Enjekte Gryllus bimaculatus Yumurta
Summary
Burada kriket yumurtaları enjekte etmek için bir protokol salıyoruz, kriketteki birçok deneyde temel bir yöntem olarak hizmet veren bir teknik, RNA paraziti ve genomik manipülasyon dahil, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere.
Abstract
Gelişmekte olan bir organizmada gen işlevini değiştirmek farklı deney türlerinin merkezinde yer alıyor. Geleneksel model sistemlerinde son derece güçlü genetik araçlar geliştirilmiş olmakla birlikte, diğer organizmalarda genleri veya haberci RNA’yı (mRNA) işlemek zordur. Aynı zamanda, evrimsel ve karşılaştırmalı yaklaşımlar birçok farklı türde gen fonksiyonunun araştırılmasına dayanıyor, bu da şu anda genetik olarak kontrol edilebilir olan dış ifadeyi manipüle etme tekniklerinin geliştirilmesini ve uyarlanmasına ihtiyaç diliyor. Tür. Bu protokol, belirli bir manipülasyonun embriyonik veya larva gelişimi üzerindeki etkilerini tetkiklemek için kriket yumurtalarına reaktif enjekte etme yöntemini tanımlar. Yontucu iğnelerle yumurtaların nasıl toplanıp enjekte edilene ilgili talimatlar açıklanmıştır. Bu nispeten basit teknik esnek tir ve diğer böceklere karşı potansiyel olarak uyarlanabilir. Tek bir deneyde düzinelerce yumurta toplayıp enjekte edilebilen bir kişi, tampon aparatların sağkalım oranları pratikte iyileşir ve %80’e kadar çıkabilir. Bu teknik, farmakolojik ajanların enjeksiyonu, ilgi genlerini ifade etmek için in vitro kapaklı mRNA, RNA girişimini sağlamak için çift iplikli RNA (dsRNA), kümelenmiş düzenli olarak kullanımı gibi çeşitli deneysel yaklaşımları destekleyecektir. genomik modifikasyon için CRISPR ilişkili protein 9 (Cas9) reaktifleri ve geçici veya kararlı transgenik çizgiler oluşturmak için geçirilebilir elementler ile birlikte uzaya kısa palindromik tekrarlar (CRISPR).
Introduction
Organizmalarda genomu değiştirebilme veya gen ekspresyonunu etkileme yeteneği, fonksiyonel nedenselliği test eden birçok deney türünün tasarımının temelini oluşturur. Genomik ve genomik olmayan modifikasyon tekniklerinin geleneksel genetik laboratuvar hayvan model sistemleri dışındaki organizmalarda bulunması karşılaştırmalı ve evrimsel olarak ilgili çalışmalar için de önemlidir (örneğin, Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogaster, ve Caenorhabditis elegans). İster organizma çeşitliliğini anlamak için arzu1 veya Krogh ilkesine bir bağlılık, her biyolojik soru için en iyi çözüm 2 uygun bir organizma olduğunu,3, genomları değiştirmek için yeteneği ya da gen ekspresyonunun modern deneysel tasarımlar için gerekli olduğu etkidir.
Kriket Gryllus bimaculatus gelişmekte olan bir model sistemidir. Nöroethology deneylerde son yüzyılda kullanılan4, son yirmi yılda kriket artan bir deneysel ilgi tanık, özellikle bu organizmanın evrimi ve gelişimi üzerinde duruldu5. Kriket d. melanogaster ve Tribolyum castaneum6gibi iyi çalışılmış holometabolöz böcekler, bazal dalları hemimetabolous böcek. Evrim ağacı üzerindeki yararlı konumu nedeniyle, bilim adamları g. bimaculatuskullanımı için moleküler araçlar adapte artan bir ilgi yol açmıştır bu böcek, modern, sofistike deneysel sorular soran ilgileniyoruz.
Kriket yumurtalarına moleküler reaktif enjeksiyonları genomik modifikasyon deneyleri ve embriyolarda gen ekspresyonunun genomik olmayan manipülasyonları için kullanılabilir. Örneğin, transgenik G. eGFP eklemeleri taşıyan bimaculatus transposaz piggyBac7,8kullanılarak oluşturulmuştur. Araştırmacılar başarıyla çinko-parmak nükleazlar kullanarak nakavt G. bimaculatus yarattık (ZFNs) ve transkripsiyon aktivatör benzeri (TAL) efektör nükleazlar (TALENs) belirli genomik bölgelerde çift iplikli tatili tanıtmak için9. ZFN’ler ve TALEN’ler büyük dört model sistemlerinin ötesindeki hayvanlarda siteye özgü hedeflemeye izin vermesine rağmen, bu reaktifler kullanımı daha kolay, daha verimli ve son derece esnek10olan CRISPR/Cas9 sistemi tarafından hızlı bir şekilde aşılmıştır. CRISPR, G. bimaculatus’ta nakavt11 ve knock-in hatları üretmek için kullanılmıştır12,13 Genomik modifikasyona ek olarak, dsRNA gelişmekte olan mRNA ekspresyonunu yıkmak için yumurtalara enjekte edilebilir embriyolar, araştırmacılar geliştirme 14 ,15boyuncabelirli transkript rolünü anlamak için izin . Kriket yumurtaları enjekte etmek için bazı sınırlı ayrıntılar daha önce12yayınlanmıştır .
Burada, erken G. bimaculatus yumurta enjekte etmek için ayrıntılı bir protokol açıklar. Bu protokol çeşitli laboratuvar ayarlarına, enjeksiyon malzemelerine ve muhtemelen diğer böceklere etkili ve kolayca uyarlanabilir. Genomik modifikasyon ve nakavt deneylerinin tasarlanması ve uygulanması için ek ayrıntılar başka bir yerde yayınlanmış olsa da12,13, Bu yaklaşımlar sonuçta burada ayrıntılı enjeksiyon protokolü ne bağlı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu teknikile iki ana zorluklar optimal iğne boyutu ve hayatta kalma ile ilgili konulardır. Küçük iğneler hayatta kalma yeteneğini artırmak rağmen, dar lümenile iğneler iş yerinde kılcal kuvvetler daha büyük bir dereceye sahip, hangi sarısı iğne içine hareket edecek daha olası dır tıkanmasına neden. En iyi durumda, tıkanıklıklar sadece başka bir yumurta enjekte ederek veya yukarıda açıklandığı gibi iğne temizleyerek temizlenebilir. Bir de yumurta sarısı iğne dışarı itilir kadar mikr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu projede bildirilen araştırmalar, P20GM10342 ile HH3 arasında yer alan Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü’nden Kurumsal Gelişim Ödülü (IDeA) ve NSF ödül numarası IOS-1257217 tarafından desteklenmiştir. Cge.
Materials
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence | |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | ||
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- | |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) | |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | ||
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | ||
| Tubing to connect air source to microinjector | ||||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic | |
| Microwave | various | |||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26°C are needed. | ||
| cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | ||
| cricket wter | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | ||
| cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | ||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament | |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. | |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head | |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90mm diameter | |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand | |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure | |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 – 1.0 mm | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep | |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118mm | |
| syringe filters, 25mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 ml syringe | |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work | |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank | |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, | |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20uL Microloader | |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | ||
| 20X objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | ||
| camera | Leica | DMC 5400 | ||
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here | |
References
- Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).
- Krebs, H. A. The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
- Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. . Cricket neurobiology and behavior. , (1989).
- Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. . The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , (2017).
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).
- Shinmyo, Y., et al. piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus. Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).
- Watanabe, T., et al. Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases. Nature communications. 3, 1017 (2012).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
- Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets. Scientific Reports. 5, 15885 (2015).
- Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. Protocols in the Cricket. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).
- Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus. Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).
- Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus. Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).
- Miyawaki, K., et al. Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis. Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).
- Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect. Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).
- Larson, E., Andres, J., Harrison, R. Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets. PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).
- Donoughe, S., Extavour, C. G. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. Developmental Biology. , (2016).
- Matsuoka, Y., et al. Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes. Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).
- Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects. Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).
- Bacon, J., Strausfeld, N. Nonrandom resolution of neuron arrangements. Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).
