Injicera gryllus bimaculatus ägg
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att injicera cricket ägg, en teknik som fungerar som en grundläggande metod i många experiment i cricket, inklusive, men inte begränsat till, RNA-interferens och genomisk manipulation.
Abstract
Att förändra gen funktionen i en utvecklande organism är central för olika typer av experiment. Medan oerhört kraftfulla genetiska verktyg har utvecklats i traditionella modellsystem, är det svårt att manipulera gener eller Messenger-RNA (mRNA) i de flesta andra organismer. Samtidigt förlitar sig evolutionära och komparativa metoder på en utforskning av genfunktion hos många olika arter, vilket nödvändiggör utveckling och anpassning av tekniker för att manipulera uttryck utanför för närvarande genetiskt tractable Arter. Detta protokoll beskriver en metod för att injicera reagenser i cricket ägg att analysen effekterna av en viss manipulation på embryonal eller larv utveckling. Anvisningar för hur man samlar in och injicerar ägg med avfasade nålar beskrivs. Denna relativt enkla teknik är flexibel och potentiellt anpassningsbar till andra insekter. Man kan samla och injicera dussintals ägg i ett enda experiment, och överlevnaden för buffert-bara injektioner förbättra med praktik och kan vara så hög som 80%. Denna teknik kommer att stödja flera typer av experimentella metoder, inklusive injektion av farmakologiska medel, in vitro-utjämnade mRNA att uttrycka gener av intresse, dubbelsträngad RNA (dsRNA) för att uppnå RNA-interferens, användning av klustrade regelbundet korta palindromiska repetitioner (CRISPR) i samförstånd med CRISPR-associerat protein 9 (Cas9) reagenser för genomisk modifiering, och överföras element för att generera övergående eller stabila transgena linjer.
Introduction
Förmågan att modifiera arvsmassan eller påverka genuttrycket i organismer är grunden för utformningen av många typer av experiment som testar funktionell kausalitet. Det är också kritiskt för det komparativa och evolutionärt relevanta arbetet att teknikerna för genomisk och icke-genomisk modifiering finns tillgängliga i organismer utanför traditionella genetiska laboratorie modeller (t. ex. mus Musculus, Danio rerio, Drosophila melanogasteroch Caenorhabditis elegans). Oavsett om det är viljan att förstå organismers mångfald1 eller en anslutning till Krogh princip, att för varje biologisk fråga finns en organism som är bäst lämpad för sin lösning2,3, förmågan att ändra genom eller inflytande genuttrycket är viktigt för modern experimentell design.
Cricket gryllus bimaculatus är ett framväxande modellsystem. Används för det senaste århundradet i neuroethology experiment4, de senaste två decennierna har bevittnat ett ökat experimentellt intresse för cricket, särskilt inriktad på utvecklingen och utvecklingen av denna organism5. Cricket är en hemimetabolous insekt som grenar basalt till väl studerade holometabolous insekter, såsom D. melanogaster och Tribolium Auktor6. På grund av sin användbara position på den evolutionära träd, forskare är intresserade av att ställa moderna, sofistikerade experimentella frågor i denna insekt, vilket har lett till ett växande intresse för att anpassa molekylära verktyg för användning i G. bimaculatus.
Injektioner av molekylära reagenser till Cricket ägg kan användas för genomisk modifiering experiment samt icke-genomisk manipulationer av genuttryck i embryon. Till exempel transgena G. bimaculatus redovisade egfp-infogningar har skapats med hjälp av transposase piggybac7,8. Utredare har framgångsrikt skapat knockout G. bimaculatus med zink-Fingernukleaser (ZFNs) och transkription Activator-liknande (tal) Effektornukleaser (talens) för att införa dubbelsträngade raster i specifika genomiska regioner9. Även om ZFNs och TALENs tillåter platsspecifik inriktning hos djur bortom de fyra stora modell systemen, har dessa reagenser snabbt överträffats av CRISPR/Cas9-systemet, vilket är enklare att använda, effektivare och mycket flexibelt10. CRISPR har använts i G. bimaculatus för att producera Knock-Out11 samt Knock-in-linjer12,13 utöver genomisk modifiering kan dsRNA injiceras i ägg för att slå ner mRNA-uttrycket i utvecklingen embryon, vilket gör det möjligt för utredarna att förstå de specifika Avskriftens roll under hela utvecklingen14,15. Några begränsade Detaljer om hur man injicerar cricket ägg har publicerats tidigare12.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att injicera tidiga G. bimaculatus -ägg. Detta protokoll är effektivt och lätt att anpassa till olika laboratorie inställningar, injektions material, och möjligen till andra insekter. Även om ytterligare Detaljer för utformning och genomförande av genomiska modifikationer och knockdown experiment har publicerats på andra ställen12,13, kommer dessa metoder i slutändan att förlita sig på det insprutnings protokoll som beskrivs här.
Protocol
Representative Results
Discussion
De två största utmaningarna med denna teknik är de relaterade frågorna om optimal nål storlek och överlevnadsförmåga. Även mindre nålar förbättra överlevnadsförmåga, nålar med smalare lumen har en högre grad av kapillärkrafter på jobbet, vilket gör det mer sannolikt att äggula kommer att flytta in i nålen orsakar det att täppa. I bästa fall, blockeringar kan rensas helt enkelt genom att injicera ett annat ägg eller genom att rensa nålen som beskrivs ovan. Man kan också försöka öka balansen t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning som rapporterats i detta projekt stöddes av en institutionell utveckling Award (IDeA) från National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health under Grant nummer P20GM10342 till HH3, och av NSF Award Number IOS-1257217 till CGE.
Materials
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence | |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | ||
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- | |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) | |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | ||
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | ||
| Tubing to connect air source to microinjector | ||||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic | |
| Microwave | various | |||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26°C are needed. | ||
| cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | ||
| cricket wter | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | ||
| cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | ||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament | |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. | |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head | |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90mm diameter | |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand | |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure | |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 – 1.0 mm | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep | |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118mm | |
| syringe filters, 25mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 ml syringe | |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work | |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank | |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, | |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20uL Microloader | |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | ||
| 20X objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | ||
| camera | Leica | DMC 5400 | ||
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here | |
References
- Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).
- Krebs, H. A. The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
- Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. . Cricket neurobiology and behavior. , (1989).
- Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. . The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , (2017).
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).
- Shinmyo, Y., et al. piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus. Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).
- Watanabe, T., et al. Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases. Nature communications. 3, 1017 (2012).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
- Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets. Scientific Reports. 5, 15885 (2015).
- Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. Protocols in the Cricket. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).
- Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus. Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).
- Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus. Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).
- Miyawaki, K., et al. Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis. Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).
- Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect. Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).
- Larson, E., Andres, J., Harrison, R. Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets. PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).
- Donoughe, S., Extavour, C. G. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. Developmental Biology. , (2016).
- Matsuoka, Y., et al. Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes. Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).
- Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects. Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).
- Bacon, J., Strausfeld, N. Nonrandom resolution of neuron arrangements. Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).
