本文的目的是概述从单聚α-合核蛋白中产生纤维所需的步骤、随后的质量控制以及在体内使用预成型纤维。
在研究人员中, 使用α-核蛋白预形成纤维 (α-sysyn PFF) 模型的研究人员越来越受到欢迎, 该模型旨在为帕金森病的核细胞病和黑纹状体变性建模。为了确保α-syn PFF 的病理一致、稳健, 将其标准化至关重要。在这里, 我们提出了一个详细的方案, 从单核菌α-syn, 纤维化后的质量控制步骤, 并建议参数, 为神经外科注射α-syn Pff 到大鼠或小鼠成功。从单体α-syn 开始, 在7天的潜伏期内进行灭菌, 同时在最佳缓冲条件、浓度和温度下晃动。通过沉淀法、硫代黄素 t 法在纤维中形成淀粉样蛋白构象以及纤维的电子显微镜可视化, 评估纤维后的质量控制。虽然使用这些检测的成功验证是成功所必需的, 但它们不足以保证 Pff 会在神经元中产生α-syn 内含物, 因为每个 PFF 批次的这种聚集活性应在细胞培养或试验动物队列中进行测试。在使用之前, Pff 必须在精确标准化的条件下进行声纳处理, 然后使用电子显微镜或动态光散射进行检查, 以确认纤维长度在最佳尺寸范围内, 平均长度为50纳米。然后, Pff 可以添加到细胞培养培养基中, 也可以在动物中使用。磷酸化α-syn (心理; 丝氨酸 129) 的免疫染色可检测病理, 在细胞培养和啮齿类动物模型中分别有明显的数天或数周。
帕金森病 (PD) 的主要特征是死后有两个主要病理特征: 广泛和渐进的α-核蛋白 (α-sysyn) 病理和黑纹体变性。在野生小鼠或大鼠体内注射α-syn 预知情纤维 (PFFs) 后, 会导致病理α-syn 的逐渐积累, 从而导致黑质 (SNpc) 多巴胺神经元在许多过程中的长期退化月, 以及感官运动赤字 1,2,3,4,5, 6。神经元暴露在α-syn 纤维中, 或者通过直接脑内注射或添加到培养的神经元的培养基中。当 pff 被带入神经元时, pff 通过模板化来 “种子” 内含物的形成, 并将内源性α-syn 积累成磷酸化的夹杂物1,7, 8, 9个。内含物与莱维体具有相似的性质: 含有α-syn 磷酸化在丝氨酸 129 (pSyn)、泛素和 62;具有淀粉样的第四纪结构, 如阳性硫代黄素染色所示;并对蛋白酶 k 消化1,3,5,7, 8,9, 10,11, 12岁Pff 接触导致原代神经元和培养中的一些不朽神经元以及体内的小鼠、大鼠和非人类灵长类动物形成α-syn 包涵形成1、2、3、4、 5,6,7,8,9, 13.需要注意的是, 在所有细胞培养模型中, Pff 不会导致α-syn 包涵形成, 一些培养的神经元种子会比其他神经元更好。
体内α-syn PFF 模型的另一个重要特征是几个月内出现的明显的顺序病理阶段。在啮齿类动物体内注射后, α-syn 包涵形成通常在 SNpc 和许多皮质区域内达到峰值, 在1-2个月内。这个聚集峰之后是小骨纹状体退化, 2-4 后 1,3,5。这些不同的病理阶段为研究人员提供了研究和制定策略的平台, 1) 减少α-syn 聚集, 2) 明确已经形成的α-syn 内含物, 和/或 3) 防止随后的神经退行性变。与神经毒理学、转基因和病毒载体介导的α-syn 过度表达模型相比, PFF 模型具有明显的优点和缺点.应确定采取哪种模式或方法最适合调查人员提出的问题。
虽然 PFF 模型已被许多实验室成功地利用, 但仍有一些群体经历了与产生纤维和产生一致的α-赛恩病理的不一致.不一致的例子包括产生很少或根本没有α-syn 病理的 Pff, 批量到批量播种效率, 甚至是纤维的失败形成。因此, 将α-syn PFF 生成和体内应用标准化至关重要, 以便对新型治疗干预措施的影响做出准确的解释。以下协议概述了从α-syn 单体中生成 Pff 所需的步骤、Pff 一旦形成后的体外质量控制、使用前 Pff 的超声和测量, 以及促进体内注射成功的建议。Pff 进入老鼠或老鼠体内。
Α-syn Pff 的生产能够播种神经元并导致莱维身体样的内含物取决于多种因素和步骤。一个关键因素是用于产生纤维的单体需要专门用于纤维化4、9、14、15。如果单体不是为纤维化而配制的, 纤维可能不会形成, 或者形成的纤维可能不会产生α-syn 病理。同样, 单体所处的缓冲液也会影响纤维化。因此, 为了获得最佳效果, 盐浓度应在约 100 mM 氯化钠, pH 值在7.0 至7.3 之间。引入可变性的第一步是确定初始蛋白质含量的方法, 在 A280 测量可能会产生更准确的结果, 因此是首选方法。蛋白质浓度的差异会降低纤维化过程的疗效, 也会改变实验中假定的 PFF 浓度。两者都可能导致播种效率的下降和实验之间的批次变化。
最初的质量控制步骤将确认 Pff 的关键特征, 特别是它们具有纤维状形成 (电子显微镜), 含有淀粉样蛋白结构 (硫代黄素 t 法), 并且是可造的 (沉淀法)。需要注意的是, 硫代黄素 t 检测的结果会随着时间的推移而波动, 并不是对存在的淀粉样蛋白结构量的直接衡量, 相反, 硫代黄素 T 检测只能作为淀粉样蛋白结构存在的指标。样品。硫黄素 T 通常用于体外检测, 如上述检测, 以显示纤维含有淀粉样结构。或者, 硫代黄素 S 用于组织中检测淀粉样蛋白结构, 如图 7所示。关于沉降分析, 结果显示, Pff 主要存在于可球化分数中。由于样品是在变性条件下运行的, 凝胶上存在一个大约 14 kDa 的突出带, 即α-syn 单体的大小。这与在使用原生凝胶或非变性凝胶时 Pff 具有较高分子量的多个波段不同。最后, 所有这些初始质量控制步骤的成功通过并不能保证α-syn 包涵播种活动。因此, 细胞培养实验或一小群注射手术的动物在使用大型实验之前, 应用于测试 Pff 的疗效。
超声速是工艺中的关键一步, 参数将因使用的声纳模型而异。必须应用和验证声参数, 以证明已生成了较短的 PFF 片段。纤维的大小对播种有影响, 较短的纤维播种效率更高。虽然较短的纤维种子更有效, 这种效果高原和最佳的 pff 长度约为50纳米4,18。同样重要的是, 不要对样品进行过长的处理, 并使 Pff 暴露在过热的环境中, 因为这可能会降低播种效率。在大规模实验中使用之前, 应测试这些超声 Pff 在小细胞培养或体内实验中的有效性。由于不同的超声检查有可能引入变异性, 因此应相应地规划实验治疗组。
在体内提供 pff 时, 注射部位的定位和使用的 pff 总量会影响产生夹杂物的神经元数量以及神经退行性变的程度 7,14。协议中的坐标提供了一个起点, 但应该在实验室内进行测试, 以确保所需的目标区域在大规模实验中使用之前发展α-syn 病理学。如果需要, 跟踪染料或荧光磁珠可作为在使用 Pff 之前测试区域定位的一种方式。体内使用的 pff 数量因群体而异, 大多数群体在一个注射部位使用的 pff 总数在5至20μg 之间, 或在两个注射部位1、2、3、4、5之间进行划分,6,7.,14. 由于注射部位的数量、注射部位的位置和注射的 pff 的数量会影响核源病的结果和进展, 因此, 在使用该模型之前, 应确定所使用参数的下游结果。测试潜在的干预措施或检查模型的时间特征。
在选择用于测试治疗方法或研究疾病进展的模型时, 应选择所使用的模型, 以最好地回答所提出的问题。并非所有模型都具有 PD 的某些疾病特征, 或提供测试潜在干预措施所需的时间框架。PFF 模型概述了 PD 的主要特征, 如α-syn 病理和神经退行性变, 并可导致轻微的运动损伤。该模型提供了一个可预测的和持久的时间过程, 其中内含物形成前几个月神经退行变。这使得研究人员能够在整个系统核病的长期进展过程中检查和利用不同的阶段。该模型目前和未来的总体应用有望有利于疾病进展和新疗法的发展研究。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了 Michael J. Fox 基金会、国家神经疾病和中风研究所 (NS099416) 和韦斯顿大脑研究所的资助。
1x Dulbecco’s phosphate buffered saline | Thermo Fisher (Gibco) | 14190144 | |
Anti-alpha-synuclein (phosphorylated at serine 129) antibody | Abcam | AB184674 | |
Anti-alpha-synuclein antibody | Abcam | AB15530 | |
Bicinchonic acid | Thermo Fisher (Pierce) | PI23228 | |
Clear Medical Shrink Tubing (0.036″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0143 | |
Clear Medical Shrink Tubing (0.044″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0296 | |
Copper sulfate | Thermo Fisher (Pierce) | PI23224 | |
Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 2231000574 | |
Eppendorf ThermoTop heated lid | Eppendorf | 5308000003 | |
Formvar/Carbon coated electron microscopy grids | Eletron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
Glass capillary tube (0.53 mm outer diameter; 0.09 mm inner diameter; 54 mm length) | Drummond | 22-326223 | |
Glass needle puller | Narishige | PC-10 | |
Hamilton syringe | Hamilton | 80000 | |
Human alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-003 | |
Mouse alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-009 | |
Orange Medical Shrink Tubing (0.021″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0152 | |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7543 | |
Proteinase K | Invitrogen | 25530015 | |
Qsonica 3.2 mm tip | Qsonica | 4422 | |
Qsonica Q125 sonicator | Qsonica | Q125 | |
Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892 | |
Thioflavin T | EMD Millipore | 596200 | |
ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit | Genscript | L00350C | |
Uranyl acetate | Eletron Microscopy Sciences | 22400 |