Hücre viability ve ölüm kanser hücrelerinin 3D Küroid kültürlerde değerlendirilmesi
Summary
Burada, 2D kültürden çok daha iyi in vivo tümörlerin fiziko-kimyasal degradelerini taklit eden 3D kanser hücresi kürelerinin içinde canlanıyor ve ölümü değerlendirmek için birkaç basit yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, küroid modeli, kanser ilaç etkinliğinin değerlendirilmesi için gelişmiş çeviri ile in vivo koşullara izin verir.
Abstract
Kanser hücrelerinin üç boyutlu kürüler hem kanser ilaç ekranları için önemli araçlar ve kanser hücresi biyoloji içine mekanik fikir kazanmak için. Bu preparatın gücü, hızlı, ucuz ve nispeten yüksek verim taramasına izin verecek kadar çok yönlü olmakla beraber, tümörün in vivo koşullarının birçok yönünü taklit etme yeteneğiyle yatıyor. Küroid kültürü koşulları, bir tümördeki fiziko-kimyasal degradeleri, artan ekstrellüler asitliği, artan lakdamak, ve glikoz ve oksijen kullanılabilirliğini azaltarak, küre çevresinden çekirdeğine kadar tekrar edebilir. Ayrıca, in vivo tümörlerin mekanik özellikleri ve hücre hücre etkileşimleri kısmen bu model tarafından taklit edilmiştir. Özel özellikleri ve sonuç olarak en iyi büyüme koşulları, 3D kürler, farklı kanser hücrelerinin türleri arasında farklıdır. Ayrıca, 3D Kürklerde hücre cancılığı ve ölümün değerlendirilmesi, 2D kültürler için istihdam edenler kısmen farklılık yöntemleri gerektirir. Burada kanser hücrelerinin 3D kürleri hazırlamak için çeşitli protokoller açıklamak ve antikanser ilaçların etkinliğini değerlendirmek bağlamında hücre canlılığı ve ölüm değerlendirmek için bu tür kültürler kullanmak için.
Introduction
Kanser biyolojisinde çok hücreli küre modellerinin kullanımı birkaç yıl eski1,2, ama son yıllarda önemli momentum kazanmıştır. Büyük ölçüde, bu kanser hücrelerinin phenoype onların mikroçevre ve spesifik büyüme koşullarına bağlı olduğu ne kadar güçlü farkındalığını arttırmaktadır. Solid tümörlerde mikroçevre, karşılık gelen normal dokularda temelde farklıdır. Bu pH gibi fiziko-kimyasal koşulları içerir, oksijen gerilimi, yanı sıra interstisyel basınç, besin gibi çözünür faktörlerin konsantrasyon degradeler, atık ürünler, ve salgılanmış sinyalizasyon bileşikleri (büyüme faktörleri, sitokinler). Ayrıca, hücre içi matris (ECM), hücreli hücre etkileşimleri ve hücresel sinyalizasyon organizasyonu ve tümör3,4, belirli üç boyutlu (3D) mimarisi diğer yönlerini içerir 5,6. Kanser hücrelerinin mevcut olduğu spesifik mikroçevresel koşullar, gen ifade profilini ve fonksiyonel özelliklerini derinden etkiler ve 2D ‘de yetiştirilen hücrelerle karşılaştırıldığında, 3D kürelerinin fenotipini çok daha yakından taklit ettiği açıktır. In vivo tümörleri7,8,9,10,11. 2D modelleri, hipotoksi, Asidik pH ve yüksek laktat konsantrasyonları tümör mikroortamın bilinen yönlerini taklit etmek bile, hala tümör içinde doğan fizico-Kimyasal parametrelerin degradeleri yakalamak için başarısız, yanı sıra onların 3D tümör Mimari. Öte yandan, hayvan modelleri, pahalı, yavaş ve etik problemli, ve genellikle, aynı zamanda insan tümörü koşullarını tekrar etme yeteneğinde eksiklikleri vardır. Sonuç olarak, 3D Kürtler en katı kanserlerin çoğu özellikleri geniş bir yelpazede çalışmalarda bir ara karmaşıklık modeli olarak uygulanmıştır9,11,12,13, 14,15,16,17.
3B kürlerin yaygın olarak istihdam edilmesi, antikanser terapisi etkinliğini9,18,19,20‘ ye göre taramasında yer almaktadır. Tedavi tepkiler özellikle tümör mikroortama duyarlıdır, hem tortuların etkisini yansıtan, kısıtlı difüzyon, yüksek interstisyel basınç, ve ilaç teslim asidik çevresel pH, ve hipoksi ve diğer etkisi hücre ölüm tepkisi üzerinde mikroçevre yönleri9,17. 3D küre içerisindeki çevre, tüm bu özellikleri7,8,9,10,11olarak geliştirdiğinden, 3D hücre kültürlerini istihdam edebilir sonuçların in vivo koşullarına çevirisini önemli ölçüde iyileştirebilir, ancak net büyümenin verimli ve uygun maliyetli yüksek verim taramasına izin verir. Ancak, kanser hücrelerinin ilaç tepkisi üzerinde çalışmaların büyük çoğunluğu hala 2D koşullar altında gerçekleştirilir. Bu büyük olasılıkla, bazı deneyleri nispeten kolayca 3D hücre kültürler için uygulanabilir iken, birçok, gibi canlılığı gibi, Batı blotting, ve immünofluorescence analizi, çok daha uygun 2D 3D daha yapılır.
Mevcut çalışmanın amacı, Anti-kanser ilaçları ile tedavinin etkisinin analiz edilmesi için, 3 boyutlu bir tümördeki ayarı taklit eden kanser hücresi kalabilirlik ve hayatta kalma konusunda kolayca sağlamlık ve hassas protokoller sağlamaktır. Özellikle, biz sağlamak ve küresel oluşumu için üç farklı yöntemler karşılaştırmak, büyüme, canlılığı ve ilaç tepkisi nitel ve niceliksel analizler için yöntemler izledi.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D kanser hücresi kürüler kullanımı sadece antikanser ilaç taraması için değerli ve çok yönlü bir araç kanıtlanmıştır, aynı zamanda tümör bu taklit koşullar altında kanser hücresi ölüm ve canlılığı düzenlenmesi içine mekanik fikir kazanmak için Mikro. Bu özellikle erişilebilirlik, hücresel alımı ve kemoterapötik ilaçların hücre içi etkileri gibi tümör, pH, oksijen gerilimi, tortuluk ve fiziksel ve fiziko-kimyasal koşullar tarafından derinden etkilenir çok önemlidir kimyasal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Katrine Franklin Mark ve Annette Bartels için mükemmel teknik yardım ve Asbjørn Nøhr-Nielsen şekil 1D deneyler gerçekleştirmek için minnettarız. Bu çalışma Einar Willumsen Vakfı, Novo Nordisk Vakfı ve Fondation Juchum (tüm SFP için) tarafından finanse edildi.
Materials
| 2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | For staining nuclei |
| 5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Component in chemotherapeutic treatment |
| 5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inhibitor of NHE1 |
| Antibody against PARP and cPARP | Cell signaling | #9542 | Used in western blotting |
| Antibody against Ki-67 | Cell signaling | #9449 | Used for IHC |
| Antibody against p53 | Cell Signaling | #2524 | Used for IHC |
| Antibody against β-actin | Sigma | A5441 | Used in western blotting |
| Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Used for agarose gel preparation |
| Benchmark protein ladder | Invitrogen | #10747-012 | Used for SDS-PAGE |
| Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Used for protein determination from lysates |
| Bürker chamber | Marienfeld | 610311 | For cell counting |
| BX63 epifluoresence microscope | Olympus | Used for fluorescent imaging | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Used for the cell viability assay |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | #P4394 | Component in chemotherapeutic treatment |
| Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom, Ultra-low attachment, With lid, Sterile | Corning | #4520 | Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point |
| Corning 96 well, clear round bottom, Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile | Corning | #7007 | Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point |
| Criterion TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Used for SDS-PAGE |
| Doxorubicin | Abcam | #120629 | Component in chemotherapeutic treatment |
| FLUOStar Optima Microplate reader | BMG Labtech | Used for recording luminescence | |
| Formaldehyde | VWR Chemicals | #9713.1000 | Used for cell fixation |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | #A1413202 | Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol. |
| Heat-inactivated FBS | Sigma | #F9665 | Serum for growth media |
| ImageJ | NIH | Scientific Image analysis | |
| Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Used for storage of embedded spheroids |
| Mini protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Used for lysis buffer preparation |
| MZ16 microscope | Leica | Used for light microscopic images | |
| NuPAGE LDS 4x Sample Buffer | Invitrogen | #NP0007 | Used for western blotting |
| Pierce ECL Western blotting substrate | Thermo scientific | #32106 | Used for western blotting |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Used for protein band staining |
| Prism 6.0 | Graphpad | Scientific graphing and statistical software | |
| Propidium iodide (1mg/ml solution in water) | Invitrogen | P3566 | Light sensitive |
| Sterile reservoirs, multichannel | SPL lifesciences | 21002 | Used for seeding cells for spheroid formation |
| Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | Microscope glass slide used for embedding |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Used as chemotherapeutic treatment |
| Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #170-4159 | Used for western blotting |
| Tris/Glycine/SDS running buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Used for SDS-PAGE |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | #T4174 | Cell dissociation enzyme |
References
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Influence of glucose and oxygen supply conditions on the oxygenation of multicellular spheroids. British Journal of Cancer. 53 (3), 345-353 (1986).
- Gaedtke, L., Thoenes, L., Culmsee, C., Mayer, B., Wagner, E. Proteomic analysis reveals differences in protein expression in spheroid versus monolayer cultures of low-passage colon carcinoma cells. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4111-4118 (2007).
- Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS Genetics. 4 (12), 1000293 (2008).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30 (3), 247-255 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews in Molecular and Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Jacobi, N., et al. Organotypic three-dimensional cancer cell cultures mirror drug responses in vivo: lessons learned from the inhibition of EGFR signaling. Oncotarget. 8 (64), 107423-107440 (2017).
- Rodriguez-Enriquez, S., et al. Energy metabolism transition in multi-cellular human tumor spheroids. Journal of Cell Physiology. 216 (1), 189-197 (2008).
- Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor. Cell Biology International. 23 (3), 157-161 (1999).
- Andersen, A. P., et al. Roles of acid-extruding ion transporters in regulation of breast cancer cell growth in a 3-dimensional microenvironment. Molecular Cancer. 15 (1), 45 (2016).
- Swietach, P., Patiar, S., Supuran, C. T., Harris, A. L., Vaughan-Jones, R. D. The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular ph in three-dimensional tumor cell growths. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20299-20310 (2009).
- Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected fibroblasts. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (4), 509-522 (2000).
- Kunz-Schughart, L. A., Groebe, K., Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell culture induces novel proliferative and metabolic alterations associated with oncogenic transformation. International Journal of Cancer. 66 (4), 578-586 (1996).
- Feng, H., et al. Homogeneous pancreatic cancer spheroids mimic growth pattern of circulating tumor cell clusters and macrometastases: displaying heterogeneity and crater-like structure on inner layer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 143 (9), 1771-1786 (2017).
- Santini, M. T., Rainaldi, G., Indovina, P. L. Apoptosis, cell adhesion and the extracellular matrix in the three-dimensional growth of multicellular tumor spheroids. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36 (2-3), 75-87 (2000).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. Journal of Visual Experiments. (66), e4218 (2012).
- Friedrich, J., et al. A reliable tool to determine cell viability in complex 3-d culture: the acid phosphatase assay. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 925-937 (2007).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. International Journal of Oncology. 31 (6), 1403-1413 (2007).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Andersen, A. P., et al. The net acid extruders NHE1, NBCn1 and MCT4 promote mammary tumor growth through distinct but overlapping mechanisms. International Journal of Cancer. , (2018).
- Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in Radiation Oncology. 14 (3), 198-206 (2004).
- Vaupel, P. W., Frinak, S., Bicher, H. I. Heterogeneous oxygen partial pressure and pH distribution in C3H mouse mammary adenocarcinoma. Cancer Research. 41 (5), 2008-2013 (1981).
- Helmlinger, G., Yuan, F., Dellian, M., Jain, R. K. Interstitial pH and pO2 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nature Medicine. 3 (2), 177-182 (1997).
- Zhang, X., Lin, Y., Gillies, R. J. Tumor pH and its measurement. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1167-1170 (2010).
- Gillies, R. J., Raghunand, N., Karczmar, G. S., Bhujwalla, Z. M. MRI of the tumor microenvironment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 16 (4), 430-450 (2002).
- Vukovic, V., Tannock, I. F. Influence of low pH on cytotoxicity of paclitaxel, mitoxantrone and topotecan. British Journal of Cancer. 75 (8), 1167-1172 (1997).
- Song, C. W., Griffin, R., Park, H. J., Teicher, B. A. . Cancer Drug Resistance. , 21-42 (2006).
- Lotz, C., et al. Role of the tumor microenvironment in the activity and expression of the p-glycoprotein in human colon carcinoma cells. Oncology Reports. 17 (1), 239-244 (2007).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular Oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
- Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model. PLoS One. 12 (7), 0182039 (2017).
- Bochet, L., et al. Adipocyte-derived fibroblasts promote tumor progression and contribute to the desmoplastic reaction in breast cancer. Cancer Research. 73 (18), 5657-5668 (2013).
- Amann, A., et al. Development of a 3D angiogenesis model to study tumour – endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs. Scientific Reports. 7 (1), 2963 (2017).
- LaBonia, G. J., Ludwig, K. R., Mousseau, C. B., Hummon, A. B. iTRAQ Quantitative Proteomic Profiling and MALDI-MSI of Colon Cancer Spheroids Treated with Combination Chemotherapies in a 3D Printed Fluidic Device. Analytical Chemistry. 90 (2), 1423-1430 (2018).
- Hulikova, A., Vaughan-Jones, R. D., Swietach, P. Dual role of CO2/HCO3(-) formula buffer in the regulation of intracellular pH of three-dimensional tumor growths. Journal of Biological Chemistry. 286 (16), 13815-13826 (2011).
- Wallace, D. I., Guo, X. Properties of tumor spheroid growth exhibited by simple mathematical models. Frontiers in Oncology. 3, 51 (2013).
- Michel, T., et al. Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids. Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).
- Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).
