i vores hænder, mens denne analyse generelt pænt afspejler antallet af celler seedet, det ikke tilstrækkeligt indfange hurtig behandling-induceret celledød (data ikke vist), sandsynligvis fordi syre fosfatase forbliver aktiv i nogen tid efter celledød. Desuden, denne analyse kræver fuldstændig fjernelse af mediet, hvilket øger fejl især med skrøbelige, kemoterapi-behandlede sfæroider. Den celle levedygtigheds analyse, der er beskrevet her, og som er baseret på cellulær ATP-indhold, blev valgt på grundlag af dens enkle og tids effektive protokol og høj reproducerbarhed. Endvidere, denne analyse ikke kræver fuldstændig fjernelse af kulturmedium, som er en fordel, når man arbejder med sfæroider. Som vist i repræsentative resultater, denne analyse fanger godt både celle nummer og forventede kemoterapi behandling effekter. Men, en faldgrube af denne teknik er naturligvis, at metaboliske ændringer reducere intracellulære ATP indhold kan fejlagtigt registreres som et lavere celle nummer. Derfor er parallel vurdering af sfæroide volumen og morfologi, eller PI farvning, tilrådeligt at validere resultaterne.
Spheroid lysis efterfulgt af Western blotting kan give semi-kvantitativ indsigt i tilstanden af signalering processer, celledød-, vækst-og levedygtighed veje. Brugen af Western blotting er kompliceret, når ringmekanismer bruges til at forberede sfæroider, da dette vil omfatte en betydelig brøkdel af det lysat proteinindhold, og endnu vigtigere, dens fraktioneret bidrag vil stige med faldende cellulære indhold ved kemoterapeutisk celledød. Det er i princippet muligt at fjerne ringmekanismer ved centrifugering. Dette er imidlertid et kritisk skridt, da det er vanskeligt helt at fjerne alle ringmekanismer, og dette vil udelukke en kvantitativ sammenligning mellem betingelserne. For sådanne sfæroider, og generelt for rumligt løst vurdering af døds veje og relevante signalering parametre, indlejring og IHC er stærke værktøjer. Andre tilgange kan overvejes: levende confokal billeddannelse af (relativt små) intakte sfæroider39. En anden interessant egenskab af sfæroider er, at i betragtning af deres temmelig almindelige "Ball" form, de egner sig godt til iteration mellem matematisk modellering og Wet Lab eksperimenter, for at øge forståelsen af betydningen af de ovenfor nævnte stigninger i ilt, ph og næringsstoffer i sfæroider og ved ekstrapolation, tumorer40,41. Således, selv om vigtige 3D tumormodeller af langt større kompleksitet er ved at dukke op, herunder en bred vifte af organotypiske og organoid kulturer baseret på komplekse biologiske såvel som inaktive stilladser, og ikke mindst, patient-afledte xenografter42, sfæroider er fortsat et vigtigt redskab på grund af deres overlegne biologiske relevans sammenlignet med 2D-kulturen kombineret med relativ let håndtering.
Sammenfattende præsenterer vi her en række enkle metoder til analyse af anti-cancerbehandling-induceret ændringer i kræft cellelevedygtighed og død i 3D-kultur. Sammensætningen af sfæroider kan ændres afhængigt af de anvendte cellers egenskaber og biologi, og de fremlagte kvantitative og kvalitative analyser er nyttige både til vurdering af forholdet mellem dosis og respons og til at få indsigt i signalering-og døds veje involveret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi er glade for Katrine Franklin Mark og Annette Bartels for fremragende teknisk assistance og for Asbjørn Nøhr-Nielsen for at udføre eksperimenterne i figur 1D. Dette arbejde blev finansieret af Einar Willumsen Foundation, Novo Nordisk Foundation, og Fondation Juchum (alle til SFP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | For staining nuclei |
| 5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Component in chemotherapeutic treatment |
| 5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inhibitor of NHE1 |
| Antibody against PARP and cPARP | Cell signaling | #9542 | Used in western blotting |
| Antibody against Ki-67 | Cell signaling | #9449 | Used for IHC |
| Antibody against p53 | Cell Signaling | #2524 | Used for IHC |
| Antibody against β-actin | Sigma | A5441 | Used in western blotting |
| Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Used for agarose gel preparation |
| Benchmark protein ladder | Invitrogen | #10747-012 | Used for SDS-PAGE |
| Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Used for protein determination from lysates |
| Bürker chamber | Marienfeld | 610311 | For cell counting |
| BX63 epifluoresence microscope | Olympus | Used for fluorescent imaging | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Used for the cell viability assay |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | #P4394 | Component in chemotherapeutic treatment |
| Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom, Ultra-low attachment, With lid, Sterile | Corning | #4520 | Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point |
| Corning 96 well, clear round bottom, Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile | Corning | #7007 | Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point |
| Criterion TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Used for SDS-PAGE |
| Doxorubicin | Abcam | #120629 | Component in chemotherapeutic treatment |
| FLUOStar Optima Microplate reader | BMG Labtech | Used for recording luminescence | |
| Formaldehyde | VWR Chemicals | #9713.1000 | Used for cell fixation |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | #A1413202 | Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol. |
| Heat-inactivated FBS | Sigma | #F9665 | Serum for growth media |
| ImageJ | NIH | Scientific Image analysis | |
| Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Used for storage of embedded spheroids |
| Mini protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Used for lysis buffer preparation |
| MZ16 microscope | Leica | Used for light microscopic images | |
| NuPAGE LDS 4x Sample Buffer | Invitrogen | #NP0007 | Used for western blotting |
| Pierce ECL Western blotting substrate | Thermo scientific | #32106 | Used for western blotting |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Used for protein band staining |
| Prism 6.0 | Graphpad | Scientific graphing and statistical software | |
| Propidium iodide (1mg/ml solution in water) | Invitrogen | P3566 | Light sensitive |
| Sterile reservoirs, multichannel | SPL lifesciences | 21002 | Used for seeding cells for spheroid formation |
| Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | Microscope glass slide used for embedding |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Used as chemotherapeutic treatment |
| Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #170-4159 | Used for western blotting |
| Tris/Glycine/SDS running buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Used for SDS-PAGE |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | #T4174 | Cell dissociation enzyme |
References
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Influence of glucose and oxygen supply conditions on the oxygenation of multicellular spheroids. British Journal of Cancer. 53 (3), 345-353 (1986).
- Gaedtke, L., Thoenes, L., Culmsee, C., Mayer, B., Wagner, E. Proteomic analysis reveals differences in protein expression in spheroid versus monolayer cultures of low-passage colon carcinoma cells. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4111-4118 (2007).
- Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS Genetics. 4 (12), 1000293 (2008).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30 (3), 247-255 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews in Molecular and Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Jacobi, N., et al. Organotypic three-dimensional cancer cell cultures mirror drug responses in vivo: lessons learned from the inhibition of EGFR signaling. Oncotarget. 8 (64), 107423-107440 (2017).
- Rodriguez-Enriquez, S., et al. Energy metabolism transition in multi-cellular human tumor spheroids. Journal of Cell Physiology. 216 (1), 189-197 (2008).
- Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor. Cell Biology International. 23 (3), 157-161 (1999).
- Andersen, A. P., et al. Roles of acid-extruding ion transporters in regulation of breast cancer cell growth in a 3-dimensional microenvironment. Molecular Cancer. 15 (1), 45 (2016).
- Swietach, P., Patiar, S., Supuran, C. T., Harris, A. L., Vaughan-Jones, R. D. The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular ph in three-dimensional tumor cell growths. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20299-20310 (2009).
- Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected fibroblasts. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (4), 509-522 (2000).
- Kunz-Schughart, L. A., Groebe, K., Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell culture induces novel proliferative and metabolic alterations associated with oncogenic transformation. International Journal of Cancer. 66 (4), 578-586 (1996).
- Feng, H., et al. Homogeneous pancreatic cancer spheroids mimic growth pattern of circulating tumor cell clusters and macrometastases: displaying heterogeneity and crater-like structure on inner layer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 143 (9), 1771-1786 (2017).
- Santini, M. T., Rainaldi, G., Indovina, P. L. Apoptosis, cell adhesion and the extracellular matrix in the three-dimensional growth of multicellular tumor spheroids. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36 (2-3), 75-87 (2000).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. Journal of Visual Experiments. (66), e4218 (2012).
- Friedrich, J., et al. A reliable tool to determine cell viability in complex 3-d culture: the acid phosphatase assay. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 925-937 (2007).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. International Journal of Oncology. 31 (6), 1403-1413 (2007).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Andersen, A. P., et al. The net acid extruders NHE1, NBCn1 and MCT4 promote mammary tumor growth through distinct but overlapping mechanisms. International Journal of Cancer. , (2018).
- Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in Radiation Oncology. 14 (3), 198-206 (2004).
- Vaupel, P. W., Frinak, S., Bicher, H. I. Heterogeneous oxygen partial pressure and pH distribution in C3H mouse mammary adenocarcinoma. Cancer Research. 41 (5), 2008-2013 (1981).
- Helmlinger, G., Yuan, F., Dellian, M., Jain, R. K. Interstitial pH and pO2 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nature Medicine. 3 (2), 177-182 (1997).
- Zhang, X., Lin, Y., Gillies, R. J. Tumor pH and its measurement. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1167-1170 (2010).
- Gillies, R. J., Raghunand, N., Karczmar, G. S., Bhujwalla, Z. M.
- Vukovic, V., Tannock, I. F. Influence of low pH on cytotoxicity of paclitaxel, mitoxantrone and topotecan. British Journal of Cancer. 75 (8), 1167-1172 (1997).
- Song, C. W., Griffin, R., Park, H. J. Cancer Drug Resistance. Teicher, B. A. , Humana Press. 21-42 (2006).
- Lotz, C., et al. Role of the tumor microenvironment in the activity and expression of the p-glycoprotein in human colon carcinoma cells. Oncology Reports. 17 (1), 239-244 (2007).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular Oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
- Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model. PLoS One. 12 (7), 0182039 (2017).
- Bochet, L., et al. Adipocyte-derived fibroblasts promote tumor progression and contribute to the desmoplastic reaction in breast cancer. Cancer Research. 73 (18), 5657-5668 (2013).
- Amann, A., et al. Development of a 3D angiogenesis model to study tumour - endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs. Scientific Reports. 7 (1), 2963 (2017).
- LaBonia, G. J., Ludwig, K. R., Mousseau, C. B., Hummon, A. B. iTRAQ Quantitative Proteomic Profiling and MALDI-MSI of Colon Cancer Spheroids Treated with Combination Chemotherapies in a 3D Printed Fluidic Device. Analytical Chemistry. 90 (2), 1423-1430 (2018).
- Hulikova, A., Vaughan-Jones, R. D., Swietach, P. Dual role of CO2/HCO3(-) formula buffer in the regulation of intracellular pH of three-dimensional tumor growths. Journal of Biological Chemistry. 286 (16), 13815-13826 (2011).
- Wallace, D. I., Guo, X. Properties of tumor spheroid growth exhibited by simple mathematical models. Frontiers in Oncology. 3, 51 (2013).
- Michel, T., et al. Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids. Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).
- Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).
