Sprøytebruk Gryllus bimaculatus egg
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å injisere cricket egg, en teknikk som fungerer som en grunnleggende metode i mange eksperimenter i cricket, inkludert, men ikke begrenset til, RNA forstyrrelser og genomisk manipulasjon.
Abstract
Endring av gen funksjon i en utvikler organisme er sentral for ulike typer eksperimenter. Mens enormt kraftige genetiske verktøy har blitt utviklet i tradisjonelle modellsystemer, er det vanskelig å manipulere gener eller Messenger RNA (mRNA) i de fleste andre organismer. Samtidig, evolusjonære og komparative tilnærminger stole på en utforskning av gen funksjon i mange forskjellige arter, nødvendiggjør utvikling og tilpasning av teknikker for å manipulere uttrykk utenfor for tiden genetisk medgjørlig Arter. Denne protokollen beskriver en metode for å injisere reagenser i cricket egg til analysen virkningene av en gitt manipulasjon på embryonale eller larvestadiet utvikling. Instruksjoner for hvordan du samler inn og injiserer egg med skrå nåler er beskrevet. Denne relativt enkle teknikken er fleksibel og potensielt kan tilpasses andre insekter. Man kan samle og injisere dusinvis av egg i et enkelt eksperiment, og overlevelses rater for buffer bare injeksjoner bedre med praksis og kan være så høyt som 80%. Denne teknikken vil støtte flere typer eksperimentelle tilnærminger inkludert injeksjon av farmakologiske midler, in vitro avkortet mRNA å uttrykke gener av interesse, dobbel-strandet RNA (dsRNA) for å oppnå RNA interferens, bruk av gruppert regelmessig oppdelt korte palindromic repetisjoner (CRISPR) i samspill med CRISPR-assosiert protein 9 (Cas9) reagenser for genomisk modifikasjon, og transposable elementer for å generere forbigående eller stabile transgene Lines.
Introduction
Evnen å endre det Genova eller innvirkningen gen gjengivelsen inne organisere er grunnlaget for planen av mange typer av eksperimenter tester funksjonell årsakssammenheng. Det er også kritisk for det komparative og evolutionarily arbeidet som genomisk og ikke-genomisk modifikasjons teknikker er tilgjengelig i organismer utenfor tradisjonelle genetiske laboratoriedyr modellsystemer (f. eks mus laboratoriemusmusculus, Danio rerio, Drosophila melanogaster, og Caenorhabditis elegans). Enten det er et ønske om å forstå organismal mangfold1 eller ens overholdelse av Krogh ‘ s prinsipp, at for alle biologiske spørsmål er det en organisme som er best egnet til løsningen2,3, evnen til å modifisere genomer eller påvirke genuttrykket er essensielt for moderne eksperimentell design.
The cricket Gryllus bimaculatus er en ny modell system. Brukt for forrige århundre i neuroethology eksperimenter4, de siste to ti årene har vært vitne til en økt eksperimentell interesse i cricket, spesielt fokusert på utviklingen og utviklingen av denne organismen5. The cricket er et hemimetabolous insekt som grener basally til godt studert holometabolous insekter, slik som D. melanogaster og Tribolium castaneum6. På grunn av sin nyttige posisjon på den evolusjonære treet, forskere er interessert i å spørre moderne, sofistikerte eksperimentelle spørsmål i dette insekt, som har ført til en økende interesse for å tilpasse molekylære verktøy for bruk i G. bimaculatus.
Injeksjoner av molekylære reagenser i cricket egg kan brukes til genomisk modifikasjon eksperimenter så vel som ikke-genomisk manipulasjoner av genuttrykk i embryo. For eksempel er transgene G. bimaculatus bærer eGFP innsettinger opprettet ved hjelp av transposase piggyBac7,8. Etterforskerne har opprettet knockout G. bimaculatus bruke sink-finger Nukleaser (zfner) og transkripsjon aktivator-lignende (TAL) effektor Nukleaser (TALENs) å innføre dobbel-strandet pauser i bestemte genomisk regioner9. Selv om Zfner og TALENs tillater områdespesifikk målretting i dyr utover de fire store modell systemene, har disse reagensene raskt blitt overgått av CRISPR/Cas9-systemet, noe som er enklere å bruke, mer effektivt og svært fleksibelt10. CRISPR har vært brukt i G. bimaculatus å produsere Knock-Out11 samt knock-in linjer12,13 i tillegg til genomisk modifikasjon, dsRNA kan injiseres i egg for å slå ned mRNA uttrykk i utviklingsland embryo, slik at etterforskerne å forstå rollen til bestemte transkripsjoner gjennom utvikling14,15. Noen begrensede detaljer om hvordan å injisere cricket egg har blitt publisert tidligere12.
Her beskriver vi en detaljert protokoll for injisering av tidlige G. bimaculatus egg. Denne protokollen er effektiv og lett tilpasses ulike laboratorie innstillinger, injeksjon materialer, og muligens til andre insekter. Mens ytterligere detaljer for å designe og implementere genomisk modifikasjon og knockdown eksperimenter har blitt publisert andre steder12,13, vil disse tilnærmingene til slutt stole på injeksjon protokollen detaljert her.
Protocol
Representative Results
Discussion
De to viktigste utfordringene med denne teknikken er de relaterte problemstillingene av optimal nål størrelse og overlevelsesevne. Selv om mindre nåler bedre overlevelsesevne, nåler med smalere lumen har en større grad av kapillær krefter på jobben, noe som gjør det mer sannsynlig at eggeplomme vil flytte inn i nålen forårsaker den til å tette. I beste fall kan blokkeringer tømmes ved å injisere et annet egg eller ved å fjerne nålen som beskrevet ovenfor. Man kan også forsøke å øke balanse trykket på …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning rapportert i dette prosjektet ble støttet av en institusjonell utvikling Award (IDeA) fra National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health under Grant nummer P20GM10342 til HH3, og av NSF Award nummer IOS-1257217 til CGE.
Materials
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence | |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | ||
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- | |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) | |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | ||
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | ||
| Tubing to connect air source to microinjector | ||||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic | |
| Microwave | various | |||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26°C are needed. | ||
| cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | ||
| cricket wter | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | ||
| cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | ||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament | |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. | |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head | |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90mm diameter | |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand | |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure | |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 – 1.0 mm | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep | |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118mm | |
| syringe filters, 25mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 ml syringe | |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work | |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank | |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, | |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20uL Microloader | |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | ||
| 20X objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | ||
| camera | Leica | DMC 5400 | ||
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here | |
References
- Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).
- Krebs, H. A. The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
- Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. . Cricket neurobiology and behavior. , (1989).
- Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. . The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , (2017).
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).
- Shinmyo, Y., et al. piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus. Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).
- Watanabe, T., et al. Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases. Nature communications. 3, 1017 (2012).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
- Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets. Scientific Reports. 5, 15885 (2015).
- Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. Protocols in the Cricket. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).
- Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus. Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).
- Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus. Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).
- Miyawaki, K., et al. Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis. Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).
- Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect. Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).
- Larson, E., Andres, J., Harrison, R. Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets. PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).
- Donoughe, S., Extavour, C. G. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. Developmental Biology. , (2016).
- Matsuoka, Y., et al. Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes. Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).
- Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects. Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).
- Bacon, J., Strausfeld, N. Nonrandom resolution of neuron arrangements. Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).
