그릴루스 바이마쿨라투스 계란 주입
Summary
여기에서 우리는 크리켓 계란을 주입하는 프로토콜을 제시, 크리켓의 많은 실험에서 기초 방법 역할을하는 기술, 포함하되 이에 국한되지 않음, RNA 간섭 및 게놈 조작.
Abstract
개발 유기체에서 유전자 기능을 변경하는 것은 다양한 종류의 실험의 중심입니다. 엄청나게 강력한 유전 공구가 전통적인 모형 시스템에서 개발되는 동안, 대부분의 그밖 유기체에 있는 유전자 또는 메신저 RNA (mRNA)를 조작하는 것은 어렵습니다. 동시에, 진화및 비교 접근법은 많은 다른 종에 있는 유전자 기능의 탐사에 의존합니다, 현재 유전으로 견인할 수 있는 외부 표현을 조작하기 위한 기술의 발달 그리고 적응을 필요로 합니다 종. 이 프로토콜은 배아 또는 애벌레 발달에 주어진 조작의 효력을 분석하기 위하여 크리켓 계란으로 시약을 주입하는 방법을 기술합니다. 벨바늘로 계란을 수집하고 주입하는 방법에 대한 지침이 설명되어 있습니다. 이 비교적 간단한 기술은 유연하고 잠재적으로 다른 곤충에 적응할 수 있습니다. 하나는 수집하고 하나의 실험에 계란 수십 주입 할 수 있습니다, 버퍼 전용 주사에 대한 생존율은 연습으로 개선하고 80 %로 높을 수 있습니다. 이 기술은 약리학 에이전트의 주입을 포함하여 실험적인 접근의 몇몇 모형을 지원할 것입니다, 관심있는 유전자를 표현하기 위하여 시험관 외에서 덮인 mRNA, RNA 간섭을 달성하기 위하여 이중 좌초된 RNA (dsRNA), 군집된 정규의 사용 CRISPR 관련 단백질 9(Cas9) 시약과 함께 협착한 짧은 팔린드로믹 반복(CRISPR) 및 과도 또는 안정적인 형질전환 라인을 생성하기 위한 트랜스포저 블론트.
Introduction
유기체에서 게놈을 수정하거나 유전자 발현에 영향을 미치는 능력은 기능적 인과관계를 테스트하는 많은 유형의 실험설계의 기초가 된다. 또한 전통적인 유전 실험실 동물 모델 시스템(예: Mus musculus,Danio) 외부의 유기체에서 게놈 및 비게놈 변형 기술을 사용할 수 있는 비교 및 진화학적 관련 작업에도 중요합니다. rerio, 드로필라 멜라노가스터,그리고 케노하브디티스 예쁜꼬마선충). 생물다양성1을 이해하려는 욕구이든, 크로의 원리를 고수하는 것이든, 모든 생물학적 질문에 대해 그 해결책2,3,게놈을 수정할 수 있는 능력에 가장 적합한 유기체가 있다는 것입니다. 현대 실험 설계에 필수적인 유전자 발현에 영향을 미칩니다.
크리켓 그릴루스 바이마쿨라투스는 신흥 모델 시스템입니다. 신경과 실험 4에서 지난 세기동안 사용, 지난 2 년 은 특히이 유기체의 진화와 개발에 초점을 맞춘 크리켓에 대한 증가 된 실험적 관심을 목격했다5. 크리켓은 D. 멜라노가스터와 트리볼륨 카스타뇌6과같은 잘 연구된 홀로메타볼루스 곤충에 기초로 분기하는 헤미메타볼루블 곤충이다. 진화 나무에 그것의 유용한 위치 때문에, 과학자들은 이 곤충에 있는 현대, 정교한 실험적인 질문을 하는 것에 흥미, G. bimaculatus에있는 사용을 위한 분자 공구 적응에 있는 증가로 이끌어 냈습니다.
크리켓 계란에 분자 시약의 주사는 배아에서 유전자 발현의 비 게놈 조작뿐만 아니라 게놈 수정 실험에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, eGFP 삽입을 운반하는 형질전환 G. 바이마쿨라투스는 트랜스포사제 피기박7,8을사용하여 생성되었다. 연구자들은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFNs) 및 전사 활성제(TAL) 이펙터 뉴클레아제(TALENs)를 사용하여 특정 게놈 영역에서 이중 가닥 의 분리를 도입하는 녹아웃 G. 바이마쿨라투스를 성공적으로 생성하였다9. ZFN과 TALENs는 4대 모델 시스템을 넘어서는 동물에 대한 사이트별 타겟팅을 허용하지만, 이러한 시약은 사용하기 쉽고 효율적이며 매우 유연한CRISPR/Cas9 시스템을 통해 빠르게 능가되었습니다 10. CRISPR은 G. bimaculatus에서 녹아웃11뿐만 아니라 노크 인 라인12,13 게놈 수정 이외에, dsRNA는 개발에 mRNA 발현을 노크하기 위해 계란에 주입 될 수있다 배아, 조사자가 개발 전반에 걸쳐 특정 성적 증명서의 역할을 이해할 수 있도록14,15. 크리켓 계란을 주입하는 방법에 대한 몇 가지 제한된 세부 사항은 이전에 게시 되었습니다12.
여기에서, 우리는 초기 G. bimaculatus 계란을 주입하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 효과적이고 다양한 실험실 설정, 사출 재료 및 기타 곤충에 쉽게 적응할 수 있습니다. 게놈 수정 및 녹다운 실험을 설계하고 구현하기 위한 추가 세부 사항이12,13다른 곳에 게시되었지만, 이러한 접근법은 궁극적으로 여기에 상세한 주입 프로토콜에 의존할 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기술의 두 가지 주요 과제는 최적의 바늘 크기와 생존력의 관련 문제입니다. 작은 바늘은 생존을 향상하지만, 좁은 루멘을 가진 바늘은 직장에서 모세 혈관의 더 큰 정도를 가지고, 이는 노른자가 막힘을 일으키는 바늘로 이동 할 가능성이 더 높습니다. 가장 좋은 경우에, 막힘은 단순히 다른 계란을 주입하거나 위에서 설명한 대로 바늘을 치워서 지울 수 있습니다. 노른자가 바늘에서 밀려나올…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트에 보고 된 연구는 기관 개발 상에 의해 지원되었다 (IDeA) 보조금 번호 P20GM10342에 따라 국립 보건원의 국립 연구소에서 HH3에, NSF 수상 번호 IOS-1257217에 CGE.
Materials
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence | |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | ||
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- | |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) | |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | ||
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | ||
| Tubing to connect air source to microinjector | ||||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic | |
| Microwave | various | |||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26°C are needed. | ||
| cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | ||
| cricket wter | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | ||
| cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | ||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament | |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. | |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head | |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90mm diameter | |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand | |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure | |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 – 1.0 mm | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep | |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118mm | |
| syringe filters, 25mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 ml syringe | |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work | |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank | |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, | |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20uL Microloader | |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | ||
| 20X objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | ||
| camera | Leica | DMC 5400 | ||
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here | |
References
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