Het doel van dit artikel is het schetsen van de stappen die nodig zijn voor de generatie van fibrillen van monomeer Alfa-synuclein, latere kwaliteitscontrole, en het gebruik van de voorgevormde fibrillen in vivo.
Gebruik van de in vivo Alfa-synuclein voorgevormde fibril (α-SYN PFF) model van synucleinopathy is aan populariteit wint onder onderzoekers gericht op de ziekte van Parkinson-model synucleinopathy en nigrostriatal degeneratie. De standaardisering van α-SYN PFF generatie en in vivo toepassing is cruciaal om te zorgen voor een consistente, robuuste α-SYN pathologie. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de generatie van fibrillen van monomeer α-SYN, post-fibrilization kwaliteitscontrole stappen, en voorgestelde parameters voor een succesvolle neurochirurgische injectie van α-SYN PFFs in ratten of muizen. Beginnend met monomeer α-SYN, komt fibrilization over een incubatieperiode van 7 dagen voor terwijl het schudden bij optimale buffer voorwaarden, concentratie, en temperatuur. Post-fibrilization kwaliteitscontrole wordt beoordeeld door de aanwezigheid van pelletable fibrillen via sedimentatie Assay, de vorming van amyloid conformatie in de fibrillen met een thioflavin T Assay, en elektronen microscopische visualisatie van de fibrillen. Overwegende dat een succesvolle validatie met behulp van deze tests is noodzakelijk voor succes, ze zijn niet voldoende om te garanderen PFFs zal zaad α-SYN opneming in neuronen, als zodanig aggregatie activiteit van elke PFF partij moet worden getest in de cel cultuur of in pilot Animal cohorten. Voorafgaand aan het gebruik, PFFs moet worden sonicated onder nauwkeurig gestandaardiseerde omstandigheden, gevolgd door onderzoek met behulp van elektronenmicroscopie of Dynamische lichtverstrooiing te bevestigen fibril lengtes zijn binnen optimale grootte bereik, met een gemiddelde lengte van 50 nm. PFFs kan dan worden toegevoegd aan cel cultuurmedia of gebruikt bij dieren. Pathologie detecteerbaar door immunokleuring voor phosphorylated α-SYN (psyn; serine 129) is duidelijk dagen of weken later in de cel cultuur en knaagdieren modellen, respectievelijk.
De ziekte van Parkinson (PD) wordt voornamelijk gekenmerkt postmortem door twee belangrijke pathologische kenmerken: wijdverbreide en progressieve Alfa-synuclein (α-SYN) pathologie, en nigrostriatal degeneratie. Na injectie in wild type muizen of ratten, α-SYN voorgevormde fibrillen (PFFs) induceren progressieve accumulatie van pathologische α-SYN, die kan resulteren in langdurige degeneratie van Substantia nigra pars Compacta (SNpc) dopamine neuronen in de loop van vele maanden, evenals sensorimotor tekorten1,2,3,4,5,6. Neuronen worden blootgesteld aan α-SYN fibrillen, hetzij via directe intracerebrale injectie of toegevoegd aan de media van gekweekte neuronen. Wanneer de PFFs worden genomen in de neuronen, de PFFs handeling “zaad” de vorming van inclusies door middel van sjablonen, en accumulatie van endogene α-SYN in phosphorylated inclusies1,7,8, 9. Inclusies delen gelijkaardige eigenschappen aan Lewy organismen: bevattend α-SYN phosphorylated bij serine 129 (pSyn), ubiquitin, en P62; bezitten amyloid quaternaire structuren zoals aangetoond met positieve thioflavin kleuring; en zijn bestand tegen proteïnase K spijsvertering1,3,5,7,8,9,10,11, 12. PFF blootstelling leidt tot α-SYN inclusie vorming in de primaire en sommige vereeuwigd neuronen in de cultuur, evenals muizen, ratten, en niet-menselijke primaten in vivo1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13. Het is belangrijk op te merken dat PFFs niet zal leiden tot α-SYN inclusie vorming in alle modellen van de cel cultuur en sommige gekweekte neuronen zal zaad beter dan anderen.
Een ander belangrijk kenmerk van de in vivo α-SYN PFF model is de verschillende sequentiële pathologische fasen die ontstaan over enkele maanden. In knaagdieren, na intrastriatal injectie, α-SYN inclusie vorming pieken in het algemeen binnen de SNpc en vele corticale regio’s binnen 1-2 maanden. Deze aggregatie piek wordt gevolgd door nigrostriatal degeneratie ≈ 2-4 maanden later1,3,5. Deze afzonderlijke pathologische stadia verstrekken onderzoekers het platform waarmee om strategieën te bestuderen en te ontwikkelen die 1) verminderen α-SYN samenvoeging, 2) duidelijke reeds gevormde α-SYN opneming, en/of 3) verhindert verdere neurodegeneratie. De PFF model biedt verschillende voordelen en nadelen ten opzichte van neurotoxiciteit, transgene, en virale vector gemedieerde α-SYN overexpressie modellen zoals eerder beoordeeld6. De keuze van welk model of benadering te nemen moet worden bepaald door welk model het beste past bij de vraag van de onderzoekers vragen.
Hoewel het PFF model met succes door vele laboratoria is gebruikt, zijn er nog groepen die inconsistentie met het produceren van fibrillen en het veroorzaken van verenigbare α-SYN pathologie14hebben ervaren. Voorbeelden van inconsistenties variëren van PFFs die weinig of geen α-SYN pathologie produceren, batch tot batch zaaien efficiëntie, en zelfs het falen van fibrillen te vormen. Aldus, is de normalisatie van α-SYN PFF generatie en in vivo toepassing kritiek om voor nauwkeurige interpretaties betreffende de invloed van nieuwe therapeutische interventies toe te staan. Het volgende protocol schetst de stappen die nodig zijn voor het genereren van PFFs van α-SYN monomeren, de in vitro kwaliteitscontrole van de PFFs eenmaal gevormd, de sonication en meting van PFFs voorafgaand aan het gebruik, en suggesties om succesvol te vergemakkelijken in vivo injectie van PFFs in ratten of muizen.
De productie van α-SYN PFFs geschikt voor het zaaien van neuronen en leidt tot Lewy lichaam-achtige inclusies is afhankelijk van meerdere factoren en stappen. Een kritieke factor is dat de monomeren die voor het produceren van fibrillen worden gebruikt specifiek voor fibrilization4,9,14,15moeten worden geformuleerd. Als de monomeren niet voor fibrilization worden geformuleerd, kan fibrillen niet vormen of fibrillen die doen de vorm kan geen α-SYN pathologie veroorzaken. Evenzo, de buffer die de monomeren zijn in ook invloed fibrilization. Als dusdanig, voor de beste resultaten, zou de zoute concentratie ongeveer 100 mM NaCl en pH tussen 7,0 en 7,3 moeten zijn. Een eerste stap die veranderlijkheid introduceert is de methode waarbij het aanvankelijke eiwitgehalte wordt bepaald, met meting bij A280 waarschijnlijk om nauwkeurigere resultaten te veroorzaken en daarom de aangewezen methode is. De discrepantie in eiwitconcentratie kan de doeltreffendheid van het fibrilization proces verminderen evenals de veronderstelde PFF concentratie veranderen die in experimenten wordt gebruikt. Beide kunnen leiden tot een afname van het zaaien efficiëntie en batch variatie tussen experimenten.
Initiële kwaliteitscontrole stappen zullen bevestigen kritieke kenmerken van de PFFs, in het bijzonder dat zij een vezelachtig conformatie (elektronenmicroscopie), bevatten amyloid structuren (thioflavin T assay), en zijn pelletable (sedimentatie assay). Het is belangrijk op te merken dat de resultaten van de thioflavin T-assay zal fluctueren met de tijd en zijn niet een directe maatregel van de hoeveelheid amyloid structuren aanwezig zijn, in plaats van, de thioflavin T-assay mag alleen worden gebruikt als een indicator van amyloid structuren aanwezigheid binnen het monster. Thioflavin T wordt typisch gebruikt in in-vitro assays, zoals de bovengenoemde assay om de fibrillen bevatten amyloid structuren te tonen. Alternatief, thioflavin S wordt gebruikt in weefsel op te sporen amyloid structuren, zoals weergegeven in Figuur 7. Met betrekking tot de sedimentatie Assay, de resultaten blijkt alleen dat de PFFs zijn voornamelijk gevonden in de pellet bare Fractie. Als de monsters worden uitgevoerd in denaturerende omstandigheden, een enkele prominente band van ongeveer 14 kDa, de grootte van α-SYN monomeren, is aanwezig op de gels. Dit is in tegenstelling tot de veelvoudige banden huidig bij hogere moleculaire gewichten die met PFFs zouden worden verwacht als een inheems of niet-denaturerende gel werd gebruikt. Ten slotte is het succesvol passeren van al deze initiële kwaliteitscontrole stappen niet garanderen α-SYN inclusie zaaien activiteit. Om deze reden, moeten de de cultuur experimenten van de cel of een kleine cohort van chirurgisch-ingespoten dieren worden gebruikt om de doeltreffendheid van de PFFs vóór gebruik in grotere experimenten te testen.
Sonication is een cruciale stap in het proces en parameters zullen verschillen, afhankelijk van het model van geen ultrasoonapparaat gebruikt. Sonication parameters moeten worden toegepast en geverifieerd om aan te tonen dat korte PFF fragmenten zijn geproduceerd. Fibril grootte heeft invloed op het zaaien, met kortere fibrillen zaaien efficiënter. Hoewel kortere fibrillen zaad efficiënter, dit effect plateaus en de optimale pff lengte is ongeveer 50 nm4,18. Het is ook belangrijk om de steekproeven niet te bewerk en de PFFs aan bovenmatige hitte bloot te stellen, aangezien dit het zaaien efficiency kan verminderen. Deze sonicated PFFs moeten worden getest op de werkzaamheid in de kleine cel cultuur of in vivo experimenten voorafgaand aan het gebruik in grotere schaal experimenten. Aangezien de verschillende sonische zittingen het potentieel hebben om veranderlijkheid te introduceren, zouden de experimentele behandelingsgroepen moeten dienovereenkomstig worden gepland.
Bij het leveren van PFFs in vivo, de lokalisatie van de injectie site (s) en het totale bedrag PFFs gebruikt kan invloed hebben op het aantal neuronen dat zal de ontwikkeling van inclusies, alsmede de omvang van neurodegeneratie7,14. De coördinaten in het Protocol bieden een plaats om te beginnen, maar moeten worden getest in het lab om ervoor te zorgen de gewenste doelregio ontwikkelt α-SYN pathologie voorafgaand aan het gebruik in grootschalige experimenten. Indien gewenst, kan het volgen van kleurstof of fluorescente parels als manier worden gebruikt om het regionale richten te testen alvorens PFFs te gebruiken. De hoeveelheid PFFs die in vivo wordt gebruikt varieert tussen groepen, waarbij de meeste groepen met een totaal tussen 5 en 20 µ g PFFs bij één of verdeeld tussen twee injectieplaatsen1,2,3,4,5 , 6 , 7 , 14. aangezien het aantal injectieplaatsen, plaats van injectieplaatsen, en hoeveelheid PFFs ingespoten resultaten en vooruitgang van de synucleinopathy kan beïnvloeden, zouden de stroomafwaartse uitkomsten van de gebruikte parameters voorafgaand aan het gebruiken van het model moeten worden gekenmerkt om test potentiële interventies of het onderzoeken van temporele kenmerken van het model.
Bij het selecteren van een model te gebruiken voor het testen van therapeutische of het bestuderen van progressie van de ziekte, moet het gebruikte model worden geselecteerd om het beste antwoord op de vraag gesteld. Niet alle modellen zullen beschikken over bepaalde ziekte kenmerken van PD, of bieden het tijdschema nodig om potentiële interventies te testen. De PFF model recapituleert belangrijkste kenmerken van PD, zoals α-SYN pathologie en neurodegeneratie, en kan leiden tot een bescheiden motorische beperkingen. Het model biedt een voorspelbare en langdurige tijd-cursus, waar inclusies vorm maanden vóór neurodegeneratie. Hierdoor kunnen onderzoekers de verschillende fasen onderzoeken en exploiteren gedurende de langdurige progressie van de synucleinopathy. De huidige en toekomstige gebruik van het model in het algemeen zal naar verwachting gunstig zijn in de studie van de progressie van de ziekte en de ontwikkeling van nieuwe therapieën.
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Michael J. Fox Foundation, het Nationaal Instituut voor neurologische aandoeningen en beroerte (NS099416) en het Weston Brain Institute.
1x Dulbecco’s phosphate buffered saline | Thermo Fisher (Gibco) | 14190144 | |
Anti-alpha-synuclein (phosphorylated at serine 129) antibody | Abcam | AB184674 | |
Anti-alpha-synuclein antibody | Abcam | AB15530 | |
Bicinchonic acid | Thermo Fisher (Pierce) | PI23228 | |
Clear Medical Shrink Tubing (0.036″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0143 | |
Clear Medical Shrink Tubing (0.044″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0296 | |
Copper sulfate | Thermo Fisher (Pierce) | PI23224 | |
Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 2231000574 | |
Eppendorf ThermoTop heated lid | Eppendorf | 5308000003 | |
Formvar/Carbon coated electron microscopy grids | Eletron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
Glass capillary tube (0.53 mm outer diameter; 0.09 mm inner diameter; 54 mm length) | Drummond | 22-326223 | |
Glass needle puller | Narishige | PC-10 | |
Hamilton syringe | Hamilton | 80000 | |
Human alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-003 | |
Mouse alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils | Proteos | RP-009 | |
Orange Medical Shrink Tubing (0.021″ inner diameter) | Nordson Medical | 103-0152 | |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7543 | |
Proteinase K | Invitrogen | 25530015 | |
Qsonica 3.2 mm tip | Qsonica | 4422 | |
Qsonica Q125 sonicator | Qsonica | Q125 | |
Thioflavin S | Sigma-Aldrich | T1892 | |
Thioflavin T | EMD Millipore | 596200 | |
ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit | Genscript | L00350C | |
Uranyl acetate | Eletron Microscopy Sciences | 22400 |